Способ выделения аутопротромбина с

Авторы патента:

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗЬВРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<п>890248 (6!) Дополнительное к авт. саид-вувЂ” (22)Заявлено 11.02.80 (2!) 2899285/28-13 с присоединение«в заявки МвЂ” (23) ПриоритетвЂ” (51)A%. Кл.

G 01 N 33/48 тоеударстмнный квинтет

СССР оо авлаи нзворвтеннй н открытий

Опубликовано 15.12.81. о«оллетень .РВ 46

Дата опубликования описания 15 . 12 .81 (53) УДК612.13 (088. 8) (72) Авторы изобретения

А.Ш.Бышевский и, О.А.Терсенов,$ «4j ..«;!(д«

Тюменский государственный медицинский институт вЂ”,,1 (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АУТОПРОТРОИБИНА С .

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим способам выделения факторов свертывания крови.

Известен способ выделения аутопро5 тромбина С из крови, путем хроматографической очистки его Г1) .

Однако известный способ требует для своего осуществления большого количества длительных и трудоемких операций, на выполнение которых требуется пять суток непрерывной работы.

Целью изобретения является ускорение способа, Эта цель достигается тем, что fIQH осуществлении способа выделения аутопротромбина С из крови путем хромато" графической очистки его, аутопротромбин С выделяют из сыворотки крови, при этом ее разбавляют 0,18-0,20 M .фосфатным буфером в соотношении 1:4 соответственно при рН 7,0, далее. ее смешивают с гелем ДЭАЭ -Сефадекса

А-50, предварительно набухшим в том же буферном растворе, далее промывают гель названным буферным раствором, и целевой продукт извлекают 0,400,45 М фосфатным буфером при рН 8,18,2.

Способ осуществляют следующим образом.

Аутопротромбин С извлекают непосредственно из разбавленной 0,2 М фосфатным буфером (рН 7,0) сыворотки крови с помощью ДЭАЭ-Сефадекса А-50, который затем помещают в колонку и освобождают от сопутствующих белков пропусканием фосфатного буфера (0,2 И, рН 7,0), вытесняя после этого аутопротромбин С фосфатным буфером с рН 8,2 (0,4 М), таким образом, извлечение аутопротромбина С производят непосредственно из отделяющейся при свертывании крови сыворотки.

Il р и м е р 1. 400 мл сыворотки крови, полученной при самопроизвольном свертывании крови при 37 С в течение I ч, разбавляют 1:4 0,2 М фос-.

0248

Предложенный способ

Известный способ

Название операции

Адсорбция протромбинового комлекса сульфатом бария, элюирование цитратом

6 Отсутствует

Освобождение от ионов цитрата диализом

36 Отсутствует

Высаливание сульфатом аммония и обессоливание с помощью диализа

32 Отсутствует

Изоэлектрическое осаждение протромбинового комплекса и его концентрация

4 Отсутствует фатным буфером с рН 7,0. К разбавленной сыворотке приливают набухший декантированный гель ДЭАЭ-Сефадекса

А-50 (12 r в 0,2 М фосфатном буфере с рН 7,0). Смесь экспонируют при комнатной температуре 0,5 ч при непрерывном помешивании. Затем смесь вносят в стеклянную колонку (30х900 мм), позволяя жидкости свободно стекать, После сформирования столба геля колонку промывают тем же буфером (700 мл).

Затем через колонку пропускают со скоростью 20 капель в минуту 0,4 M фосфатный буфер с рН 8,2., собирая вытекающую жидкость порциями по 8 мл.

Выход белка из колонки устанавливают по оптической плотности растворов при

280 нм. Фракции, содержащие белок, объединяют, охлаждают при 0 С, и удаляют выпавшие при этом кристаллы Фосфатов центрифугированием. Раствор белка разбавляют в 2 раза дистиллированной водой и вновь смешивают с гелем

ДЭАЭ-Сефадекса А-50 (12 г геля,набухшего в 0,2 И фосфатном буфере с рН

7,.0). После экспозиции в течение

0,5 ч повторяют фракционирование на колонке. Белоксодержащие фракции объединяют на колонке (Акрилекс П-60, 40Х300 мм), контролируя выход белка по оптической плотности при 280 нм.

Фосфаты в полученных фракциях белка не обнаруживались. Полученный белок представляет собой аутопротромбин С, гомогенный по данным диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата.

При многократном применении способа выход гомогенного аутопротромбина С составляет 33-2,6 мг из 1 л сыворотки. В пробе "Частичное тромбопласти- . новое время плазмы" 0,03 мг аутопротромбина C сокращают время свертывания с 120-6,8 до 40,1-0,9 с.

Пример 2. Кровь, полученную из яремной вены быка, помещают на

1 ч при 37ОС. Сыворотку отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 1500 об/мин. 400 мл сыворотки разбавляют 1:40,2 M фосфатным буфером (рН 7,0). К разбавленной сыворотке приливают гель ДЭАЭ-Сефадекса А-50 (12 г набухшего геля), смесь экспонируют 0,5 ч при комнатной температуре, непрерывно помешивая. Смесь вносят в стеклянную колонку (30X900 мм), позволяя стекать жидкости. После сформирования столба геля колонку промывают тем же буфером (700 мл), а затем пропускают через колонку 0,4 M

Фосфатный буфер с рН 8,2, собирая вытекающую жидкость порциями по 8 мл.

