Способ выделения лимфацитов и гранулоцитов

 

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ И ГРАНУЛОЦИТОВ путем центрифугирования дефибринированной крови в градиенте плотности и отбора целевых продуктов с поатедующей их очисткой, отличающийся тем, что. с целью упрощения способа, в качестве градиента плотности используют раствор природного полисахарида из стеблей Alcea rosea в концентрации -2°/о и подконтрастного препарата типа верографина.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) з(51) A 61 В 10 00!

I:

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ":

К А ВТОРСКОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3529019/28-13 (22) 26.11.82. (46) 15.11.84. Бюл. № 42 (72) Л. Г. Михайлова, Н. И. Давыдова, Л. Д. Серова, И. С. Кожина, Г. Б. Гербут, И. А. Нефедова и С. А. Салихов (71) Ленинградский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (53) 315.375 (088.8) (56) 1. А. Воунгп. Isolation of lymphocytes, granulocytes and mactophages Seand.32mmu по1, 1976, ч. 5.5. (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ И ГРАНУЛОЦИТОВ путем центрифугирования дефибринированной крови в градиенте плотности и отбора целевых продуктов с последующей их очисткой, отличающийся тем, что„с целью упрощения способа, в качестве градиента плотности используют раствор природного полисахарида из стеблей А!сеа rosea в концентрации

1 — 2% и подконтрастного препарата типа верографина.

1123645

Изобретение относится к медицине, в частности, к иммунологии, и касается выделения лимфоцитов и гранулоцитов из периферической крови.

Известен способ выделения лимфоцитов и гранулоцитов путем центрифугирования дефибрилированной крови в градиенте плотности фиколл — верографин, причем выделение гранулоцитов следует за выделением лимфоцитов и характеризуется большой примесью эритроцитов в гранулоцитарной взвеси (!).

Однако известный способ сложен, трудоемок и длителен в исполнении.

Цель изобретения — упрощение способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу выделения лимфоцитов и гранулоцитов путем центрифугирования в градиенте плотности и отбора целевых продуктов с последующей их очисткой, в качестве градиента плотности используют раствор природного полисахарида из стеблей

А1сеа rosea в концентрации 1 — 2О/О и подконтрастного препарата типа верографина.

Способ осуществляют следующим образом.

К 1 — 2О/о-ному раствору полисахарида добавляют 76%-ный раствор верографина или 80О/р иодомида-380 или иодомида-300.

Плотность смеси должна быть в пределах (1,75 +-0,001). 10 кг/м . На 1 объем градиента плотности наслаивают равный объем дефибринированной крови. Пробирки центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин и температуре 18 С. После центрифугирования пастеровской пипеткой отсасывают верхнее кольцо, в котором находятся лимфоциты, и отдельно нижнее кольцо, состоящее из гранулоцитав. В полученных взвесях клеток лизируют эритроциты раствором 0,83О/о-ного хлористого аммония, после чего клетки дважды отмывают раствором Хенкса.

° Пример 1. Готовят градиент плотности путем смешивания l о/q-ного водного раствора полисахарида, выделенного из стеблей А1сеа rosea, и 76О/р раствопа верографина до p = (1,075 -0,001)-10 кг/см, плотность жидкости контролируют весовым методом. В пробирку наливают 4 мл градиента плотности и наслаивают 4 мл дефибринированной крови, полученной путем венопункции. Пробирку центрифугируют при

2000 об/мин и 18 С 20 мин. При этом образуется на границе двух фаз тонкое и плотное кольцо, представляющее собой лимфоциты, а под ним — второе кольцо, более широкое и рыхлое, представленное гранулоцитами. С помощью пастеровской пипетки осторожно отбирают сначала верхнее кольцо, а затем отдельно нижнее. К взвесям клеток добавляют по 10 мл 0,83О/о-ного хлористого аммония для лизиса примеси эритроцитов и через 10 мин центрифугируют при

10 l5

1500 об/мин в течение 10 мин. Центрифугат удаляют, а клетки дважды отмывают раствором Хенкса.

