Способ определения активности х- пролилдипептидиламинопептидазы
Союз Советскик
Социалистических республик
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
« >786853 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 291076 (21) 2415363/28-13 (23) Приоритет — (32) 30. 10. 7 5 (31) 130809/75 (33) Япония
Опубликовано 071280, Бюллетень Й9 45
Дата опубликования описания 071?80
Р1)м. Кп.з
А 61 В 10/00
G 01 N 33/48
Государственный комитет
СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 616-074 (088.8) (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Тосихару Нагацу и Сумпеи Сакакибара (Япония ) Иностранная фирма
"Адзиномото Ко.,Инк.". (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
Х-ПРОЛИЛДИПЕПТИДИЛАМИНОПЕПТИДАЗЫ
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано при диагностике некоторых заболеваний.
Предлагаемый способ в патентной 3 и научно-технической литературе не описан.
Целью изобретения является определение активности Х-пролилдипептидиламинопептидазы. 10
Эта цель достигается тем, что фермент инкубируют с субстратом общей формулы Х-L-пролин-Y или его кислой солью при температуре от 30 до 45 С в водной среде при рН 6-9 .и определяют количество высвободившегося вещества формулы Y-Н, где Х— остаток глицина, L-аланина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты, L-лизина, L-аргинина; Y — 20 остаток п-нитроанилина, и-фенилазоанилина или 4 фенилазо-1-нафтиламина.
Кроме того, в качестве кислой соли используют соль соляной кислоты, бромистоводородной кислоты или п-то" 25 луолсульфокислоты.
Остаток Н-конечной аминокислоты (Х) дипептидных .производных, Х-L-пролина-Y включает любой аминокислотный остаток, так как фермент специфичен 30
2 по отношению ко второму аминокислотному остатку, остатку L-пролина, а не к остатку й-концевой аминокислоты.
N-концевую аминокислоту обычно выбирают из L-аминокйслот, содержащих до
15 атомов углерода, и существующих в протеине, например в нейтральных аминокислотах, таких как .глицин, алании, валин, лейцин, серии, треонин, фенилаланин, триозин и триптофан; основных аминокислотах, таких как лизин и аргинин. Эти аминокислоты могут.обладать любой стереохимической конфигурацией (L D и LO), если они содержат асимметричный углеродный атом; однако обчыно они имеют L форму. Кроме того,,эти дипептидные производные используют в качестве субстратов не только в свободной форме, но также в форме солей тех кислот, которые не ингибируют активность фермента, таких как и-толуолсульфоновая кислота, хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота.
Так:как соли более стабильны, чем сами дипептидные производные, они и являются более предпочтительными в качестве субстратов.
Часть У Х-L-пролина-Y выбирают из группы, состоящей из групп и-нитро766Ц53 анилина, и-фенилаэоаннлина и 4-фенилазо-1-нафтиламина. Предпочтительным является остаток п-нитроанилина, так как содержащее его дипептидное производное лучше всего растворяется в воде, наиболее стабильно и синтезировать его проще всего.
Активность фермента по отношению к новым дипептидным производным
X-L-пролин-Y различна в зависимости от того, какова крупна й-конечной @ аминокислоты (Х). Дипептидные производные,.содержащие нейтральную или основную аминогруппу в качестве Х, наиболее легко гидролизуются ферментом, а те, которые содержат кислотную аминогруппу, наиболее слабо.
Дипептидные производные, содержащие нейтральную или основную аминокислотную группу, или их соли, таких кислот как и-толуолсульфоновая кислота, подходят в качестве субстратов, 26 но производные основных аминокислот гигроскопичны. Дипептидные производные, содержащие группу глицина, отличаются самой большой скоростью гидрслиза при рН 8,7 из различных дипептидных производных Х-l. †ïðîëè-, на-У; в темноте они обладают высокой стабильностью и легко растворяются в воде. Производные глицина, особенно его соль такой кислоты, как хлористо- З0 водородная и п-толуолсульфоновая, не гигроскопичны по сравнению с производными основных аминокислот и удобны при анализе. П-нитроанилид глицил-L-пролина или его соли, особенно и-толуолсульфонат (тоэилат), являются наилучшими субстратами.
Если используемая аминокислота содержит боковые функциональные группы, то они могут быть использованы 40 после того, как функциональные группы будут защищены. Например, в случае кислых аминокислот, их используют после того, как боковые карбоксильные группы превращают в сложные эфи- 4Я ры, такие как бензиловый эфир. Аргинин используют после того, как группу гуанидина защищают обычной защитной группой, такой как тозил, нитро-, n-нитро-бензил-карбонил и g0
2-(изопропилоксикарбонил)3,4,5,б-тетрахлор-бенэоил, и особенно двумя первыми группами, тогда как
N-аминогруппу лизина обычно защищают известными аминозащищающими группами, предпочтительно теми же защитными группами, как и те, что используют дня защиты N-аминогруппы.
