Устройство для считывания люминесцентных сигналов с поверхности биочипов
Полезная модель относится к оптическим сканирующим устройствам и может быть использована в здравоохранении, медицине, в лабораторной практике для проведения экспрессной индикации и идентификации патогенных микроорганизмов, гормонов, токсинов и других биологически активных веществ. Сущность устройства заключается в том, что оно содержит оптический канал возбуждения и оптический канал измерения эмиссии люминесценции исследуемого биологического образца на поверхности биочипов, при этом оптический канал возбуждения люминесценции содержит установленные последовательно и оптически связанные источник возбуждающего люминесценцию излучения исследуемого биологического образца, волоконно-оптический световод, фильтр возбуждения люминесценции, конденсор, первое селективное зеркало, установленное под углом к оптической оси, и первый объектив для фокусирования возбуждающего излучения на поверхность биочипа, причем на входной поверхности конденсора установлена апертурная диафрагма, а фильтр возбуждения установлен между конденсором и первым селективным зеркалом, оптический канал измерения люминесценции с поверхности биочипа содержит установленные последовательно и биологически связанные первый объектив для сбора люминесценции исследуемого биологического образца с поверхности биочипа, первое селективное зеркало, второе селективное зеркало, установленное под углом к оптической оси, фильтр регистрации люминесценции, второй объектив для направления сфокусированного излучения через полевую диафрагму на фотодетектор.
Полезная модель относится к оптическим сканирующим устройствам, в частности к устройствам для считывания люминесцентных сигналов микрозон биологически активных веществ на поверхности дна лунок многолуночных микротитровальных сосудов.
Существуют оптические системы, используемые для считывания флуоресцентных сигналов с поверхности субстратов, имеющих множество реакционных микрозон - биочипов. В связи с тем, что микрозоны имеют очень малые размеры, возникает необходимость точного измерения сигналов люминесценции от микрообъектов. В настоящее время существует множество считывающих устройств, оптические схемы которых позволяют осуществлять с большой чувствительностью считывание флуоресцентных или люминесцентных сигналов с микрозон биологических веществ на поверхности микрорядов биочипов.
Известно устройство для сканирования биочипов (РСТ, заявка WO 01/65241, класс МПК G01N 21/64). Устройство может быть использовано для измерения сигналов флуоресценции биологических микрочипов или биочипов, выполненных на плоской поверхности. Оптическая схема устройства содержит канал возбуждения флуоресценции и канал измерения эмиссии флуоресценции исследуемого образца. Канал возбуждения содержит оптически связанные и установленные последовательно источник возбуждающего излучения, например, лазер, модулятор возбуждающего излучения, отражающее зеркало, первый объектив для направления сфокусированного возбуждающего излучения по волоконно-оптическому световоду и через сканирующую головку на микрочип. Канал измерения эмиссии флуоресценции содержит последовательно расположенные и оптически связанные сканирующую головку, волоконно-оптический световод, первый объектив, набор интерференционных фильтров эмиссии флуоресценции, ирисовую диафрагму, второй объектив и фотодетектор.
Известно устройство для считывания флуоресценции с биочипов (патент США 
6646271, класс НКИ 250/458.1). Устройство может быть использовано для считывания флуоресценции с биочипов, биологические вещества на которых, нанесенные в виде отдельных очень плотных микрозон, мечены веществами, позволяющими проводить измерения с временным разрешением флуоресценции. Оптическая схема устройства содержит канал возбуждения и канал измерения флуоресценции исследуемого образца. Канал возбуждения флуоресценции содержит оптически связанные и установленные последовательно источник излучения, точечную диафрагму, первое отражающее зеркало, селективное зеркало, используемое для направления света на биочип, и первый объектив для освещения исследуемого образца. Канал измерения флуоресценции содержит первый объектив для сбора флуоресценции с биочипа, селективное зеркало для пропускания излучения флуоресценции с биочипа, второе отражающее зеркало, фильтр, второй объектив, точечную диафрагму и фотодетектор. В изобретении использована конфокальная оптическая система для направления возбуждающего света на образец и сбора излучения флуоресценции в одну точку на фотодетекторе. При этом свет от источника излучения и свет, попадающий на фотодетектор, оптически связаны расположением и идентичной системой объективов как на стороне освещения исследуемого образца, так и на стороне детектирования, благодаря этому фотодетектор получает информацию только из точек сканирования. В качестве флуоресцентных веществ могут быть использованы европий, СуЗ и др. Измерение флуоресценции с временным разрешением позволяет получить высокое соотношение величины сигнал/шум.
