Способ разделения нуклеиновых кислот

 

СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОИЛХ КИСЛОТ путем их центрифугирования в градией- ё плотности CsCl, отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности процесса, нуклеиновые кислоты помещают в средний слой трехслойного градиента плотности Csci, в котором равные объемы нижнего и верхнего слоев превышают в 1-10 раз объем среднего слоя, плотность которого равна среднему арифметическому плотностей нижнего и верхнего слоев, различающихся на 0,20-0,35 г/см , и является промежуточной между плотностями разделяемых нуклеиновых кислот или равной одной из них, и цент- § рифугирование ведут при 40000 (Л 50000 об/мин.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

Э(Я) С 07 Н 21 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3390590/23-04 (22) 05.02.82 (46) 07.10.83. Бюл. Р 37 (72) M.M.Áàáûêèí и В.В.Зинченко (71) Иосковский ордена. Ленина-, ордена Октябрьской Революции и ордена

Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В.Ломоносова (53) 547.455,07(088,8) (56) 1. Meselson М., ЯСап1 F.W., Vinograd J. Equilibrium sedimentation of тасгово1еси1ев in density

gradients Ргос. Natl Acad. Sci

USA  > 43, 581-588, 1957 °

2. Griffith О,М. Rapid d.ensity

gradient centrifugation using Short

column Сechnigues. Anal.Biochem,90, 435-443, 19Т8, 3> Brunk C,F, Leick V, Rapid equilibrium isopycnic CsC1 gradients.

Biochim. Biophys. Acta,179, 136

144, 1969 (прототип}...SU„„1046249 А (54}(557) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНО-

ВЫХ КИСЛОТ путем их центрифугирования в градиейте плотности CsC1, отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности процесса, нуклеиновые кислоты помещают в средний слой трехслойного градиента плотности Cscl, в котором равные объемы нижнего и верхнего слоев превышают в 1-10 раэ объем среднего слоя, плотность которого равна среднему арифметическому плотностей нижнего и верхнего слоев, различающихся на 0,20-0, 35 г/см 3, и является промежуточной между плотностями разделяемых нуклеиновых кислот или равной одной из них, и цент- @ рифугирование ведут при 40000

50000 об/мин.

1046249 эанные с этим большие затраты электроэнергии и рабочего времени центрифуг.

15

Способ Соотношение объемов слое Время разделения, ч

;,)

ДНК M.radiodurans Хромосомная и мин В.subtilis тохондриальная ДНК

3 02033 0

4,5!0:4,5

Известный

13

Предлагаемый

2,5.1,0:1!1,0

4,0т1:4,0

10:1:10

2,0

2,0

В табл. 2 приведено разделение

ДНК и рибонуклеиновых кислот (PHK ) °

Как видно из табл. 2 отделение ДНК от РНК в предлагаемом способе идет в Зтб раза быстрее, чем в известном.

Т а б л и ц а 2

Способ Соотношение объемоВ слоев Время разделения, ч

3,5:0:3,5

Известный

ПредлагаеМНА

3,0:1:3,0

Изобретение относится к области разделения и очистки биологических макромолекул, таких как нукленновые кислоты (HK), и может быть применено в биохимии, генетике, молекулярной биологии, микробиологии и.медицинской промышленности.

Известен способ разделения НК путем центрифугирования смеси растВОра ХЛОрйатОГО цЕЗИя CsC1 И HK В течение 48-60 ч Г1).

Известен также способ разделения НК путем центрифугирования .смеси раствора CsCL и НК, заполняющей центрифужную пробирку наполовину, в течение 16 ч (.27.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ разделения НК путем центрифугирования НК, помещанных „в верхний или нижний слой двуслойного

ГрадИЕНта ПЛОтНОСтИ CsC1 .С СООтНОшением .объемов 1:1 и разницей плотностей нижнего и верхнего слоев

0,35 г/см 3 при 40000 об/мин в теченйе 12-18 ч ГЗ 3

Недостатком известных способов является длительность процесса и свя"

Ыз табл. 1 видно, что разделение различных ДНК по плавучей плотности в предлагаемом способе идет в 4 - 6 раэ быстрее, чем в невест-5 иом.

