Флуориметрический способ определения тиосоединений

 

ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОСОЕДИНЕНИЙ в нейтральной среде, включающий измерение степени тушения дхпуоресценции флуоресцеиндимеркуриацетата (ФДМА) при его реакции с тиосоединением, отличающийся тем, что, с целью расширения класса определяемых тиосоединений , как водорастворимых, таки растворимых в органических растворителях , смешиваю1чихся с водой, одновременного определения концентрации класса тиосоединений и расстояния между атомами серы в случае дитиолов, реакцию ФДМА с тиосоединением проводят при концентрации ФДМА 10 1 о моль/л, степень тушения флуорес (Л С ценции ФДМА измеряют сравнивая флуоресценцию ФДМА с флуоресценцией в пробах, в которые добавляют тиосоединение в мольном соотношении от S 0,05 до 5 ФДМА, строят зависимость степени тушения флуоресценции от объема прибавленного соединения и по точке эквивалентности, соответствующей излому в указанной зависимости, Ю СО определяют концентрацию и судят о классе тиосоединений и расстоянии v между атомами серы в дитиолах. N3

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

2 (19) ()1) (51) 4 1 1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

О ф - «1 р г: о .:., -

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ -, „".:,13

М АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

БЙБЛНОТЕИ (21) 3345649/18-25 (22) 29.09.81 (46) 30.09.87. Бюл. 1(- 36 (71) Отделение Института химической физики АН СССР (72) Е.В.Попко, Л.А.Сырцова

-и Г.И.Лихтенштейн (53) 535.37(088.8) (56) Hoyer P.D. Spectrophotometric

investigation of react,ions of protein

sulfhydril groups vith organic mercury compounds J. Am. С)ш. Soc 1954, v. 76, р. 4331-4336.

Торчинский N.N. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков. — М.

"Наука", 1971, с. 229.

Karush F., à.o An. Assay Method

for Disulfide Groups by Fluorescence

Qunchung. "Analyt. Biochem". 19649

v. 9, р. 100-114.

Миронов Г.П. и др. Чувствительный флуориметрический метод определения SH u S-S групп при их совместном присутствии. Вопросы медицинской химии, 1971, т. 17, с. 83-88. (54)(57) ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОСОЕДИНЕНИЙ в нейтральной среде, включающий измерение степени тушения флуоресценции флуоресцеиндимеркуриацетата (ФДМА) при его реакции с тиосоединением, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью расширения класса определяемых тиосоединений, как водорастворимых, так и растворимых в органических растворителях, смешивающихся с водой, одновременного определения концентрации класса тиосоединений и расстояния между атомами серы в случае дитиолов, реакцию ФДМА с тиосоединением проводят при концентрации ФДМА 10—

10 моль/л, степень тушения флуоресценции ФДМА измеряют сравнивая флуоресценцию ФДМА с флуоресценцией в пробах, в которые добавляют тиосоецинение и мольном соотношении от

0 05 до 5 ФДМА, строят зависимость степени тушения флуоресценции.от объема прибавленного соединения и по точке эквивалентности, соответствующей излому в укаэанной зависимости, определяют концентрацию и судят о классе тиосоединений и расстоянии между атомами серы в дитиолах.

1 1029723 2

Изобретение относится к области его реакции с дисульфидами в, щелочаналитической химии, преимуществен- ной среде. За реакцию тушения ответно аналитической биохимии, и может ственно, в частности, образование быть использовано как экспресс-ана- ковалентной связи между ртутью и атолиз в лабораторных и производственных - мами серы. Степень тушения связывают условиях для определения концентрации с количеством дисульфидных групп, растворимых в воде или растворителях, Недостатки этого способа следуюсмешивающихся с водой, сульфидов, ор- щие: возможность определения этим ганических тиолов дитиолов дисуль- способом только концентрации дисуль9

