Способ обнаружения вируса гепатита @ и антител к нему

 

СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А И АНТИТЕЛ К НЕМУ путем проведения энзимоиммунологической реакции с использованием твердофазного носителя, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения его, в качестве твердофазного носителя используют полистироловые шарики, покрытые антителами к вирусу гепатита А и хранящиеся в 1-5%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в присутствии антибиотика широкого спектра действия при 4°С.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1076121

>пи А 61 К 39/12

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3436899/28-13 (22) 12. 05.82 (46) 28.02.84. Бюл. № 8 (72) М. К. Мамедов, М. С. Балаян и А. Г. Анджапаридзе (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (53) 615.375 (088.8) (56) 1. Mathiesen L. R. et al. Enzyme - linked immunosoraent assay for detection of

hepatitis. А antigen in stool and antiaogy

to pepatitis А antigen in sera. — J. Clin.

Microsiol, 1978, 7.2. р. 184-193. (54) (57) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А И АНТИТЕЛ К НЕМУ путем проведения энзимоиммунологической реакции с использованием твердофазного носителя, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения его, в качестве твердофазного носителя используют полистироловые шарики, покрытые антителами к вирусу гепатита А и хранящиеся в 1-5 /z-ном растворе бычьего сывороточ ного альбумина в присутствии антибиотика широкого спектра действия при 4 С.

1076121

Изобретение относится к эпидемиологии, преимущественно к способам диагностики вирусного гепатита.

Известен способ обнаружения вируса гепатита А и антител к этому вирусу с использованием твердых полимеров в качестве носителя антител к вирусу гепатита

А (1).

Однако известный способ является очень трудоемким и сложным при выполнении и требует значительных затрат времени (около

40 ч).

Цель изобретения — упрощение и ускорение способа.

Поставленная цель достигается тем, что, согласно способу обнаружения вируса гепатита А и антител к нему путем проведения энзимоиммунологической реакции с использованием твердофазного носителя, в качестве последнего используют полистероловые шарики, покрытые антителами к вирусу гепатита А и хранящиеся в 1-5О/o-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в присутствии антибиотика широкого спектра действия при 4 С.

Способ осуществляют следующим образом.

Полистироловые шарики (в количестве от нескольких десятков до нескольких сотен в зависимости от-объема предстоящего исследования) помещают в сосуд с сывороткой рекновалесцента гепатита А, содержащий антитела к вирусу А в достаточно высоком титре, в подобранном опытным путем оптимальном разведении. При этом раствор должен полностью покрывать все шарики.

В этом растворе шарики инкубируют 16 ч при 20 С, после чего их промывают 0,01 М раствором фосфатно-солевого буфера рН

7,4 в течение 3-5 мин и переносят их в сосуд с 1-5 /О-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в физиологическом растворе или 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4, содержащем 10 ед/мл канамицина или другого антибиотика широкого спектра действия. Сосуд плотно укупоривают и хранят в бытовом холодильнике при

4 С в течение 6 — 8 мес.

При необходимости шарики из раствора извлекают, однократно промывают 0,01 М

ФСБ и используют в качестве специфического иммуносорбента вируса гепатита А в энзимоиммуносорбентом методе обнаружения этого вируса или антител к нему.

Использование заранее покрытых антилелами к вирусу гепатита А полистироловых шариков, которые хранятся в 1-5 /о-ных растворах бычьего сывороточного альбумина, позволяет в 2 раза сократить продолжительность способа, а также упростить его, поскольку при этом отпадает необходимость специального покрытия шариков антителами и выдерживания их в растворе

55 бычьего сывороточного альбумина (последнее обеспечивает снижение неспецифических результатов способа) .

Пример. Обнаружение вируса гепатита

А (ВГА).

1-й этап — адсорбция анти-ВГА поверхностью полистироловых шариков и их длительное хранение с фиксированными к их поверхности анти-ВГА. Полистироловые шарики одинакового диаметра (5-7 мм) помещают в раствор сыворотки реконвалесцента гепатита А, содержащий анти-ВГА в достаточном титре. Цельную сыворотку разводят 0,01 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с рН 7,4. При этом оптимальное для адсорбции разведение сыворотки заранее подбирают опытным путем с помощью титрования ее в шахматном порядке. Шарики инкубируют в разведенной сыворотке при комнатной температуре (18-20 C) в течение 16-18 ч, после чего их трехкратно промывают в растворе 0,01 М ФСБ, содержащем 0,05 /о твина-20, трижды меняя раствор через 3-5 мин. Затем шарики извлекают из раствора 0,01 М ФСБ с 0,05 /О твина-20 (ФСБ-Тв), помещают в 1 /О-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на 0,01 М

ФСБ, содержащего в качестве консервантов пенициллин и стрептомицин в концентрации 5 ед/мл, и хранят в нем в укупоренных флаконах при 4 С в холодильнике в течение 3-4 мес. По мере необходимости шарики извлекают из указанного раствора и используют в качестве специфического иммуносорбента В ГА.

