Диагностическая тест-система на основе аптамеров
Полезная модель относится к области биотехнологии и медицины, а именно к оборудованию (приспособлениям) для проведения лабораторного анализа, с целью диагностики заболеваний.
Диагностическая тест-система, содержит n-луночный планшет, лунки которого покрыты слоем немеченых аптамеров, специфичных к заданной биологической мишени, связанных непосредственно с пластиком планшета.
Тест-система на основе аптамеров, позволяет быстро и точно диагностировать заболевания при наличии аптамеров к определенной мишени (биомаркеру заболевания). Дает возможность определять очень низкие количества биологических веществ в исследуемых препаратах, вследствие высокой специфичности аптамеров.
4 з.п. ф-лы, 2 илл.
Полезная модель относится к области биотехнологии и медицины, а именно к оборудованию (приспособлениям) для проведения лабораторного анализа, с целью диагностики заболеваний.
В настоящее время для диагностики заболеваний в большинстве случаев применяют диагностические тест-системы на основе моноклональных антител.
Известна тест-система для иммуноферментной диагностики (RU 79337 U1, G01N 15/00, 25.06.2008) на основе определения гамма-интерферона, содержащая планшет, в лунках которого сорбированы моноклональные антитела к гамма-интерферону, флаконы, содержащие раствор рекомбинантного интерферона и растворы конъюгатов, хромагена и стоп-реагента, растворы для разведения образцов и конъюгатов, а также буферные растворы, стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой, содержащие белки ESAT-6, CFP-10, туберкулин PPD и контрольный физиологический раствор с растворами антигенов.
Недостатком данной тест-системы является ее недостаточная чувствительность и специфичность к разного рода биологическим мишеням.
Известна экспериментальная тест-система для исследования клеток, представляющая собой стандартный иммунологический планшет (например, 96 луночный планшет для ИФА производитель - «Coming-Costar Co», США) в лунках которого иммобилизованы антитела, специфичные к поверхностным антигенам клеток. (См. А.В.Шишкин «Иммунологические биочипы для исследования клеток. Собственный опыт разработки. Некоторые новые подходы к проведению анализа» LAP Lambert Academic Publishing & Co. KG-2010 - с.81-87). Данная тест-система принята за прототип.
Недостатком известной диагностической тест-системы также является ее недостаточно высокая чувствительность и специфичность к биологическим мишеням, короткий срок годности, дорогое производство, вследствие использования материалов животного происхождения для получения моноклональных антител.
Задачей заявленной полезной модели является создание тест-системы, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, имеющей больший срок годности; удешевление производства тест-систем по сравнению с тест-системами на основе моноклональных антител.
Поставленная задача решается за счет того, что диагностическая тест-система, содержащая n-луночный планшет, лунки которого содержат молекулы веществ, обладающие детекцией к молекулам-мишеням, согласно полезной модели, содержит лунки покрытые слоем немеченых аптамеров, специфичных к заданной биологической мишени, связанных непосредственно с пластиком планшета.
В тест-системе все лунки планшета могут быть покрыты слоем аптамеров, специфичных к одной заданной биологической мишени (одному диагностируемому заболеванию).
В тест-системе все лунки планшета могут быть разделены на группы, при этом лунки разных групп покрыты слоем аптамеров, специфичных к разным заданным биологическим мишеням (разным диагностируемым заболеваниям).
Тест-система может содержать контрольные лунки, при этом в лунках с отрицательным контролем нижний слой представлен немечеными аптамерами, (немеченой библиотекой аптамеров), а в лунках с положительным контролем нижний слой представлен биотинилированными аптамерами, специфичными к мишени.
Тест система может содержать планшетный спектрофлуориметр.
Новизна предлагаемого решения состоит в применении искусственных антител-аптамеров для создания диагностических тест-систем нового поколения. С помощью технологии SELEX удается подобрать высокоспецифичные искусственные антитела-аптамеры практически к любой мишени (от маленьких неорганических ионов до интактных клеток). Благодаря высокой чувствительности аптамеров можно обнаружить наличие возбудителей заболевания или продуктов распада опухоли в биологических жидкостях на начальной стадии развития болезни. Поэтому аптамеры можно использовать как основу для диагностических тест-систем.
Технический результат выражается в повышении точности и удешевлении диагностики заболеваний и достигается за счет того, что аптамеры, используемые для покрытия лунок планшета, обладают высокой специфичностью к заданным мишеням, имеют более низкую стоимость, чем моноклональные антитела.
Заявляемая полезная модель поясняется чертежами.
На фиг.1 чертежа схематично представлена диагностическая тест-система;
на фиг.2 схема работы тест-системы (на примере аптамеров с флуоресцентной меткой).
Тест система содержит планшет 1 с лунками 2, покрытыми слоем 3 немеченых аптамеров, специфичных к биологической мишени, контрольными лунками 4. Возможно использование иммунологических 96 или 384 - луночных иммунологических планшетов.