В выделенных взвесях производят подсчет количества клеток в камере Горяева.

Определяют процентный выход лимфоцитов и гранулоцитов их жизнеспособность (по трипановому синему) и находят процентное содержание примесей в каждой взвеси клеток. Кроме того, определяют функциональную активность выделенных лимфоцитов в лимфоцитотоксическом тесте (10 опытов) и в реакции розеткообразования (РОК) (15 опытов) .

Результаты изучения свойств клеток, выделенных с помощью предлагаемого способа, показали, что процентный выход лимфоцитов составляет в среднем 45О/о, гранулоцитов — 65О/р. Во взвеси лимфоцитов примесь гранулоцитов и эритроцитов составляет не более 10 /О. В гранулоцитарной взвеси примесь эритроцитов составляет не более 5 /p, лимфоцитов — не выше 20 /р. Жизнеспособность .лимфоцитов и гранулоцитов составляет 90 — 100 /о.

Исследование фенотипа лимфоцитов, выделенных из крови стандартных доноров на градиенте плотности lо/о-ный полисахарид + верографин и фиколл+ верографин методом иммунологического типирования в лимфоцитотоксическом тесте показывает совпадение результатов в 100О/О случаев.

Результаты сравнительного изучения Т и В-лимфоцитов, выделенных известным и предлагаемым способом, представлены в табл.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что функциональная активность лимфоцитов, выделенных с использованием градиента плотности на основе

lо/О раствора полисахарида, не отличается от розеткообразующей способности лимфоцитов, полученных с помощью раствора фиколла.

Пример 2. Готовят градиент плотности смешиванием 2О/О-ного водного раствора полисахарида из стеблей А1сеа rosea и 76 /р-ного раствора верографина до р = (1 075

0,001).10 кг/м (контролируется взвешиванием) . В пробирку наливают 4 мл градиента плотности и наслаивают 4 мл дефибринированной крови, полученной путем венопункции. Пробирку центрифугируют при тех же условиях, что и в примере 1. В результате центрифугирования в пробирке образуется тонкое и плотное кольцо, содержащее лимфоциты, и под ним второе кольцо — более рыхлое и широкое, содержащее гранулоциты. С помощью пастеровской пипетки осторожно отбирают сначала верхнее кольцо, а затем нижнее. К взвесям клеток добавляют по 10 мл 0,83 /О-ного раствора хлорстого аммония для лизиса эритроцитов

1123645 и через 10 мин центрифугируют при 1500 об/

/4ин в течение 10 мин. Центрифугат удаляют, а клетки дважды отмывают раствором Хенкса. В выделенных взвесях определяют процентные выходы клеток, оценивают их свойства, теми же методами, что и в примере 1.

Результаты оценки характеристик клеток, выделенных с помощью 2О/p-ного раствора полисахарида, с верографином, показывают, что выход лимфоцитов составляет

50 /р, а гранулоцитов — 70 /p. Примеси гранулоцйтов и эритроцитов в лимфоцитарной взвеси составляют не более IОО/p. В гранулоцитарной взвеси примеси эритроцитов не более 5О/р, лимфоцитов 15 — 20 /p. Жизнеспособность клеток в среднем составляет

95P/о.

Исследование фенотипа лимфоцитов, выделенных из крови 20 стандартных доноров с помощью градиента плотности: 2О/О полисахарид + верографин и раствор фиколла+ верографин методом иммунологического типирования в лимфоцитотоксическом тесте показало совпадение результатов в 100О/о случаев.

Сравнительное определение Т и В-лимфоцитов, проведенное методом розеткообразования, показало, что функциональная активность клеток, выделенных с использованием 2О/p-ного раствора полисахарида, не отличается от розеткообразующей способности лимфоцитов, полученных центрифугированием в градиенте плотности фиколл+ верографии (таблица 2) .

Для приготовления градиента плотности применяют полисахарид из стеблей штокрозы розовой (А1сеа rosea) полученный в лабораторных условиях Ботанического института им. В. Л. Комарова АН СССР.