2-й этап — специфическая иммуносорбция ВГА из водной суспензии исследуемых фекалий.

Шарики, покрытые анти-ВГА, извлекают из 1 /q-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, где они хранились, промывают в течение 3 мин раствором ФСБ-Тв и помещают в пронумерованные стандартные стеклянные пробирки с внутренним диаметром 9 мм (по одному шарику в каждую пробирку). В пробирки вносят по 0,2 мл 10О/рной водной суспензии исследуемых на присутствие ВГА фекалий. Одновременно в одну из пробирок вносят 0,2 мл 10 /о-ной водной суспензии фекалий, содержащих В ГА (контроль «положительных фекалий), а во вторую — 0,2 мл 10О/o-ной водной суспензии фекалий, не содержащих ВГА (контроль «отрицательных» фекалий) . В пробирках с суспензиями фекалий шарики инкубируют при комнатной температуре 1618 ч, после чего суспензии фекалий из пробирок отсасывают пастеровской пипеткой, а в пробирки вносят по 0,5 мл раствора ФСБ

Тв и промывают в нем шарики 10-15 мин.

Трижды меняя раствор через каждые 3-5 мин.

Затем раствор ФСБ-Тв тщательно отсасывают.

1076121

3-й этап — выявление комплексов антиВГА-ВГА, фиксированных на поверхности полистироловых шариков.

Анти-ВГА, меченные пероксидазой хрена альдегидным методом, используют в виде раствора в 0,01 М ФСБ, в разведениях от 1:100 до 1:600, в зависимости от содержания связанных с периксидазой анти-ВГА.

В полученный раствор меченных анти-ВГА добавляют 2,5О/р нормальной сыворотки человека, не содержащей анти-ВГА, для устранения ложноположительных результатов.

В пробирки с шариками, обработанными соответствующими суспензиями фекалий, вносят по 0,2 мл раствора меченных антиВГА и инкубируют шарики в этом растворе при комнатной температуре 2 ч. Затем раствор меченных анти-ВГА из пробирок отсасывают, а шарики промывают: в пробирки вносят по 0,5 мл раствора ФСБ-Тв, который дважды меняют сразу, после чего шарики промывают в течение 15 мин, трижды меняя раствор через каждые 5 мин. В конце промывки раствор ФСБ-Тв тщательно отсасывают, чтобы обеспечить быстрое высыхание шариков.

Наличие специфического присоединения меченных анти-ВГА к ВГА, фиксированному к твердой фазе, определяют путем обработки поверхности шариков раствором о-фенилендиамина, являющегося субстратом пероксидазы. Во все приборы с высушенными шариками вносят по 0,2 мл 0,04О/оного раствора о-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0) с добавлением 0,2О/о перекиси водорода и инкубируют шарики в этом растворе в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего во все пробирки вносят по 0,1 мл

2 М раствора серной или соляной кислот для остановки ферментативного окисления о-фенилендиамина и фиксации значений экстинкций растворов субстратов исследуемых образцов и контролей.

Затем по очереди все пробирки помещают в гнездо штатива. В соседнее гнездо помещают пробирки с эталонными растворами 2,3-диаминофеназина с известными значениями экстинкций. Сравнивая интенсивность окраски раствора субстрата учитываемого образца с эталонными растворами в проходящем свете и подбирая пробирки с эталонными растворами, добиваются того, чтобы интенсивность окраски раствора субстрата учитываемого образца была визуально неотличима от интенсивности раствора в одной из эталонных пробирок. Экстинкцию раствора субстрата учитываемого образца считают равной экстинкции эталонного раствора, находящегося в указанной пробирке, подобранной визуальным сравнением.

Ю

Аналогично сравнивают интенсивности окраски раствора субстрата всех исследуе5

35 мых и двух контрольных образцов, определяя для каждого из них величину экстинкции. Результаты записывают, а затем вычисляют отношение экстинкции раствора субстрата каждого исследуемого образца к экстинкции раствора субстрата контрольного, отрицательного образца фекалий. Те образцы, для которых указанное отношение превышает 2,1, считая положительными, т.е. содержащими ВГА.

Обнаружение антител к вирусу гепатита А.

Предварительно из каждой исследуемой сыворотки готовят два разведения на 0,01

М ФСБ — 1:20 и 1:200.

