Способ исследования молока на содержание жира и белка

 

1. СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛОКА НА СОДЕРЖАНИЕ ЖИРА И БЕЛКА, предусматривающий отбор пробы, экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива цп9 получения цветного комплекса d белком, его последующее фотоколориметрирование и установление значения оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуемой пробе, отличаюти и ся тем, что, с целью повьшения точности и обеспечения возможности одновременного определения содержания в исследуемой пробе углеводов, органический растворитель добавляют к отобранной пробе в соотношении 90:1, затем удаляют осажденный белок из обезжиренного раствора и вводят в йоследний воду для получения водноорганической смеси с последунщим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жирон и углеводаьт путем .введения реактивов соответствеино в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определяют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и углеводов в исследуемой пробе. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что в качестве органического растворителя использ пот 00 смесь Фолча, а в качестве реактивов ;о для получения цветных комплексов с СП белком, жиром и углеводами - соответственно биуретовый, сульфофосфо05 ванилиновый и антроновый реактивы.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ ц М е

РЕСПУБЛИН

9516 А (19) (11) (р G 01 N 33/04

- ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3407370/28-13 (22) 05.03 .82 (46) 30.04.84. Бюл. Р 16 (72) В.Ю.Домбровский, В.С.Данильчик, В.П.Панферов.и Л.А.Василевская (71) Белорусский государственный институт усовершенствования врачей и Белорусский научно-исследовательский институт охраны материнства и детства (53) 637.127.6(088.8) (56) 1. Методические рекомандации по лабораторному исследованию женского молока. Киев, "Наука", 1979, с. 7-11.

2. Авторское свидетельство СССР

Ф 412549, кл. G 01 И 33/04, 1981.

/ (54) (57) 1; СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛОКА HA СОДЕРЖАНИЕ ЖИРА И БЕЛКА, предусматривающий отбор пробы, экстракЦию из нее жира органическим растворителем, введение в обеэжиренный раствор химического реактива для получения цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметрирование и установление значения оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуе мой пробе, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и обеспечения возможности одновременного определения содержания в исследуемой пробе углеводов, органический растворитель добавляют к отобранной пробе в соотношении 90: 1, затем удаляют осажденный белок иэ обезжиренного раствора и вводят в последний воду для получения водноорганической смеси с последующим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жиром и углеводами путем введения реактивов соответственно в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определяют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и уг- . леводов в исследуемой пробе.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ н и с я тем, что в качестве органического растворителя используют смесь Фолча, а в качестве реактивов для получения цветных комплексов с белком, жиром и углеводами — соответственно биуретовый, сульфофосфовайилиновьэи и антроновый реактивы.

1 10895

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к способам исследования состава женского молока.

Известны способы определения бел5 ка, жира и углеводов в молоке, предусматривающие определение белка в альбуминометре или с помощью метода

Кьельдаля, определение жира бутирометрически или путем центрифугирования, определение углеводов путем титрования раствором Бенедикта (1 3.

Недостатком указанных способов является их невысокая сПецифичность и точность, значительная трудоемкость и необходимость в относительно большом количестве молока (5-20 мл), причем каждый нутриент определяется в отдельной пробе молока. Это делает невозможным исследование состава женского молока указанными способами в клинико-диагностических .г лабораториях лечебно-профилактических учреждений.

Поскольку количество материала (женского молока), которое можно взять для исследования без ущерба для ребенка, ограничено, особенно в первые дни лактации из-за малого количества образующегося молока.

Известен также способ исследования молока на содержание жира и белка, предусматривающий отбор пробы,экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива для получения цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметрирование и установление значения оптической плотности, про4О порциональной количесву. белка в исследуемой пробе (23.

Недостатками такого способа являются неполная экстракция жира спиртово-эфирной смесью и недостаточная точность его определения весовым

45 методом в сочетании со значительными затратами времени, а также невысокая специфичность химических реакций для определения белка и лактозы, что значительно снижает точность и

50 г †достовернос определения.

