Способ получения препарата на основе белковой сыворотки

 

Союз Советскик

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

< «786854 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 26,01.78 (2I) 2572351/28-13 (51)М. Кл.з (32) 26 . 01 . 77

Швейцария (33). Австрия

А 61 К 35/14 (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (31) 934/77

Опубликовано 071230. Бюллетень Ио 45

Дата опубликования описания 071280 (53) УДК 611-018. .54(088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранец

Маркус Радовитц (ФРГ) Иностранная фирма

"Пласмеско АГ" (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА HA ОСНОВЕ

БЕЛКОВОЙ СЫВОРОТКИ

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается получения препарата на основе белковой сыворотки.

Известен способ получения пре- 5 парата на основе белковой сыворотки путем фракционирования плазмы с последующей адсорбцией, очисткой и сте,. рилизацией (1).

Однако известный способ не позво- 10 ляет получить препарат с высоким содержанием иммуноглобулина.

Целью изобретения является повышение содержания иммуноглобулина.

Эта цель достигается тем, что плазму освобождают от продуктов коагуляции, фракционируют по способу

Кона, из полученной после фракционирования фракции III выделяют фракции 20

1II-1 и III-IJ, последние смешивают с фракцией IV и суспендируют смесь в физиологическом растворе.

Способ осуществляют следующим образом. 25

Из плазмы удаляют сырой фибриноген, 53,3%-ный холодный этанол доводят до 8%-ной концентрации. При этом температуру поддерживают — 2,5-3,0 С.

Осадок Рт -фибриноген удаляют цени-, 30

2 трифугированием. Супернатант 51 обрабатывают дальше.

Затем к выдержанному супернатанту

S„ опять добавляют 53,3%-ный этанол, концентрацию которого в жидкости устанавливают равной 18-25%. Температуру при этом подцерживают — 5ОС, рН

5,8. Выделяется преципитат Р, который обозначают фракцией !!1-II -глобулина. Этот преципитат содержит иммунный глобуин и другие физиологически важные протеины. При температуре — 54C преципитат удаляют путем центрифугирования. Супернатант 5 подвергают дальнейшей обработке. Концентрацию этанола устанавливают 40%.

Температуру на этой ступени поддерживают равной — 7 С, а рН 5,8. Осадок также центрифугируют (Рз) и его обозначают фракцией IV. Он содержит

-Аи Ь-глобулин.

Оставшуюся жидкость, супернатант

S затем обрабатывают далее.

На этой ступени поддерживают температуру — 7ОС, рН 4,8. Концентрация этанола 40%. При этом выделяется преципитат Р, так называемый сырой альбумин, который очищают и стерилизуют. Оставшуюся жидкость, супернатант 5,ь, выбрасывают.

786854

g -глобулиновую фракцию III-11 обрабатывают далее следующим образом.

Осадок Р погружают в цитрат-фосфатный буфер с рН от 7,0 до 7,4, при температуре 15 С. Добавляют ЗЪ полиэтияенгликоль 4000 (PE Y ) или 2,5Ъ

PF 6000. 3

После реакции, продолжающейся от

30 мин до 4 час, смесь подают на центрифугу. Получают супернатант S-и фракцию 111-1 (осадок Pу).

Ф

Ь 16

Супернатант S> еще раз обрабатывают и фракционируют при рН 4,6, количество РЕ F 4000 — около 53 при температуре -15 С), Получают фракцию

II1 (осадок Р ), а также супернатант

S6, который, главным образом, содержйт.иммунный глобулин, Глобулин фракции ill 1 и III значительно обогащен иммунными глобулинами lgG, igA !9Н.

Кроме того, он содержит -антитрипсин, б(.-хаптоГлобин, церулоплазмин, траноферрин и хаемопексин.

Фракции III †u N далее не обрабатывают.

В качестве исходного продукта применяют как фракцию I×, так и фрак- 23 ции ill-i u Ill.

Их смешивают в установленных соотношениях, причем в общих протеинах содержится от 50 до 70% альбулина или от 50 до 30% глобулина. 36

Также возможно путем соответствующего повышения добавки части глобулина или фракций III-I u Ill повысить долю глобулина, IgH и, 19А.

Фракции IV, 111-! и 111 суспензиру-З5 ют в растворе поваренной соли или в другом пригодном буферном растворе, вес.Ъ:

Фракция IV 30-80

Фракция ill-i 0-70

Фракция 11! 0-70, ф) причем общее количество протеинов

100%.

Препарат на основе белковой сыворотки можно получать только из какой-либо одной из фракций 111-1 111 или IV a получить специфичные плаз, мопротеины из отдельных фракций в устойчивой, растворенной форме в качестве препарата. Препарат можно получить из смеси полученных конечных gg, продуктов фракций !l!-I !. и IV.