Полисахарид представляет собой смесь кислого (состав: пентозы, гексозы и уроновые кислоты) и нейтрального (типа глюкана) полисахаридов.

В настоящее время разрабатывается нормативно-техническая документация (регламент и ТУ), необходимая для организации выпуска градиента плотности в качеетве диагностического реактива.

Предлагаемый способ одномоментного выделения гранулоцитов и лимфоцитов внедрен в иммунологической лаборатории

ЛНИИ и ГиПК.

Для выявления запредельных параметров, при которых положительный эффект

45 (наличие двух колец) не может быть достигнут, проводились следующие эксперименты. Готовили градиент плотности путем смешивания 0,5, 0,75, 2,25, 2,5 /р-ного водного раствора полисахарида и 76О/р-ного раствора верографина до у — 1,075-0,001/10 кг/см . Плотность жидкости контролируют весовым методом. В пробирку наливают 4 мл градиента плотности и наслаивают - 4 мл дефибринированной крови, полученной путем венопункции.

Установлено, что 2,25 и 2,5О/р-ные растворы полисахаридов в связи с высокой вязкостью создают трудности для приготовления точных по плотности растворов, что не дает возможности использовать их в дальнейшей работе.

При исследовании растворов полисахаридов низкой концентрации (0,5 и 0,75) не наблюдается желаемого эффекта — образование двух колец.

Поэтому для выделения лимфоцитов и гранулоцитов рекомендуется использовать 1 — 2О/о-ный раствор полисахарида.

Предложенный способ выделения лимфоцитов и гранулоцитов заметно упрощает процедуру получения взвесей клеток, так как благодаря одномоментному получению двух видов клеток исключается многостадийность процесса их выделения.

На первом этапе на градиент плотности фиколл+ верографин (по прототипу) наслаивают дефибринированную кровь, разведенную физиологическим раствором 1:1, а на градиент плотности полисахарид+ верографин наслаивают неразведенную дефибри ни рова нную кровь.

Отличием II этапа является разница во времени центрифугирования и в количестве оборотов (1500 об/мин — 30 мин и 2000 об/мин — 20 мин.) ..

На III этапе при центрифугировании на градиенте плотности фиколл+ верографин образуется только одно кольцо, представленное лимфоцитами. При центрифугировании на градиенте плотности полисахарид+ верографин образуется одномоментно два кольца: верхнее — лимфоциты, нижнее— гранулоциты. Это дает возможность на последующих этапах (IV и V) получить более чистые взвеси гранулоцитов: примесь эритроцитов в гранулоцитарной взвеси при использовании предлагаемого способа составляет 5 — 10 /о, а общепринятого 10 — 20 /о.

1123645

Таблица 1

Тп

Т с»

Г н

IZ-ный раствор полисахарида + верографин

34,1+0,8 45,3+2,0

31,2+2,1 45,2+2,4

5,3+1,0

15,7+1,8

13,3+1,8

5,0+0,6

Фиколл + верографин

Приме

P0K—

Та

Вс

Таблица 2

Гра нос

Т, в

Вс

27.-ный раствор полисахарида + верографин

44,5+2,5 5,8+0,9

35,2+1,9

31,2+2,1

17,7+1,8

13,3+1,8

45,2+2)4

5,0+0,6

Фиколл + верографин

ВНИИПИ Заказ 8033/5 Тираж 687 Подписное

Филиал ППП «Патентi, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ч ание: розеткообразующие клетки.

Т-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся наличием 1о. антигена на поверхностной мембране, который определяет способность клеток к спонтанному образованию розеток с эритроцитами барана.

Т-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся отсутствием 1 антигенов и неспособностью к спонтанному розеткообразованию.

В-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся наличием на поверхностной мембране рецепторов для F — фрагмента иммуноглобулина, что обусловливает способность этих клеток к образованию розеток с эритроцитами барана, несущими фиксированные молекулы 1 .

В-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся наличием на поверхностной мембране рецепторов для с» компонента комплемента, обусловливающего образование розеток с эритроцитами барана, имеющими молекулы С» — компонента комплемента.