Биореактор для функциональной тканевой инженерии
Биореактор для выращивания тканевых заменителей, особенно хрящей, состоит из отдельной герметически закрытой камеры, в которой упорядочено устройство для воздействия механической нагрузкой, в частности на тканевые заменители. При этом устройство для механической нагрузки состоит из емкости для культивирования с подложкой, расположенной в ее верхней части, и с как минимум одним прижимным вращающимся индентором, соединенным с поводком. При этом поводок соединен с линейным мотором и имеет плотную посадку по отношению к емкости для культивирования.
Область техники
Техническое решение связано с биореактором для функциональной тканевой инженерии, состоящим из герметично отделенной камеры, в которой находится устройство для механического воздействия нагрузкой на, в частности, тканевые заменители хрящей.
Текущий уровень техники
Для успешного создания заменителей хрящевой ткани необходимо отдельные тканевые матрицы с нанесенными клетками подвергать механической нагрузке. Необходимо также обеспечить среду, в которой данные клетки могут дальше развиваться. При выполнении этих требований происходит формирование функционального тканевого имплантата, который готов к имплантации в среду, где будет подвержен биологической нагрузке. Для моделирования циклов нагрузки в процессе созревания хрящевой ткани используются тканевые биореакторы.
Целью современных устройств, предназначенных для культивирования тканей, является имитация условий среды "in-vivo", прежде всего, с химической и биологической точки зрения. Эта среда формируется в современных типах биореакторов в зависимости от типа желаемой ткани. В общем целом можно констатировать, что речь идет об устройстве, в котором обеспечена химическая и биологическая стойкость питательной среды, где регулируется и контролируется температура инкубации пространства культивирования и где обеспечивается требуемое давление и концентрация смеси рабочих и питательных сред. Однако для того, чтобы была обеспечена возможность роста жизнеспособной ткани, устройство должно соответствовать требованиям по простоте стерилизации, легкому доступу питательной среды к культивируемым клеткам и ее обмену.
Одной из самых базовых версий является т.наз. Flask (колбы)система, которая содержит среду для культивирования и может содержать несколько матриц, в зависимости от размера. Колба (ы) работает либо статически, либо при перемешивании.
Отдельным вариантом можно считать биореакторы для роста сердечных тканей, которые приспособлены прохождению пульсирующего одно и двунаправленного потока питательной среды через конструкцию опорных матриц. То есть они сконструированы так, чтобы моделировали сердечнососудистую среду. Представителями таких биореакторов являются системы HARV (High Aspect Ratio Vessels) и STLV (Slow Turning Lateral Vessels). STLV сконфигурирован как кольцевое пространство между двумя концентрическими цилиндрами, из которых внутренний является мембраной для газообмена, тогда как HARV представляет собой цилиндрический сосуд с мембраной для газообмена в его дне. Оба сосуда работают в горизонтальной плоскости и вращаются по отношению друг к другу.
Другой используемой системой является система RWPV (Rotating Wall Perfused Vessels), которая была разработана НАСА и, помимо иного, использовалась для выращивания хрящей в условиях микрогравитации и в нормальных условиях. Среда непрерывно циркулирует в столбцах с перфузией. Камеры с перфузией сконструированы так, чтобы среда непрерывно протекала между камерой и наружной мембраной.
До сих пор не было найдено достаточно удовлетворяющее решение конструкции биореактора для выращивания заменителей хрящей, особенно при моделировании реальных условий нагрузки. Существующие реакторы для хрящевых тканей воздействуют на отдельные имплантаты простыми нагрузками типа давления или сдвига. У хряща "in-vivo" всегда имеет место сочетание данных нагрузок вследствие специфичной геометрии, кинематики и свойств контактных поверхностей.
Недостатком существующих решений является косвенная механическая стимуляция тканей, которая представляет собой фактор, существенный для соответствующего роста выращиваемых тканей.
Сущность технического решения
Указанные выше недостатки в значительной мере устраняет биореактор для функциональной тканевой инженерии, состоящий из герметично отделенной камеры, в которой находится устройство для механического воздействия, в частности, тканевых заменителей хрящей, выполненный согласно данному техническому решению. Суть решения заключается в том, что устройство состоит из сосуда для культивирования с подставкой для укладывания образцов культивирования и минимально одним вращающимся зажимным индентором, соединенным с поводком, причем поводок имеет плотную посадку по отношению к емкости для культивирования.
