Способ получения ганглиозидов

 

СПОСОР ПОЛУЧЕНИЯ ГАНГЛИОЗИ .ДОВ путем гомогенизации мозговой ткани, обезвоживани ее, экстрагирования смесью хлороформа с органическим растворителем с последующей очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, экстракцию ведут смесью хлороформа с этанолом, а очистку проводят добавлением к пробе ацетона в соотношении 5:1.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (1% (111

1(51) 0 01 N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

Н ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПИЙ (21) 3404144/28-13 (22) 05.02. 82 (46 ) 15. 09. 84. Вюл. 9 34 (72) В.И.Ефременко и В.Н.Масленникова (71 ) Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (53) 616.07(088.8) (56) 1. Патент Франции Р 2320760, кл. A 61 К 35/30, 1977 (аналог).

2. Свеннерхольм. Ганглиоэиды: выделение. В кн. Методы исследования углеводов. М., "Мир", 1975, с. 348-352 (прототип). (54)(57) CIIOCOg ПОЛУЧЕНИЯ ГАНГЛИОЭИДОВ путем гомогениэации моэговой ткани, обеЭвоживани ее, экстрагирования смесью хлороформа с органическим растворителем с последующей очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения способа, экстракцию ведут смесью хлороформа с этанолом, а очистку проводят добавлением к пробе ацетона в соотношении 5:1 .

1113743

Пример 1. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг свиньи. Отделяют серое вещество головного мозга от бе-65

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии.

Известен способ выделения ганглиозидов, включающий экстрагирование ганглиозидов из нервных .тканей млекопитающих тетрагидрофураном с последующим пропусканием экстракта через хроматографическую колонку и выделение осадка,.который растворяют в воде, диализуют и сушат сублимацией (13 .

Известен также способ получения ганглиозидов по Свеннерхольму, включающий обезвоживание нервной ткани ацетоном, последующее ее экстрагирование смесью хлороформ-метанол с 15 многократным фракционированием, включающим в себя 18 этапов 121.

Целью изобретения является ускорение и повышение безопасности способа.

Укаэанная цель. достигается тем, что согласно способу, получения ганглиозидов путем гомогенизации мозговой ткани, обезвоживание ее, экстрагирования смесью хлороформа с органическим растворителем с последующей очисткой целевого продукта, экстракцию ведут смесью хлороформа с этанолом, а очистку проводят добавлением к пробе ацетона в соотношении

5:1.

Способ осуществляют следующим образом.

Отделяют серое вещество головного мозга от белого. Серое вещество гомогенизируют с ацетоном иэ расчета

4 мл на 1 г исходной ткани. Затем непрерывно перемешивают в течение

12-20 ч и фильтруют суспензию на воронке Бюхнера. Осадок опять суспендируют в ацетоне из расчета 2 мл 40 на 1 г ткани, перемешивают в течение

4 ч при 20 С и повторно фильтруют на воронке Бюхнера.

Полученный осадок дважды экстрагируют смесью хлороформ-этанол (1:1) 45 из расчета 2 мл на 1 r исходной ткани. В течение 1 ч встряхивают на шуттеле и центрифугируют. Супернатанты собирают, а осадок опять экстрагируют смесью хлороформ-этанол (1:1) 50 из расчета 1 мл на 1 г исходной ткани. Эту суспензию нагревают на водяной бане 30 мин при 50 С и центрифугируют в горячем виде. Супернатан- ты объединяют. 55

Добавляют к полученному экстракту 5 объемов ацетона. Смесь ганглиозидов выпадает в осадок. После полного формирования осадка (через 3040 мин супернатант отсасывают сифоном, а смесь ганглиозидов собирают. лого. Серое вещество в количестве

1000 r гомогенизируют в 4000 мл ацетона, затем непрерывно перемешивают в течение 12 ч при 20 С и суспензию фильтруют на воронке Бюхнера.

Oc.".:.äoê вновь суспендируют в 2000 wI ацетона и перемешивают в течение

4 ч при 20 С и повторно фильтруют на воронке Бюхнера.

Для извлечения ганглиоэидов полученный осадок экстрагируют 2000 мп смеси хлороформ-этанол(1: 11 путем встряхивания на шуттеле в течение

1 ч при 20С. Супернатант. собирают, а осадок вновь экстрагируют 1000 мп этой же смесью органических растворителей при 50 С в течение 30 мин и центрифугируют при данной температуре. Полученные супернатанты объединяют н для осаждения ганглиозидов добавляют к ним 5 объемов (15000 мл ацетона. После полного Формирования осадка (через 30-40 мин 1 супернатант отсасывают сифоном, а осадок, представляющий собой смесь различных ганглиозидов, окончательно освобождают от супернатанта центрифугированием.

Полученный препарат ганглиозидов содержит 395 + 17 мг N-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и

6122500 51500 токсиннейтрализующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу Крейга. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиозиды не обнаруживаются.

Пример 2. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг свиньи. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в примере 1, испольэуя для осаждения ганглиозидов вместо 5 объемов ацетона 4 объема, что приводит к частичному выпадению ганглиозидов в осадок. Полученный препарат ганглиозидов содержит 211 13,5 мг

N-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощьв резорцинового реактива, и 3872000 < 32500 токсиннейтрализующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу Крейга. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, обнаруживаются ганглиозиды, полностью осадить которые удается путем добавления к раствору ацетона до 5 объемов.

Пример 3. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг свиньи. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в примере 1, используя для осаждения ганглиозидов вмес1113743

Составитель И.Емельяненко

Редактор Н.Ивыдкая Техред Т.Дубинчак Корректор д.Обручар

Заказ 6613/37 Тираж 822 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП"Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 то 5 объемов ацетона 6 объемов, что не обеспечивает дополнительного осаждения ганглиоэидов, которые практически полностью осаждаются 5 объе-мами ацетона. Полученный препарат ганглиозидов содержит 397 - 15 мг

N-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью реэорцинового реактива, и 6124000 i 49500 токсиннейтралиэующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического 10 действия холерогена в кожной пробе по Крейгу. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиозиды не обнаруживаются. 15

Пример 4. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг крупного рогатого скота. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в при- « О мере 1. Полученный препарат ганглиоэидов содержит 369 - 18 мг N-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и 5897000 > 56500 токсиннейтралиэующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу, Крейга. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиоэиды не обнаруживаются.

Пример 5. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг барана. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в примере 1. Полученный препарат ганглиоэидов содержит 352 N

14 мг N-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и 5863000 + 545000 токсиннейтралиэующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу Крейга. R надоса1дочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиозиды не обнаруживаются.

Таким образом, получение ганглиозидов предлагаемым способом проходит

На 6-7 дней быстрее, чем по известному за счет введенйя осаждения ацетоном. Способ позволяет заменить использование сильнодействующего ядовитого растворителя метанола на этанол, что повышает безопасность получения целевого продукта.