10 фидов, а также одновременно для от- фидов в белках, т.к. калибровочная несения анализируемого тиосоединения зависимость рассчитана только на это; к одному из перечисленных классов и невозможность выполнения количестэпределения расстояния между атомами венных измерений в присутствии тушасеры в растворе в случае дитиолов. щих флуоресценцию ФДМА примесей К

В аналитической химии и биохимии недостаткам этого способа относится часто ставится задача определения также проведение реакции в сильно класса и количественного содержания щелочной среде, что способствует осперечисленных тиосоединений, Однако, вобождению в белках каких-то дополнисуществующие до настоящего времени тельных групп, которые тушат флуорес20 способы трудоемки, не позволяют сде- ценцию и мешает точному количественлать различие между этими классами ному определению дисульфидов. тиосоединений и в ряде случаев не- Все перечисленные способы не попригодны при анализе этих соединений. зволяют дифференцировать классы тиоИзвестен спектрофотометрический ., соединений и определять расстояние с. 5 способ Бойера, основанный на измере- между атомами серы в случае дитиолов. нии прироста оптической плотности в Ближайшим к изобретению по суй области 250-255 нм,который происхо- ности и достигаемому эффекту являетдит при присоединении п-меркурибензо- ся флуориметрический способ опредеата к SH-группам. ления тиосоединений в нейтральной

Недостатками этого способа явля- среде, включающий измерение степени ется: невозможность определения тио- тушения флуоресценции флуоресцеиндилов, сильно поглощающих при 250- . меркуриацетата (ФДМА) при его реак255 нм невозможность применения в ции с тиосоединением. Способ основан присутствии примесей (например, N-ме- на измерении тушения флуоресценции тилформамида), поглощающих при 35 ФДМА при его реакции с монотиолом

250 нм; невозможность определения при рН 7,4. За реакцию тушения ответтиосоединений при концентрации их ме- ственно образование ковалентной свя.-5 нее -3 10 И, зи между ртутью и атомами серы. По-.

Известен также амперометрический данному способу при рН 14 определяспособ, основанный на измерении ион- 0 ют также дисульфиды или смесь диной проводимости в электрохимической сульфидов с монотиолами. ячейке раствора тиола, титруемого По указанному способу для опредераствором AgN0,.когда все SH-групп Р ления концентрации монотиолов в стек(-, 6 . пы блокируются, в растворе появляют- лянный стакан вносят 1,5 мл 1 10 1; ся свободные ионы металла и, как 45 раствора ФДМА, 0,1 — 1,5 мл исследуемоследствие, диффузионный ток., ro образца, 1,5 мл 0,05 М трис-HClЧувствительность способа — 0,1- буфера (для создания рН 7,4). Конеч1 мкмоля тиосоединения. К недостат- ный объем доводят до 4,5 мл бидискам этого способа относятся невысо- тиллированной водой. Параллельно стакая чувствительность и способность яп вят контрольную пробу, в которой меркаптидов серебра дополнительно объем образца компенсируют водой. связывать ионы Ар с образованием После инкубации в течение 15-20 мин

+ комплексов типа t.(RS-Ag)Ag ) . Обра- по интенсивности тушения флуоресцензование таких комплексов объясняет ции при рН 7,4 определяют количество завышенные результаты при титровании g SH-групп по калибровочной кривой. Кацистеина и других соединений. либровочная кривая строится по восИзвестен способ, основанный на становленному глутатиону в параллельизмерении тушения флуоресценции флу- ных пробах при повышении мольного сооресцеин димеркуриацетата (ФДМА) при отношения глутатиона и ФДМА от 0 до з 10

1. Максимальная относительная ошибка:

2-4Х.

Недостатками прототипа являются: невозможность определения концентрации дитиолов и сульфидов, так как калибровочная кривая, рассчитана только на анализ монотиолов, невозможность определения по этому способу класса тиосоединения, а также расстояния между атомами серы дитиола в растворе. Реакция проводится только в водной среде, анализ монотиолов— не по методу параллельных проб, а по единичной точке.