Цель изобретения — повышение точности определения белка и жира в

1 одной пробе молока с одновременным ! определением в этой же пробе содержания углеводов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу исследова16 2

""я молока на содержание жира и белка, предусматривающему отбор пробы, экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива для поЛучения цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметривание и установление значения оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуемой пробе, органический„ растворитель добавляют к отобранной пробе в соотношении 90: 1, затем удаляют осажденный белок из обезжиренного раствора и вводят в последний воду. для получения водноорганической смеси с последующим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жиром и углеводами путем введения реактивов соответственно в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определяют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и углеводов в исследуемой пробе.

Кроме того, в качестве органического растворителя используют смесь

Фолча, а в качестве реактивов для получения цветных комплексов с белком, жиром и углеводами — соответственно биуретовый, сульфофосфова- нилиновый и антроновый реактивы.

Для осаждения белка и одновременного полного извлечения жира и углеводов из молока применяется смесь

Фолча (хлороформ:метанол = 2:1), которую добавляют к исследуемой пробе молока в соотношении 90: 1, полученную смесь встряхивают и центрифугируют, в результате чего образуется белковый осадок и супернатант, содержащий жир и углеводы, который отделяют от,осадка путем добавления воды разделяют на водную и органическую фазы, содержащие, соответственно, углеводы и жир. Смесь Фолча и молоко смешивают в соотношении 90!1, поскольку установлено (табл. 1), что при уменьшении количества смеси

Фолча не происходит полного осаждения белка и полной экстракции жира (углеводы экстрагируются полностью), а при увеличении количества смеси

Фолча, наряду с полным осаждением

Наличие белка, жира и углеводов в осадке и супернатанте при различном соотношении смеси Фолча и молока приведено в таблице 1.

1089516 белка и полной экстракцией жира, наступает нежелательное разведение супернатанта с уменьшением концентрации в нем жира и углеводов.

Таблица 1

Соотношение смеси Фолча и молока

Осадок

Супернатант жир углеводы белок белок углеводы жир

70:1

75:1

80:1

85:1

90:1

95:1

100: 1

105: 1

110:1

Примечание. Наличие белка, жира и углеводов в осадке и супернатанте определяют: белка — биуретовым методом, жира — сульфофосфованилиновым методом, углеводов — с антроновым реактивом; "+" — данный компонент в пробе присутствует; "-" — данный компонент в пробе отсутствует.

К полученному осадку белка добав- 40 ляют биуретовый реактив, к отобранному образцу водной фазы вЂ, антроновый реактив, к отобранному и выпаренному досуха образцу органической фазы серную кислоту и фосфованилиновый 45 реактив. Оптическую плотность полученных при этом цветных комплексок измеряют на фотоэлектроколориметре

На фиг. 1, 2 и 3 показаны графики, зависимости измеренной величины 50 оптической плотности от содержания соответственно белка, жира и углеводов. !

Для определения количества белка, жира и углеводов в исследуемой про- 55 бе молока используют калибровочные кривые, построенные на основании определения указанных нутриентов в эталонных .растворах: для белка — в растворе альбумина с содержанием его 5, 10, 15, 20, 25, 30 г/л фиг.1), для жира — в растворе триолеина с содержанием его 10, 20, 30, 40, 50, 60 г/л (фиг. 2) для углеводов — в растворе лактозы с концентрациями

10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 г/л (фиг ° 3) ., Реактивы, необходимые для осуществления предлагаемого способа.

1 ° Смесь Фолча (хлороформ:метанол = 2:1), 2. Биуретовый реактив: O — 4,5 г сегнетовой соли (KNaC+H O )растворяют в 40 мп 0,2 н. NaOH, после чего прибавляют 1,5 г Си$0 ° 5Н О и.

0,5 г КХ; раствор доливают до 100 мл

0,2 н. NaOH, хранят в темном месте;

0,2

54, 7

О, 190

0,115

О, 040

О, 155

21,0

О, 205

0, 120

О, 070

0,163

58,8

О, 235

0,215

О, 250

33,1

12,3

53,8.

