Штамм @ @ @ -1,используемый для внутривидовой дифференциации иерсиний чумы

 

Штамм Phagum pestis M-l 101. (коллекция фагов Всесоюзного научноисследовательского противочумного института Микроб), используемый для внутривидовой дифференциации иерсиний чумы. § (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (191 (11):, (594 С 12 Н 7/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3576654/28-13 (22) 08.04.83 (46) 23.03.86.Бюл. Р 11 (71) Всесоюзный ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (72) Л.М.Гольдфарб, П.И.Анисимов, О.П.Плотников, Ю.И.Кондрашин, Ю.А.Попов, Н.П.Коннов и В.Е.Тарасова (53) 576.858.9(088.8) (56) Ларина В.С., Мельников Н.Ф., .Тимофеева Л.А. и др. Сравнительная характеристика активных фаговых корпускул чумных и псевдотуберкулезного фагов. Сб .. "Проблемы ООИ", Саратов, :У 4, 1977, с.13. (54). ШТАММ PHAGUM PESTIS М-1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ИЕРСИНИЙ ЧУМЫ (57) Штамм Phagum pestis .М-1, 101. (коллекция фагов Всесоюзного научноисследовательского противочумного института "Микроб" ),.используемый для внутривидовой дифференциации иерсиний чумы.

1106834 2

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при бактериологической диагностике чумы для целей внутривидовой дифференциации иерсиний чумы, а также в генетических и микробиологических экспериментах..

Известны псевдотуберкулезный и чумный диагностические бактериофаги для дифференциации подвидов чумного микроба.

Однако известные бактериофаги. лизируют 98-99 . штаммов псевдотуберкулеэного микроба и 57% музейный культур воэбудйтеля чумы, что приводит к диагностическим ошибкам.

Целью изобретения является получение бактериофага с узким спектром литической активности в отношении отдельных групп штаммов возбудителя чумы и повьппение качества дифференциации бактерий иэ различных природных очагов чумы.

Поставленная цель достигается использованием штамма Phagum pestis

M-1 .

Для получения фага были изучены на наличие фагов, активных в отношении бактерий чумы, 150 свежевыделенных и музейных штаммов E.coli, Один из изученных фильтратов (К-.

235) образовывал на штамме -.I.pestis

400(290) (Закавказское высокогорье) единичные мелкие неправильной формы относительно прозрачные негативные колонии.

С целью выделения однородной популяции фага проведена селекция негативных колоний. Чистая линия фага

M. — 1 была получена путем. 10-кратного пассирования отдельных негативных колоний на штамме,I.Pestis 400(290).

Бактериофаг М-1 депонирован в лаборатории.холерных фагов с музеем института "Микроб" за N 101.

Штамм М-1 чумного умеренного фага имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.

Частица фага М-1 имеет головку гексагональной формы размером 51,4+

+2,3 нм, отросток длиною 114,4 1,6 нм, шириной 14,2+0,4 нм и сокращающийся чехол (длина в состоянии сокращения

50+1,8 и ширина 20+1,7 нм, что дает основание отнести этот фаг к .Т морфологической группе).

Бактериофаг M-1 образует относительно прозрачные колонии диаметром

3S

I.Pestis 400(290) вносят в свежий бульон Хоттингера из расчета конечной концентрации 5 ° 10 клеток на о

1 мл; после 6 ч подращивания при 28 С

45 с постоянным шюттелированием и достижением культурой плотности 2-3 ° 10 клеток на 1 мл добавляют фаг М-1 иэ расчета множественности инфекции 0,10 4. Через 16-18 ч шюттелирования

5 !

0 !

0,5-1 мм, отличающиеся от. крупных (4-8 мм) негативных колоний извест. ного псевдотуберкулезного фага.

Одиночный цикл развития на штамме I ° Pestis 400(290) характеризуется следующими показателями: константа скорости адсорбции 2,4 10 мл/мин, 9 латентный период 90-100 мин, средний урожай 8,4 фаговых частиц íà 1 бактериальную клетку.

В табл.1 приведена серологическая характеристика фага М-1.

По серологическим свойствам бактериофаг М-1 относится к II серотипу чумных фагов (табл.1).