1-й этап осуществляют так же, как и при обнаружении ВГА. При покрытии поверхности шариков анти-ВГА два шарика используют для исследования каждой сыворотки (по одному шарику на два разведения исследуемой сыворотки), а два шарика — на соответствующие контроли.

2-й этап. Шарики, покрытые анти-ВГА, извлекают из 1 /о-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, где они хранились, промывают в течение 3 мин раствором

ФСБ-Тв и помещают в пронумерованные пробирки, куда вносят по 0,2 мл 10О/о-ной водной суспензии фекалий, содержащих ВГА, инкубируют при комнатной температуре

16-18 ч. Затем суспензии фекалий из пробирок отсасывают, а шарики промывают: в пробирки вносят по 0,5 мл раствора ФСБТв и трижды меняют его через каждые 35 мин, после чего раствор тшательно отсасывают.

По 0,2 мл из обоих разведений каждой из исследуемых сывороток вносят в отдельные пробирки и инкубируют в них парики при 37 С 2 ч. Одновременно с этим в одну из пробирок вместо разведенной сыворотки вносят 0,2 мл чистого раствора 0,01 м ФСБ (контроль «положительных» фекалий), а в другую — 0,2 мл сыворотки, не содержащей анти-ВГА, в разведении 1:20 (контроль

«отрицательной» сыворотки). По истечении времени инкубации растворы из всех пробирок отсасывают, а в пробирки вносят по

0,5 мл раствора ФСБ-Тв, в котором шарики трижды промывают по 3-5 мин каждый раз, после чего раствор удаляют.

3 и этап осуществляют так же, как и при обнаружении ВГА: во все пробирки с шариками вносят.по 0,2 мл раствора меченных анти-ВГА и инкубируют в нем шарики при комнатной температуре 2 ч, после чего шарики 5 раз промывают раствором ФСБТв и сушат на воздухе. Затем в пробирки вносят по 0,2 мл 0,04О/о-ного раствора о-фенилендиамина и помещают пробирки в темноту на 30 мин при комнатной температуре, после чего в каждую пробирку вносят по

0,1 мл раствора 2 М серной или соляной кислоты.

1076121

Визуальный учет результатов осуществляют сравнением интенсивности окраски растворов субстрата всех исследуемых образцов, а также обоих контролей, как и согласно способу обнаружения ВГА, с набором эталонных растворов. Установленные экстинкции растворов субстрата всех обследуемых и контрольных образцов записывают. Экстинкцию раствора субстрата контрольного образца (контроль «отрицательной» сыворотки) принимают за 100О/о связывания меченных анти-ВГА с ВГА, фиксированным к твердой фазе. Вычисляют проценты связывания меченных анти-ВГА с фиксированным ВГА, исходя из экстинкций растворов субстрата парных образцов исследуемой сыворотки, каждый из которых обрабатывали двумя соответствующими разведениями этой сыворотки (1:20 и 1:200).

Затем путем интерполяции вычисляют титр сыворотки, в котором она обеспечивает

50О/р-ное блокирование процесса связывания меченных анти-ВГА с фиксированным

ВГА.

Например, при исследовании неизвестной сыворотки в разведениях 1:20 и 1:200 получили следующие величины экстинкций растворов субстрата: контрольного образца (контроль «отрицательной» сыворотки)

0,9; образцов, обработанных исследуемой сывороткой в разведениях 1:20 и 1:200, соответственно 0,2 и 0,5. Принимая экстинкцию 0,9 за 100О/о, вычисляют проценты связывания для обоих образцов, которые соответственно равны 22,2 и 55,5 /р связывания меченных анти-ВГА с фиксированным ВГА.

Интерполируя, получают значение титра исследуемой сыворотки 1:130.

Приготовление набора эталонных растворов 2,3-диаминофеназина с известными значениями оптической плотности.

Готовят исходный раствор 2,3-диаминофеназина . В 15,0 мл 0,04 /О-ного раствора о-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0) вносят 30 мкл ЗОО/р-ного раствора перекиси водорода и 0,5 мг пероксидазы хрена и инкубируют 1 ч на свету при комнатной температуре, после чего в полученный окрашенный раствор вносят

7,5 мл 2 М раствора серной кислоты.

Из исходного раствора готовят серийные разведения в 0,66 М растворе серной кислоты в цитратно-фосфатном буфере от

1:1 до 1:1024. Фотометрируя эти растворы при длине волны 492 нм, строят калибровочную кривую зависимости величины экстинкции от разведения исходного раствора.