Целью изобретения является ускорение процесса и снижение связанных с ним затрат электроэнергии и рабочего времени цеитрифуг.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу разделения НК последние помещают в средний слой трехслойного градиента плотности CSC1 в. котором равные объемы нижнего и верхнего слоев превышают в

1-10 раэ объем среднего слоя, плотность которого равна среднему арифметическому плотностей нижнего н верхнего слоев, различающихся на

0,20-0,35 г/см Э, и является промежуточной между плотностями разделяемых НК или равной одной из них, и центрифугирование ведут при 4000050000 об/мин, Разделение НК осуществляется эа

2-5 ч.

Разделение дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) различной плавучей плотности в двухслойном и трехслойном градиентах CsC1 приведено в табл. 1.

Таблица 1

1046249

Составитель Г.Коннова

Техред И.Метелева Корректор A.Ïîâõ

Редактор А.Шишкина

Заказ 7649/22 Тираж 387 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35,.Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", Г.ужгород, ул.Проектная, 4

II р и м е р 1. В центрифужную пробирку помещают 2,0 мл раство.ра CsCl плотностью 1,881 г/ñì3. ДНК

Micrococcus radiodurans с плавучей плотностью 1,728 г/см и ДНК Bacillus subtilis с плавучей плотностью

1,708 г/смЗ растворяют в 2,0 мп раствора Cscl плотностью 1,718 г/см3 и наслаивают на нижний раствор, после чего наслаивают 2 0 мл раствора СяС1 плотностью 1,556 г/смз, Пробирку помещают в угловой ротор и центрифугируют при 40000 об/мин, Время разделения ДНК составляет

2 5 ч. В результате получают полное разделение полос ДНК.

Пример 2. В центрифужную пробирку помещают 4 мл раствора CsCl плотностью 1,818 г/см >. ДНК M.radiodurans с плавучей плотностью

1,728 г/см и ДНК В.subtilis с плавучей плотностью 1,708 г/см 3 растворяют в 1,0 мп раствора cscl плотностью 1,718 г/см з и наслаивают на нижний раствор, после цего наслаивают 4,0 мл раствора СяС1 плотностью 1,618 г/сМ . Пробирку помещают в угловой ротор и центрифугируют при 50000 об/мин. Время разделения

ДНК составляет 2 ч. В результате получают полное разделение полос ДНК

Пример 3. B центрифужную пробирку помещают 3,0 мл раствора CsCl плотностью 1,854 г/см >, Хромосомную и.митохондриальную ДНК Sacсharomyces cerevisiae с плавучимн плотностями 1,698 и 1,685 г/смЗ, соответственно, растворяют в 0,3.мл раствора CsCl плотностью 1,692 г/см3 .и наслайвают на нижний раствор, после чего наслаивают 3,0 мл раствора Сяс1 плотностью 1,530 г/см 3.

Пробирку помещают в угловой ротор и центрифугируют при 42000 об/мин, Время разделения хромосомной и митоIp хондриальной ДНК составляет 4 ч. В результате получают полное разделение полос ДНК.

II р и м е р 4. В центрифужную г пробирку помещают 3 0 мл раствора сяС1 плотностью 1,883 г/см3. НК

ДНК и РНК, плотность которых превышает максимальную плотность градиента CsCl, выделенные из В.subtilis, растворяют в 1,0 .мп раствора СяС1 плотностью 1,708 г/см 3, равной плавучей плотности ДНК, и наслаивают на нижний раствор, после чего наслайвают 3,0 мл раствора CsCl плотностью 1,533 г/см з. Пробирку помещают . в угловой ротор и центрифугируют при 42000 об/мин. Время разделения ДНК и PHK составляет 5 ч. В результате получают полное отделение

ДНК от PHK.

ЗО Предлагаемый способ является более быстрым и сокращает расходы электроэнергии и рабочее время центрифуг (центрифугирование 2-5 ч).