Биосенсор для определения дихлорметана
Полезная модель относится к области биотехнологии и охраны окружающей среды, а именно к устройствам для определения органических веществ, в частности - для определения дихлометана.
Предложен биосенсор, включающий pH-чувствительный полевой транзистор, сопряженный с предварительно сформированным биорецептором, содержащем, иммобилизованные на хроматографической стеклобумаге клетки аэробных метилотрофных бактерий штамма Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, способных к биодеградации дихлометана. Нижний предел детекции ДХМ - 0,6 мМ, сигналы биосенсора стабильны в течение 14 суток, продолжительность одного анализа - 5 мин.
Полезная модель относится к области биотехнологии и охраны окружающей среды, а именно к устройствам для определения органических веществ, в частности дихлометана.
Дихлорметан (ДХМ) применяется в качестве хладагента (фреон-30, хладон-30), растворителя для химического синтеза в фармацевтической промышленности и удаления широкого спектра лакокрасочных покрытий. Благодаря способности снижать горючесть, вязкость и давление паров, ДХМ входит в состав аэрозолей, а также применяется при производстве термопластиков, синтетических волокон, фотопленки и для экстракции чувствительных к нагреванию веществ (пищевые жиры, кофеин) [Троценко, Торгонская, 2009].
Известно, что ДХМ обладает высокой токсичностью для млекопитающих. Это соединение вызывает образование опухолей печени и легких у мышей и крыс [Mizutani et al., 1988]. А также оказывает канцерогенный эффект на эритроциты, печень и почки человека [Green, 1997; Thier et al., 1998].
Поскольку в водных средах период полураспада ДХМ составляет до 700 лет, а в атмосфере 70 суток, он считается одним из основных загрязнителей воды и атмосферы (Dhillon, Von Burg, 1995; Law, Sturges, 2007). Поиск новых способов и технологий биодеградации ДХМ на основе активных штаммов микроорганизмов может решить проблему очистки окружающей среды от этого соединения. Актуальной задачей остается также разработка высокочувствительных, экспрессных, селективных и простых по конструкции аналитических устройств для определения ДХМ в промышленных и городских стоках.
Биодеградацию дихлорметана обычно определяют по возрастанию ионов хлора, с помощью газовой хроматографии или с использованием радиоизотопов [Krausova et al., 2003]. Разработан такой метод как хроматография газовой фазы над жидкостью для определения ДХМ в моче [Sakai et al., 2002], линейный диапазон определения концентраций ДХМ составил 0.01-2 мг/л. Концентрацию ионов хлора в культуральной жидкости клеток определяют также спектрофотометрически [Jörg, Bertau, 2004].
Эти методы не подходят для оценки содержания ДХМ непосредственно на месте отбора проб.
Известен биосенсор для определения ДХМ. Анализ был основан на клетках Hyphomicrobium DM2, иммобилизованных в альгинат. В работе использовали комбинацию преобразователей, состоящую из проточного калориметра (в котором происходило накопление продуктов биодеградации ДХМ) и электрода, чувствительного к ионам хлора. Предел детекции такого биосенсора составлял 0,1 мкМ ДХМ [Henrysson, Mattiasson, 1993].
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель - создание устройства для быстрого и чувствительного определения дихлорметана, простого по конструкции и эксплуатации.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что биосенсор обеспечивает быстрое определение содержания дихлометана без использования сложного дорогостоящего оборудования.
Сущность полезной модели.
Предложен биосенсор для определения дихлорметана, включающий рН-чувствительный полевой транзистор, сопряженный с предварительно сформированным биорецептором, выполненным в виде мембраны, содержащей иммобилизованный клетки аэробных метилотрофных бактерий штамма Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4. Биорецептор укрепляют на транзисторе с помощью пружинного держателя.
При этом pH-чувствительный полевой транзистор (1) укреплен на основании (2) и подключен в измерительную цепь через разъем (3). На затворной области транзистора находится биорецептор (4), прижатый к поверхности транзистора с помощью пружинного держателя (5). Транзистор погружен в измерительную ячейку (6) с буферным раствором (Фиг.1).
Формирование биорецептора осуществляют отдельно от транзистора. Для приготовления рецепторного элемента биосенсора используют суспензию бактериальных клеток, являющихся аэробными деструкторами ДХМ - Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 (ВКМ В-2191=DSMZ 6343) (Doronina et al., 2000). Бактерии выращивают на среде «К», содержащей (г/л): KH2 PO4 - 2, (NH4)2SO4 - 2, NaCl - 0.5, MgSO4×7H2O - 0.025, FeSO4×7H2O - 0.002, pH 7.2, при 29ºC в колбах объемом 0.75 л на качалке (180 об/мин). В качестве источников углерода и энергии добавляют дихлорметан, CH2Cl 2 (10 мМ). При культивировании на СН2Сl 2 колбы Эрленмейера объемом 300 мл с 50 мл среды закрывают завинчивающимися крышками с резиновой мембраной (Precision Sampling Corp., Baton Rouge, США). ДХМ вносят в среду через мембрану шприцем порциями до конечной концентрации 10 мМ. По мере сдвига pH до 5.0 добавляют 3 М NaOH до pH 7.0.
Выращенные таким образом клетки, центрифугируют при 10000 g в течение 3 минут, затем промывают 2 раза фосфатным буфером (pH 7,0) и суспендируют в определенное количество такого же буфера; 5 мкл суспензии клеток наносят на мембрану - хроматографическую стеклобумагу GF/A размером 3×3 мм2 (Whatman, Великобритания) и подсушивают на воздухе в течение 10-15 минут. Эта мембрана и является биорецептором биосенсора.
