Способ определения иммунологического состояния организма

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) Ø з

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 2)1 3429)98/2d-13 (22) 23.04.82 (46! 07.05.84. Бюл. Ф 17 (72) И. Д. Понякина, К. А. Лебедев, М. И. Васенович, Е. М. Шибанова и И. В. Рагоэина (71) Московский научно-исследовательс. кий институт уха, горла и носа (53) 6)5.477(088.8) (,56) ). Clinical experimental Jmmvnology 1976, 25, )) 2, 319-327.

2. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1976, )) 2, с. 197-200. (54)(57} СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИМИУНОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА, включающий выделение лейкоцитов седиментацией в желатине, добавление эритроцитов, инкубирование, фиксацию и подсчет роэеткообраэующих клеток, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, выцеление лейкоцитов осуществляют путем центрифугирования крови при 4-5 g в течение 5-25 мин, а инкубацию с эритроцитами проводят при 4- 12 С в течение 28-30 мин. о

1090409

Изобретение относится к медицине и может быть использовано как для анализа Т-В н А-клеточных систем у здоровых людей, так и для диагностики заболеваний (первичных и вторич- 5 ных нммунодефицитов), Известен способ определения Т- и

В-популяций лимфоцнтов периферической крови человека путем розеткообразования {PO) с эритроцитами барана 10 или мьппи соответственно, включающий выделение моноядерных клеток градиентным центрифугированием крови на гипак-фнкелле при 400 g в. течение

50-40 мин, отмывку клеток, смешение 15 полученной суспензии клеток с суспензией эритроцитов из расчета 50—

100 эритроцитов на одну клетку с добавлением 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки, инкубацию смеси в 20 течение 5 мин при 37 С, центрифугио рование при 100-150 g в течение о

5 мин к инкубацию при 4 С в течение

18 ч с эритроцитами барана или при

22 С в течение ч для PO c эритроци- 25 о тами мыши с последующим подсчетом количества розеткообраэующих лимфоцитов B гемоцитометрах jlj .

Однако данный способ требует больших затрат времени, что делает невозможным его применение в клинике, не является универсальным, так как не позволяет определять PO другими клетками, кроме того, является малочувствительным к изменению функционального состояния клеток при латало-З5 гиях.

Известен также способ определения

T-клеток, который включает выделение лейкоцитов из крови после добавления с 40 желатины путем расслаивания в,тече&не 40-50 мин (седиментация эритроцитов при 1 g) трехкратную отмывку клеток с добавлением перед второй отмывкой дистиллированной воды на 15 с, приго;

45 давление клеточной суспенэии, содержащей 2 10 клеток в 1 мл, смешение

Ь

- суспензии с равным объемом 0,4Х-ной взвеси эритроцитов барана, инкубацию .при 37 С в течение 5 мин, центрифуо гирование при 200 g 5 мин, инкубацию при 12 С в течение 1 ч, выдерживание с глутаровым альдегидом в течение 20 мин, отмывку от глутарового альдегида, приготовление и окраску мазков и подсчет количества 55 розеткообразующих клеток (21, 1

Однако данный способ также требует значительных затрат времени и включает большое число манипуляций, что затрудняет его широкое использование в клинике, кроме того, является недостаточно чувствительным к изменению функционального состояния клеток.

Целью изобретения является повышение чувствительно ти и упрощение способа.

Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу опрЕделения иммунологического состояния организма, включающему выделение лейкоцитов крови седиментацией в желатине, добавление эритроцитов, инкубирование, фиксацию и подсчет розеткообразующих клеток, выделение лейкоцитов осуществляют путем центрифугирования при 45 g в течение 15-25 мин, а инкубацию с эритроцитами проводят при 4-12 С.в течение 28-32 мик.

Способ осуществляют следующим образом.

К геларинизированной периферической крови (20-60 ед. гепарина на 1 мл крови) добавляют ЗХ-ный раствор желатины на физрастворе в количестве 1 мл на 3 мл крови и центркфугируют при

4-5 g 15-25 мин. Верхний, лейкоцитарный слой собирают в центрифужную пробирку и измеряют его объем. Добавляют среду Хенкса до общего объема )Оl! мл, центрифугируют при 400 g

l0 мин, а надостаточную жидкость сливан>т. Осадок ресуспендируют, добавляют к нему 1 мл дистиллированной воды, взбалтывают, а через 15 с приливают среду Хенкса до объема !0-1!мл.