При измерении сигналов на дне лунок многолуночных микротитровальных сосудов указанные устройства обеспечивают малую точность измерений из-за высокого уровня вертикального положения дна лунки в микротитровальном сосуде и недостаточной глубины резкости оптической системы, используемой для возбуждения люминесценции измеряемого образца.
Известно устройство для считывания очень малых значений флуоресценции биологических образцов с чипов или микрорядов, находящихся на стеклянных или силиконовых платах, или на пористых фильтрах (заявка США 2004/0130715, класс НКИ 356/317). Устройство содержит канал возбуждения флуоресценции исследуемого образца и канал измерения эмиссии флуоресценции образца. Канал возбуждения флуоресценции содержит последовательно расположенные и оптически связанные источник излучения параллельного пучка возбуждающего света, первую точечную диафрагму, направляющий первый объектив, селективное зеркало для отражения возбуждающего света на исследуемый образец, расположенное под углом к направлению возбуждающего пучка света, второй объектив для фокусирования возбуждающего света на исследуемый образец. Канал измерения содержит оптически связанные и последовательно расположенные второй объектив для передачи излучения эмиссии флуоресценции на фотодетектор через селективное зеркало, третий объектив и вторую точечную диафрагму. Параллельный пучок возбуждающего излучения формируется первой точечной диафрагмой и через первый объектив и селективное зеркало направляется в фокус второго объектива, который направляет на исследуемый образец параллельный пучок света. Использование двух точечных диафрагм, одна из которых установлена перед объективом возбуждающего излучения, а вторая - после третьего объектива перед фотодетектором, позволяет исключить попадание на детектор излучения мешающей флуоресценции. Устройство позволяет измерять очень малые количества эмиссии флуоресценции образца, находящегося в жидкости или на твердом носителе.
Известна конфокальная детектирующая система для мультиплексного анализа микрорядов биологического образца (заявка США 2008/0277595, класс НКИ 250/458.1). Устройство может быть использовано для анализа образца в лунках многолуночных микротитровальных сосудов, нанесенного на поверхность дна ячейки в виде множества дискретных зон. Система содержит оптический канал возбуждения и канал измерения эмиссии флуоресценции исследуемого образца. Канал возбуждения флуоресценции содержит расположенные последовательно и оптически связанные источник возбуждающего излучения, оптический мультиплексный элемент для создания множества освещающих элементов от одного источника, первый и второй объективы для направления возбуждающего света через первые сменные спектральные фильтры, селективное зеркало и третий объектив, фокусирующий излучение на исследуемый образец. Канал измерения содержит оптически связанные и установленные последовательно третий объектив для сбора и передачи эмиссии флуоресценции от образца, селективное зеркало, четвертый и пятый объективы с установленными между ними сменными спектральными фильтрами для выделения потока эмиссии от отдельной микрозоны образца, призму для раздельного направления сигналов флуоресценции через шестой объектив на фотодетектор.
Недостатком указанных устройств является сложность конструкции и недостаточная точность измерений из-за использования импульсного лазера, обладающего нестабильностью светового потока.
