Способ получения @ -амилазы

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) 3(59 С 12 N 9 2.8 // С 12 N 15 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 2711504/28-13 (22 ) 10. 01. 79 (46) 23. 11.83. Бюл. Р 43 (72 ) Л. М. Ермакова, Н. П. Шурупова, Т. И. Иванова, Г. В. Ставинская, В. A. Удовченко, Н. С. Дерканосова и В. М. Степанов (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (53) 663.53(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР по заявке М 2588998/13, кл. С 12 D 13/10, 1978.

2. Авторское свидетельство СССР

Р 538024, кл. С 12 D 13/10., 1975. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ((, -АИИЛАЗЫ, предусматривающий культирование продуцента Bacillus subtilis в аэробных условиях на ферментационной питательной среде, содержащей. источники углерода - крахмал и лактозу, источник азота и фосфора— (NHp) HPO4, ростОвые факторы - белково-витаминный концентрат и кукурузный.экстракт, минеральные соли Nacl, CaCOqq K@SO4, NgSO4 ÒÍ 0, CuSO4 и воду, о т л и ч а ю ц и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и era стабильности, в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44.

2. Способ по п. 1, о т .л и ч аю шийся тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят, Ъ от ее объема, минеральные соли: СвС1у 0,08-0,15, FeCl(° 6Н О g

0,005-0,02, ZnSOg 0,001-0,003, а количество крахмала устанавливают равHbtM 16-24 (NHg)g Н Р04 0,9-2,0 NaCl д

0,08-0,3 °

841351

Изобретение относитоя к,микробиологической промышленности, а именно к способам получения 6(. -амилазы.

Препараты, содержащие М -айилазу, используются в животноводстве, пищевой, текстильной,. бумажной промыш- ленности и других областях народного хозяйства., Известен способ получения амилолитических ферментных препаратов с испольэованйем штамма .Baoillus subtilis 0

"ВНИИгенетика-42" выращиванием посевного материала на ломтиках картофеля с последующей ферментацией, в условиях аэрации на среде, содержащей крахмал, кукурузный экстракт, нитрат 15 аммония и мел. Штамм Bacillus subti—

lis ВНИИгенетика-42 в лабораторных условиях в колбах имеет активность

360-450 ед/мл за 48 ч ферментации f1) .

Однако штамм Bacillus subtilis 20

ВНИИгенетика-42 не дает оптимально высоких активностей в производственных условиях в ферментерах емкостью 20 м . Кроме того, ферментационная

9 среда, используемая для такого штамма, на производстве не позволяет получать стабильный препарат..

Известен способ получения О(-амилазы, предусматривающий культивирование продуцента Bacillus subtilis 30

0-43 в аэробных условиях на ферментационной питательной среде, содержащей,источники углерода - крахмал и лактоэу, источник азота и фосфора - (NH4)2Hp54, ростовые факторыбелково-Витаминный концентрат и кукурузный экстракт, минеральные соли

НаС1, С8,СО, К БО4, MgSO4 "7Н О, CuSOq и воду f2).

Амияолитическая активность культуральной жидкости, полученной в 40 лабораторных условиях, в колбах составляет 303 ед/мл. В промышленных условиях этот штамм при культивироЛмилолитическая активность, ед/мл

Номер ферментации

Bacillus subtilis

ВНИИгенетика-44

Bacillus subtil:is

ВНИИгенетика-42

309

233

301

226

302

208

Средняя амилолитическая активность по трем ферментациям

304

222 чен .в результате применения генетиио-селекционных методов и в промышленных условиях является более продуктивным, чем прототип — штамм

Bacillus sibtilis ЗНИИгенетика-42.

Штамм Bacillus sujtilis ВНИИгене- тика-44 является мутантом исходного штамма Bacillus subtilis В-340, полученного из Музея живых культур института "ВНИИгенетика". Штам поду- 6> ванин на ферментерах по сравнению

co m a o Bacillus subtilis ВНИИгенетика-42 не проявляет вышеотмеченной активности.

В связи с тем, что штамм Bacillus

subtilis ВНИИгенетика-42 в производственных условиях является более .активным продуцентом, сопоставительный анализ активностей проводят с учетом этого факта.

Целью изобретения является ловышение выхода целевого продукта и его стабильности.

Поставленная цель достигается тем что в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis

ВНИИгенетика-44, в состав питательной среды дополнительно вводят, % от ее объема, минерЪльные соли:

СаС1д 0,08-0,15, FeC1 6Н О 0,0050,02, .ZnSO4 0,001-0,003, а количество крахмала устанавливают..главным

16-24, (NH4) НРО4 0р9-2p0i NaC1

0,08-0,3.

