Молекулярно-генетическая тест-система для экспресс-определения устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам группы фторхинолонов, аминогликозидам (амикацину, канамицину) и капреомицину
Полезная модель относится к области медицины, в частности к области лечения туберкулеза и касается тест-системы на основе технологии ПЦР в реальном времени для экспресс-определения устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) в клинических образцах к противотуберкулезным препаратам: этамбутолу, амикацину, капреомицину и фторхинолонам. Описанная тест-система представляет собой комплект микропробирок с реагентами для амплификации фрагментов ДНК МБТ, кодирующих нуклеотидные последовательности с различными, в том числе, мутантными аллелями, причем комплект микропробирок состоит из последовательной по составу комбинации функционально и структурно связанных микропробирок, выполненных в виде стрипа (рис.1), содержащих реакционные смеси соответствующих специфичных 5'-флуоресцентно-меченных различными флуорофорами аллель-специфичных праймеров, для мультиплексной ПЦР-амплификации фрагментов генов embB, rrs и gyr А и gyr В. Представленная тест-система позволяет проводить эффективную диагностику и лечение туберкулеза.
Полезная модель относится к области медицины, в частности к устройствам для лабораторной диагностики и лечения туберкулеза.
Распространение лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ) является одной из главных проблем борьбы с туберкулезом во всем мире. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) МБТ, определяемая как устойчивость к рифампицину и изониазиду, в России постоянно растет, достигая, даже у впервые заболевших пациентов, по данным официальной статистики - 15,5%, а по результатам пилотных исследований - свыше 20% (М.А.Владимирский, Ю.С.Аляпкина, Д.А.Варламов, Я.И.Алексеев и др. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза. Проблемы туберкулеза и болезней легких, 2008, 
4 стр.38-44).
В настоящее время возникла угроза распространения крайне устойчивой формы туберкулеза - заболевания с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ), вызванной МЛУ штаммами, устойчивыми не только к рифампицину и изониазиду, но и к препаратам второго ряда - фторхинолонам и, по крайней мере, к одному инъекционному препарату. Ежегодно в мире регистрируется 30,000 новых ШЛУ случаев. Более того, появились данные о случаях абсолютно устойчивого туберкулеза, т.е. формы, устойчивой ко всем существующим на сегодняшний день противотуберкулезным препаратам (Fattorini L., Migliori G.B., Cassone A. 2007. Extensively drug-resistant (XDR) tuberculosis: an old and new threat. - Ann. Ist. Super. Sanita, 43 (4), p.317-319) (Shelley E. Haydel. 2010. Extensively Drug-Resistant Tuberculosis: A Sign of the Times and an impetus for Antimicrobial Discovery. - NIH Public Access Author Manuscript. Pharmaceuticals (Basel), V.3 (7), p.2268-2290). Лекарственная устойчивость туберкулеза является одной из основных причин низкой эффективности лечения даже впервые заболевших пациентов, которая составляет около 65%, т.е. не излеченные больные становятся хрониками и продолжают заражать здоровых людей. Лечение же ШЛУ туберкулеза крайне трудно и дорого.
Анализ лекарственной устойчивости МБТ при использовании традиционных микробиологических методов очень длителен и занимает от 1 до 3 мес. с начала исследования диагностического материала и лечения больного. При этом анализ устойчивости к препаратам второго ряда возможен только в крайне ограниченном числе лабораторий. Молекулярно-генетические методы анализа и соответствующие тест-системы (наборы реагентов) начали внедряться в лабораторную диагностику туберкулеза, т.к. являются наиболее перспективными методами, альтернативными традиционным микробиологическим, и позволяющими значительно сократить сроки проведения диагностического исследования. Поэтому разработка и внедрение эффективных и быстрых новых методов лабораторной диагностики в практику фтизиатрии является чрезвычайно важной и актуальной.
