Способ определения биологической активности химических соединений

СОЮЗ СОВЕТСКИХ /И П

РЕСПУБЛИН сЮ4 0 01 Б 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3575419/28-13 (22) 18.02.83 (46) 30.11.85. Бюл. М 44 (71) Институт биологической физики

АН СССР (72) Б.С.Маринов . (53) 578.08,(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

К 741154, кл. G 01 11 33/48. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ путем взаимодействия тестируемых соединений в растворе с возбуж- .. денным светом красителем, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью

„„Я0„„1143193 А упрощения способа образец, содержащий тестируемое соединение, краситель и восстановленный никотинамидадениндинуклеотид, а также контрольный образец без тестируемого соединения освобождают от- кислорода, освещают светом в полосе поглощения красителя и измеряют начальную скорость снижения оптической плотности или флюоресценции красителя или его редикалов.в присутствии тестируемого соединения и контрольного образца, причем среди соединений одного класса большей скорости выцветания соответствует более высокая биологическая активность.

1143193

Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано для первичной оценки биологической активности химических соединений на стадии предбиологических испыта- 5 ний..

Изобретение предназначено для отбора наиболее эффективных из биологически активных веществ в ряду новых веществ, полученных путем химической модификации исходного соединения и предназначенных для воздействия на одну и ту же биологическую функцию.

Известен способ определения биологической активности .химических соединений путем взаимодействия тестируемых соединений в растворе с возбужденным светом красителем, который заключается в том, что определяют величину начальной вспышки послесвечения раствора хлореллы, которую принимают за 100Х, затем в свежий раствор хлореллы добавляют раствор антибиотика заранее известной концентрации и строят стандартную кривую снижения интенсивности начальной вспышки послесвечения хлореллы в присутствии известных доз антибиотика. Измеряют интенсивность послесвечения испытуемого образца и по стандартной кривой определяют активность антибиотика, содержащегося в этом образце, т.е по сути дела его концентрацию. В основе этого способа 35 лежит взаимодействие тестируемого вещества (т.е..полиенового антибиотика ) с красителем (в данном случае— хлорофиллом), находящимся в возбужденном светом состоянии, в резуль- 40 тате чего уменьшается флуоресценция клеток хлореллы.

Недостаток этого способа заключается в том, что он сложен в связи с необходимостью культивирования 45 хлореллы, предназначен для определения активности только одного класса веществ и мало пригоден для определения биологической активности новых веществ, поскольку не содержит корре- 50 ляций между биологической активностью известных соединений и их влиянием на флуоресценцию хлореллы.

Целью изобретения является упрощение способа ° SS

Цель достигается в способе определения биологической активности химических соединений путем взаимодействия тестируемых соединений в растворе с возбужденным светом красителем. тем, что образец, содержащий тестируемое соединение, краситель и восстановленный никотинамидадениндинуклеотид, а также контрольный образец без тестируемого соединения освобождают от кислорода, освещают светом в полосе поглощения красителя и измеряют начальную скорость снижения оптической плотности или флюоресценции красителя или его радикалов в присутствии тестируемого соединения, причем среди соединений одного класса большей скорости выцветания соответствует более высокая биологическая активность °

Способ поясняется следующими примерами.

П. р и м е р 1. Определение биологической активности нейромедиатора дофамина и предшественников его биосинтеза — с =. ДОФА и тироэина.

В оптическую кювету, снабженную вакуумным краном, помещают контрольный образец: 2 мл буферного раствора (трис-НС! 0,0! M рН = 7,0 ), содержащего краситель эозин (1.10 !!) и восстановитель — восстановленный никотинамидофенилдинуклеотид (НАД-Н, 5.!О М ). Образец освобождают от растворенного кислорода осторожной откачкой на форвакуумном наеосе

1.10 мм.рт.ст.) в течение 30 мин.

Деаэрированный контрольный образец помещают в термостатированное кюветное отделение спектрофотометра СФ-10, позволяющее освещать образец непре-, рывным светом лампы накаливания мощностью 100 Вт ° Нужный участок спектра выделяют светофильтром ЖС-16. Через равные интервалы времени освещения (10 с ) фиксируют уменьшение максимума поглощения красителя на

= 517 нм и изображают на графике или в таблице кинетику выцветания красителя.