Сущность спосОба состоит в том, что в условиях производства на ферментационной питательной среде нового состава, содержащей крахмал, лактозу, кукурузный Экмтракт, амилолитическая активность штамма Bacillus

subtilis ВНИИгенетика-44 на 15% выше, чем у штамма Bacillus subtilis

ВНИИгенетика-42. Так, активность штамма ВНИИ-генетика-44 в этих усло» виях через 64 ч ферментации достигает 309 ед/мл, в то время как активность штамма ВНИИгенетика-42232 ед/мл.

В таблице приведены сравнительные данные трех параллельных ферментаций с использованием штаммов Bacillus

subtilis ВНИИгенетика-42 и ВНИИгенетика-44 в производственных условиях в ферментерах емкостью 20 м . Продолжительность ферментации 60-64 ч.

841351

Ниже приведена биологическая характеристика штамма Bacillus

subtilis ВНИИгенетика-44.

Культурально-морфологические признаки шгамма Bacillus sibtilis

ВНИИгенетика-44.

Морфология. Штам представляет собой грамположительную, спорообразующую палочку, размером 2,5-4,5 х х 0,5-0,7(й . Размер спор: 1,0-1,.2 х х 0,6-0,7 р .

Культуральные и физиологические признаки.

Мясо-пептонный агар (МПА). Через

48 ч инкубации при 37 С образует . желтовато-серые плоские, круглые, 15 колонии, диаметром 2,5-3,5 мм и с лопастными краями: колонии не врас тают в агар. Поверхность гладкая, матовая.

Посев шгрихом на мясо-пептонном 20 агаре. При инкубации в течение 24 ч при 37 С рост хороший. Штрих ните0 видный с лопастным краем и гладкой, матовой поверхностью.

Посев уколом. Рост на поверхности.25

Культура аэробная.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) При инкубации в течение 24 ч при 37 С без встряхивания рост беэ помутнения среды, на поверхности образуется сухая пленка. При встряхивании на качалке — сильное помутнение среды.

При стоянии образуется пленка.

Агаризованная среда Хоттингера.

При инкубации в течение 48 ч при

37ОС образует желтовато-серые, круглые, плоские колонии с белым лопастным краем, диаметром 3,5-5 мм. Поверхность шероховатая, матовая. На синтетической среде с минеральным азотом (среза Спицайзена) растет в 40 виде мелких круглых колоний диаметром 1-2 мм серовато-белого цвета.

Поверхность матовая. Колонии срастаются с,субстратом.

На ломтиках картофеля пигмента 45 не образует, имеет матовую, сухую, морщинистую поверхность.

Желатину разжижает на вторые сутКие

Крахмал гидролиэует. 50

Молоко пептонизирует и подщелачивает.

Отношение к источникам углерода.

Глюкозу, лактозу, фруктоэу, сахарову ассимилирует.. 55

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии в стеклянных ампулах.

В отличие от прототипа, обладающего сниженной активностью щелочной протеинаеы, штамм Bacillus sibtilis

ВНИИгенетика-44 имеет нормальный уровень синтеза щелочной протеиназы.

Штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44 xpRHHTcsK B Музее )KHBblx культур института "ВНИИгенетика" под регистрационным номером ЦМПМ В-1737.

Штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44 выращивают поверхностным способом в колбах в виде пленки на жидкой питательной среде, содержащей следующие компоненты крахмал, (НН 4)У С6Н40У, KHgP04, MSSOg 7Н20, CaS04, FeSO4, MnS04, CuS04, п-аминобензойная кислота,. вода рй среды

6,0-6,3: Полученнйм таким образом посевным материалом в количестве

0,01-0,02% от объема ферментационной среды засевают аппарат емкостью

20 м, содержащий 10 м ферментационной питательной среды состава, %: крахмал 16-24, лактоза 0,2-0,3, кукурузный экстракт 0,8-1,2,. BBK

0,2-0,4, (NH4) НР04 0,9-2,0, NaCl

0,08-0,3., CaClg 0,08-0,15., СаС09

0,02-0,03, MgS04. 7Н О 0,05-0,25, К 804 0,02-0,09, FeC1 g 6НуО 0,050,02, ZnS04 0,001-0 003, CuS04

0,00025-0,00040, MnS04 0,0001-0,0002, вода,72,2-81,7.