Наиболее близким является портативное устройство для сканирования биочипов (патент США 6407395, класс НКИ 250/458.1). Устройство имеет небольшие размеры, простое в обслуживании, дешевое и позволяет производить сканирование биочипов с достаточной чувствительностью и широким динамическим диапазоном при наличии в микрорядах биочипов несколько сотен или менее элементов. Оптическая схема устройства содержит канал возбуждения и канал измерения флуоресценции. Канал возбуждения флуоресценции исследуемого образца содержит установленные последовательно и оптически связанные источник возбуждающего флуоресценцию образца излучения, например, компактный лазер с волоконно-оптическим световодом, который направляет возбуждающее излучение через фильтр возбуждения люминесценции, конденсор и селективное зеркало на первый объектив, фокусирующий возбуждающее излучение на микроряды для последовательного сканирования всех микрозон биочипа. Канал измерения флуоресценции образца с биочипа содержит установленные последовательно и оптически связанные первый объектив, собирающий флуоресценцию образца, селективное зеркало, пропускающее излучение флуоресценции образца на второй объектив и точечную диафрагму, направляющих сфокусированное излучение флуоресценции на вход фотодетектора, в качестве которого могут быть использованы фотодиоды или миниатюрные фотоумножители. Точечная диафрагма устраняет мешающую флуоресценцию рассеяния и фона вокруг сканируемой микрозоны, благодаря чему улучшается соотношение сигнал/шум. Устройство предназначено для измерения флуоресценции с линейных рядов биочипов.
Недостатком устройства является небольшая глубина резкости оптической системы возбуждения люминесценции образца, что приводит к ухудшению чувствительности при измерении сигналов люминесценции микрозон рядов на поверхности дна лунок многолуночных микротитровальных сосудов.
Задачей является создание устройства для измерения сигналов люминесценции с поверхности биочипов, выполненных на дне лунок многолуночных микротитровальных сосудов.
Техническим результатом, достигаемым при использовании полезной модели является улучшение соотношения сигнал/фон, снижение порогов обнаружения при качественном анализе и уменьшение ошибок при количественном анализе.
Технический результат достигается предлагаемым техническим решением, сущность которого заключается в том, что в устройстве для считывания люминесцентных сигналов с поверхности биочипов, содержащем оптический канал возбуждения и оптический канал измерения люминесценции биологического образца на поверхности биочипов, в котором оптический канал возбуждения люминесценции содержит установленные последовательно и оптически связанные источник возбуждающего люминесценцию биологического образца излучения, волоконно-оптический световод, фильтр возбуждения люминесценции, конденсор, первое селективное зеркало, установленное под углом к оптической оси, и первый объектив для фокусирования возбуждающего излучения и сбора люминесценции с поверхности биочипа с исследуемым биологическим образцом, оптический канал измерения люминесценции с поверхности биочипа с исследуемым биологическим образцом содержит первое селективное зеркало, фильтр регистрации люминесценции, второй объектив для направления сфокусированного излучения люминесценции исследуемого биологического образца на полевую диафрагму и затем на вход фотодетектора и систему обработки измеряемых сигналов, в оптическом канале возбуждения люминесценции на входной поверхности конденсора установлена апертурная диафрагма, а фильтр возбуждения люминесценции установлен между конденсором и первым селективным зеркалом, в оптическом канале измерения после первого селективного зеркала установлено второе селективное зеркало под углом к оптической оси.