Определение концентрации тиосоединений в одной пробе при отношении монотиола к ФДМА, меньшем 1, является серьезным недостатком способа, так как вид калибровочной кривой зависит от класса тиосоединения, и при анализе тиосоединений неизвестного класса (монотиолы, дитиолы. сульфиды) нельзя определить концентрацию, Цель изобретения — расширение класса определяемых тиосоединений, как водорастворимых, так и растворимых в органических растворителях, смешивающихся с водой, одновременное определение концентрации тиосоединений и определение расстояния между атомами серы в случае дитиолов.

Поставленная цель достигается тем, что при флуориметрическом определении тиосоединений в нейтральной среде способом, включающим измерение степени тушения флуоресценции флуоресцеиндимеркуриацетата (ФДМА) при

его реакции с тиосоединениями, реакцию ФДИА с тиосоединением проводят при концентрации ФДИА 10 -10 4 моль/л, степень тушения. флуоресценции ФДИА измеряют, сравнивая флуоресценцию

ФДМА с флуоресценцией в пробах, в кбторые добавляют тиосоединение в мольном соотношении от 0 05 до 5 к ФОКА, строят зависимость степени тушения флуоресценции от объема прибавленного соединения и по точке эквивалентности, соответствующей излому в указанной зависимости, определяют концентрацию и судят о классе тиосоединений и расстоянии между атомами серы в дитиолах.

Способ осуществляют следующим образом. ФДМА растворяют в 1,5 мл

0,01 и. раствора NaOH в воде, прибавляют для нейтрализации 1,5 мл 0,5 И (моль/л)фосфатного буфера рН 7,0, 29723 4 флуоресценции. Тушение флуоресценции и в том, и в другом случае оценивают по уменьшению интенсивности флуоресценции в точке максимума флуоресценции. Строят график зависимости степени тушения (/) от объема (мл) тиосоединения в пробе. Степень тушения (X). рассчитывают по формуле

40

6.100Х, Х где Х вЂ” интенсивность флуоресценции

ФДИА в контроле (проба У 1); интенсивность; флуоресценции в опытной пробе (пробы

11 2-10);

Точка эквивалентности соответствует излому зависимости степени тушения флуоресценции от объема тиосоединения в пробе.

Концентрацию тиосоединения в точке эквивалентности определяют по формуле: t Т1 V,=(ФДИА1 V, где t Zl u (ФДИА1- — молярные концентрации тиосоединения и ФД4А соответственно;

V u V — объемы (мл) тиосоединения и ФДМА соответственно.

55 фильтруют полученный раствор. Разводят раствор ФДИА до 10 M 0,05 M фос" фатным буфером рН 7,0. В 10 пробирок разливают ФДМА (по 0,3 мл в каждую пробирку), раствор тиосоединения в

0,05 И фосфатном буфере прибавляют в пробирки Р 2-10 возрастающими дозами: например, начиная с 0;05 или 0 .0,1 мл и увеличивая объем дозы на 0,1 мл — от 0,1 меля до 3-5 молей тиосоединения на моль ФДМА. Затем доводят объем раствора в пробирках

М 1-10 до 3 мл 0,05 M фосфатным буфером рН 7;О, и через 15-20 мин записывают спектр флуоресценции ФДИА на спектрофлуориметре (например, Aminco-Bowman) при возбуждении

450 нм.

В случае тиосоединений, не раст20 воримых в воде и растворимых в органических растворителях, смешивающихся с водой (например, в спирте или

N-метилформамиде), после прибавления тиосоединения в этом растворителе в пробирки М 2-10 во все пробирки (М 1-10) прибавляют этот раствори" тель до его объема в пробирке М 10 затем доводят общий объем в пробирках М 1-10 до 3 мл 0,05 M фосфатным буфером рН 7,0 и записывают спектр

5 10297

На фиг. 1-9 изображены зависимости степени тушения флуоресценции от объема тиосоединений (фиг . 1-5, 7-9) и от расстояния между атомами серы в дитиолах (фиг, 6).

