Способ получения вакцины таежного весенне-летнего энцефалитного вируса

ОП ИСАНИ

ИЗОБРЕТЕН И

Союз Соавтсиик

Социапистичвскик

Рвспубпин

738

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту( (22) Заявлено 21.12.79(21) 2854825/2 (23) Приоритет — (32) 22.12.78 (31) А9220/78 (33) Австрия

Опубликовано 07.03. 83.Бюллетень %

К 39/12

Гасударственный кеантет

СССР во девам нэееретеннй н отнрытий

15.372

88.8) Дата опубликования описания 07.0 г .! . & !

HHoCtpBHHbI

I франц Хайнц, Кристиан Кунц, Йоханн/ФаумЫ.И,::Отто Шварц,! (Австрия)!

Иностранная фирма

Иммуно АГ фюр Хемиш-мецицинише Продукте" (Австрия) (72) Авторы изобретения (7I) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ TAE)KHOIO

ВЕСЕННЕ-ЛЕТНЕГО ЭНЦЕФАЛИТНОГO ВИРУСА

Изобретение относится к произвоц ству вакцин.

Известен способ получения вакцины таежного весенне-летнего энцефалитного вируса путем культивирования вируса в культуре ткани или в суспензии эмбриональных клеток птиц с послецуюшим от делением вируссодержашей жидкости центрифугированием, инактивацией вируса и получением целевого продукта (1).

Однако известный способ не обеспечивает высокой чистоты целевого процукта.

Целью изобретения является повыше- д ние чистоты целевого продукта.

Поставленная цель цостигается тем, что при осушествлении способа получения вакцины таежного весенне-летнего энце- . фалитного вируса путем культивирования рО вируса в культуре ткани или в суспензии ,эмбриональных клеток птиц, с последую; »

; шим отделением вируссоцержашей жицкос ти центрифугированием, инактивацией вируса и получением целевого продукта вируссоцержашую жидкость инактиви1. формалином или бета-пропиолактоном, затем обрабатывают протаминсульфатом, очистку осушествляют при непрерывном центрифугировании с градиентом. плотноо ти сахавозы or 0 цо 50%, отбирают фракции, имеюшие повышенную экстинкцию при 260 нм и соцеркашие частицы с константой сециментации в области .

2006 и полученные фракции разводят буферным раствором, преимушвственно ,фосфатным буферным раствором рН 7,6.

Кроме гого, с целью стабилизации целевого продукта фракции разводят буферным раствором, соцержашим O,1% человеческого альбумина.

Способ осушествляют слецуюшим об» разом.

Эмбриональные клетки кур суспенци

1руют в среде культуры клеток ТСМ 199 (Т1М06 СИkure %Едали 199}, инфициру ют вирусом и держат в суспейзии при аэробных условиях при температуре в прв» делах 25-38 С в течение 1-5 дней.

3 1003138 4

3агем клегки и осгагки клеток огделяюг повышенную, а фракпия 11 максимальную путем центрифугирования. Полученную экстинкдию. В этой фракции находятся суспензию вируса инактивируюг с по» < почти исключигельно частицы вируса с мощью формалина или Р -пропиолактона константой седиментации 200 5 беэ и после этого концентрируют путем ультра- . седименгируюших заметно быстрее или фильтрации. Стадии инакгивапии и конпен- медленнее чем вирус примесей. Пик сотрирования можно также проводить в об- ответствуег конпентрапии сахароэы 39%. ратной последовательности. Суспензия Другой пик у фракции номер 25, coom наряду с ТВЛЭ-вирусом содержит paa- ветствуккпий концентрации сахароэы меличные примеси, которые седнментируюг ЗФ иее чем 10%, указывает иа наличие причасгично быстрее или медленнее чем „месей,которые отбрасываются. На диаТВЛЭ-вирус. Предпочтительно отделяют грамме наглядно показано относительное быстрее седименгируюшие части путем протективное действие (определенное в осаждения с помощью протаминсульфата, прямом опыте защиты мышей) отдельных прежде чем осуществляют собственный iy фракций с помощью различной высоты конепрерывный способ ульграпенгрифугирова пони. Фракция 11, следовательно, имеет .. ния с распределением градиентов плогноо., самое высокое относительное защитное ти. действие.

