Биосенсор для определения диэтилентриаминпентауксусной кислоты и ее комплексов с ионами металлов

Полезная модель относится к области охраны окружающей среды, а именно к устройствам для определения полиаминополикарбоксильных кислот. Предложен биосенсор для определения диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА) и ее комплексов с ионами Mg²⁺, Mn ²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, включающий кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395.

Полезная модель относится к области охраны окружающей среды, а именно, к устройствам для определения полиаминополикарбоксильных кислот. Диэтилентриаминпентаацетат (ДТПА)

занимает особое место среди хелатообразующих соединений. ДТПА-пятиосновная кислота, имеющая строение тройного бетаина. Представляет интерес комплексообразующие свойства ДТПА, являющейся одним из наиболее универсальных органических лигандов. В терапевтической практике ДТПА используется в виде натрий-кальциевой соли (Na₃Ca - ДТПА). ДТПА может использоваться для разделения близких по свойствам элементов (редких, редкоземельных и трансурановых) [Цирульникова Н.В., Демина Н.П., Литвинова Т.В., Темкина В.Я. Диэтилентираминпентауксусная кислота и ее применение// Химическая промышленность 1977. 6. С. 23-26]. ДТПА применяют при обработке отложений сульфида железа [Патент Великобритании 2004/003856 (10.09.2004)]. Кроме того, благодаря способности образовывать водорастворимые комплексы с двух- и трехвалентными металлами, ДТПА может использоваться при дезактивации ядерных реакторов. В настоящее время для переработки облученного ядерного топлива различных типов энергетических реакторов как в России, так и за рубежом используется Пурекс-процесс, в котором в качестве стабилизатора в растворы вводят комплексообразователь - диэтилентриаминпентаацетат (ДТПА) [Мелентьев А.Б., Машкин А.Н., Тугарина О.В., Колупаев Д.Н., Герман К.Э., Тананаев И.Г. Влияние комплексообразующих реагентов (ДТПА и щавелевой кислоты) на экстракционное поведение технеция в системе «ТБФ - HNO₃ - N ₂H₅NO₃» // Радиохимия - 2011. - Т. 53, 2, - С. 150-154. Герман К.Э., Мелентьев А.Б., Зубавичус Я.В., Калмыков C.H., Ширяев А.А., Тананаев И.Г. Синтез, исследование структуры и свойств новых малорастворимых комплексных соединений технеция с диэтилентриаминпентауксусной кислотой // Радиохимия. 2011. Т. 53. 2. С. 155-161]. Закономерен интерес исследователей к мониторингу ДТП А в водной среде.

Известны два хроматографических метода определения ДТПА в воде: газовая хроматография (ГХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ). Метод ГХ требует сложной и время-затратной пробоподготовки (получение производных). Метод ВЭЖХ быстрее по сравнению с методом ГХ [С. Randt, R. Wittlinger, and W. Merz. Analysis of nitrilotriacetic acid (NTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) in water, particularly waste water // Fresenius J Anal Chem. 1993. V. 346. Р. 728-731]. Известен спектрофотометрический метод определения ДТПА [Sunil Kamboj, Deepak Sharma, Anroop В Nair, Suman Bala,Rakesh Kumar Sharma,Vinod Kumar, Javed AH, Pramod К and S.H. Ansari. A simple and sensitive spectrophotometric method for estimation of diethylene triamine penta acetic acid (DTPA) in topical gel formulations // Der Pharmacia Lettre. 2011. V. 3. 3. P. 23-28. Laine , Matilainen R. Simultaneous determination of DTP A, EDTA, and NTA by UV-visible spectrometry and HPLC. Anal Bioanal Chem. 2005. V. 382. 7. P. 1601-1609]. Кроме того, известен метод определения ДТПА с использованием капиллярного электрофореза [Laamanen PL, Mali A, Matilainen R Simultaneous determination of DTPA, EDTA, and NTA by capillary electrophoresis after complexation with copper // Anal Bioanal Chem. 2005. V. 381. 6 P. 1264-1271]. Все перечисленные методы требуют дорогостоящего стационарного оборудования.

Ранее было показано, что существуют бактерии Chelativorans oligotrophicus LPM-4, способные деградировать тетраацетат (ЭДТА) с потреблением молекулярного кислорода. На основе этих бактерий создан амперометрический биосенсор для определения этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и ее комплексов с ионами Ba²⁺, Mg²⁺, Ca ²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺ [Решетилов А.Н., Кувичкина Т.Н., Капарулина Е.Н., Доронина Н.Н. Биосенсор для определения этилендиаминтетрауксусной кислоты и ее комплексов с ионами металлов // Бюллетень изобретений полезных моделей. 2011. 16. С. 1133-1134. Патент РФ на полезную модель 105292. Заявка 2010152768. Зарегистрировано 10.06.2011]. Штамм LPM-4 выделен из очистных сооружений г. Пущино и отнесен к новому роду и виду Chelativorans oligotrophicus LPM-4 sp. nov. (типовой штамм LPM-4 ^T=BKM B-2395T=BKM B-2445^T=DSM 19276^T ) [Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Badratdinova D.N., Yudina E.I., Minkevich I.G., Vainshtein M.B. EDTA-dependent assimilation of glucose and organic acids by an EDTA-degrading bacterium //Apll. Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 77. 6. P. 1367-1370].

Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель - создание устройства для определения диэтилентриаминпентауксусной кислоты и ее комплексов с металлами, простого по конструкции и эксплуатации.

Технический результат, который может быть получен при использовании полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержания ДТПА без использования сложного стационарного дорогостоящего оборудования.

Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения ДТПА включает кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные клетки (ИмК) штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395 на носителе.

Биосенсор для определения ДТПА включает кислородный электрод Кларка 1, на котором размещен биорецептор 2, содержащий на носителе ИмК штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395 с помощью фиксатора 3. Измерения проводят с помощью гальваностата-потенциостата IPC-Micro (ООО «Кронас», Россия), интегрированного с персональным компьютером. Регистрируемым параметром является максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/мин), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потребленного кислорода.

Нижний предел определения ДТПА 0,5 мМ; операционная стабильность - 3 суток, продолжительность анализа - 20 мин, ошибка измерения - 8%. На фиг. 1 представлена схема биосенсора для определения ДТПА. На фиг. 2 представлены градуировочные кривые биосенсора на основе ИмК штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395 для определения ДТПА (А) и Mg-ДТПА (Б). На рис. 3 представлены градуировочные кривые биосенсора на основе ИмК штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395 для определения комплексов с ионами металлов 4-го периода Периодической системы Mn-ДТПА (В), Co-ДТПА (Г), Ni-ДТПА (Д).

Для создания биорецептора используют штамм Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395. Штамм Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395 выращивают первоначально на агаризованной среде состава (г/л): MgSO₄7H₂O - 1,0; KH₂PO₄ - 0,26; CaCl₂2H₂O - 0,40; Na₂HPO₄12H₂O - 0,63; ЭДТА - 1,0. Микроэлементы (мг/л): FeCl₃4H₂O - 1,5; H₃BO3 - 0,06; MnCl ₂*4H₂O - 0,1; CoCl₂6H₂O - 0,12; ZnCl₂ - 0,07; NiCl ₂6H₂O - 0,025; CuCl₂2H₂O - 0,015; Na₂MoO₄ - 0,025; агар - 20,0. Витамины (мг/л): пиридоксинHCl - 0,1; тиаминHCl - 0,05; рибофлавин - 0,05; никотиновая кислота - 0,05; кальция пантотенат - 0,05; P-аминобензойная кислота - 0,05; липоевая кислота - 0,05; никотинамид - 0,05; витамин B₁₂ - 0,05; биотин - 0,02; фолиевая кислота - 0,02. Витамины и микроэлементы готовят в виде концентрированных стерильных растворов и добавляют в среду в количестве 1 и 2 мл/л, соответственно. Для получения биомассы культивирование бактерий проводят в жидкой среде того же состава (pH 7,0) в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 200 мл питательной среды на качалке 150 об/мин при температуре 29°C.

Культуральную жидкость, взятую в конце экспоненциальной фазы роста штамма, центрифугируют при 5000g в течение 20 мин., дважды промывают 30 мМ HEPES буфером (pH 7,4), бактериальные клетки ресуспендируют в том же буфере и иммобилизуют на носителе.

Иммобилизацию клеток проводят методом физической адсорбции на хроматографической бумаге Whatman GF/A (Великобритания). Клеточную суспензию наносят на бумагу и подсушивают при комнатной температуре в течение 20 мин. Масса ИмК на носителе составляет 2 мг сырого веса. Полученный биорецептор помещают на рабочую поверхность кислородного электрода Кларка и фиксируют его с помощью нейлоновой сетки.

Водные растворы комплексов ДТПА с металлами (Me-ДТПА) готовят, смешивая эквимолярные концентрации водных растворов ДТПА и соответствующей соли металла за 24 ч до начала эксперимента. Используют 40 мМ стоковые растворы.

Принцип определения ДТПА и ее комплексов с ионами металлов основан на измерении скорости потребления кислорода ИмК штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395 в процессе деградации ДТПА и ее комплексов с ионами металлов, содержащихся в образце.

Биосенсор для определения ДТПА и ее комплексов с ионами металлов работает следующим образом. Электрод Кларка 1 с размещенным на нем биорецептором 2, содержащим ИмК штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395, погружают в измерительную ячейку вместимостью 2 мл с 30 мМ HEPES буферным раствором (pH 7.2) и регистрируют силу тока, отражающее содержание кислорода в среде (фоновое).

Добавляют аликвоту анализируемого образца и регистрируют потребление кислорода. Рассчитывают величину изменения максимальной скорости потребления кислорода (ответ сенсора, dI/dt, нА/мин) и определяют концентрацию ДТПА или Me-ДТПА по предварительно построенным калибровочным кривым (Фиг. 2-3). Измерения проводят при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

Таким образом, предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержание ДТПА или ее комплексов с ионами Mg²⁺, ионами металлов 4-го периода Периодической системы Mn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺ без использования сложного дорогостоящего оборудования.

Кроме того, биосенсор может быть использован в полевых условиях.

Биосенсор для определения диэтилентриаминпентауксусной кислоты-и её комплексов с ионами Mg²⁺, n²⁺, Со²⁺, Ni²⁺, включающий кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus ВКМ В-2395.

РИСУНКИ