Устройство с выгодой состоит из линейного мотора, к статору которого подсоединяется нижняя часть емкости для культивирования, а к подвижной части линейного мотора подсоединен поводок с, как минимум, одним вращающимся индентором с посадкой на ось с трением качения. Ось подвижно уложена в вертикальном направлении в направляющих вертикальных стоек для равномерного воздействия циклической нагрузки от индентора на выращиваемые образцы.
К оси удачно подсоединена как минимум одна приподнимающая пружина растяжения и/или пружина сжатия, причем между осью и пружинами установлен датчик напряжения.
Вращающийся индентор может быть опоясан парой тормозных лент, прикрепленных к соединительному профилю. К тормозным лентам присоединен балансир для обеспечения симметрии тягового усилия в лентах для регуляции откатки, проскальзывания или полного волочения индентора по подложке.
Верхняя часть емкости для культивирования выгодно выполнена как разделенная продольной и поперечной перегородками на ячейки для культивирования, в которых установлена подложка с отверстиями для культивируемых образцов. Подложка выполнена из материала с механическими свойствами, сходными с механическими свойствами будущей требующейся ткани, для обеспечения стабильности и равномерного распределения нагрузки на образцы.
Сущность технического решения заключается в размещении стола с вращающимся индентором в камере роста в биореакторе. От окружающей лабораторной среды камера герметично отделена, а внутри поддерживается защитная атмосфера. Практически, камера биореактора представляет собой ламинированный лабораторный бокс, который приспособлен размерам культивационной ванны с образцами. В отличие от используемых технических решений здесь происходит прямое механическое стимулирование выращиваемой ткани вращающимся индентором, который имитирует реальную нагрузку на сустав.
Вращающийся индентор имеет форму цилиндра с поворотным подшипником, который с разной заданной величиной прижима передвигается по культивируемым образцам ткани. Другим важным преимуществом является возможность отката, частичного проскальзывания или полного волочения, в результате которого достигается не только стимуляция от нормальной нагрузки, но применяется и компонент сдвиговой нагрузки в тангенциальном направлении. Благодаря этому решения мы существенно приблизились "in-vivo" условиям роста тканей в организме. Образцы культивируемых тканей уложены в отверстиях цилиндрической формы. Остальное культивационное пространство заполнено подложкой из материала с механическими свойствами, сходными с механическими свойствами будущей требующейся ткани. Вращающийся индентор движется по подложке с образцами равномерно и с константными прижимом, причем в ходе культивирования отдельные параметры движения и прижима можно менять и регистрировать. Образцы и подложка уложены в ванночке с подогревом. Решение конструкции устраняет некоторые недостатки существующего стандартно используемого оборудования.
Техническое решение касается новой концепции устройства, стимулирующего ткань во время роста. Биореактор с вращающимся индентором для функциональной тканевой инженерии заменителей хрящей и с непрерывным дополнением питательных веществ представляет собой трехфазное оборудование, в котором присутствует контролируемая внутренняя атмосфера, а также регулируется поступление питательных веществ и, не в последнюю очередь, происходит механическая стимуляция культивируемых клеток вращающимся индентором.
Благодаря своему упорядочению предлагаемое техническое решение повышает эффективность механической стимуляции тканей. Оно заключается, прежде всего, в возможности применить сдвиговую нагрузку при одновременном применении нормального прижима. Использование двух цилиндров с пятью функциональными поверхностями позволяет одновременно культивировать до 50 образцов, что означает значительный экономический эффект и экономию времени.
По сравнению с простыми типами оборудования, представителем которых является вышеупомянутая система "Flask" предлагаемое решение является экономически и технически более сложным оборудованием, которое с точки зрения технической сложности управления является, в конечном итоге, более удобным для обслуживающего персонала. Вся система оснащена значительным количеством элементов управления и контроля, позволяющих лучше контролировать, что происходит внутри устройства и более точно выполнить настройки рабочих параметров. При сравнивании с более сложными и специальными системами взаимное сравнение является более сложным в том, что вышеуказанные системы "HARV, STLV и RWPV" предназначены, в первую очередь, для выращивания других типов тканей, чем разработанный нами биореактор. Тем не менее, исходя из конструкции, можно предположить, что итоговое механическое воздействие на механическую стимуляцию будет более низким, чем при прямом контакте цилиндра и ткани.