Из существующего уровня техники известны устройства для измерения малых значений флуоресценции, имеющие конфокальные оптические системы, используемые для возбуждения и измерения флуоресценции исследуемого образца, которые позволяют уменьшить влияние мешающей флуоресценции, улучшить соотношение сигнал/шум, т.е. повысить чувствительность измерений (патент США 6646271, заявка США 2004/0130715). В предлагаемом техническом решении по сравнению с прототипом, введены новый признак: второе селективное зеркало, установленное под углом к оптической оси канала измерения и апертурная диафрагма, и использовано иное расположение известных признаков. Апертурная диафрагма предназначена для формирования угла сбора светового пучка возбуждения люминесценции и угла сходимости светового пучка возбуждения на дне лунки многолуночного микротитровального сосуда, что позволяет улучшить равномерность освещенности в световом пятне возбуждения. Расположение фильтра возбуждения между конденсором и селективным зеркалом на участке параллельного пучка возбуждающего света позволяет использовать интерференционные фильтры высокого контраста. Второе селективное зеркало позволяет повысить спектральный контраст в канале регистрации люминесценции, что имеет большое значение при измерении сигналов сильно структурированных исследуемых образцов с неравномерным распределением сигнала люминесценции по поверхности. За счет введения новых признаков и иного их расположения увеличивается глубина резкости оптической системы возбуждения, что позволяет компенсировать нестабильность вертикальных размеров дна лунок многолуночного микротитровального сосуда и нестабильность положения дна относительно посадочной поверхности установки планшета, что приводит к снижению случайных составляющих ошибки измерения при количественном анализе. Вся совокупность признаков предлагаемой полезной модели позволяет уменьшить уровень минимального определяемого сигнала, т.е. определять более низкие концентрации искомых биологических объектов, улучшить соотношение сигнал/фон, снизить уровень систематических ошибок при количественном анализе, а значит повысить чувствительность и точность измерений. Следовательно, предлагаемая полезная модель соответствует критерию новизны.
Полезная модель может быть использована в здравоохранении, медицине, биотехнологии, в лабораторной практике для проведения экспрессной индикации и идентификации патогенных микроорганизмов, гормонов, токсинов и других биологически активных веществ. Следовательно, предлагаемая полезная модель соответствует критерию промышленной применимости.
На фиг. показан вариант устройства полезной модели. Устройство содержит канал возбуждения люминесценции исследуемого образца и канал регистрации люминесценции исследуемого образца. В канал возбуждения люминесценции образца входят последовательно расположенные и оптически связанные лазерный диод 1, волоконно-оптический световод 2, апертурная диафрагма 3 конденсор 4, фильтр 5 возбуждения люминесценции исследуемого образца, установленное под углом к оптической оси первое селективное зеркало 6, объектив 7 возбуждения люминесценции образца на дне 8, лунки 9 многолуночного микротитровального сосуда; канал измерения люминесценции образца содержит последовательно расположенные и оптически связанные дно 8 ячейки микротитровального сосуда 9, первый объектив 7 измерения люминесценции образца, селективное зеркало 6 и селективное зеркало 10, установленные под углом к оптической оси, набор светофильтров 11 регистрации люминесценции, второй объектив 12 регистрации люминесценции, полевая диафрагма 13, фотоумножитель (ФЭУ) 14 и блок 15 обработки измеряемых сигналов.
Устройство работает следующим образом.
Световые импульсы возбуждения люминесценции с лазерного диода 1 по волоконно-оптическому световоду 2 поступают через апертурную диафрагму 3 и конденсор 4 на вход фильтра 5 возбуждения люминесценции. Основная длина волны возбуждающего лазерного излучения 375 нм. Однако кроме основного излучения в спектре присутствуют паразитные излучения с длинами волн до 800 нм с мощностью излучения на 3-4 порядка ниже мощности основного излучения. Оптический фильтр 5 возбуждения люминесценции подавляет паразитные составляющие светового потока возбуждения, делая их влияние пренебрежимо малым. С выхода фильтра 5 возбуждения люминесценции световой поток поступает на первое селективное зеркало 6, которое имеет коэффициент отражения на длине волны 375 нм не менее 90%. В области длин волн регистрации (600-690 нм) коэффициент его пропускания не менее 85%. Световой поток возбуждения, отразившись от первого селективного зеркала 6, поступает на вход первого объектива 7 возбуждения люминесценции, который формирует световое пятно возбуждения на поверхности биочипа дне лунки 8 ячейки 9 многолуночного микротитровального сосуда. Оптимальные размеры светового пятна возбуждения определяются распределением люминесцирующих объектов на поверхности микрозон биочипов и способом сканирования. Например, при шаге сканирования 50 мкм, диаметре индицируемого реагентного пятна на объекте измерения 500 мкм и минимальном расстоянии между реагентными пятнами 350-450 мкм оптимальный диаметр светового пятна возбуждения должен находиться в интервале 125-150 мкм, т.е. 2,5-3 шага сканирования. При этом значении светового пятна возбуждения обеспечивается многократное возбуждение люминесценции любой точки реагентного пятна на биочипе (исследуемого биологического образца), что особенно важно при геометрически структурированном характере объектов внутри сканируемого пятна, т.е. образцов с неравномерным распределением сигнала люминесценции по поверхности. Чем ниже концентрация определяемого вещества в реагентном пятне, тем сильнее структурирована его геометрия, при этом при низких значениях концентрации внутри реагентного пятна располагается всего несколько люминесцирующих объектов размером менее одного шага сканировая.