Диапазон и специфичность действия фага М-1 изучены на 985 штаммах возбудителя чумы, 184 культурах псевдотуберкулезного микроба и 57 штаммах возбудителя кишечного иерсиниоза.

Испытания проведены в сравнении с псевдотуберкулеэным диагностическим фагом (табл.2).

В табл.2 приведена литическая активность чумных бактериофагов М-1, Л-143 "С" и псевдотуберкулезного диагностического в отношении штаммов бактерий рода Iersinia.

Пример. Фаг М-1 репродуцируется на клетках штамма T.Pestis

400(290) в бульоне Хоттингера, рН 7,2

При посевной дозе 2-3 ° 108 клеток

1 на 1 мл среды и множественности инфекции 0,1-0,4 при инкубации с постоянным шюттелированием в течение о

16-18 ч при 28 С накапливается до и 10 фаговых частиц на 1 мл.

Для получения препарата фага М-1

18-часовую бульонную культуру штамма о при 28 С к фаголизату добавляют хлороформ до 2 по объему. Фаголиэат с добавленным хлороформом выдерживают

1,5-2 ч при комнатной температуре (20-24. С) и 10-12 ч в холодильнике о (4-6 С).Затем фаголиэат фильтруют через бактериальные фильтры марки Ф-З, Ф-5. Полученный фильтрат разливают по ампулам и контролируют на специТаблица l

Фаг

Сыворотка

Л-413 "С™

Псевдотуберкулезный диагностический

М-1

Антифаговая серотипа

О/О/О/Антифаговая

II серотипа

98/83,72 98/300

О/Антифаговая

М-I

99,6/441,6 97,2/283,4

О/П р и м е ч а н и е. Числитель — % нейтрализованных фаговых корпускул; знаменатель — константа ней трализации.

Таблица 2

Культура

Количество штаммов лизирующихся фагами, Ж

Очаг

Количество исследуемых культур

Возбуди- Закавказский тель равнинночумы предгорный

100

98,9

О

Закавказский высокогорный 242

100 .

78,4 99,5 фическую и общую стерильность .и активность.

Фаг М-l, подобно типовым фагам других видов, используют для фаготипирования штаммов возбудителя чумы в дифференцирующем рабочем титре (ДРТ).

ДРТ фага определяется следующим образом: 18-часовую бульонную индикаторную культуру I.Pestis 400(290) в объеме 0,3 мл .вносят в пробирку с

4,5 мл расплавленного и остуженного до 47 С 0,7Х-ного агара Хоттингерао (рН=7, 2), перемешивают и содержимое пробирки выпивают на поверхность агаровой пластинки (1,27-ный агар Хоттингера, рН 7,2).После застывания . второго слоя на его поверхность пет-! лей или штампом наносят десятикратные

06834 4 разведения фага М-l. После подсыхав ния капель посевы инкубируют при 28 С в течение 18-20 ч; За дифференцирующий рабочий титр принимают то разведение, в котором фаг М-1 образует на месте нанесения не менее 10 негативных колоний.

Изучение чувствительности иссле1О дуемых культур к фагу М-1 проводит.ся так же, как и определение дифференцирующего рабочего титра.

Использование фага М-! в практике лабораторного исследования позволит

15 повысить эффективность зпизоотологических, микробиологических, генетических исследований, направленных на борьбу с возбудителями чумы;

Д-413 Псевдотуберкулез"С" ный диагностический

1106834

Продолжение табл. 2

Количество исслеКультура Очаг дуемых культур

М-1

Приараксинский

100

100

Дагестанский горный

lOO

100

ЦентральноКавказский

100

97,2

Горно-Алтайский

100

216 98,1 100

100

100

Тувинский

97 0

Забайкальский

100

100

Гиссарский

1.00

100

10

Прикаспийский степной

100

100

101

Африка, Ю.. Америка

100

100

Возбудитель

3,2

98,1

184 0

Возбудитель ки-. шечного иерсиниоза

0,6

Редактор Е.Месропова Техред Л.Олейник Корректор Л1Патай

Заказ 1339/3 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 псевдотуберкулеза

Количество штаммов лизирующихся фагами, 7.

Д-413 Псевдотуберкулез"С" ный диагностический

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная, 4