Так.как анализируемые тиосоединения нестойки при хранении в растворе в присутствии воздуха, то в случае примеров h- 1-6, 9-11 концентрацию исходного анализируемого тиосоединения определяли параллельно по методу Бойера. Поэтому на фиг. 1-5, 7-9 для большей наглядности отложены не мл тиосоединения, а отношение молярной концентрации тиосоединения, определенной по методу Бойера, к молярной концентрации ФДМА. На оси ординат отложена степень тушения в X. Стрелками показаны точки эквивалентности.

Пример 1 (фиг. 1). Определение концентрации сульфида Иа.

Кристаллы Na S gHгО марки х.ч. высушивали в течейие суток в вакуумэксикаторе над NaOH. Непосредственно перед анализом готовили 10 M раствор .Иа Б в 0,05 M фосфатном буфере рН 7,2. Определение концентрации проводили как описано в методике, но при рН 7,2 и в 8 параллельных пробах.

На фиг. 1 (ФДМА)=10 М; (11а Б) — молярная концентрация Na Б. г

Пример 2 (фиг. 2). Определение концентрации монотиола — восстановленного глутатиона, Восстановленный глутатион фирмы !

1 1 I

Beonal хроматографически гомогенный хранили в вакуумированном сосуде на холоде. Непосредственно перед анализом готовили 10 М раствор глутатиона в 0,05 М фосфатном буфере рН

7,0. Определение концентрации прово40 дили, как описано в методике при рН 7,0, но в 12 параллельных пробах.

На фиг. 2 (Ф КА)=10 М; СГТ) — молярная концентрация глутатиона.

Пример (фиг. 3). Определение концентрации монотиола-2-меркаптоэтанола в присутствии этилового спирта.

2-Меркаптоэтанол фирмы "Fluka"

98% чистоты (d =1,115) разводили этиловым спиртом до концентрации

Д

10 М. Определение концентрации проводили, как описано в методике, в присутствии этилового спирта, в 8 параллельных пробах, но использовали

0,05 M фосфатный буфер gH 6,7.

На фиг. 3 (ФДМА)=10 М; 1 МЗ) — молярная концентрация меркаптоэтанола.

23 6

g р и м е р 4 (фиг. 4),Ог ределение концентрации дитиола — дитиотреитола.

Дитиотреитол фирмы "Serva" растворяли в 0,05 M фосфатном буфере рН

7,0. Определение концентрации проводили как описано в методике при рН

7,0. На фиг. 4 4 ФДМА1=1(1 М; (ДТТ)— молярная концентрация дитиотреитола.

Пример 5. (фиг. 5). Определение концентрации дитиола — дигидролипоевой кислоты в присутствии этилового спирта.

Использовали 10 M раствор дигид-4 ролипоевой кислоты в спирте, приготовленный в атмосфере Ar. В связи с легкостью окисления дигидролипоевой кислоты во время отбора проб пипеткой через раствор пропускали Ar. Определение концентрации проводили, как описано в методике, в присутствии этилового спирта, но использовали

0,05 M фосфатный буфер рН 6„7. На фиг. 5 l 6>JQA)=10 М; (ДГЛК) — молярная концентрация дигидролипоевой кислоты.

Пример б. Определение концентрации дисульфида — липоевой кислоты.

Концентрацию раствора липоевой кислоты фирмы "Fiuka" определяли после ее восстановления в дигидролипоевую кислоту боргидридом натрия. Определение концентрации дигидролипоевой кислоты проводили, как описано в примере 5 (фиг„ 5). Получена зависимость, аналогичная фиг. 5.

Пример 7. Определение концентрации дитиола-дитиотреитола в присутствии N-метилформамида.

Определение концентрации дитиотреитола проводили, как описано в примере 5, но вместо этилового спирта использовали N-метилформамид. Получена зависимость, аналогичная фиг. 4.

Пример 8 (фиг. 6). Определение -класса тиосоединений, и в случае дитиолов — расстояния между атомами серы в растворе.