Способ, в частности, осуществляют Собранные содержащие вирус фракиии таким образом, что в роторе ультрадентри-рй теперь предпочтительно разбавляют буфефуги, наполненном расгвором буфера, ром, содержащим человеческий альбумин целесообРазно раствором фосфагного буфе- для того, чтобы улучшить стабильность ра, при 3000 оборотов в минуту полови» вирусангигена, и затем обычным спосо на буферного yacrsopa вытесняется 50%- бом перерабатывают далее в вакцины. ным раствором сахарозы, и образуется уу Полученные вакцины имеют более высоблагодаря этому градиент плотности кую чистоту и лучше переносятся челове0 0% сахарозы После этого суспензия, ком, чем препараты, изготовленные обыч» содержащей вирус, дают стечь через ро- ным способом.

rop при скорости вращения рогора 35000 В таблице приведены. сравнительные оборотов s минуту со скоростью, исге- 3Е результаты переносимости препаратов, чения предпочтигельно 3 л/ч. При выб»- полученных известным и предложенным ранных условиях большая часть вирусных способами, причем в первой граф npsseчастиц входит в градиенты плотности. цены реакции с вакцинами, изгоговленныКак только весь материал прошел аппарат, ми известным способом, а во второй пенгрифугируюг еще один час причем графе - реакции с вакцинами, полученныУ

33 опновременно дают протекать раствору ми преДложенным спосОбом. В случае прифосфатного буфера. Затем осторожно про- вивок с помощью полученных согласно водят ротор в состояние Ifonog и содер- . изобретению вакцин не могли наблюдатьжимое его разделяют на отдельные фрак» ся никакие нежелательные Реакции - « дни. После этого в каждой фракции опре- локальные, ни системные.

Яеляют экстинкцию при 260 нм и одно- ные реакции ни локальные, нн систем временно устанавливают содержание са ные. харозы во фракции. Локализация вируса Полученные согласно предложенному в градиентах плотности делается воэмож» способу вакцины отличаются неэначитель ной благодаря его экстинкцин при 260нм. ным содержанием протеина, не принимая

43

Вирус связывается в области при содер- во внимание добавленный человеческий жанни сахарозы примерно 40% н обуслав. альбумин. Это содержание протеина при пинает здесь отчетливое увеличение эко- равном антигеняом действии во много чянкдии при 26О нм. раз (по меньшей мере в 10) меныпе, чем в случае до сих пор применяемых

Йа чертеже представлена диаграмма ® препаратов. этой зависимости откуда видна экстинкцн Пример,. Суспенэию эмбриональ» отдельных фракций по отношению к гра ных клеток кур в ТСМ 199 (ТЭ380Е. диенгам плотности. Градиент плотности культу ч:реда) инфицяруюг ТВЛЭ-Виру раствора оахароэы составляет 0-50%. сом. После выдержки в течение 4 cyr

Шгрихпунктирная кривая показывает рао- ® при 33 С содержащую вирус суспенэню пределение экстинкцни щж 260 нм в o - собирают и йентрнфугированием щк дельных фракциях. В области около 40% 3000 г в течение 1S мнн при 4 C ow сахарозы фракции 10, 11 и 12 имеют деляют клетки.

38 4 .ся распрецеленяе, показанное на циагрепмме. Пиковые фракции 10,11 и 12 с

-концентрацией сахара около 40% объеци няюг и разбавляют цо 1:10 фосфагным буферным солевым раствором при значении рН 7,6, в котором содержится 0,1% человеческого альбумина, Защитную активность полученного пре аложенным способОм rtpenapara определяют в прямом защитном опыте на мьпиах.