Вещества, смешанные в определенных соотношениях и суспензированные.в пригодном буферном растворе или в растворе поваренной соли, под-- вергают предварительной очистке. При предварительной очистке путем адсорбции на пригодных адсорбентах (аэрозил, бентонит или другие кремнийсодержащие комплексные соединения) удаляют липидные факторы * — и р,--глобулинов. После 40 этогб продукт фильтруют, диализируют и устанавливают нужную концентрацию раствора.

Для устранения вирусов производят пастеризацию путем нагрева до 60 С 65 б в течение 10 часов. Однако прн этих условиях возможна денатурация протеинов сыворотки или же обрабатывают

-пропиолактоном и ультрафиолетовыми

„лучами.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. К 300 л раствора . поваренной соли (днстиллированная вода с 1,7Ъ по весу NaCI, который получают в помощью 6,2 н. НС! с рН 4,6) добаВляют 10 kp COHN фракции 1Ч со следующим анализом белка и суспендируют, %:

Альбумина 55 А„-Глобулина 10

<А -Глобулина 8 ! †Глобули 15

Я -Глобулина -12

Фракция IЧ содержит около 50% твердых веществ (белок, соль) и 50% влажного остатка (Н О, остаточный этанол).

Далее добавляют 5 kp COHN фракции

III-l (субфракция) со следующим анализом твердых составляющих, вес.%:

Альбумина 15 б1.1-Глобулина 2 сА,р -Глобулина 13 (- Глобулина 17 -Глобулина 53 и 5 kp COHN субфракции Ill †со следующим анализом суспензируется, вес.Ъ:

Альбумина 8 о(,1-Глобулина 3

4 -Глобулина 9 р-Глобули на 25

) -Глобулина 55

Соотношение твердого вещества и влажного остатка во всех фракциях практически одинаковое.

20 kp флажной фракции суспензируют в растворе и перемешивают. При этом значение рН поддерживают постоянным и равным 4, 6. Растворимая субстанция, имеющаяся в растворе, растворяется. Имеющаяся нерастворимая субстанция дает помутнение раствора и составляет около 12% по отношению к всему количеству твердых составляющих. Среди нерастворимых веществ имеются, в частности, денатурированные глобулины, включая липопротеиды, которые на дальнейших ступенях способа не нужны. Последние удаляют путем центрифугирования.

Оставшаяся жидкость имеет слабую мутность и желтоватый цвет.

Добавляют 0,2 NaOH, .устанавливают значение рН на 7,4. В раствор до- бавляют чистую колоидную кремниевую соль до достижения концентрации

5 вес.В и все перемешивают. Жидкость подогревают до 45 С (около 1 в минуту) и значение рН поддерживают постоянным. После достижения температуры 45 С жидкость перемешивают в течение 4 часов. Во время процесса длительноустойчивые протеины

786854 соединяются с кремниевой кислотой и образуют осадок, который удаляют центрифугированием.

Жидкость, оставшуюся после центрифугирования, осветляют при пропускании ее через фильтр с активированным углем. После этого фильтрат становится прозрачным янтарного цвета.

Далее жидкость концентрируют до 25% по отношению к исходному объему с по. мощью способа диаконцентрации (миллипоры — кассетная система, мембрана — величина пор 10.000 дальтон).

После этого концентрация белка в рас-. творе составляет 3,4-4,5 вес.Ъ.

Анализ показывает, что благодаря диаконцентрационной ступени все фрак- 15 ции, составляющие кровь с молекулярным весом, меньшим 10.000, из концентрата удаляют. К ним принадлежат фракции, которые нежелательны для консервирования, например олигопептиды 20 с вазоактивным действием.

После этого для окончательного удаления примесей, а также электролитического установления диализа, обработку ведут трехкратным раствором, 0,9Ъ-ного NaC 8. Диализ проводят в одинаковых аппаратах с одинаковыми мембранами, которые применяют при концентрировании.

Последующее концентрирование заканчивают установлением концентрации протеина 6-10%. После этого с помощью раствора МаС 3 устанавливают физиологические условия изотонии, присущие человеческой крови, и об- 35 щая концентрация протеинов становится равной 5%

Анализ полученных в примере 1 протеинов показал следующие значения, мг: (содержание в 100 мл) 40

Протеин 5.000

Альбумин 2.925

I g !. 1.500

IgA 380

1дМ 285 45

Полученный раствор фильтруют дополнительно через стерилизующие фильтры. Благодаря мембранным фильтрам происходит стерильная фильтрация.

После этого препарат готов для внутривенной инъекции.