Известные методы и соответствующие тест-системы (комплекты реагентов), основанные на определении мутаций в генах МБТ, ответственных за устойчивость к конкретным лекарственным препаратам, используют помимо пробирок с реагентами специальные пластинки или мембраны в виде чипа для гибридизации с олигонуклеотидными зондами.
Например, из уровня техники известны два альтернативных метода идентификации резистентных к рифампицину штаммов Mycohacterium tuberculosis на биологических микрочипах. Методы основаны на детекции точечных нуклеотидных мутаций и иных перестроек в регионе гена rpoВ, определяющем устойчивость к рифампицину. Метод гибридизации на ТБ-микрочипе позволяет обнаружить 30 мутантных вариантов ДНК, встречающихся в устойчивых к рифампицину штаммах (около 95% всех резистентных форм). Описанные методы могут быть использованы в клинико-диагностических лабораториях как для определения лекарственной устойчивости/чувствительности возбудителя туберкулеза, так и для контроля эффективности антибактериальной терапии (В.М.Михайлович и др. Использование методов гибридизации и пцр на специализированном Тб-микрочипе для обнаружения рифампицинрезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosi, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001, т.131, 1, стр.112-117.
Из RU 2376387 С2, 20.12.2009 или RU 2005140679/13 А, 26.12.2005 известен способ одновременного обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и идентификации мутаций в ДНК микобактерий, приводящих к устойчивости микроорганизмов к рифампицину и изониазиду,. Описанный способ включает обеспечение биочипа для одновременного обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и идентификации мутаций, приводящих к устойчивости к рифампицину и изониазиду и мультиплексную амплификацию фрагментов генов rpoВ, katG, inhA, ahpC, мобильного элемента IS6110 с использованием набора пар специфичных праймеров.
В статьях Innogenetics, Ghent, Belgium; Ando H. et al. - Evaluation of a line probe assay for the rapid detection of gyr A mutations associated with fluoroquinolone resistance in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. - J. Med. Microbiol., 2011, 60 (Pt 2), p.184-188 и Genotype MTBDR (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany; Vo Sy Kiet et al. - Evaluation of the MTBDRRsl Test for Detection of Second-Line-Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis. - J. Clinical Microbiology, 2010, V.48, No.8, p.2934-2939 раскрывается определение лекарственной восприимчивости к препаратам группы фторхинолонов (левофлоксацин (LVFX), спарфлоксацин (SPFX) и ципрофлоксацин - CPFX) с использованием гибридизации ампликонов на полосках (стрипах) с олигонуклеотидными ДНК-зондами, комплементарными известным мутациям - анализы INNO-LiPA.
Китайский патент (CN 101580879 А, 2009-11-18, Drug-resistance gene film chip for detecting Mycobacterium tuberculosis) описывает гибридизационный чип, представляющий собой нейлоновую мембрану, несущую 54 олигонуклеотидных зонда, специфичных для сайтов мутаций лекарственной устойчивости в генах rpoB, katG, embB, inhA, ahpC, gyrA, rrs, rpsL и pncА возбудителя туберкулеза. Набор регентов позволяет выявлять мутации, определяющие устойчивость к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду, фторхинолонам. Специфические фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР-амплификации с использованием 12 пар биотинилированных праймеров, гибридизуют с мембраной чипа, отмывают и выявляют продукты гибридизации за счет цветовой реакции со стрептавидиновым конъюгатом.
Однако, многие из этих методов, вследствие трудоемкости, сложности, малой технологичности и высокой стоимости не имеют практической реализации в виде коммерческих продуктов. Но даже коммерчески реализованные - биочипы, INNO-LiPA, Genotype MTBDR, GeneXpert MTB/RIF обладают различными недостатками и могут использоваться в практике лишь с ограничениями, в том числе, в частности, важным недостатком наборов на основе биочипов является затруднение интерпретации результатов при анализе клинических образцов, содержащих смесь микобактерий дикого и мутантного штаммов. Недостатками GeneXpert MTB/RIF являются определение лекарственной устойчивости только к одному рифампицину, а также очень высокая стоимость расходных материалов. INNO-LiPA и Genotype MTBDR трудоемки и многостадийны, т.к. включают несколько стадий постамплификационных процедур, что требует использования для предотвращения внутрилабораторной контаминации дополнительных изолированных помещений.