Световые импульсы возбуждения люминесценции возбуждают как регистрируемую длительную люминесценцию исследуемого образца, так и паразитную флуоресценцию окрестных областей. Световой поток люминесценции исследуемого образца имеет шаровую диаграмму направленности, при этом часть его собирается первым объективом возбуждения люминесценции и направляется через первое селективное зеркало 6 на второе селективное зеркало 10. Отраженный световой поток люминесценции поступает на вход сменных фильтров 11 регистрации люминесценции. В данном варианте предлагаемого устройства используется три фильтра регистрации для пропускания трех длин волн: 615 нм. 653 нм и 670 нм в зависимости от используемых люминесцентных меток - Pt-порфирина, хелатного комплекса Еu или Pd-порфирина. Коэффициент пропускания для всех фильтров в максимуме регистрации не менее 40%, при этом особенностью фильтров регистрации является высокий контраст основных спектров пропускания и способность подавлять отраженное от объекта измерения возбуждающее излучение и паразитную флуоресценцию. Сформированный по спектру световой поток поступает на вход второго объектива 12 регистрации люминесценции и через полевую диафрагму 13 - на вход фотоумножителя 14, с выхода которого сигнал поступает на вход системы 15 обработки измеряемых сигналов. Полевая диафрагма 13 оптически сопряжена со световым пятном возбуждения люминесценции на микрочипе на дне 8 лунки 9 многолуночного микротитровального сосуда. Диаметр диафрагмы выбирается больше сопряженного пятна возбуждения, что позволяет пропустить без потерь световой поток люминесценции из светового пятна возбуждения на дне лунки и максимально подавить световые излучения окрестных областей. Это дает возможность исключить влияние соседних микрозон с исследуемым образцом на биочипе друг на друга в несколько раз.
Устройство для считывания люминесцентных сигналов с поверхности биочипов, содержащее оптический канал возбуждения и оптический канал измерения эмиссии люминесценции исследуемого биологического образца на поверхности биочипов, в котором оптический канал возбуждения люминесценции содержит установленные последовательно и оптически связанные источник возбуждающего люминесценцию биологического образца излучения, волоконно-оптический световод, фильтр возбуждения люминесценции, конденсор, первое селективное зеркало, установленное под углом к оптической оси, и первый объектив для фокусирования возбуждающего излучения и сбора люминесценции на поверхность биочипа с исследуемым биологическим образцом, оптический канал измерения люминесценции с поверхности биочипа с исследуемым биологическим образцом содержит установленные последовательно и оптически связанные первое селективное зеркало, фильтр регистрации люминесценции, второй объектив для направления сфокусированного излучения люминесценции исследуемого биологического образца на полевую диафрагму и затем на вход фотодетектора и систему обработки измеряемых сигналов, отличающееся тем, что в оптическом канале возбуждения люминесценции на входной поверхности конденсора установлена апертурная диафрагма, фильтр возбуждения люминесценции установлен между конденсором и первым селективным зеркалом, а в оптическом канале измерения после первого селективного зеркала под углом к оптической оси установлено второе селективное зеркало.
