Способ идентификации лосося,кумжи и их гибридов

 

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛОСОСЯ , КУМХИ И ИХ ГИБРИДОВ, предусматриBaKKfift взятие у рыб образцов тканей , приготовление экстракта белков этих тканей, электрофорез экстракта белков в полиакриламидном геле, и нкубйрование геля, получение электрофорегра1«1« видеоспецифических белков и сопоставление последних со ста«дарта1Ф1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью ускорения процесса и повышения точности видовой идентификации, а также возможности проведения анализа различных возрастных групп р«б, элек-. трофорез экстракта белков в полиакриламидном геле осуществляют в течение 30-40 мин, гель инкубируют в растворе 4-метилумбеллиферилацетата в течение 20-60 с, а получение электрофореграмм проводят путем сканирования геля в ультрафиЬлетов я4 свете. СО О) 00 со о hd

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИН (1% (И) .

Зев А 01 К 61 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABYOPCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ Р ) 3275513/28-13 (22) 07.04.81 (46) 30. 12. 83. Вюл. в 48 (72) В.И.Слынько и С.К.Семенова (71) Институт общей генетики AH СССР (53) 639 ° 3.03(08Я. 8) ,1,56) .1 ° Tsuyuki Н; !(оЬВ ts Е, :Gddd REA muscle,proteins of Pacific фаЪвол (oncorTnonus) сообщение Б, The еервгай1ол of muscle proteins

so1uble in low ionic strength salt so1utlons by storch eIectrophoresis"

Canadian Journa1 of Biochemistry алд Physiology, 1962,. vol (!О, р 419-936.

2. Payne R.H., (hi ld А.R. and Forrets

"The ех14Чеа се of natural hybrids

between the European trout and At"

lantic: sa1mon. iournà1 of Fi sh В1о1оду ч 4, В 2, 1972, р. 233"236. (54) (57) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛОСОC8, KAKH H HX ИБРИДОВ, предусматривакКкй взятие у рыб образцов тканей, приготовление экстрак- та белков этих тканей, электрофорез экстракта белков в полиакрилавмдном геле, ннкубирование геля, получение электрофореграмм видеоспецифических белков и сопоставление последних со стандартамн, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью ускорения процесса и новы(цения точности видовой идентификации, а также возможности проведения анализа различных возрастных групп рыб, элек-. трофорез экстракта белков в полиакриламидном геле осуществляют в Е течение 30-40 мин, гель инкубнруют в растворе 4-метилумбеллнферилаце тата в течение.20-60 с, а получение электрофореграмм проводят путем С„ сканирования геля в ультрафиолетовом свете.

968902

Изобретение относится к рыбной промышленности, а именно к способам идентификации лосося, кумжи и их гибридов, и может быть использовано для определения качественного состава и количественной оценки промысловых уловов лососей в Балтийском море отдельно по видам при искусственном воспроизводстве, включающем селекцию производителей рыб отдельно по виду "лосось" (Salmo solar и виду "кумжа" (Salmo trutta Z) cl последующей выбраковкой межвидовых гибридов, а также при осуществлении контроля чистоты видов в возрастных группах молоди, выращиваемой на рыбоводных заводах.

Известен способ идентификации лосося, кумжи и их гибридов, включающий взятие у рыб образца скелет" ной мышцы, измельчение его в равном объеме трис НС1 буфера и центрифугирование в течение 1 ч для получения экстракта белков, электрофорез белков в крахмальном геле в течение

25 ч, после чего гель помещают на

4 ч в 7%-ную уксусную .кислоту для коагуляции белков и иХ локализации, белки окрашивают путем,выдерживания геля в течение 15 мин в

7%-ной уксусной кислоте, содержащей

1% красителя "Амидочерный 10В", затем избыток красителя удаляют иэ геля, промывая его несколькими объемами 7%-иой уксусной кислоты в течение 14-18 ч и получают на геле полосы окрашенных белков в виде спектров, которые сравнивают со стандартными спектрами видоспецифических белков скелетных мышц, на основании чего идентифицируют принадлежность исследованных рыб к определенному виду Ц

Однако известный способ не требует больших затрат времени и не может быть использован при оценке показателей вылова лососей по видам, поскольку операция по иссечению образцов скелетных мышц нарушает целостность кожного покрова и, следовательно, снижает товарную ценность рыб иэ промысловых уловов, поступающих на предприятия рыбообрабатывающей промышленности.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ идентификации лосося, кумжи . и их гибридов, сущность которого состоит в том, что у исследуемых рыб берут образец крови, образец центрифугируют и фильтруют для получения экстракта белков, проводят электрофорез полученного экстракта . белков в полиакриламидном геле в течение 3 ч, затем гель инкубируют в течение ночи в слабом растворе индьксилацетата и получают электрофореграммы видеоспецифических белков и сопоставляют последние со стандартами $2), Этот .способ также является длительным, что не позволяет использовать его в производственных усльвиях. Не может быть Использован способ и при работе с молодью рыб, поскольку у последних очень сложно получить образец крови ввиду незна.чительных их размеров.