Подвергаемый исследованию препарат разбавляют (1:3;1:9 1:27; 1:81; 1:243) и смешивают с 0,2% гицроокиси алюминия, примененной в качестве срецсгва, усили» ваюшего действие црепарага. При приме» ненни в каждом случае 0,2 мл указанных разбавленных растворов 2 раза с проме» жутком в 1 неделю подкожно иммунизируют по 10 мышей .(весом примерно по

10 г). Через цве последующие недели, мышей инфицнруюг 100-1000 U)qo

ТВЛЭ-вирусом и рассчитывают защитную цозуЬЭ .по мегоцу Рида и Мкнха после наблюдения.в течение 3 недель.

При этом защитную дозу ;Ь р опре» деляюг при разбавлении l:30.

Локальная боль, %

Qo 72 36

Общие реакции (головная боль, усталосгь),%

llo 64

Повышенная температура тела (объем) %.

37,3-38оС

38-39 С .Выше 39 С

До 68Jlo 36

llo 27

Qo 9

19

14

S 10037

К полученной суспензии вируса прибавляют формалин в гаком количестве, чтобы конечное раз{ валенке составляло

1:2000, и затем суспенэию вьшерживаюгs течение 30 мин при 37 С и 48 ч при комнатной температуре.

Затем инактивироваиную суспензию вируса смешивают с 0,5 мг/л протамиисуль- фата и смесь выдерживают в течение ночи при 4 С. Образовавшийся осадок отделяют 1й посредством цеитрифугироваиия при

10000 г в течение 30 мии при 4 С. о

Предварительно обработанная указанным способом суспензия прецставляег собой . исходный материал для непрерывного ультраценгрифугирования в грациенге плотности, Суспензию вируса со скоростью noro» ка 3 л/ч пропускают с помощью насоса через центрифугу, в которой в качестве сахарозного градиента плотности содержится 0-50% сахароэы в фосфагном бу» ферном солевом растворе при рН 7,6.

Обьем составляет 4,5 л, время цент» рифугирования 1,5 ч. После остановки центрифуги содержимое ротора выкачива юг и при этом разделяют на 16 фракций по 100 мл. Для каждой отдельной фракции определяют экстинкцию при 260 им на спектрофотометре и удельную плотность, рЕ на пефрактомегре. При этом наблюдаетПредложенный способ позволяет ловы сить чистоту и стабильность вакцины таежного весенне-летнего энцефалигно о, вируса.

260лщ/1рууру

Составитель C. Малютина

Рецактор Л; Алексеенко Техред A.Áâáêíåö

Корректор С, Шекмар

Заказ 1598/49 Тираж 711

RHHHHH Госуцарсгвенного комитета СССР

IIo целам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., ц. 4/5

Попписное

Филиал ППП Патент, r. Ужт ороц, ул. Проектная, 4.7 1003738 8 ф о р M у л а и з о б р е т е н и я; or 0 ао 50%, отбирают фракции, имею1. Способ получения вакцины таежного шие повышенную экстинкцию при 260нм весенне-летнего энцефалигного вируса и соцержашие частицы с консгантой путем культивирования вируса в культуре сециментации в области 2006 и полученгкани или в суспензия эмбриональных > ные фракции развоцят буферным раствором, клеток птиц, с послецуюшим огцелением преимушесгвенно фосфагным буферным виРУссоцеРжашей жипкосги ценгРифУгйРо- .раствором рН 7 6 ванием, инактивацией вируса и получе- 2. Способ пс. и. 1, о т л и ч а юнием целевого продукта, î r л и ч а ю - ш и и с я тем, что, с целью сгабилизашийся тем, что, с целью повышения gO ции целевого продукта, фракции развоцяг чистоты целевого процукта, вируссоцержа- .буферным раствором, соцержашим 0,1% шую жипкость инакгивируюг формалином человеческого альбумина.

Юли бета-пропиолак ВНОМ, затем обраба» Источники информации, тываюг протаминсульфатом, очистку осу- принятые во внимание при экспергизе шесгвляют при непрерывном ценгрифугиро->> 1. Патент Великобритании ванин с грациенгом плотности сахарозы l4 1453035, кл. А 53, 1977.