Способ определения единицы активности гуморального фактора тимуса

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕДИНИЦЫ АКТИВНОСТИ ГУМОРАЛЬНОГО ФАКТОРА ТИМУСА путем воздействия на иммунокомпетентные клетки, отличающий ся тем, что, с целью повышения точности определения, исследуемый препарат вводят in vivo и через 40-50 ч определяют количество ядросодержащих клеток в тимусе , а за единицу активности препарата принимают то количество препарата измеряемое в микрограммах, которое вызывает увеличение ядросодержащих клеток в 1,8-2 раза по сравнению с контролем.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„,;ЯМ„„ 122299

А зов А 61 В 1000

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTGPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3471765/28-13 (22) 21.05.82 (46) 07.11.84. Бюл. № 41 (72) Е. С. Скобельцына, С. М. Гринберг, Т. В. Столярова и И. Я. Калмыкова (71) Харьковский научно-исследовательский институт медицинской радиологии (53) 615.375(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР № 858834, кл. А 61 В, 1981. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕДИНИЦЫ АКТИВНОСТИ ГУМОРАЛЬНОГО

ФАКТОРА ТИМУСА путем воздействия на иммунокомпетентные клетки, отличающий ся тем, что, с целью повышения точности определения, исследуемый препа рат вводят ill vlvo и через 40 — 50 ч определяют количество ядросодержащих клеток в тимусе, а за единицу активности препарата принимают то количество препарата измеряемое в микрограммах, которое вызывает увеличение ядросодержащих клеток в 1,8 — 2 раза по сравнению с контролем.

1122299

Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано при определении единицы активности гуморального фактора тимуса (гормона тимо-яна).

Известен способ определения единицы активности гу морального фактора, за ключающийся в том, что определяют тормозящее влияние теозиллина розеткообразования лимфоцитов, предварительно cTHM)ëèрованных тимозином. За единицу активности препарата принимают количество гормона измеряемое в микрограммах, которое обеспечивает уменьшение образования розеткообразующих клеток (РОК) на 50 /р, т.е. в 2 раза 11).

Однако известный способ недостаточно точен, поскольку не позволяет осуществлять определение единицы активности в пробе менее 0,05 мкг, а кроме того, он производится in vitro и при пересчете увеличивается ошибка измерения,. не позволяющая определять достоверное ли различие между

0„0l мкг и 0,05 мкг.

Це !ью изобретения является повышение точности определения единицы активности гуморального фактора тимуса.

Указанная цель достигается тем. что согласно способу определения единицы активности гуморального фактора тимуса путем воздействия на иммунокомпетентные клетки исследуемый препарат вводят in vivo я через 45 — 50 ч определяют количество ядросодержащях клеток в тимусе, а за единицу активности препарата принимают то количество препарата, измеряемое в мякрогр,;Il.fax, которое вызывает увеличение ядросодержащих клеток в 1,8 — -2 раза по сравнению с контролем.

При,!!ер. Определяют биологическую активность гуморальных факторов тимуса: пятой фракции типа «Тимозин« я низкомолекулярного компонента (НМК) этой фракции, полученных в очередной серии ! сследований из тимуса телят.

Как отражено в табл. 1, различные дозы тямусного фактора вводят подопытным мышам. Каждую дозу исследуют на 4 — б мышах. Через 40 — 50 ч после введения тимусного фактора определяют количество ядросодержащих клеток (ЯСК) тимуса у подопытных животных.

Для подсчета количества ЯСК животных забивают под эфирным наркозом, извлекают у них железы и определяют вес каждой вялочковсй железы. Среди тимусов, принадлежащих одной группе мышей, могут встречатьсяжелезы с весом, значительно отличающимся от веса других желез этой же серии мышей. Для выявления «выскакивающя,» значений применяют метод, основанный на оценке максимальных различит полученных результатов «Выскакивающие» значения веса стямуса следует исключить яз расчеов, а,данный т:!мус в исследованиях не исг!ользовать.

Из отобранных для дальнейшего анализа тимусов готовят клеточную суспензи!о.

Для этого все отобранные железы продавливают через тонкую стальную или нейлоновую сеть ь физиологи !еском растворе.

Полученную клеточную взвесь г!ропускают

5 — 10 раз через иглу для получения одно10 клеточной суспензия Hi замеря!ст объе полченной взвеся (ч ) . Определяют количество тимоцитов (ЯСК) в 1 мл путем подсче: в камере Горяева, а затем общее коля чес- во

ЯСК во всем объеме (ЯСК д„,) по формуле

ЯСК,g =ЯСК, мл- ";

15 Количество ЯСК в каждом тиv. !се (Я!. К„., определяют по формуле где Pîбщ суммарHH! É вес тямусов в гру ппе;

Р„ †в отдельчого тимуса в гр лпе.