Пример 2. В 300 л раствора, как и в примере 1, растворяют, kp:

7,5 СОНМ фракции IV

4 СОНМ фракции 11-1

8 СОНМ фракции 1!1

Состав этих фракций соответствует . примеру 1 ° Фракции перемешивают с растворителем, значение рН поддерживают 4,6. В раствор добавляют 60 г на литр аэрозила И значение рН уста- d0 навливают равным 7,6 и смешивают при температуре 47 С в течение 4 часов, после этого раствор охлаждают до 18 С и гидравлически фильтруют. Гидравлическую фильтрацию производят в намыв- 65 ных фильтрах, тип CHF-S В качестве фильтровального средства используют

Hyf Po Super Сей 8II-ной концентрации на общее количество фильтрата. В качестве фильтровального средства можно применять также кизельгур целит

545 в 5%-ной концентрации .

Пример 3. После очистки растворы разделяют и подвергают обработке способом диаконцентрирэвания,как в примере 1. Их можно при желании обрабатывать до получения конечного концентрата по способу, описанному в примере 1, и после этого по выбору соединять в любой состав.

Пример 4. В 200 л фосфатноцитратного буферного раствора (0,66 моль фосфат-цитрата) растворяют

10 Мр фракции lll в течение 3 часов.

Значение рН устанавливают 7,5 и после последующего разбавления в 300 л перемешивают с упомянутым буферным раствором при добавлении 100 г/л аэрозил/бентонита (2:1) в течение

4 часов при 45 С. После охлаждения до 10оС суспензию фильтруют на намывном фильтре через фильтрат, в качестве которого применяют кизельцел т .545, количество которого на

1 м фильтровальной поверхности составляет 1,0 кг, причем мощность фильтра 50 л/м час. Фильтрация происходит как и диаконцентрирование в примерах 1-3. Раствор готового конечного концентрата содержит 5% белка. При этом средний состав следующий, мг:

Протеин 5000

Альбумин Около 1800-2000

Глобулин 3.00 0- 3 2 00

Ig× Около 1.450

IgA Около 700

IgM Около 500

Пример 5. СОНМ фракции I †I и IV-1 с концентрацией этанола 40% и со значением рН 5,8 выделяют в ступени. Под фракцией IV-I следует понимать фракцию, идентичную фракции IV.

Осадок изолируют 20 кг преципитата, как и в примере 1 погружают в

300 л растворителя и далее обрабатывают.

Пример 6. Фракционирование человеческой плазмы производят спомощью риванола (2-этокси-6,9-диамино-ацидинилацетат), при этом выпадают осадки II, Ill u IV. Эти осадки можно по предлагаемому способу обрабатывать до получения препарата белковой сыворотки. По 10 1 р каждого осадка, т.е. вместе это составляет 30 kp, вносят в 300 л растворителя,как и в примере 1. Дальнейшую обработку производят также, как и в примере 1.

Пример 7. В 200 л раствора поваренной соли (дистиллированная вода с 1,7 вес.Ъ МаС С, у которой ве.

786354

Формула из обрете ни я

Составитель С. Малютина

Редактор В. Смирягина Техред T.Ìàòî÷êa Корректор О, Ковинская

Заказ 8872/63 . Тираж 673 Подписное

ВНИИПИ Гооударственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 личина рН при помощи 0,2 н. НСР установлена в 4,6 и которая ниже называется растворителем) добавляют

6,0 kp СОНМ фракции 1Ч со следующим анадизом компонентов белка и суспендируют, вес.II:

Альбумина 53 с(,,-Глобулина 11

-Глобулина 8 -Глобулина 14

Гаммаглобулина 14

Затем добавляют 4,0 kp СОНМ подфракций III со следующим анализом белковых компонентов, вес.%:

Альбумина . 7

* -Глобулина 3

А -Глобулина 9

Ь -Глобулина 26

Гаммаглобулина 56

Соотношение остаточной влажности (Н О, остаточный этанол) и твердых веществ (белки, соли) составляют около 1г1.

10 kp влажной фракции суспендируют в растворителе и размешйвают.

При этом величину рН поддерживают постоянно 4, 6. Следующие стадии протекают, как описано в примере

1 (центрифугирование; обработка кремневой кислотой, фильтрование на активном угле, концентрирование диализом) .

На 100 мл раствора при 5.000 мг установленного содержания протеина получают около 37% альбумина, соответственно 1850 мг, около 63% глобулинов, соответственно 3150 мг, содержание иммунных. глобулинов, мг:

IgG Около 1.450 у IgA

Около 700

IgN Около 500

Предлагаемый способ позволяет получить препарат на основе белковой сыворотки с повышенным содержа © нием иммуноглобулина.

Способ получения препарата íà осИ нове белковой сыворотки путем фракционирования плазмы с последующей адсорбцией, очисткой и стерилизацией, отличающийся тем,.что, с целью повышение содержания иммуноЯ© глобулина, плазму освобождают от продуктов коагуляции, фракционируют по способу Кона, из полученной после фракционирования фракции III выделяют фракции III-I u lll-ll, последние д смешивают с фракцией. IV и суспендируют смесь в физиологическом растворе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. W.Stephan. — Vox Sanguim, 442457, 1975.