Наиболее близким к заявляемой нами полезной модели для экспресс-определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к первому и второму ряду противотуберкулезных препаратов является полезная модель по корейскому патенту (KR 20050009052 А, 24.01.2005, «Microarray comprising probes for accurately detection of antibiotic-resistance of Mycobacterium tuberculosis at one time). Описанный набор включает набор пробирок с реагентами для ПЦР-амплификации специфических фрагментов с 8 парами биотинилированных праймеров и чип-мембраной, предназначенный для определения ДНК-мутаций в генах rpoB, katG, embB, inhA, ahpC, gyrA, rrs, rpsL и pncA возбудителя туберкулеза, обусловливающих лекарственную устойчивость, в том числе и, в большей степени, в отношении препаратов 2-го ряда: к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду, фторхинолонам и канамицину/амикацину.
Описанная тест-система (набор микропробирок с реагентами и чип-мембрана) также требует для осуществления задачи быстрого определения лекарственной чувствительности/устойчивости проведения ряда последовательных процедур с возможностью внутрилабораторной контаминации, для предотвращения которой необходимо использовать дополнительные изолированные помещения.
Задачей предлагаемой полезной модели является повышение технологичности процесса определения лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам, за счет исключения использования специального чип-детектора, сокращения числа необходимых последовательных процедур при проведении анализа и уменьшения возможностей внутрилабораторной контаминации.
Поставленная задача решается с помощью молекулярно-генетической тест-системы на основе технологии ПЦР в реальном времени для экспресс-определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) в клинических образцах к противотуберкулезным препаратам: амикацину, капреомицину и фторхинолонам, представляющей собой стрип микропробирки (см. рис.1) с реагентами для амплификации фрагментов ДНК МБТ, кодирующих нуклеотидные последовательности с различными, в том числе мутантными аллелями, с обнаружением точек мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость к соответствующим препаратам.
Представленная тест-система отличается от известной тем, что набор реагентов состоит из стрипа - последовательной комбинации микропробирок (панель), функционально и структурно связанных между собой, каждая из которых имеет определенный состав. Такая панель содержит соответствующие специальные 5'-флуоресцентно-меченные различными флуорофорами аллель-специфичные праймеры, которые при проведении ПЦР в реальном времени, с использованием компьютерной программы, соответствующей расположению реагентов в стрипе, позволяют определить, в результате аллель-специфической амплификации, мутации в генах МБТ rrs 16S РНК, gyr А и gyr В, ответственных за возникновение лекарственной устойчивости к указанным препаратам (рис.1). Для исследования каждого образца, содержащего ДНК микобактерий туберкулеза, с целью определения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к указанным резервным препаратам, используют отдельный стрип микропробирок с реагентами. Кроме того, тест-система содержит также контрольный стрип с набором фрагментов ДНК, содержащих соответствующие мутации и пробирки с реакционной смесью для предварительной мультиплексной ПЦР-амплификации фрагментов генов rrs, gyr А и gyr В. Обнаружение мутаций обеспечивается использованием стрипа микропробирок, содержащих реакционные смеси, включающих последовательную комбинацию специально сконструированных олигонуклеотидных праймеров, гибридизация которых с точками мутаций специфических фрагментов ДНК приводит к появлению измеряемой флуоресценции при использовании соответствующей компьютерной программы, определяющей результаты исследования.