Опытный образец, содержащий кроме зозина и НАД-Н в концентрациях, равных таковым в контрольном образце, также и тестируемое вещество-дофамин (l 10 ! подвергают тем жепроцедурам, что и контрольный, и результаты измерений выцветания красителя наносят на один и тот же график. Аналогичным образом измерены предшественники дофамина 4-ДОФА и тирозин (см. табл.! ). Из данных

3 1143193 табл.1 следует., что дофамин наиболее сильно замедляет выцветание красителя зозина. Как известно из литературных данных, дофамин обладает и наивысшей биологической активностью как..:нейтромедиатор, являясь конечным продуктом биосинтеза. Менее активен биологически его предшественник о(-ДОФА, и он не столь сильно тормозит выцветание красителя,.проявляя более .слабые электронно-акцепторные свойства. Исходный продукт биосинтеза-тирозин, характеризующийся незначительным медиаторным действием, в наименьшей степени влияет на кинетику фотовыцветания зоэина. Таким образом, имеет место корреляция между биологической активностью изученных веществ и их способностью замедлять фо"

5 товьщветание красителя, т.е. их электронно-акцепторными качествами.

Обнаруженная корреляция биологической активности производных дофамина с их электронно-акцепторными свойствами позволяет прогнозировать биологическую активность новых лекарств на основе дофамина путем иэ15 мерения их электронно-акцепторных свойств.

Таблица 1

Кинетика выцветания красителя (дА1 зозина в контрольном образце в присутствии дофамина и предшественников его биосинтеза Ы-ДОФА и тирозина

Время освещения,с

40. 30

10

Выцветание

25 40

14 26

Контроль

Тирозин е -ДОФА

Дофамин

37

l 2,5 4

7,5

1,5

0,3 0,7 1

П р и м е ч а н и е: Выцветание красителя (ciA ) указано в делениях шкалы спектрофотометра СФ-10. Для.получения выцветания красителя в единицах оптической плотности указанные цифры нужно умножить на 0 01 25 Д.

Пример 2. Определение биологической активности нейролептиков-аминазина (хлоропромазина ) и его производных. . 50

Исследуют аминазин и его производные: -этаперазин и трифтазин.

Поскольку нейролептики образуют прочный комплекс с зозином в качестве красителя, в этом примере исполь- $5 зуют флуоресцеин-краситель близкий по строению к зоэину. Об образовании комплекса свидетельствует смещение полосы поглощения зозина в присутствии этих веществ.

Контрольный образец, содержащий

2 мл буферного раствора (.трис HCl

0,01 М рН 7,0), краситель флуоресцеин (1.10 М ) и восстановитель НАД-Н (5.10 )помещают в оптическую кювету, снабженную вакуумньк краном и под" вергают процедурам, описанньм в примере 1. Через каждые 15 с фиксируют уменьшение максимума поглощения флуТаблица 2

Концентрации производных аминазина, вызывающие одинаковое замедление выцветания зозина эа первые 15.с освещения образца и их известная биологическая ак тив нос ть

Аминазин Этаперизин Трифтазин

Концентрация, вызывающая равное замедление выцветания, M

5.10

I 7.10

20-80

150

5 1 143! оресценции на М 490 нм и строят кривую его кинетики выцветания.

Опытный образец, содержащий 2 мл буферного раствора (как и контрольный), флуоресцеик и НАД-Н в тех же концентрациях,что и контрольный образец, а также тестируемое вещество— аминазин, подвергапи тем же процедурам, что и контрольный образец и строят кривые кинетики выцвечивания !0 флуоресцеина в присутствии аминеэина при следующих его концентрациях:

5.10 И и 1,7.10 М.

Затем последовательно были построены кривые выцветания флуорес- !5

Суточная доза, мг До 800

Как видно из табл.2, одинаковую степень замедления выцветания красителя наблюдают при различной концентрации нейролептиков — наименьшей у трифтазина (5.10 М ) и наибольшей у исходного вещества — аминазина (1,7.10 М 1 В той же последовательности находится и их биологическая активность, определяемая по суточной дозе. В данном примере наблюдается и количественная пропорциональность между физиологической активностью членов гомологического ряда (доза } и интенсивностью их электронно-акцепторных взаимодействий с радикалами красителя (концентрация вещества, в заданной степени замедляющая выцветание красителя !.

