Устройство для получения вирионов вирусов клещевого энцефалита или бешенства

Авторы патента:

C12N7 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)

Полезная модель относится к биотехнологии, в частности, к устройствам для получения вирионов вирусов клещевого энцефалита (КЭ) и бешенства для изготовления противовирусных вакцин.

Технический результат от использования предлагаемого устройства заключается в возможности получения как фракции вирионов вируса клещевого энцефалита, так и фракции вирионов вируса бешенства.

Устройство для получения вирионов вирусов клещевого энцефалита или бешенства содержит полый цилиндр 1, с входным отверстием 2 и выходным отверстием 3, заполненный агарозой 4 марок Sepharose 4 Fast Flow или Sepharose 6 Fast Flow.

Для производства вакцин против вируса КЭ и вируса бешенства необходимо выделить из инактивированной вируссодержащей суспензии фракцию вирионов этих вирусов, очистив ее от неиммуногенных и слабоиммуногенных примесей: антибиотиков, формальдегида, красителя, фрагментов мембран, белков, РНК и ДНК клеток, используемых для культивирования вирусов, белков сыворотки, а также неструктурных вирусных белков и фрагментов вирионов.

Известны устройства получения вакцин клещевого энцефалита, в которых описано использование для удаления примесей метода гель-хроматографии на колонках с модифицированными пористыми кремнеземами со средним эффективным диаметром пор 100 нм (SU 1124483, 1982), (RU 2203089, 2003). Гель-хроматография на колонках с модифицированными пористыми кремнеземам со средним эффективным диаметром пор 200 нм (RU 1367487, 1993) может использоваться и для производства вакцины против вируса бешенства.

Описанные способы очистки предложены либо только для получения вакцины клещевого энцефалита, либо только для получения вакцины против вируса бешенства, так как в устройствах для очистки используются различные по свойствам модифицированные пористые кремнеземы.

Устройства для получения вирионов, как вируса клещевого энцефалита (КЭ), так и вируса бешенства, из инактивированной вируссодержащей суспензии авторам неизвестны.

При хроматографии на модифицированных кремнеземах из-за размера пор кремнезема, соотносимого с размером вирионов вируса КЭ в одном случае, или с размером вирионов вируса бешенства в другом случае, значительная часть вирионов способна задерживаться в порах, что приводит к ухудшению качества очистки. Кроме того существенной проблемой является постепенное удаление модификатора с поверхности кремнезема, что приводит к изменению эффективного диаметра пор кремнезема, сорбции вирионов на кремнеземе, снижению выхода целевого продукта и увеличению содержания примесей в получаемой после гель - хроматографии вирионной фракции. Химические свойства модифицированных кремнеземов не позволяют эффективно проводить их депирогенизацию, что может приводить к накоплению пирогенов в конечном препарате.

Указанный технический результат достигается тем, что устройство для получения вирионов вирусов клещевого энцефалита или бешенства из инактивированной вируссодержащей суспензии содержит вместилище с корпусом из материала, не взаимодействующего с вирионами клещевого энцефалита и бешенства, заполненное поперечно-сшитой 4-6% агарозой.

Указанный технический результат достигается также тем, что вместилище заполнено агарозой марок Sepharose 4 Fast Flow или Sepharose 6 Fast Flow.

Указанный технический результат достигается также тем, что вместилище выполнено в виде полого цилиндра.

Так как вирионы вируса КЭ имеют размер 40-60 нм и икосаэдрическую (сферическую) форму, а вирионы вируса бешенства имеют пулевидную форму с диаметром 75-80 нм и длиной до 200 нм, то необходимо было подобрать носитель с постоянным размером пор, меньшим, чем 40 нм, эффективно удаляющий вышеперечисленные примеси, не обладающий сорбционными свойствами в отношении вируса КЭ и вируса бешенства, химически устойчивый к проведению многократных циклов депирогенизации.

Нами были использованы различные системы для проведения хроматографии инактивированных препаратов вируса КЭ и вируса бешенства. Устройство заполнялось следующими хроматографическими носителями:

1. Носители на основе полиакриламида, получаемые сополимеризацией акриламида и М,М-метиленбисакриламида (Биогель Р 300).

2. Носители на основе аллил-декстрана сшитого N,N-метиленбисакриламидом (Сефакрилы марок S300,S400,S500).

3. Носители на основе декстрана, поперечно-сшитые эпихлорогидрином (Сефадексы G200).