Уьеличение количества ЯСК H опытной группе определяется по отношеня!о средней клеточности Tlf".".óñoâ огыт:ой группы к

YoHTpG II HoH группе I; обозначается как чндекс стимуляция (ИС1

Количество ЯСК, ус;;Hoaле.-нное в анном опыте пря воздействии того::::ли иного фактора, и биологическая активность 5 фракции и низкомолекуляряого ком .онента

311 (НАЙК) г!ряводятся в т. .Ол. .

Наименьшей дозой, вызываюш„=й увеличе гие количества ЯСК в 8 раза для 5 фракции. 10;,!кг; д я БАК 10 " мкг. Таким образом. в IIBHHoA серия препарата в

1 мг 5 фракции содерж:-;тся 100 тыс. e:I. активности; в 1 мг НМК 100 млрд. е.-,. актявкости.

В каждой серии полученного препарата

40 определяют ИС для нескояькях доз. Наименьшее весовое количество исг!ытуемого препарата, вызывающее 1,8 — 2,0 --- .;ратное увеличение количества ЯСК. принимается за единицу биологической активности.

Количество единиц биологической активности в 1 мг препарата характеризуег биологическую активность данной серии.

Индекс стимуляция, равный 1,8 — 2,0 выбран для определения единицы актявносгя, исходя из биологи !ескях свояств тимуса, отвечающего на горм >нальные раздражители различной силы однотипной реакцией: возрастанием клеточности по мере увеличения силы раздражителя до определенного максимума с постепенным снижени55 ем силы ответа при дальнейшем повышении силы раздражителя. Максимум повышения клеточ ности кол ебл ется в предел а х 1,8-2,8—

ОО2ОТ.

Таблипа1

5 фракция

Доза фактор, мкг

) ЯСЕ в тимусе; Индекс стимулн1 (к10 ) ции

О (физ. р-р) 37,4+3,06

109

61, 34+11 0

1,64+0,18

-,0t) 67 32+7,41

i,80+0„i1!

43,01+5,59

73,30 9,53

1,96+0,13

1,15+0,13

43,01+5,59

74.05+iI,85

1,15+0,13

1,98+0,16

10"

1.23+0,12

72 56+7 98

46,00+5,52

1,94- 0,11

IO

46,00+5, 2

1,23+0,12

65,82+7,24

1,76+0,11

53,48+6,41

54,98+5,49

1,43+0, 12

1,47+0,10

10 "

67,32+10,09

54,23+12,47

1,45+0,23

1,80+0,15

101

54,23+8,13

1,45+0,15

П р и м е ч а н и е. 2 таблице представлены средние .начения из 3 опытов по 4-6 мышей в каждом. кратного увеличения. Для того, чтобы мож но было использовать наименьшее количество доро. остоящего гормона для оценки единицы активности, мы определили ее по наименьшему максимуму реакции. Кроме того, при дозах препарата, Вызывающих 1,8 — 2,0кратное увеличение клеточности тимуса в любой серии полученного гормона, отличия от контрольной группы всегда статистически достоверны. Поэтому индекс стимуляции, равный 1,8 — 2,0 является надежным критериеч оценки единицы активности гормон».

Воспроизводимость результатов, получаемых данным способом. Оценивалась по коэффициенту вариации. Коэффициент вариации при сравнении индексов стимуляции в 4 повторных опытах для одной серии препарата не превышал 20 /р (допустимый уровень 33%).

Сдав««тельные 1аннь,е но чуьст-.«тельно(ти прсдлОженного спосО 3 liG ссоавнению г с известным ноказаны B табл. 2.

i- езультаты, 1риведенныс В таол. 2, свидетельствуют о том, tTo предложенный способ определения биологической активности гуморального фактора ти муса позволяет пределять ее в опытах in vivo и при этом

ВыЯвлЯть содержание фактора В пробе В

ЗНВЧИ: ЕЛЬНО МЕНЬШИХ КОЛИЧЕС! ВВХ, ЧЕМ При использовании известных способов.

Высокая чувствительность предложенного способа, в 5 раз превышз1ощая чувствительность известного. и воснроизводимость результатов позволяет рекомендовать его для использования в химико-фармацевтической промышленности для стандартизации выпускаемы.; "ерий препарата (гормона), получаемого из тимуса.

1122299

Таблица 2

1 10

5 фракция

100 тыс.ед.!

00 млрд.ед.

Н1 1К

Составитель Г. Крюкова

Редактор С. Патрушева Техред И. Верес Корректор В. Бутяга

Заказ 7779/3 Тираж 687 Подлисное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», r. Ужгород, ул. Проектная, 4