7,1

62,5

44,6

16,7

67 5

0,270

51,8

0 180

23 6

О 230

Примечание. Величины С (концентрации белка, жира и углеводов) определены по соответствующим калибровочным кривым (фиг. 1, 2 и 3), по осям ординат которых отложены величины оптической плотности

Е, а по, осям абсцисс — концентрации определяемых веществ.

S 1089 реактив устойчив в течение 1 мес;

b - -0,5Х раствор K3: в 0,2 í. NaOH.

Реактив устойчив 2 недели.

Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл реактива смешивают с

80 мл реактива о . Хранят в темноте.

Реактив устойчив 2 недели.

3, Серная кислота, концентрированная по Савалю.

4. Фосфованилиновый реактив: 1 ч 1р

0,67-ного водного раствора ванилина смешивают с 4 ч. концентрированной ортофосфорной кислоты. Смесь хранят

I в посуде из темного стекла при комнатной- температуре . 15

5. Антроновый реактив: к 34 мл воды приливают 66 мл серной кислоты уд.в. 1,84 охлаждают, добавляют

50 мг антрона и 1 г тиомочевины, перемешивают, нагревают .до 80,© С. Реак-2б тив устойчив 2 недели в холодильнике в темной бутылке.

Пример. В пробирку, содержащую 4,5 мл смеси Фолча, приливают

0,05 мп молока, тщательно встряхивают в течение 1 мин, центрифугнруют при скорости 3000 об/мин в течение

5 мин и супернатант количественно сливают в чистую пробирку. К осадку добавляют 1 мл биуретового реактива, тщательно перемешивают на вихревом смесителе в течение 1 мин и оставляют на 30 мин при комнатной температуре для развития реакции и образования комплекса сине-фиолетового

35 цвета,- после чего проводят фотометрию против биуретового реактива на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре в кювете с толщиной

516 а рабочего слоя 10 мм. В пробирку с супернатантом добавляют 1,5 мл дистиллированной воды, тщательно встряхивают в течение 1 мин и центрифугируют 5 мин при скорости

1000 об/мин для расслоения на 2 фазы — водную (верхнюю) и органическую (ннжнюю). В водной фазе определяют содержание углеводов. К 0,2 мп водной фазы прибавляют 2,3 мл антронового реактива, перемешивают, ставят на 15 мин в водчную баню с температурой воды 100 С, охлаждают и колориметрируют на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре в кювете с.толщиной рабочего слоя

5 мм. В органической фазе определяют содержание жира. 0,2 мл органической фазы переносят в чистую обезжиренную пробирку, выпаривают досуха при 80 С, добавляют 0,45 мл концентрированной серной кислоты, тщательно встряхивают пробирку, помещают в кипящую водяную баню на

20 мин, после чего охлаждают, добавляют 1,75 мл фосфованилинового реактива, тщательно перемешивают и через 1 ч колориметрируют на фотозлектроколориметре при зеленрм- светофильтре в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мм . Фотометрию проб при определении жира и углеводов проводят против контрольных проб, которые обрабатывают так же, как и опытные, только вместо 0,05 мл молока берут

0,05 мл воды.

Примеры определения белка, жира и углеводов в пробах молока приводятся в табл. 2..

Таблица. 2

7 1

По сравнению с известным предлагаемый способ позволяет повысить .точность определения белка, жира и, углеводов за счет применения смеси фолча, полнее экстрагирующей жир, чем спиртовоэфирная смесь, .и исполь-. зования высокоспецифичных химических

089536 реакций для определения белка, жира и углеводов, кроме того, количество молока, необходимое для определения белка, жира и углеводов, S уменьшено в 40 раз, а время определения сокращено в 3 ра1089516

С г/я

0А

ОИЮ

0048

«1>

УНИИПИ Заказ 2926/42 ТиРан 823 Подпнсное идно ППП патент", г. Унгород,ул.Проектная, 4