Центрифугируют при 200 g 10 мин, насадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют, добавляют к нему среду

199 из расчета 0,8 мл на 1 мл лейкрцитарного слоя, О,l мл полученной суслензии смешивают с 0,6Х-ной взвесью эритроцитов (для определения PO с зрит. роцитами мыши в смесь добавляют 0,05 кл эмбриональной телячьей сыворотки) смесь центрифугируют при 200 g 5 мин и инкубируют при 4-!2 С 28-30 мин. Затем осадок ресуспендируют, добавляют к нему 0,05 мл 3Х-нога раствора глутарового альдегида в фосфатном буфере, выдерживают 5-6 мин и приливают

10 мл дистиллированной воды. Центри@угируют, надосадочную жидкость слива. ют, а из осадка готовят мазки. Мазки сушат на воздухе, окрашивают и подсчитывают количество РОК для всех ви.-. дов клеток крови.

1090409

Пример 1. Берут 6 мл крови в пробирку, содержащую 0,6 мл раствора гепарина на физрастворе (200 ед. в мл), добавляют 2 мл З .-ного раствора желатины, перемешивают и центрифугиру- 5 ют при 5 g 25.мин. Верхний слой. собирают в центрифужную пробирку. (получено 2,3 мп верхнего лейкоцитарного слоя). Приливают среду Хенкса до объема ll мл, центрифугируют при 400 g

10 миц. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Приливают

1 мл дистиллированной воды, выдержива. ют 15 с. Затем добавляют среду Хенкса до 11 мл и центрифугируют 10 мнн при 200 g. Надосадочную жидкость сливают ° Осадок ресуспендируют и добавляют к нему 2,5 мл 199. среды. О,l мп полученной взвеси клеток смешивают с О,l мл 0,6Х-ной суспензии эритроци- 20 тов барана. В другой пробирке смешивают 0,1 мл полученной взвеси клеток с 0,6%-ной суспензией эритроцитов мыши (О, 1 мл) и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки инактивирован 5 иой адсорбированной).Центрифугируют при 200 g 5 мин. Инкубируют при 4 С о

28 мин. Осадки ресуспендируют, добавляют к ним 0,05 мл З -ного раствора глутарового.альдегида, выдержива- 30 ют 5 мин. Затем в пробирки наливают по 6-10 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 200 g 5 мин, надосадочную жидкость сливают. Готовят мазки, сушат на воздухе. Препараты З5 фиксируют в метаноле, окрашивают метиловым зеленым — пиронином, подсчитывают количество лимфоцитарных розеток на 100 лимфоцитов и нейтрофиль.ных розеток на 100 нейтрофилов. 40

Пример 2. Берут 3 мл крови в центрифужную пробирку, содержащую

0,6 мл гепарина (20 ед. в мл) и мл З -ного раствора желатины переЭ

45 мешивают. Центрифугируют при 4 я

15 мин. Верхний алой в количестве

1,5 мл собирают в центрнфужную пробирку. Приливают среду Хенкса до объема ll мл, центрифугируют при 400g

10мин. Надосадочнуюжидкость сливают;. осадок ресуспендируют. Приливают 1 мп . дистиллированной воды, выдерживают

15 с. Затем добавляют среду Хенкса до

11 мл, центрифугируют при 200g 10 мин.

Надосадочную жидкость сливают. Îñàдок ресуспендируют и добавляют к не-, му 1,2 мл 109 среды, 0,1 мл полученной взвеси клеток смешивают с О,l мл

0,6 -ной суспензии эритроцитов барана, а в другой пробирке — с О, l мл

О,б -ной суспензии эритроцитов мыши и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Центрифугируют при 200g о

5 мин. Инкубируют прн 7 С 30 мин.

Далее - так же, как в примере 1.

П р и.м е р 3. Берут 3 мп крови в центрифужную пробирку, содержащую

0,3 мл гепарина (200 ед. в мл), добавляют 1 мл 3Х-ного раствора желатины, перемешивают. Центрифугируют при 4-5g 20 мин. Верхний слой в количестве 1,5 мп собирают в центрнфужную пробирку. Приливают среду Хенкса до объема ll мл, цеитрифугируют при

400g 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Приливают l мл дистиллированной воды, выдерживают 15 с. Затеи добавляют среду Хенкса до 11 мл и центрифугируют при 200g 10 мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нему 1,2 мл среды

199. 0,1 мл полученной взвеси клеток смешивают с 0,1 мл 0,6Х-ной суспензии эритроцитов барана, а в другой пробирке — с 0,1 мл О,б -ной суспензии эритроцитов мыши и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Центрифугируют прн 200g 5 мин. Инкубируо ют при 12 С. 30 мин. Далее — так же, как в примере 1.