По данным примеров 1-5, повторенных 3 раза, нашли, что каждому классу тиосоединений соответствует в точке эквивалентности определенная степень тушения флуоресценции 10 M

ФДМА. В случае сульфидов степень тушения флуоресценции 10 М ФДМА в точке эквивалентности составляет 85-95Х; монотиолов 45-55%, дитиолов 65-80Х.

По данным примеров 1-5, повторенных 3 раза, построили график зависи23 8 между атомами серы в растворе больше, чем в случае дитиотреитола, имеющего

4 СН -группы, которые могут присоединить 2 молекулы ФДИА в свернутой конформации. Калибровочные зависимости, аналогичные фиг. 6 можно сделать для всей области концентраций ФДМА, при которой возможно определение концентрации (10 -1О М}.Однако, как будет. показано ниже в примерах 9-11 нужно учитывать, что предельное тушение зависит не только от класса тиосоединения, но и от концентрации

ФДИА в точке эквивалентности.

Пример 9 (фиг. 7). Определение концентрации восстановленного глутатиона при концентрации ФДМА

10 И.

Определение концентрации проводили, как описано в примере 2 (фиг. 2), в фосфатном буфере 0,05 И рН 7,0 в

11 параллельных пробах за тем исключением, что во всех точках концентрации ФДМА и глутатиона были в 10 раз меньше. Сплошная линия на фиг. 7 измерения сделаны через 15 мин после смешивания; прерывистая линия — через-4 ч. Из фиг. 7 видно, что и при этой концентрации ФДМА реакция доходит до конца и за 15 мин: через 4 ч наблюдается не дополнительное тушение, а некоторое возгорание флуоресценции. На фиг. 7 (ФДМА3=10 6 И; (ГТ 1 — молярная концентрация глутатиона. Видно, что точка эквивалентности в этом случае выявляется хуже, чем в случае 10 N ФДИА (пример 2).

Тушение в точке эквивалентности в этом случае меньше, чем при 10 М

-5

ФДМА (пример 2) .

Пример 1О (фиг. 8). Определение концентрации восстановленного глутатиона при концентрации ФДИА

10 И.

Определение концентрации восстановленного глутатиона проводили, как описано в примере 2 (фиг. 2), в фосфатном буфере рН 7,0, в 8 параллельных пробах, но во всех точках концентрации ФДМА и глутатиона были в

100 раз меньше. - На фиг. 8 ГФДИАЗ=

=10 И; 1 ГТ1 — молярная концентрация глутатиона. Сплошная линия измерения сделаны через 15 мин после смешивания; прерывистая линия — через 4 ч.

На оси ординат отложен процент остаточной флуоресценции:

I — ; 100, I

7 10297 мости средней из 3 опытов степени тушения в точке эквивалентности от расстояния в растворе между атомами серы о в точках присоединения ФДИА, в А (фиг. 6). Цифры возле точек на фиг.6. соответствуют следующим тиосоединениям: 1 — сульфид натрия; 2 — дитиотреитол; 3 — дигидролипоевая кислота; 4, 5 — монотиолы — восстановленный-глутатион и меркаптоэтанол. Pac- fp стояние между атомами серы (в точках присоединения ФДМА) в растворе в дитиотреитоле и дигидролипоевой кисло те, модифицированных ФДМА, равны о о соответственно 4 А и 4,5 А, определили из их моделей по Стюарту-Бриглебу. В случае На Я на фиг. 6 отлоо жено расстояние (1,6 А) между точками присоединения ФДИА к Na S, определенное также из модели по СтюартуБриглебу. Из фиг. 6 видно, что при о расстоянии более 9,5 А между атомами серы в растворе дополнительного по сравнению с монотиолами (точки 4, 5) тушения наблюдаться не будет.

