Биосенсор для определения этилендиаминтетрауксусной кислоты и ее комплексов с ионами металлов

Полезная модель относится к области охраны окружающей среды, а именно к устройствам для определения аминополикарбоксильных кислот. Предложен биосенсор для определения этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и ее комплексов с ионами Ва²⁺, Mg ²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Сu² , включающий кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus LPM-4.

Полезная модель относится к области охраны окружающей среды, а именно к устройствам для определения аминополикарбоксильных кислот.

Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), благодаря способности образовывать стабильные водорастворимые комплексы с двух- и трехвалентными металлами, широко используется в промышленности. ЭДТА применяется для производства поверхностно-активных веществ (в том числе жидких мыл и шампуней), средств защиты растений, очистки поверхностей металлов перед покрытием их в гальванотехнике, для удаления следов металлов из растительных масел, лекарственных веществ (Egli Т., Weilenmann H.U., El-Banna Т., Auling G. Gram-negative, aerobic, nitrilo-triacetate-utilizing bacteria from wastewater and soil // Syst. Appl. Microbiol. 1988. V.10. P.297-305). Суммарное мировое производство ЭДТА в 2000 г. достигло 2·10⁵ тонн, при этом 70-80% потребленного ЭДТА поступает в окружающую среду (Дедюхина Э.Г., Салмов Н., Чистякова Т.Н., Минкевич И.Г., Вайнштейн М.Б. Бактериальный штамм - облигатный деструктор ЭДТА и перспективы его использования для очистки воды // Вода: химия и экология. 2008. 2. С.31-34). Поэтому закономерен интерес исследователей к мониторингу ЭДТА в водной среде.

Известные методы определения ЭДТА предусматривают использование дорогостоящего стационарного оборудования, в частности, хроматографа (Waters. Great Britan), оснащенном колонкой Nukleosil 100 (Machery und Nagel, Germany) и УФ-детектором (285 нм) при анализе методом жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ)(Kluener Т., Norteman В., Hempel D.C. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V.49. P.194-201). Кроме того, известен титриметрический метод определения ЭДТА (Пшипенко А.Т., Демуцкая Л.Н., Онопа Н.В., Фалендыш, Н.Ф., Арендарюк Е.Н. Способ определения этилендиаминтетраацетата в воде //АС 1525574 А1. 1989. Бюл. 44). При титриметрическом методе используется легковоспламеняющаяся жидкость ацетон.

Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель - создание устройства для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами Ва²⁺, Mg²⁺ , Са²⁺, Mn²⁺, Со²⁺, Cd²⁺ , Zn²⁺, Ni²⁺, Сu², простого по конструкции и эксплуатации.

Технический результат, который может быть получен при использовании полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержания ЭДТА и ее комплексов с ионами Ва²⁺ , Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Co²⁺ , Cd²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Сu² , без использования сложного стационарного дорогостоящего оборудования и легковоспламеняющейся жидкости.

Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов включает кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе бактериальные клетки Chelativorans oligotrophicus LPM-4 M.

Штамм LPM-4 - облигатный деструктор ЭДТА, обладающий специфической потребностью в ЭДТА как единственном источнике углерода, азота и энергии и не растет на органических сахарах и кислотах. Он был выделен из очистных сооружений г.Пущино и отнесен к новому роду и виду Chelativorans oligotrophicus LPM-4 sp. nov. (типовой штамм LPM-4^т=BKMB2395^т =BKMB2445=DSM19276^т) (Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Badrutdinova D.N., Yudina E.I., Minkevich I.G., Vainshtein M.B. EDTA-dependent assimilation of glucose and organic acids by an EDTA-degrading bacterium // Apll. Microbiol. Biotechnol. 2008. V.77. 6. Р.1367-1370).

Биосенсор для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов включает кислородный электрод Кларка 1, на котором размещен биорецептор 2, содержащий иммобилизованные на носителе клетки (ИмК) Chelativorans oligotrophicus LPM-4 с помощью фиксатора 3. Измерения проводят с помощью гальваностата-потенциостата IPC-Micro (OOO «Кронас», Россия), интегрированного с персональным компьютером. Регистрируемым параметром является максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/мин), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потребленного кислорода. Для обработки данных используют SigmaPlot 11.0.

Нижний предел детекции ЭДТА и ее комплексов с ионами Ва²⁺, Mg²⁺, Са ²⁺, Мn², Со²⁺, Cd²⁺, Zn ²⁺, Ni²⁺, Сu² - 0,125 мМ; операционная стабильность - 3 суток, продолжительность анализа - 20 мин, ошибка измерения - 8%.

Биосенсор чувствителен к наличию промежуточных продуктов деградации ЭДТА этилендиаминдиацетата, глиоксилата, а также таких соединений как иминодиацетат и пировиноградная кислота.