Белоксодержащие фракции (порции элюата 30-36) объединяют и подвергают рехроматографии при тех же условиях, Белоксодержащие фракции (порции элюата 29-37) охлаждают при О С, выпавшие кристаллы фосфатов отделяют центрифугированием и хроматографируют на колонке с Акрилексом П-60 (40300 мм). Собранный обессоленный белок (0,3 мг в 1 мл, общий объем

45 мл) подвергают проверке в тесте

"Тромбопластиновое время плазмы" с частичным (неполным) тромбопластином, обнаружено укорочение времени свертывания с 120 до 4 1 с. Часть раствора концентрируют и подвергают дискэлектрофорезу s присутствии додецилсульфата. Исследуемый белок движется при электрофорезе в виде одной полосы, что свидетельствует, об однородностИ, т.е. чистоте продукта.

Сравнительные данные, подтверждающие преимущества предложенного способа выделения аутопротромбина С, приведены в таблице.

Название опера- Врем ции . ч

$ 890248 .б

Продолжение табл. обходимого для выделения аутопротромбина С, в три раза.

Предложенный способ 1 формула изобретения

Способ выделения аутопротромбина азвание опе- С из крови путем хроматографической очистки его,. о T Jl H ч а ю g H Й c R тем, что, с целью ускорения способа, Известный способ

Название операции

Время

Активация протромбинового комплекса и освобождение от . взвеси тромбопластина

Активация путем самопроизвольного свертывания крови

Ионообменная хроиатография на ДЭАЭ-;целлулозе

Связывание фактора Ха с ионообиенником и хроматография на ДЭАЭ-Сефадексе А-50

Обессоливание аутопротромбина С

Обессоливание кутопротроибина С

Составитель l0.Àëìàçoâ

Редактор О,Персиянцева Техред М. Надь Корректор Г Orap

Заказ 10960/71 Тираж 910 Подписное

ВНИИПИ Государственйого комитета СССР

llo делам изобретений. и открытий

113035 Москва Щ"35 Рамшская наб. д.4/5

H2» - ---- вЂ” 2---

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4

Предложенный способ позволяет сократить число операций и времени,неаутопротромбин С выделяют из сыворотки крови, при этом ее разбавляют.

0,18-0,20 М фосфатным буферои.в соотношении 1:4 соответственно при рН

7,0, далее ее смешивают с гелем

ДЭАЭ-Сефадекса A-50, предварительно набухшим в том же буферном растворе

t далее промывают гель названным буферным растворои, и целевой продукт извлекают 0,40-0,45 М Фосфатным буфером при рН 8,1"8,2.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Стручкова С.М., Баскова И.П., Сучкова С.Н. Влияние аутопротромби-. на С на процесс тромбиногенеза в нормальной плазме и плазме, лишенной фактора ХП.-Биохимия. 1969, 34, 4, с.816-823.

Способ диагностики остеопороза // 885882

Реактив для определения скрытой крови // 885881

Способ разделения смеси биологических частиц // 879469

Способ диагностики неврологических осложнений сифилиса // 879370

Способ определения криза отторжения трансплантированной почки // 877435

Способ выявления капиллярной сети надпочечников // 877393

Способ приготовления гистологического препарата твердой мозговой оболочки спинного мозга // 877392

Способ определения коагуляционных свойств крови // 875281

Способ определения концентрации форменных элементов крови // 864130

Способ контроля состояния сельскохозяйственных и пищевых веществ или лекарственного препарата и устройство для его осуществления // 2100805

Способ определения в пробе цельной крови распределения вероятностей в популяции эритроцитов их подмножеств и устройство для его осуществления // 2100807

Способ определения гетероциклических нитросоединений в биологическом материале // 2100808

Способ выявления лимфоидных узелков в тотальных анатомических препаратах // 2101699

Изобретение относится к медицине, а именно к анатомии, топографической анатомии, патологической анатомии и может быть использовано для изучения лимфоидных узелков в тотальных анатомических препаратах макромикроскопическом поле видения в норме, в возрастном аспекте, в эксперименте и патологии

Способ ионного парамагнитного резонанса на нервном волокне // 2101700

Изобретение относится к медицине, в частности к способам неинвазивной диагностики функционирования биологических мембран и соответствующей оценке метаболических процессов в организме на клеточном уровне

Способ прогноза хронического рецидивирующего течения заболевания у лиц, перенесших первичную рожу // 2101701

Изобретение относится к медицине, а именно инфекционным болезням и дерматологии, и может найти применение как в стационарных, так и поликлинических условиях

Способ определения реактивного лизиса клеток // 2101702

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для определения реактивного лизиса клеток в содержащей комплемент биологической жидкости в клинической практике и в научных исследованиях

Способ определения наличия активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите // 2101703

Изобретение относится к медицине и предназначено для оценки активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите путем биохимического исследования сыворотки крови

Способ дифференциальной диагностики миокардита и миокардитического кардиосклероза // 2102749

Устройство для локального подведения биологически активных веществ // 2102750