Диагностическую тест-систему на основе аптамеров получают следующим образом. При проведении селекции аптамеров выбирают аптамеры из раунда, обладающего наибольшей специфичностью связывания с клетками-мишенями. В каждую из лунок 2 планшета 1 помещают раствор немеченых аптамеров, специфичных к биологической мишени в фосфатном буфере, содержащем Ca2+ и Mg2+. Для создания диагностической тест-системы при проведении селекции аптамеров выбирают аптамеры из раунда, обладающего наибольшей специфичностью связывания с клетками-мишенями. Объем раствора зависит от размера лунки, необходимо, чтобы было покрыто все дно. Раствор равномерно распределяют по поверхности лунки. Буфер должен быть близким по составу или таким же, который использовался при селекции аптамеров. Фосфатный буфер с магнием и кальцием содержит все необходимые соли и ионы для формирования третичной структуры, способной к специфичному связыванию.
Готовят контрольные лунки. Лунки отрицательного контроля (в 2-х повторностях) содержат нижний слой немеченных аптамеров, подготовленный описанным выше способом. В лунках положительного контроля (в 2-х повторностях) нижний слой содержит биотинилированные аптамеры, специфичные к мишени.
Для прикрепления аптамеров к планшету его оставляют не менее, чем на 10 часов при температуре 4°C, при такой температуре аптамеры не деградируют, но такой температуры достаточно, чтобы аптамеры прикрепились к планшету.
Затем буфер с несвязавшимися аптамерами удаляют.
Лунки промывают дважды 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере, содержащем Ca2+ и Mg2+. Бычий сывороточный альбумин неспецифически связывается со стенками лунки и экранирует неспецифические сайты связывания, т.е. ни образцы, ни мишени не будут связываться со стенками лунки. Альбумин можно заменить экстрактом дрожжевой РНК, или skrembled salmon sperm DNA.
Тест-система работает следующим образом (на примере аптамеров с флуоресцентной меткой).
После удаления промывочного буфера в лунку вносят равное по объему количество двукратного фосфатного буфера с Mg2+ и Ca2+ и исследуемого образца. Контрольные лунки с отрицательным контролем заполняют в следующей последовательности:
средний слой - исследуемый образец;
верхний слой - меченую библиотеку аптамеров.
Контрольные лунки с положительным контролем в последовательности:
средний слой - стрептавидин;
верхний слой - аптамеры, меченые с одной стороны биотином, с другой стороны - флуоресцентной меткой.
Через 30 минут исследуемые образцы удаляют и лунки дважды промывают фосфатным буфером, этого времени достаточно, чтобы мишени связались с аптамерами. В зависимости от аптамеров можно удалять образцы через меньшее время. Увеличение времени инкубации, не должно влиять на связывание.
В лунки добавляют аптамеры с флуоресцентной меткой и выдерживают их там при комнатной температуре (температура может быть изменена в зависимости от типа аптамеров) для связывания со своей мишенью 30 мин. Несвязавшиеся с биологической мишенью аптамеры с флуоресцентной меткой удаляют и лунки промывают фосфатным буфером.
С помощью планшетного спектрофлуориметра определяют уровень флуоресценции. Уровень флуоресценции будет зависеть от количества связавшихся с биологической мишенью аптамеров с флуоресцентной меткой. При наличии мишени уровень флуоресценции должен быть выше, чем в отрицательном контроле, а также может быть выше, чем в положительном.
Диагностические тест-системы на основе аптамеров (искусственных антител) обладают большей чувствительностью и специфичностью, чем тест-системы на основе моноклональных антител и имеют больший срок годности. Кроме того, искусственные антитела дешевле в производстве, поскольку синтезируются химически, а не требуют для своего получения использования тканей животных.
В предлагаемой тест-системе аптамер не биотинилирован, и связывается не со стрептавидиновым покрытием планшета (такой метод используется в некоторых видах тест-систем), а с пластиком планшета, что удешевляет проведение диагностических исследований.
С помощью тест-систем на основе аптамеров, можно быстро и точно диагностировать практически любое заболевание при наличии аптамеров к определенной мишени (биомаркеру заболевания). Возможно определение очень низких количеств биологических веществ в исследуемых препаратах, вследствие высокой специфичности аптамеров.
1. Диагностическая тест-система на основе аптамеров, содержащая n-луночный планшет, лунки которого содержат молекулы веществ, обладающие детекцией к молекулам-мишеням, отличающаяся тем, что лунки планшета покрыты слоем немеченых аптамеров, специфичных к заданной биологической мишени, связанных непосредственно с пластиком планшета.
2. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что все лунки планшета покрыты слоем аптамеров, специфичных к одной заданной биологической мишени (одному диагностируемому заболеванию).
3. Диагностичекая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что все лунки планшета разделены на группы, при этом лунки разных групп покрыты слоем аптамеров, специфичных к разным заданным биологическим мишеням (разным диагностируемым заболеваниям).
4. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что содержит контрольные лунки, при этом в лунках с отрицательным контролем нижний слой представлен немечеными аптамерами, (немеченой библиотекой аптамеров), а в лунках с положительным контролем нижний слой представлен биотинилированными аптамерами, специфичными к мишени.
5. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что содержит планшетный спектрофлуориметр.