Обзор изображений на чертежах
Биореактор в соответствии с этим техническим решением будет более подробно описан на конкретном примере реализации при помощи прилагаемых чертежей, где на рисунке 1 схематически изображена в аксонометрической проекции система механической стимуляции, на рисунке 2 подробно показана посадка индентора, на рисунке 3 изображено техническое выполнение для частичного проскальзывания и полного волочения.
Примеры реализации технического решения
Устройство согласно рис.1 и 2 состоит из линейного сервомотора 1, который в верхней части прикреплен винтами к продольным ребрам жесткости 3, а в нижней части прикреплен к камере биореактора. К подвижной части линейного сервомотора 1 крепится винтами поводок 2 вращающегося индентора 13, а к нему прикреплены винтами 4 четыре вертикальные стойки 11, которые имею продольные пазы для направляющей скольжения. Каждая пара стоек 11 соединена для обеспечения жесткости соединительным профилем 10, в котором выполнена резьба для регулировочных винтов 12 прижима. Продольные ребра жесткости 3 прикреплены к нижней части емкости для культивирования 5. На нижней части 5 выполнена канавка эс-образной формы для прохождения теплоносителя, а сама нижняя часть соединена с верхней частью 6 так, чтобы не возникало утечки теплоносителя. Нижняя часть 5 имеет также канавку по всему периметру для удаления излишков питательного вещества. Верхняя часть 6 емкости для культивирования 5 разделена продольными перегородками 7 и перегородкой 14 на меньшие ячейки для культивирования. Внутри пространства для культивирования находится подложка 8 из материала с механическими свойствами, сходными с механическими свойствами будущей требующейся ткани, с отверстиями для укладывания культивационных образцов 9 цилиндрической формы. По подложке 8 полностью откатывается, с частичным проскальзыванием или с полным волочением, вращающийся индентор 13, который вращательно посажен подшипниками 15 на ось 16.
На рис.2 изображена использованная система прижима с отмериванием производимого усилия. С осью 16 неподвижно соединен и зафиксирован гайкой 17 датчик 18 напряжения - растяжение/сжатие. На противоположной стороне датчика 18 привинчена опорная миска 19 пружины сжатия 22, частью которой является также подвеска пружины растяжения 21. На противоположной стороне пружины сжатия 22 находится подвеска 20 пружины растяжения 21, которая одновременно служит как опорная подложка для пружины сжатия 22. Перемещение винта 12 позволяет выполнить настройку трех режимов работы. Исходное положение - режим I означает, что винт 12 находится в положении, когда натянута пружина растяжения 21 и индентор 13 не соприкасается с образцами 9. Режим II возникает тогда, когда винт 12 находится в таком положении, при котором индентор 13 вступает в контакт с подложкой 8 и выращиваемыми образцами 9. Величина прижима составляет в данном случае от 0 до значения, вызванного собственным весом индентора 13. Режим III наступает тогда, когда к прижиму от индентора 13 добавляется нагрузка в результате деформации пружины сжатия 22, вызванной винтом 12. В целях обеспечения симметрии нагрузки необходимо отрегулировать нагрузку винтами 12 с парным соответствием значений, а для этого служат данные с датчика 18.
На рис.3 изображено использование с торможением или полным блокированием индентора 13. Торможение индентора 13 осуществляется парой лент 23, которые опоясаны в углублениях вне функциональной поверхности. Ленты 23 с одной стороны жестко соединены с соединительным профилем 10, а с другой стороны прикреплены винтами 25, гайками 24, стопорными шайбами 26 к прямоугольному балансиру 27, который соединен гайкой 32 и винтом 33 с тягой 30. Использование балансира 27 с вращающейся посадкой вокруг винтов 25 и 33 обеспечивает равномерное тяговое усилие в лентах 23. Величину тягового усилия в лентах 23 можно регулировать гайкой 29 с шайбой 30. Для измерения тягового усилия в лентах 23 можно вставить датчик между подложку 30 и соединительный профиль 10.
