Способ получения стероида

Союз Соввтеммк

Социвлиетичееммн Рвепублии

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

«»89.6070 (61) Дополнительное к авт. свил-ву— (22)Заявлено 3L1Q78 (21) 2706807/28-13 с присоединением заявки 1Е— (23) П риоритет— (51)M. Кл.

С 12 P 1/00

А 61 К 37/24

91ауАа9атаеннын квинтет

СССР ао аелаи нзабретеннй н аткрытнй

Опубликовано 070182. бюллетейь И1

Дата опубликования описания0701.82 (53) Уд К577. 17 (088.8) Г.К. Скрябин, К.А. Кощеенко, Е.A. Борма

Л.В. Андреев, И.Б. Романова и Н.Г. (72) Авторы изобретения

Институт биохимии и физиологии микроорга

АН СССР (7I ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СХЕРОИДА

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения лекарственных стероидов.

Известен способ получения стероида путем микробиологического гидролиэа эфира стероида с последующим выделением целевого продукта (l ).

Однако известный способ обеспечивает незначительный выход целевого продукта (40Z).

Цель изобретения — повышение выхода стероида.

Цель достигается тем, что способ получения стероида осуществляют путем микробиологического гидролиза эфира стероида е последующим выделением целевого продукта, а гидролиз ведут с помощью штамма

Arthrobacter citreus ИБФМ B-51

Arthrobacter citreus ИБФМ В-185

Brevibacterium 1нйеив ИБФМ В-134

Brevibacterium citreum ИБФМ В-131 или

Corunebacterium insidiosum ИБФМ В-137

Микробиологическую трансформацию проводят любым известным способом (растущей культурой или отмытыми клетками), стероид вносят в органическом растворителе или в микрокристаллическом состоянии.

Пример 1. Культуру Arthrobacter citeum ИБФМ В- 51 поддерживают на кукурузно-глюкозном агаре, Х: глюкоза 1; кукурузный экстракт 1; агарагар 3; водопроводная вода до l л; рН 6,8-7,2. Дпя выращивания микроорганизма используют 750 мл колбы Эрленмейра, содержащие 150 м>т среды анало13 гичного состава но без агар-агара.

Для засева с косяков делают смыв

7,5 мл стерильной водопроводной водой.

В колбу со 150 мл среды вносят 5,0 мп бактериальной суспензии, содержащей

2,0 г/л клеток. Биомассу измеряют нефелометрически с последующим пересчетом на вес сухой биомассы. Культуру выращивают 24-26 ч на качалке

180 o6/мин при 28 тC до содержания

3 896070 4 биомассы 2-3 г/л, затем вносят сте- туральной жидкости показывают, что роид — 21-ацетат кортизона (300 мг) содержание гидролизованного стероида, в этанольном растворе (10 мл). кортизона, составляет 95Х.

Конечная концентрация стероида со- Аналогичным образом используют дпя ставляет 2 г/л. Через 48 ч трансфор- гидролиза ацетата кортизона (2 г/л) мации процесс заканчивается. Резуль- растущие клетки следующих штаммов. таты хроматографического анализа куль- Результаты анализов приведены в;табл.1.

Т а б л и ц а 1

Штамм

Количество гидролизованного стероида (через 24 ч трансформации),7.

Arthrobacter citreus В-185

Brevibacterium citreum В-131

Brevibacterium luteum В- 134

Corynebacterium insidiosum B-137

98

95

Пример 2. Культуру Arthrobac te r c i t reus В-51 выращивают аналогично примеру 1.

После выращивания клетки отделяют центрифугированием при 6000, 20 мин, ресуспендируют в стерильной водопроводной воде до необходимой концентра- 30 ции (8 г/л) и используют для трансформации, Трансформацию осуществляют в условиях, аналогичных выращиванию, в

750 мл колбах Эрленмейра, содержащих

150 мл реакционной смеси, Микрокристаллический стероид — 21-ацетат кортизона (величина частиц 5-30P) вносят, до конечной концентрации 100 г/л.

Через 10-12 сут трансформации заканчи- 40 вается, культуральную жидкость отфильтровывают на воронке со стеклянным пористым дном (фильтр Ф 1) с одним бумажным и двумя полотняными фильтрами. Осадок с фильтра переносят в кол- 45 бу и кипятят 30 мин с 30-кратным избытком изопропанола. Операцию повторяют трижды, декантируя раствор и добавляя новую порцию растворителя.