) 10 Кроме того, известный способ недостаточно точен.

Целью изобретения является ускорение процесса и повьааение точности видовой идентификации, а также воз15 можность проведения анализа различных возрастных групп рыб.

Для достижения поставленной цели в способе идентификации лосося, кумжи и их гибридов, предусматриваю20 щем взятие у рыб образцов тканей, приготовление экстракта белков этих тканей, электрофорез экстракта белков в полиакриламидном геле, инкубирование геля, получение электро 5 фареграмм видеоспецифических белков и сопоставление последних со стандартами, электрофореэ экстракта белков в полиакриламидном геле осуществляют в течение 30-40 мин, гель инкубируют в растворе 4-метилумбеллиферилацетата в течение 20-60 с, а получение электрофореграмм проводят путем сканирования геля в ультрафиолетовом свете.

Способ осуществляют следующим

З5 образом. У исследуемых рыб берут образец тканей мышц или внутреннего органа (скелетная мышца, мышца сердца, печень, мозг, кишечник) . Образец обрабатывают 20%-ной сахарозой в

40 процессе его измельчения, отстаивают измельченный образец для получения экстракта белков данной ткани в течение 1-2 мин и проводят электрофорез в блоке полиакриламидного

45 геля известным способом в течение

30-40 мин, затем гель помещают в

0,003%-ный раствор Флюоресцирующего субстрата-4-метилумбеллиферилацетата для инкубации, которую осуществля ют в течение 20-60 с, После инкубации сканируют гель в проходящем или отраженном ультрафиолетовом,свете для получения электрофореграмм видеосцецифичного белка

4-метилумбеллиферилацетатэкстразы, которые сравнивают с известными стандартными электрофоретическими вариантами 4-метилумбеллиферилацетатэкстеразы лосося, кумжи и их гибридов.

60 Пример. у исследуемых рыб получают образец ткани, например, кишечника весом 50 мг. Образец помещают в пробирку, приливают 3 объема (по весу образца) 20%-ной caxa6g розы, раздавливают его стеклянной

968902

Содержание, Ъ

Места обитания рыб

Квалификация по документам р/завода

Год гибрид лосося и кумжи лосось кумжа

19 79 Произ водители лосося

100 р. Нева

;:р, Нева

100

1980 Производители лосося

18,8 р. Нарова (Ленинградская область) 37,7

43,5

Производители лосося

1980

Нарвский рыбоводный завод

Се гол ет ни лосося

4,4

95,6

1980,Рыбоводный завод "Томе" (Латвийская CCP) Се гол ет ки лосося

100

1980. Рыбоводный завод ."Карли" (Латвий ская ССР) Двухлетки лосося

0,04

99,6

1980

Рыбоводный завод

"Карли" (Латвийская ССР) Се голетки кумжи

2,6

97,4

1980

ВНИИПИ Заказ 10601/8 Тираж 721 Подписное

Филиал ППП "Патент",r.ужгород,ул.Проектная,4 палочкой, отстаивают измельченный образец в течение 1 мин, отсасывают надосадочную жидкость, содержащую белки данной ткани, и проводят электрофорез в блоке полиакриламидного геля в течение 30 мин. После окончания электрофореза гель извлекают из злектрофоретической камеры, помещают в 0,003%-ный раствор флюоресцирующего субстрата-4-метилумбеллиферилацетата (4МУО} на 30 с и затем сканируют гель в проходящем или отраженном ультрафиолетовом свете. При сканировании в геле видны четкие флюоресцирующие электрофоретические варианты 4-МУФ-Эст в виде дискрет- 15 ных полос, которые сопоставляют с известными стандартными электрофоретическими вариантами 4-МУФ-Эст лосося, кумжи и их гибридов. Результаты видовой идентификации рыб регист- 7п рируют в,протоколе.

B 1979 и 1980 г этим -способом были проанализированы промысловые уловы лососей нз рек Лснинградской области и группы молоди, выращиваемой на рыбоводных заводах Латвийской

CCP и Ленинградской области. Результаты видовой идентификации производителей и молоди лососей приведены в таблице.

Результаты генетико-биохимического определения долей лосося, кумжи

1и их гибридов в промысловых уловах и в группах заводской молоди (Латвийская ССР, Ленинградская обл).

Использование предлагаемого способа генетико-биохимической идентификации лосося, кумки и их гибридов в промысловых уловах и в группах заводской молоди дает возможность осуществлять видовую идентификацию лососевых рыб в течение 1 ч, начиная с момента получения образца тканей для анализа, позволяет использовать для анализа наряду с кровью и скелетными ьышцами другие виды тканей или органов рыб, что не нарушает их товарной ценности.

Кроме того, предлагаемый способ может быть использован для качественной и количественной оценки по видам промысловых уловов лососей, поступающих на предприятия рыбообрабатывающей промышленности и на рыбоводные заводы, а также для осуществления в. сжатые сроки эффективной селекции производителей, используемых в искусственном воспроизводстве запасов лосося и кумжи и для контроля чистоты видов в группах молоди,, выращенной на рыбоводных заводах.