Пример 4 (контрольный). beрут 6 мл крови в пробирку, содержащую 0,6 мл раствора гепарина (200 ед. в мл), добавляют 2 мл З -ного раствора желатины, перемешивают и выдер О живают при 37 С 40 мин. Верхний слой собирают в центрифужную пробирку. Приливают среду Хенкса до объема ll мл, центрифугируют при

400g l0 мнн. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендпруют. Приливают 1 мл дистиллированной воды,выдерживают 15 с. Затем добавляют среду .Хенкса до 11 мл и центрифугируют при 200g 10 мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют, добавляя к нему 11 мл среды Хенкса и центрифугируют лри 200п 1О мин. Надосадочную жидкость сливают. Готовят суспензию клеток, содержащую 2 10

6 клеток в 1 мл среды 199. 0,1 мл полученной взвеси клеток- смешивают с

0,5 мл 0,4 -ной суспензии эритроцитов барана. В другой пробирке 0,1 мл взвеси клеток смешивают с 0,1 мл

1090409 личия при сравнении с группой здоровых более 99X). При исследовании этих же групп по прототипу различия между группами в большинстве случаев

5 были недостоверны, т, е, достоверность различия была менее 957.

Способ

Объект исследования

Предлàrаемый

Лимфоциты Нейтрофилы

Лимфоциты Нейтрофилы

Здоровые доноры (25 чел.)

РО с эритроцитами барана (Е-PO) 70,7+1,3 33,2+1,6 64,7+1,5 29,9+2,2

PO с эритроцитами мыши (M-PO) 16,5+1,0 12,6+1,3 14,8+0,9 9,9+1,1

Больные острой пневмонией (25 чел.)

Е-PO

24,3+1,6 (Р> 0,05) 69,9+1,7 (P ) О,О5) 26,3+1,5 (Р с 0,05) 79,1+1,5 (P(0,05) 8,2+1,3 (Р,> 0,05) 18,1+1,2 (P > 0,05) 8,4+1,2 (Р . 0,05) 2l 4+1,3 (P (0,05) М-PO

0,5Х.-ной суспензии эритроцитов мыши и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Смесь инкубируют при 37 С

5 мин, а затем центрифугируют при

200g 5 мин. Инкубируют при 12 С

60 мин. Осадки ресуспендируют, добавляя к ним .0,05 мл ЗТ-ного раствора глутарового альдегида, выдерживают 20 мин. Затем в пробирки наливают

8-10 мл дистиллированной воды, центри. о фугируют при 200g 5 мин, надосадочную жидкость сливают. Готовят мазки, сушат на воздухе. Препараты фиксируют в метаноле, окрашивают метиловым зеленым - пиронином, считают количество розеток на 100 клеток.

РО клетками периферической крови представлено в таблице.

Данные, приведенные в таблице, показывают, что предлагаемый способ по сравнению с прототипом более чувствителен к изменениям функционального состояния клеток у здоровых и больных. Это подтверждается тем, что при исследовании групп боль- ных предлагаемым способом возрастает. достоверность различия показателей, цолученных для групп больных в сравнении со здоровыми донорами. Так, нри исследовании групп больных ост- 30 рой пневмонией и раком гортани в сравнении с группой здоровых доноров предлагаемым способом достоверность различия почти всех показателей более 95Х (для Е-Ро нейтрофилов у боль-З5 ных раком гортани достоверность разТаким образом, повышение чувствительности подразумевает возможность четкого определения изменений функциональной активности клеток у больных в сравнении со здоровыми, а значит, более надежного определения иммунодефицитов или состояния повышенной функциональной активности. Такое повышение чувствительности способа дос тигается за счет более быстрого выделения клеток, на которое уходит 4050 мин вместо 80-90 мин.по прототипу, что уменьшает вероятность травмирова. ния клеток и способствует сохранению такого функционального состояния клеток, какое было в крови; уменьшение времени инкубации после центрифугирования с 60 (прототип) до 28-32 мин учитывает динамику РО : если клетки имеют нормальную функциональную активность (у здоровых),то РО завершается на 20-25 мин инкубации, далее количество розеток не изменяется. Если клетки имеют низкую функциональную активность, то PO проходит медленнее, за 60-90 мин, и инкубация в течение 28-32 мин позволяет более четко установить уменьшение функционапьной активности.

1090409

Продолжение таблицы

Объект нмсследования.Способ

Предлагаемы

Лимфоцнты Нейтрофилы

ЛимФоциты Нейтрофилы

15,1+1,9 (Р а О,оl) И-PO

7,3+1,3 (Р (0,05) . П.р и м е ч а н и е: P - достоверность различия средних значений показателей.в группах больных по сравнению с группой

4цоровьвс, полученная с использованием таблицы

Стьидента.

Составйтель Г.Крюкова

Техред С.Легеза Корректор, В.Бутяга

«Ю

Редактор Г. Гербер

Заказ 2976/7 Тираж 688 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР но делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауяская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Больные раком гортани (22 чел.)

Е-PO

55,6+1,2 (P а 0,05)

18, 4+1,2 (Р р 0,05) 60,2+1,2 (P > 0,05)

15,6+0,85 (Р о 0,05) 16,2+1,8 (Р (0,05)

6,5+1,0 (Р 0,05)