4. Носители на основе агарозы (Биогель А различных типов, Сефароза марок 2, 4, 6, 2 Fast Flow, 4 Fast Flow, 6 Fast Flow).

Анализ полученных результатов позволил выбрать для очистки вирионов вирусов КЭ и бешенства устройство, представляющее собой вместилище из материала, не взаимодействующего с вирионами (стекло, нержавеющая сталь, полиакриламид), заполненное поперечно-сшитой 4-6% агарозой.

На фиг.1 показано устройство для получения вирионов вирусов клещевого энцефалита или бешенства из инактивированной вируссодержащей суспензии.

Устройство содержит полый цилиндр 1, с входным отверстием 2 и выходным отверстием 3, заполненный агарозой 4 марок Sepharose 4 Fast Flow или Sepharose 6 Fast Flow.

Устройство для получения вирионов вирусов клещевого энцефалита или бешенства из инактивированной вируссодержащей суспензии используют следующим образом.

Через входное отверстие 2 в полый цилиндр 1, заполненный агарозой 4, подают определенную порцию суспензии, содержащую фрагменты мембран, белки, РНК и ДНК клеток, белки сыворотки, вирусные белки, вирионы и фрагменты вирионов клещевого энцефалита или бешенства, а также компоненты питательной среды.

После введения суспензии в полый цилиндр 1 осуществляют процесс гель-фильтрации и собирают фракцию вирионов вирусов клещевого энцефалита или бешенства из выходного отверстия 3.

Работа предлагаемого устройства иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1.

Вируссодержащую суспензию вируса клещевого энцефалита (КЭ) получают путем выращивания вируса КЭ (штамм «Софьин») в монослойной первичной культуре клеток эмбрионов кур. Культивирование проводят в бутылях объемом 3 литра в течение 48-72 часов при температуре (37±1)°С. Вируссодержащую суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл при температуре (32±1)°С в течение 72 часов. Инактивированную Вируссодержащую суспензию фильтруют через фильтры с конечным размером пор 0,45 мкм, концентрируют в 40-60 раз ультрафильтрацией, добавляют протаминсульфат в конечной концентрации 3 мкг/мл и центрифугируют. Далее Инактивированную вируссодержащую суспензию вносят в хроматографическую колонку размером 1,6×50 см, заполненную 100 мл Sepharose 6 Fast Flow, и проводят гель-фильтрацию со скоростью потока 3 мл/мин. На выходе из колонки собирают фракцию вирионов вируса КЭ. В полученной фракции вирионов контролируют антигенную активность, стерильность, пирогенность, концентрацию общего белка, белков сыворотки крупного рогатого скота, протаминсульфата и формальдегида. Полученная фракция вирионов вируса КЭ может быть использована для приготовления вакцины против вируса КЭ.

Пример 2.

Вируссодержащую суспензию вируса бешенства получают путем выращивания вируса бешенства (штамм «Внуково-32») в монослойной первичной культуре клеток почек сирийских хомяков. Культивирование проводят в флаконах объемом 1,5-3 литра в течение 120 часов при температуре (37±1)°С, далее 120 часов при температуре (32±1)°С. Вируссодержащую суспензию собирают, фильтруют через фильтры с конечным размером пор 0,2 мкм и затем инактивируют ультрафиолетовыми лучами при температуре (22±1)°С. Инактивированную вируссодержащую суспензию концентрируют в 40-60 раз ультрафильтрацией. Далее инактивированную вируссодержащую суспензию вносят в хроматографическую колонку размером 1,6×50 см, заполненную 100 мл Sepharose 4 Fast Flow, и проводят гель-фильтрацию со скоростью потока 3 мл/мин. На выходе из колонки собирают фракцию вирионов вируса бешенства. В полученной фракции вирионов контролируют антигенную активность, стерильность, пирогенность, концентрацию общего белка. Полученная фракция вирионов вируса бешенства может быть использована для приготовления вакцины против вируса бешенства.

1. Устройство для получения вирионов вирусов клещевого энцефалита или бешенства из инактивированной вируссодержащей суспензии, содержащее вместилище с корпусом из материала, не взаимодействующего с вирионами клещевого энцефалита и бешенства, заполненное поперечно-сшитой 4-6% агарозой.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что вместилище заполнено агарозой марок Sepharose 4 Fast Flow или Sepharose 6 Fast Flow.

3. Устройство по п.1 или 2, отличающееся тем, что вместилище выполнено в виде полого цилиндра.