Исходя из полученной калибровочной кривой готовят разведение исходного раствора

2,3-диаминофеназина со значениями экстинкций от 0,1 до 1,5 (всего 15 растворов) . Каждый из полученных растворов фотометрируют при длине волн 492 нм для контроля

25 зо

55 величины экстинкций полученных разведений исходного раствора. Каждый из полученных растворов разливают по 0,4 мл в стеклянные пробирки с внутренним диаметром 9 мм и запаивают над пламенем спиртовки.

Отмывание поверхности полистироловых шариков, использованных в энзимоиммуносортентном способе обнаружения ВГА и анти-ВГА.

Использованные шарики, трижды промытые дистиллированной водой, помещают в плоскодонную колбу с 1 /О-ным раствором додецилсульфата натрия в дистиллированной воде (объем раствора рассчитывают исходя из того, что на промывание 1 шарика расходуется 5 мл раствора). Колбу с раствором, в который погружены шарики, несколько раз встряхивают, после чего раствор сливают. Эту процедуру повторяют 3 раза. Раствор меняют. В свежем растворе додецилсульфата натрия шарики инкубируют при комнатной температуре в течение

24 ч. Шарики извлекают из колбы, трижды промывают дистиллированной водой в течение 15 мин, после чего ополаскивают дистиллированной водой 10 — 15 раз, меняя каждый раз воду в колбе. Затем шарики извлекают из колбы, помещают на фильтровальную бумагу и сушат на воздухе. Высушенные шарики могут использоваться в качестве твердой фазы.

Предлагаемый способ обнаружения ВГА и анти-ВГА прост в исполнении и может быть осуществлен на базе неспециализированной типовой вирусологической лаборатории (например, санэпидстанции) одним исполнителем. Полистиролевые шарики широко используются в качестве сырьевого материала в производстве многих пластмассовых изделий и являются дешевым и общедоступным продуктом, не требующим специального изготовления. Кроме того, возможность полностью отмывать поверхность использованных при энзимоимму носорбентном способе шариков от иммунных комплексов с помощью доступного детергента позволяет использовать такие шарики неоднократно.

Способ не требует использования дорогих микропипеток, так как рабочие объемы реагентов, относительно велики и могут быть получены с помощью стеклянных градуированных пипеток для шприцев объемами

1,0 мл. Стеклянные пробирки диаметром

9 мм выпускаются промышленностью и используются во многих лабораториях биологического и медицинского профиля.

Объективный визуальный учет результатов исследования с помощью предлагаемого способа позволяет обходиться без спектрофотометра и использовать способ в неспециализированных лабораториях практического профиля в непосредственной бли1076121

Составитель П. Бонарцев

Техред И. Верес Корректор И. Муска

Тираж 688 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент>, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор Н. Безродная

Заказ 575/6 зости от очагов инфекции. При этом точность, обеспечиваемая визуальным учетом результатов, сопоставима с точностью известного способа и достаточна для объективной оценки данных, получаемых в полевых условиях.

Возможность длительного (6-8 мес/ хранения в бытовом холодильнике полистироловых шариков, покрытых анти-ВГА, позволяет одновременно покрывать антителами значительные количества шариков, заготов1О ляя их впрок, транспортировать и использовать их в качестве специфического иммуносорбента ВГА .в условиях неспециализированной лаборатории или даже вне ее, в полевых условиях. Это сокращает затраты времени на 16-18 ч на осуществление способа в момент самого исследования, что весьма важно в условиях эпидемиологических исследований вспышек вирусного гепатита

А и необходимости быстрой разработки рациональной тактики борьбы с инфекцией.

Кроме того, процесс хранения шариков, покрытых анти-ВГА, в растворе бычьего сывороточного альбумина сам по себе обеспечивает устранение части неспецифических результатов, исключая необходимость выдерживания покрытых анти-ВГА шариков в растворе бычьего сывороточного альбумина в течение 2 ч, как это предусматривается известным энзимоиммуносорбентным способом, что, соответственно, сокращает время, затрачиваемое на все исследование.

Все это не только сокращает время исследования, но и существенно методически упро. щает его.

Предлагаемый способ обнаружения ВГА может использоваться не только для исследования фекалий, но и для исследования на наличие ВГА объектов внешней среды и продуктов питания, что имеет немаловажное значение при эпидемиологическом анализе вспышек гепатита А и выяснении путей передачи этой инфекции.

Принцип предлагаемого способа может стать методической основой для разработки аналогичных способов обнаружения других вирусов и антител к этим вирусам.

Таким образом, предлагаемый способ обнаружения ВГА и анти-ВГА по сравнению с известным является более простым, быстрым и дешевым.