На фиг.1 представлена схема биосенсора для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов. На фиг.2 представлены калибровочные кривые сенсора на основе клеток бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus LPM-4 для определения ЭДТА (а), Ва ЭДТА (б), Mg-ЭДТА (в), Са-ЭДТА (г). На фиг.3 представлены калибровочные кривые сенсора на основе клеток бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus LPM-4 для определения Мn-ЭДТА (д), Со ЭДТА (е), Cd-ЭДТА (ж), Zn-ЭДТА (з). На фиг.4 представлены калибровочные кривые сенсора на основе клеток бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus LPM-4 для определения Ni-ЭДТА (и), Сu-ЭДТА (к).

В качестве носителя для клеток, используемых в биорецепторе, могут использоваться полисахаридные гели, поливиниловые спирты, целлюлозные мембраны, стекловолокна, в частности, стеклобумага.

Для создания биорецептора используют облигатный деструктор Chelativorans oligotrophicus LPM-4. Бактериальная культура обладает способностью к утилизации ЭДТА и ее комплексов с ионами Ва²⁺, Са²⁺ , Mn²⁺, Co²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺ , Ni²⁺, Cu²⁺. Деградация осуществляется монооксигеназной системой с потреблением молекулярного кислорода в устойчивых стехиометрических соотношениях между поглощенным количеством кислорода и деградированным количеством ЭДТА.

Штамм Chelativorans oligotrophicus LPM-4 выращивают первоначально на агаризованной среде состава (г/л): MgSO ₄*7H₂O - 1,0; KH₂PO₄ - 0,26; CaCl₂*2H₂O - 0,40; Na₂ HPO₄*12H₂O - 0,63; ЭДТА - 1,0. Микроэлементы (мг/л): FеСl₃*4Н₂O - 1,5; Н₃ ВО₃ - 0,06; MnCl₂*4H₂O - 0,1; CoCl₂*6H₂O - 0,12; ZnCl₂ - 0,07; NiCl₂*6H₂O - 0,025; CuCl₂*2H ₂O - 0,015; Na₂MoO₄ - 0,025; агар - 20,0. Витамины (мг/л): пиридоксин*НСl - 0,1; тиамин*НСl - 0,05; рибофлавин - 0,05; никотиновая кислота - 0,05; кальция пантотенат - 0,05; Р-аминобензойная кислота - 0,05; липоевая кислота - 0,05; никотинамид - 0,05; витамин B₁₂ - 0,05; биотин - 0,02; фолиевая кислота - 0,02. Витамины и микроэлементы готовят в виде концентрированных стерильных растворов и добавляют в среду в количестве 1 2 мл/л соответственно. Для получения биомассы культивирование бактерий проводят в жидкой среде того же состава (рН 7,0) в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 200 мл питательной среды на качалке 150 об/мин при температуре 29°С.

Культуральную жидкость, взятую в конце экспоненциальной фазы роста штамма, центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин., дважды промывают 30 мМ HEPES буфером (рН 7,4), бактериальные клетки ресуспендируют в том же буфере и иммобилизуют на носителе.

Иммобилизацию клеток проводят методом физической адсорбции на хроматографической бумаге Whathman GF/A (Великобритания). Клеточную суспензию наносят на бумагу и дают высохнуть на воздухе. Масса иммобилизованных клеток (ИмК) на рецепторе составляет 2 мг сырого веса. Полученный биорецептор помещают на рабочую поверхность кислородного электрода Кларка и фиксируют его с помощью нейлоновой сетки.

Принцип определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов основан на измерении скорости потребления кислорода ИмК Chelativorans oligotrophicus LPM-4 в процессе деградации ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов, содержащихся в образце.

Биосенсор для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов работает следующим образом. Электрод Кларка 1 с размещенным на нем биорецептором 2, содержащим ИмК Chelativorans oligotrophicus LPM-4, погружают в измерительную ячейку вместимостью 2 мл с 30 мМ HEPES буферным раствором (рН 7.2) и регистрируют силу тока, отражающее содержание кислорода в среде (фоновое).

Добавляют аликвоту анализируемого образца и регистрируют потребление кислорода. Рассчитывают величину изменения максимальной скорости потребления кислорода (ответ сенсора, dI/dt, нА/мин) и определяют концентрацию ЭДТА или Ме-ЭДТА по предварительно построенным калибровочным кривым (фиг.2-4)

Измерения проводят при температуре 30-32°С и постоянном перемешивании.

Таким образом, предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержание ЭДТА или ее комплексов с ионами Ba²⁺, Ca ²⁺, Мn²⁺, Со²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Сu²⁺ без использования сложного дорогостоящего оборудования и легковоспламеняющихся жидкостей.

Кроме того, биосенсор может быть использован в полевых условиях.

Биосенсор для определения этилендиаминтетрауксусной кислоты и ее комплексов с ионами Ва²⁺, Mg²⁺, Са ²⁺, Mn²⁺, Со²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, включающий кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus LPM-4.