Вращательный индентор 13 со всеми его компонентами - верхняя часть 6, продольные перегородки 7, которые вступают в контакт с выращиваемой тканью, изготовлены из коррозиеустойчивого биологически совместимого материала. Другие компоненты изготовлены из нержавеющей стали. Часть для культивирования имеет размеры 200×650 мм. Отдельные ячейки для культивирования имеют размеры 30×300 мм. В каждую из них можно поместить 5 культивируемых образцов 9. Таким образом, устройство позволяет выращивать одновременно до 50 образцов. Вложенные образцы 9 состоят из матрицы с нанесенными клетками ткани для культивирования. Окружающее пространство вокруг образцов заполнено подложкой 8, которая выполнена из материала, подобного коллагену, со специфическим химическим составом, обеспечивающим соответствующие химико-механические свойства.
В процессе культивирования при точно заданных биофизических условиях, таких как температура, концентрация питательного раствора и состав защитной атмосферы, осуществляется механическое стимулирование образцов 9 вращающимся индентором 13. Устройство позволяет осуществлять нагрузку непрерывно или с определяемыми пользователем интервалами между нагрузкой. Фактическую настройку прижима выбирает и настраивает обслуживающий персонал. У каждого из цилиндров индентора 13 можно настроить другие параметры нагрузки и, таким образом, использовать его для разных условий культивирования. Прижим можно регулировать с помощью винтов 12 и отмериванием при помощи датчика 18. Значения прижима можно контролировать в процессе культивирования и регистрировать, используя ПК.
Промышленное использование
Биореактор для функциональной тканевой инженерии, выполненный согласно настоящему техническому решению, найдет применение, прежде всего, в тканевой инженерии и медицине. Нынешние тенденции указывают, что именно в этом направлении и продвигаются исследования и разработки.
Биореактор для выращивания тканевых заменителей, преимущественно хрящей, включающий отдельную герметически закрытую камеру с размещенным в ней устройством для воздействия механической нагрузкой на тканевые заменители, отличающийся тем, что устройство для воздействия механической нагрузкой на тканевые заменители состоит из линейного сервомотора 1, емкости для культивирования и, по меньшей мере, одного прижимного вращающегося индентора 13, при этом линейный сервомотор 1 содержит подвижную и неподвижную части и прикрепленные к нему в верхней части продольные ребра жесткости 3, причем нижней частью сервомотор 1 прикреплен к камере биореактора, при этом емкость для культивирования имеет верхнюю 6 и нижнюю 5 части, с подложкой 8, расположенной в ее верхней части 6, причем верхняя часть 6 емкости для культивирования разделена продольными перегородками 7 и поперечной перегородкой 14, а в подложке 8 выполнены отверстия для укладывания образцов для культивирования 9, при этом прижимной вращающийся индентор 13 имеет пару тормозных лент 23 и соединен с поводком 2, последний соединен с линейным сервомотором 1 и имеет плотную посадку по отношению к емкости для культивирования, причем поводок 2 имеет присоединенные к нему вертикальные стойки 11, каждая из которых имеет продольный паз для направляющей скольжения, а каждая пара вертикальных стоек 11 соединена соединительным профилем 10, при этом к статору линейного сервомотора 1 подсоединены нижняя часть 5 и верхняя часть 6 емкости для культивирования, а к подвижной части линейного сервомотора 1 подсоединен поводок 2 с вращающимся индентором 13 с посадкой подшипников качения на ось 16 со скользящей посадкой в вертикальном направлении в направляющих скольжения вертикальных стоек 11, при этом к оси 16 подсоединена, по меньшей мере, одна приподнимающая пружина растяжения 21 и/или пружина сжатия 22, а между осью 16 и пружинами 21, 22 вставлен датчик 18 напряжения, тормозные ленты 23 опоясаны вокруг вращающегося индентора 13 и прикреплены к соединительному профилю 10, причем к тормозным лентам 23 подсоединен балансир 27 для обеспечения симметрии тягового усилия в тормозных лентах 23.