По фиг. 6 можно определять расстояние между атомами серы дитиолов в растворе, если оно не превышает

9,5 А. В основе этого определения лежит обнаруженное в данной работе уменьшение квантового выхода ФДМА (т.е. уменьшение интенсивности флуоресценции) за счет взаимодействия молекул ФДМА, связанных сульфидом или дитиолом, видимо, в результате возможно изменение квантового выхода флуоресценции за счет образования пары молекул ФДМА. Параллельно с уменьшением интенсивности флуоресценции ФДМА при реакции с сульфидом или дитиолом происходит смещение мак40 симума флуоресценции ФДИА от 520 нм на несколько нм в сторону коротких волн; параллельно происходит уменьшение интенсивности и изменение формы линии в спектре поглощения ФДМА.

Известно, что алифатические соеди. нения легко принимают в растворе свернутую конформацию, и расстояние между атомами серы в растворе будет определяться легкостью сворачивания молекулы. Это наглядно проявляется в случае дитиотреитола и дигидролипоевой кислоты. Последняя, имея лишь

3 СН. — группы между атомами серы, судя по модели по Стюарту-Бриглебу, не может присоединить 2 молекулы

ФДМА в свернутой конформации, и в случае этого соединения расстояние

9 10 (ФДИА 1=10 М; (ГТ3 — молярная .концентрация глутатиона. На фиг. 8 видно, что в этом случае практически невозможно установить точку эквивалентности. Предельное тушение в этом случае

-5 меньше, чем при 10 N ФДИА (пример 2) и 10 М ФДИА (пример 9).

Пример 11 (фиг. 9). Определение концентрации дитиола — дитиотреитола при концентрации ФДИА 10 М, Определение концентрации дитиотреитола проводили так, как описано в примере 5, но использовали фосфатный буфер 0,05 М рН 7,2 и концентрации ФДИА и дитиотреитола были в

10 раз больше во всех точках. 11а фиг. 9 (ФДИА.1=10 И; (ДТТ1 — молярная концентрация дитиотреитола.

На фиг. 9 видно, что при этой концентрации можно проводить определение. Однако нужно учесть, что при этом будут расходоваться большие количества ФДИА и тиосоединений, что менее экономично, чем при проведе-5 нии титрования при 10 М (с этим связано малое количество точек).

Предельное тушение в этом случае больше, чем при 10 М (пример 5).

При рН выше 7,2 или ниже б,7 во всех случаях реакция тиосоединения с

ФДИА проходит не полностью из-за частичного гидролиза при этих рН об.разующейся связи серы со ртутью, что приводит к ошибкам при определении -. концентрации тиосоединений.

29723 10

Описываемый способ имеет следующие преимущества: способ прост в выполнении, высокопроизводителен, не требует сложных методов расчета и аппаратуры для идентификации тиосоединений и может быть рекомендован в . качестве экспресс-метода для широкого применения в лабораторных и производственных условиях. Применение

10 способа может ускорить решение научных вопросов, связанных с идентифика цией и количественным анализом тиосоединений, играющих важную роль в биохимии; способ более информативен по сравнению с существующими, так как позволяет по одним и тем же параллельным пробам получить величину концентрации, определить класс тиосоединений и в случае дитиола, определить расстояние между атомами серы, и таким образом исключает применение нескольких независимых методов для определения концентрации, класса тиосоединений и расстояния между атомами

25 серы в дитиоле, способ позволяет определять сульфиды, монотиолы, дитиолы, дисульфиды, способ позволяет использовать в качестве растворителя и воду, и органические растворители, сме+ шивающиеся с водой, на основании пп.

1-5 видно, что способ дешевле в 3-4 раза по сравнению с существующими способами, проведение которых требует нескольких независимых анализов.

1029723

1029723 гтрк:еФ ма

Фиа 7

Я Ъ

Ъ

%э

Р 3

Е Г тЗ:E@gtlfA3

Фиг. д

Дтт): ФдМ) Составитель

Редактор Н.Сильнягина Техред И.Попович Корректор Л.Патай

Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 3-35, Раутпская наб., д, 4/5

Заказ 4451

Производственно-полиграфическое предприятие, r, Ужгород, ул. Проектная, 4