Содержание крахмала в ферментационной питательной среде 8-10%, остальное количество крахмала добавляют в виде подпитки в ферментер во время культивирования,, Согласно предлагаемому способу не проводят полного гидролиза крахмала, входящего в состав. ферментационной среды (в том числе и добавляемого в виде, подпитки). Достаточно провести разжижение крахмала, т.е. осуществить его неполный гидролиз только до амилодекстринов (синяя окраска при реакции с йодом). В производстве по лицензии, приобретенной Советским Союзом (Главмикробиопром) у французской фирюзы "Рапидаз", в составе ферментационной среды используют глубоко осахаренный крахмал, получаемый после полного гидролиза его до декстринов (бурая окраска при реакции с йодом).

Пример 1 ° Посевной материал получают выращиванием шгамма Bacillus

subtilis ВНИИгенетика-44 в колбах в виде пленки в жидкой питательной среде состава, %: крахмал 10, (NHg)g С Н О 3 Nary H P04 О, 03, M@SO) "7HgO 0,15, KHyPOg 0,2, CaSOq 0,15., FeR04 0,002, MnS04

0,000125, CuS04 0,00075, п-аминобензойная кислота 0,001, вода 86,2, рН 6,0-6,3, температура 35-36аС.

Полученнь|й посевной материал в количестве 0,01% от объема среды в ферментере вносят в аппарат объемом

20 м9, содержащий 10 м9 ферментациоиной среды состава, % ° крахмал 24 (в среду вносят 8%, остальное добавляют в виде подпитки в ходе фермен» тации), лактоэа 0,2, кукурузный экс-. тракт 0,9, БВК 0,2, (НН4)дН Р04 1,2

841351

Составитель И. Привалова редактор 3. Бородина Техред T. Маточка, Корректор :О. Тигор

Заказ 10852/3 Тираж 523

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 аС1 0,08, Caclg 0 08, СаСО4 0,02, яS04 i 7Jlg0 0,07р КуЯ04 0,02, FeC1> 6Н,О 0,005, ZnSO< O,рр1, cuso4 0,00035, Mnso4 0,0002, вода

73,3. рН 6,5. Пеногаситель 0,05%.

Процесс Ферментации ведут при

37 С с аэрацией в течение 64 ч.

Культуральную жидкость, имеющув активность 309 ед/мл Ы -,амилазы, высушивают на распылительной сушилке. Выход готового продукта 73%.

Н р и м е р 2. Штамм-продуцент, приготовление посевного материала те же, что в примере 1. Отличие состоит в составе Ферментационной среды и температуре культивирования.

Культивирование проводят в ферментере объемом 20 м, заполненном 10 м ферментационной питательной среды следующего состава, Ъ: крахмал 16 в среду вносят 10%, остальное добав- 20 лявт в виде подпитки в ходе ферментации), лактоза 0,3, кукурузный экстракт 1,1, БВК 0,4, (ИН ) Н Р04 1,7r

NaCl 0,2, СаС11 0,12, СаС03 0,03, hfpS04 7Н <О 0;2, К РО 0,9, FeC1 6Н О 25

0,015, Zns04 0,002, (use 0 00025, Мп804 0,0001, вода 80,0. рМ 6,6.

Пендгаситель 0,05%. Процесс ферментации вецут при 34 С с аэрацией в течение 60 ч. Культуральную жидкость, 30 имеющую амилолитическув активность

301 ед/мл, высушивавт на распылительнбй сушилке. Выход сухого продукта

71%.

Преимущество способа состоит в том, что значительно сокращается время приготовления ферментационной питательной среды (2-3 ч вместо 8-10).

За счет этого увеличивается оборачиваемость оборудования, что позволит получить дополнительный экономический эффект.

Температуру ферментации поддерживают в пределах 34-37 С, рН 6-8.

Для получения высокого выхода Ф -амилазы рн поддерживается в кислой зоне.

После завершения ферментации культуральную жидкость. высушивают, стандартизуют солями и используют в качестве неочищенного ферментного препарата. Для получения очищенного препарата К -амилазы клетки после заверения фермента1 ии отделяют Фильтрованием или центрифугированием.

После отделения клеток очищенный препарат М -амилазы получают из жидкости одним из известных методов, например осаждением с поМощьв растворителя, высаливанием„ сгущением раствора и т..д. ь

По предварительным расчетам экономия от использования способа в промышленности составит 250 тыс.руб ° /год.