Биосенсор работает следующим образом.
Наличие дихлорметана в среде вызывает изменение выходного сигнала транзистора, обусловленное появлением ионов Н+ в среде в результате утилизации ДХМ микроорганизмами. Количество образующихся Н+ зависит от количества внесенного ДХМ, что и составляет основу анализа.
Сформированный Бирецептор (4) помещают на затворную область транзистора (1), прижимают с помощью пружинного держателя (5) и погружают в измерительную ячейку (6) объемом 2 мл с буферным раствором (1 мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 0,015 М NaCl, pH 7,0). Регистрируют базовый уровень электрического сигнала. Реакцию клеток, иммобилизованных в биорецепторе, инициируют добавлением 10 мкл раствора ДХМ с разной концентрацией. Регистрируют изменение сигнала транзистора в ходе биодеградации ДХМ через 250 с после введения вещества.
На основании полученных данных строят калибровочную кривую (Фиг.2).
Для определения неизвестной концентрации ДХМ после стабилизации базовой линии добавляют раствор неизвестной концентрации и затем по калибровочной кривой (Фиг.2), отражающей зависимость сигнала сенсора от концентрации ДХМ, определяют концентрацию ДХМ в анализируемом образце.
Принципиальными особенностями, отличающими предлагаемый биосенсор от известных устройств для определения ДХМ являются:
1) Использование pH-чувствительного полевого транзистора в качестве преобразователя сигнала биосенсора для прямого измерения биохимической реакции, связанной с выделением НСl в процессе биодеградации ДХМ.
2) Применение в биорецепторе уникальных микроорганизмов Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, способных к биодеградации ДХМ.
Диапазон количественного определения дихлорметана составил 0,6-9,0 мМ. Время измерения одного образца - 5 мин. Операционная стабильность - 14 суток. Коэффициент вариации (отношение среднеквадратичного отклонения к среднему арифметическому значению сигнала) составил 2-8%.
На фиг.1 представлена схема биосенсора на основе pH-чувствительного полевого транзистора для определения дихлорметана, а - вид сбоку, б - вид спереди.
На фиг.2 приведена калибровочная кривая биосенсора для определения дихлорметана.
Таким образом, разработан биосенсор для определения дихлорметана, который обеспечивает быстрое определение содержания ДХМ в образце без использования сложного дорогостоящего оборудования. Формирование биорецептора отдельно от транзистора позволяет избежать процедуры регенерации поверхности транзистора после использования и сокращает время анализа.
Список цитируемых источников:
1. Dhillon S., Von Burg R.J. Toxicology update. Methylene chloride. // Appl. Toxicol., 1995, V.15, P.329-335.
2. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Leisinger T. Methylopila helvetica sp. nov. and Methylobacterium dichloromethanicum sp. nov. - novel aerobic facultatively methylotrophic bacteria utilizing dichloromethane. // System. Appl. Microbiol. 2000. V.23. P.210-218.
3. Green T. Methylene chloride induced mouse liver and lung tumours: an overview of the role of mechanistic studies in human safety assessment. // Hum. Exp. Toxicol., 1997, V.16, 
1, P.3-13.
4. Henrysson Т., Mattiasson В. A microbial biosensor system for dihalomethanes. // Biodegradation, 1993, V.4, P.101-105.
5. Jörg G., Bertau M. Thiol-tolerant assay for quantitative colorimetric determination of chloride released from whole-cell biodehalogenations. // Anal Biochem, 2004, V.328, P.22-28.
6. Krausova V.I., Robb F.T., Gonzalez J.M. Bacterial degradation of dichloromethane in cultures and natural environments. // Journal of Microbiological Methods, 2003, V.54, 3, P.419-422.
7. Law K.S., Sturges W.T. Halogenated very short-lived substances. Scientific assessment of ozone depletion: 2006. // Global ozone research and monitoring project - Report 50 / Ed.: C.A. Ennis. Geneva: World Meteorol. Org., 2007, 572 p.
8. Mizutani К., Shinomiya К., Shinomiya Т. Hepatotoxicity of dichloromethane. // Forensic Science International, 1988, V.38, 1-2, P.113-128.
9. Sakai Т., Morita Y., Wakui Ch. Biological monitoring of workers exposed to dichloromethane, using head-space gas chromatography. // Journal of Chromatography B, 2002, V.778, 1-2, P.245-250.
10. Thier R., Wiebel F.A., Hinkel A., Burger A., Burning Т., Morgenroth K., Senge Т., Wilhelm M., Schulz T.G. Species differences in the glutathione transferase GSTT1-1 activity towards the model substrates methyl chloride and dichloromethane in liver and kidney. // Arch. Toxicol., 1998, V.72, 10, P.622-629.
11. Троценко Ю.А., Торгонская М.Л. Аэробная биодеградация дихлорметана: структурно-функциональные аспекты (обзор). // Прикладная биохимия и микробиология, 2009, Том 45, 3, С.261-276.
Биосенсор для определения дихлорметана, включающий установленный на основании рН-чувствительный полевой транзистор с укрепленным на нем посредством пружинного держателя биорецептором, выполненным в виде мембраны, содержащей клетки аэробных метилотрофных бактерий Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, способных к биодеградации дихлорметана, и разъем для подключения рН-чувствительного полевого транзистора в измерительную цепь, при этом биосенсор выполнен с возможностью погружения в измерительную ячейку с буферным раствором основания с установленным на нем рН-чувствительным полевым транзистором и укрепленным на последнем посредством пружинного держателя биорецептором в виде мембраны.