По результатам культуральных микробиологических исследований были отобраны и изучены с помощью разработанной тест-системы 46 штаммов устойчивых к препаратам фторхинолонового ряда и 68 штаммов, устойчивых к амикацину или капреомицину (табл.1).
| Таблица 1 | ||||||
| Результаты сравнительного изучения лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам резервного ряда (амикацину, капреомицину и фторхинолонам) при использовании молекулярно-генетической тест-системы ПЦР-РВ и традиционных культуральных исследований в клинических образцах мокроты | ||||||
| п/п | Кол-во МБТ/пр | Фторхинолоныы | амикацин/капреомицин | фторхинолоны | Амикацин/капреомицин | |
 | | Молекулярно-генетическая тест-система | Культуральные исследования | |||
| 1 | 1,80Е+03 | S | S | R | S | |
| 2 | 8,14Е+02 | S | S | S | S | |
| 3 | 1,44Е+04 | S | S | S | S | |
| 4 | 1,23Е+03 | R gyrA 94 Alm1 GAC-AAC (Asp-Asn) | R A1401G | S | R | |
| 5 | 3,49Е+03 | S | S | S | S | |
| 6 | 4,34Е+02 | R gyrA 94 Alm1 GAC-AAC (Asp-Asn) | R A514C | R | R | |
| R A1401G | ||||||
| 7 | 2,50Е+06 | R gyrA 90 Alm10 GCG-GTG (Ala-Val) | R C517T | R | R | |
| 8 | 4,00Е+01 | S | S | S | S | |
| 9 | 2,37Е+04 | S | S | S | S | |
| 10 | 8,72Е+02 | S | R A1401G | S | R | |
| 11 | 5,20Е+03 | S | R A1401G | R | R | |
| 12 | 4,20Е+02 | S | S | S | S | |
| 13 | 1,52Е+01 | R | S | R | S | |
| 14 | 5,99Е+04 | R gyrA 90 Alm10 GCG-GTG (Ala-Val) | S | R | S | |
| 15 | 8,68Е+00 | S | S | S | S | |
| 16 | 1,70E+04 | S | S | S | S | |
| 17 | 2,04Е+01 | R | S | R | S | |
| 18 | 1,46Е+05 | S | S | S | S | |
| 19 | 1,81Е+04 | S | S | S | S |
| 20 | 6,27Е+03 | S | S | S | S |
| 21 | 7,25Е+05 | S | S | S | S |
| 22 | 4,83Е+03 | S | S | S | S |
| 23 | 2,92Е+04 | S | R A1401G | контаминация | |
| 24 | 1,13E+04 | R gyrA 94 Alm1 GAC-AAC (Asp-Asn) | R | R | R |
| 25 | 3,75Е+03 | R gyrA 94 Alm1 GAC-AAC (Asp-Asn) | S | R | S |
| 26 | 2,12Е+04 | S | S | S | S |
| 27 | 3,23Е+03 | S | S | S | S |
| 28 | 8,02Е+02 | S | R C517T | S | R |
| 29 | 2,59Е+03 | R gyrA 94 Alm4 GAC-TAC (Asp-Tyr) | S | R | S |
| 30 | 2,60Е+05 | R gyrA 94 Alm2 GAC-GGC (Asp-Gly) | S | R | S |
| 31 | 1,05Е+04 | R gyrA 94 Alm2 GAC-GGC (Asp-Gly) | R A1401G | R | R |
| 32 | 8,95Е+02 | S | S | S | S |
| 33 | 1,99Е+03 | S | S | S | S |
| 34 | 3,05Е+03 | S | S | S | S |
| 35 | 3,28Е+05 | R gyrA 94 Alm3 GAC-GCC (Asp-Ala) | S | R | S |
| 36 | 4,15Е+03 | S | S | S | S |
| 37 | 1,23Е+04 | S | S | S | S |
| 38 | 3,11Е+05 | R gyrA 94 Alm2 GAC-GGC (Asp-Gly) | R A1401G | R | R |
| 39 | 2,15Е+05 | S | R A514C | S | R |
| R A1401G | |||||
| 40 | 1,04Е+05 | R gyrA 90 Alm10 GCG-GTG (Ala-Val) R gyrA 94 Alm1 GAC-AAC (Asp-Asn) | R A1401G | R | R |
| 41 | 4,72Е+05 | R gyrA 90 Alm10 GCG-GTG (Ala-Val) | R A1401G | R | R |
| 42 | 5,12Е+06 | S | R A1401G | S | R |
| 43 | 1,16Е+05 | R gyrA 94 Alm2 GAC-GGC (Asp-Gly) | R A1401G | R | R |
| 44 | 5,89Е+05 | S | S | S | S |
| 45 | 9,90Е+03 | S | S | S | S |
| 46 | 1,27Е+03 | S | S | S | S |
| 47 | 6,92Е+03 | S | S | S | S |
| 48 | 1,44Е+05 | R gyrA 90 Alm10 GCG-GTG (Ala-Val) | R A1401G | R | R |
| 49 | 1,09Е+04 | S | S | S | R |