Пример 3. Определение биоло-55 гической активности нейромедиатора норадреналина и его антагонистов фентоламина и атенолола, веществ, 93 Ь ценна в опытных образцах, содержащих (кроме флуоресцеина и NASH в буферном растворе, как и контроль 7 производные аминазина в различных концентрациях: атаперазин 1,6.10 М и 3.10 И и грифтазин 1,5.10 М и

5.!О М.

На основании полученных кривых определены концентрации аминазина и его производных, при которых происходит одинаковое выцветание флуоресцеина за первые 5 с освещения образца. Эти данные приведены в табл.2. характеризующихся противоположным воздействием на функцию передачи нервного импульса и сопоставление ее с их биологической активностью, описанной в литературе, Исследуют норадреналин, фентоламин и атенолол. Противоположное физиологическое действие тестируемых веществ предполагает, что одни иэ них являются акцепторами, другие - донорами электронов. Свойства доноров электронов целесообразно-оценивать при импульсном освещении образцов.

Контрольный образец, состоящий иэ 2 мл буферного раствора (трисНС1 0,01 М, рН = 7,0 ),содержащего краситель зоэин (1.10 М ) и восстановитель НАД-Н (5.10 М )помещают в оптическую кювету, снабженную вакуумным краном, освобождают от растворенного кислорода (как описано в примере 1! и помещают в кюветное отТаблица 3

Константы скорости реакции с радикалами зозина медиатора нервной проводимости норадреналина и блокаторов этого процесса — фентоламина и атеноллола

Норадреналин Фентоламин Атеноллол

Константа скорости реакции с радикалом зоэина +4,0.10 M с " -5.10 М с -5.10 И с

Биологическое действие Нейромеди- Блокатор Блокатор атор

Ф

"ВНИИПИ Заказ 7043/4 Тираж 896 Подписное

Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4

7 11431 деление импульсного спектрофотомет" ра, освещают импульсом света длительностью около 50 мкс и на запомиl нающем осциллографе типа С8-7А фиксируют кинетику исчезновения анионрадикалов зоэина на 3 420 нм (по изменению оптической плотности).

Опытный образец, содержащий 2 мл буферного раствора трис-НСI (как и контрольный ) зозин и НАД-Н в тех 10 же концентрациях, что и контрольный образец, а также тестируемое вещество норадреналин (4.10 4М ), фентоламин (3.10 М ) или атеноллол (3. I 0 M ) подвергают тем же процедурж, что и 15

Константам скорости условно приписаны разные знаки, чтобы подчеркнуть противоположный характер взаимодействия норадреналина и его антаго- 40 нистов с радикалами красителя.

Таким образом, взаимодействие тестируемых веществ с радикалами красителя позволяет выбрать наиболее активное вещество гомологического 45 ряда по наибольшей величине скорости его реакции с радикалами красителя или различать вещества с антагонистическим биологическим действием по их противоположному характеру вза-50 имодействия с радикалами.

Использование предлагаемого способа по сравнению с известным способом позволяет быстро сделать оцен93 8 контрольный образец (как описано.выше в этом же примере ). Затем получены кривые кинетики исчезновения анионрадикалов зозина в присутствии тестируемых веществ. По известной концентрации тестируемых веществ, разности контрольной и опытных кинетических кривых исчезновения радикалов и начальной концентрации радикалов стандартным образом вычислены константы скорости взаимодействия тестируемых веществ с радикалами красителя., которые представлены в табл.3, ку биологической активности химических соединений в пределах одного гомологического ряда и отобрать наиболее перспективные перед их проверкой на биологических объектах и тем самым сократить объем биологически тестируемых веществ . Кроме того, предлагаемый способ позволяет оценивать биологическую активность химических соединений различных гомологических рядов, а также способствует ускорению создания веществ с заданной биологической активностью путем сопоставления результатов химической модификации известного вещества с его электронно-акцепторными и донорными характеристиками измеряемым предлагаемы способом.