Объединенный изопропанольный раствор

50 кортизона обрабатывают 0,3 г активированного угля при комнатной температуре (20 ч). Уголь отфильтровывают с помощью стеклянного пористого фильтра 11- 4 и фильтрат упаривают до объема 10-15 мл. Концентрированный раст55 вор охлаждают и выдерживают 20 ч при

0 С. Осадок (кортизон) отфильтровыб вают, промывают охлажденным изопропаиолом и сушат в вакуум-эксикаторе до постоянного веса.

Из 4,85 г ацетата кортизона получают 3,6 r кортизона (82,0X от теоретического). Т. пл. 219-221 С Е 1См

= 450 (в метаноле). Примесь ацетата кортизона составляет 17 и 201э-оксипроизводного кортизона — следовые количества.

Из маточного раствора путем экстракции этилацетатом и последующей перекристаллизации сырого продукта из изопропанола дополнительно выделяют

0,15 г кортизона с Т. пл. 214-71 С, Е " = 430 (в метаноле). Общий выход

1см кортизона составляет 85,5Х от теоретического количества.

Пример 3. Выращивают культуру Arthrobacter citreus ИБФИ В-51 аналогично примеру 1. Дпя трансформации используют клетки, отделенны от среды, ресуспендированные в водопроводной воде, в количестве 3 r/ë.

Стероид, микрокристаллический 21-аце" тат преднизона (величина частиц 530,ц ) вносят в концентрации 10 г/л.

Трансформацию осуществляют в услоиях, аналогичных выращиванию.

Через 48 ч трансформации культуральную жидкость (общий объем 200 мл:

:100 мл ферментативной смеси+100 мл дистиллированной воды для смыва) экстрагируют этилацетатом 4 раза по

200 мл. Раствор экстрагируют этилацетатом 4 раза по 200 мп. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и упаривают при 20 С на роторном испарителе

6070 Ь выход преднизона 0,72 г (85X от теоретического количества).

Кроме ацетата кортизона и ацетата преднизона культура Arthobacter cit5 reus ИБФМ В-51 осуществляет трансформацию других эфиров стероидов(табл. 2). В условиях выращивания, описанных в примере 2, для трансформации используют отмытые клетки при биомассе 2 г/л и концентрации стерои. да 1 г/л. Как следует иэ данных хроматографического анализа выход продуктов трансформации составляет 95-100Х.

Результаты гидролиза различных

15 эфиров стероидов культурой Arthrobac-.

ter citreus ИБФМ-51 (по данным хроматографического анализа система бенэол ацетон 3 3 1 силуфол UV<< ) при ведены в табл. 2.

20 Та блица 2 до объема 5-7 мл. Конце.|трированный раствор преднизона охлаждают и выдерживают 20 ч при О С, промывают охлажденным иэопропанолом, сушат в вакуумэксикаторе до постоянного веса. Из

0,95 r ацетата предниэона получают

0,70 г преднизона (827 от теоретическог количества), Т. пл. 224-220 С, Е,!с 440 (в метаноле) .

Примесь ацетата преднизона составляет 1Х и 20 P -оксипроизводного преднизона — следы.

Иэ маточного раствора путем экстракции этилацетатом и перекристаллизации сырого продукта из изопропанола дополнительно выделяют 0,02 г . преднизона с Т. пл . 220-222 С. Общий

Количество гидролизованного стероида Ж, через, Субстрат

24 ч трансформации

21-Ацетат эпигидрокортизона

100

21-Ацетат эпипреднизолона

100

21-Ацетат вещества "Б"

Рейхштейна

95

2!-Ацетат1 вещества

Рейхштейна

70

21-Ацетат гидрокортизона

21-Ацетат предниэолона

90

100,3 -ацетат дегидроэпиандростерона

36-ацетат 1Ы.-дегидропрегненолона

100

50 100

Предложенный способ позволяет уве- ния выхода стероида, гидролиз ведут личить выход стероида с 403 известным с помощью штамма способом до 80-98Х. Arthrobacter citreus ИБФМ В-51, Arthrobacter citreus ИБФМ В-185, Brevibacterium 1uteum ИБФМ В-134, Формула изобретения Brevibacterium ci treum ИБФМ В-131 или

Способ получения стероида путем, СогупеЬасйег1um insidiosum ИБФМ В-137. микробиологического гидролиэа эфира Источники информации, стероида с последующим выделением принятые во внимание при экспертизе

55 целевого продукта, о т л и ч а ю— 1. Патент США У 2908696, шийся тем, что, с целью повыше- . кл. 260-397, 45, 1968.

ВНИИПИ Заказ 11631/10 Тираж 504 Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектна, 4