| 50 | 1,21Е+04 | S | S | S | S |
| 51 | 1,53Е+05 | S | S | S | S |
| 52 | 1,37Е+05 | R gyrA 90 Alm10 GCG-GTG (Ala-Val) | R A1401G | R | R |
| 53 | 1,46Е+03 | S | S | S | S |
| Примечания:S - чувствительные; R - устойчивые Только в номерах 1, 4, 11 и 49 имеются несовпадения результатов определения лекарственной устойчивости методом ПЦР-РВ и традиционными культуральными методами.Совпадение результатов по двум видам антибиотиков - 92,5% | |||||
Результаты экспресс-анализа исследованных штаммов МБТ показали достаточно высокую чувствительность определения мутаций ДНК, ассоциированных с лекарственной устойчивостью: для фторхинолонов - 100%, для капреомицина - 96,3%, а для амикацина - 86%.
При апробации тест-системы с исследованием непосредственно клинических образцов мокроты 48 пациентов, выделявших МБТ устойчивые к рифампицину и изониазиду, устойчивость к офлоксацину методом ПЦР определена у 20 пациентов (41,7%), а к капреомицину/амикацину у 23 (47,9%). Из 20 больных с устойчивостью к фторхинолонам у 11 отмечена устойчивость и капреомицину/амикацину (55%), из 23 больных с устойчивостью к капреомицину/амикацину устойчивость к фторхинолонам отмечена у 10 пациентов (43,5%).
Уровень совпадений результатов определения лекарственной чувствительности/устойчивости стандартных культуральных исследований и с результатов, полученных с помощью разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени составил: по двум типам антибиотиков (фторхинолоны и капреомицин/амикацин) - 92,5%. Чувствительность анализа - по отношению к культуральному методу составила 90% (фторхинолоны - 90%, капреомицин/амикацин - 90%), а специфичность - 98% (фторхинолоны - 96%, капреомицин/амикацин - 100%).
Разработанная нами молекулярно-генетическая тест-система для экспресс-определения лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза к противотуберкулезным препаратам: фторхинолонам, амикацину и капреомицину способствует повышению эффективности лечения туберкулеза.
Таким образом, объект разработки обладает новизной и превосходит ближайшие аналоги.
Рисунок 1
Молекулярно-генетическая тест-система на основе технологии ПЦР в реальном времени для экспресс-определения устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) в клинических образцах к противотуберкулезным препаратам: амикацину, капреомицину и фторхинолонам, представляющая собой совокупность микропробирок с реагентами для амплификации фрагментов ДНК МБТ, кодирующих нуклеотидные последовательности с различными, в том числе мутантными аллелями, отличающаяся тем, что совокупность микропробирок представляет собой последовательную по составу комбинацию функционально и структурно связанных микропробирок, выполненных в виде стрипа, помещаемого в прибор для ПЦР в реальном времени, содержащих реакционные смеси соответствующих специфичных 5'-флуоресцентно-меченных различными флуорофорами аллель-специфичных праймеров для мультиплексной ПЦР-амплификации фрагментов генов rrs и gyr А и gyr В с обнаружением точек мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость к соответствующим указанным препаратам.