Защитную группу N"çàùèöåííoãî-X-L-пролина-У, полученного таким образом, затем отщепляют о помощью 60 известного способа, зависящего от природы N-защитной группы; и, если она есть, защитной группы боковых функциональных групп. Очень важно отщепить только защитную группу, не 65 затронув остальные, в этой реакции . элиминирования.
Можно также синтезировать необходимые дипептидные производные соединением вначале N-защищенного
X-L-пролина с частью V-I I а затем отщепить защитную группу от полученного X-L-пролина-Y.
Если нужно получить соли кислот дипептидных производных, то их получают при -взаимодействии дипептидных производных с кислотами в такой среде, как вода, этанол. Соли также получают из й-защищенных производных при взаимодействии их с кислотами, если защитная группа является т-бутилоксикарбонилом или аналогом, который может быть отщеплен под действием кислоты.
Среди различных солей кислот тозилат является наиболее предпочтительным, так как он образует твердые кристаллы, которые не эключают примесей, присутствующих в маточном растворе, и который может быть поэтому . получен с высокой степенью чистоты . простой перекристаллизацией.
Активность фермента легко измеряется, если в качестве субстратов используют дипептидные производные или их соли. Вначале приготавливают водный раствор Х-L-пролина-Y или его соли подходящей концентрации. Если для растворения субстрата в воде требуется слишком мало времени, то предпочтительно использовать подходящие вещества для ускорения скорости растворения, такие как неионные детергенты, кислоты или спирты, или использовать субстрат в пористой форме, чего можно достичь замораживанием.
Пористый субстрат наиболее удобен для рутинного анализа фермента; рН раствора субстрата меняется в зависимости от того, какой субстрат используют. рН обычно расположен в интервале от б до 9, и предпочтительно от 7,5 до 8,9. Субстраты спонтанно гидролизуются при рН свыше 9,5, но расторы .субстрата, особенно раствор и-нитроанилида глицил-L-пролина, стабилен при вышеупомянутом оптимуме рН и может храниться при 1 С свыше недели без заметного разложени
Активность фермента измеряют при контакте субстрата с Х-пролил-диаминопептидазой или образцом, содержащим ее, в водной среде, предпочтительно в буферном растворе, таком как трималеат буфер, глицин-МаОН буфер и амидиол буфер при температуре от 30 до 45 С в течение определенного промежутка времени, определяя фермент обычным способом, и затем определяют освобожденные Y-H.
Инкубационный период определяют в с< ответствии с количеством субстрата и фермента. Даже если сырой фермент, такой как сыворотка человек, исполу
786853 зуют в качестве источника фермента, то активность измеряют достаточно точно, так как субстрат практнчески не гидролизуется другими ферментами, сопровождающими сырой фермент, Количество освобожденных Y-H легко определяют, измеряя поглощение ферментной, реакционной смеси непосредственно на длине волны, соответствующей индивидуальной группе у-Н. а именйо при 385 нм для п-нитроанилина, 493 нм для и-фенилазоанилина и 532 нм для 4-фенилазо-1-нафтиламина. Прямой фотометрический метод прост, удобен и точен и, таким образом, подходит для рутинного анализа активности фермента. 1э
Когда У-Н группой является и-нитроанилин, активность фермента можно определять диазотизицией и-нитроанилина, осуществляемой за счет избытка нитрата натрия в кислой среде. ;Н)
При этом измерении количество и-нитроанилина, который образовался, может быть рассчитано измерением непрореагировавшего нитрата натрия; однако обычно определяется так называемым способом азосоединения, разлагая непрореагировавший нитрит натрия сульфаминовой кислотой сульфатом aMIloиия, мочевиной и т.д., подвергая взаимодействию образовавшийся и-нитрофенилдиазониум с соединяющим компонентом, таким как (- 1-иафтил) этилендиамин, и затем измеряя поглощение образовавшегося азосоединения на длине волны, характеризующей это азосоединение. Этот косвенный метод определения более сложен, чем предыдущий прямой фотометрический способ, но более чувствителен.
Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение более подробно. ф)
Пример 1. и-Нитроанилид
И-бензилоксикарбонил-L- пролииа.
Треххлористый фосфорил (50,6 г) медленно размещают в растворе й-бензилоксикарбонил-L-пролина (74,8 r) 4 и и-нитроанилина (41,4 r) в тетрагидрофуране (400 мл) при -f0 С. В смесь по каплям добавляют триэтиламин (92,4 мл), причем температуру внутри поддерживают при -15 C. Триэтиламин добавляют до рН 7, после чего температуру реакционной смеси повышают до комнатной и перемешивают смесь, в течение 3 ч.
Растворитель заменяют этилацетатом (1,2 л), раствор послед -вательно 55 промывают водой (100 мл), 1 н. соляной кислотой (300 мл х 5), водой (400 мл), 5Ъ-ным раствором гидрокарбоната (300 мл х 3) и насыщенным раствором хлористого натрия (300 мл) у и сушат над сульфатом магния. Высушенный раствор концентрируют при пониженном давлении, остаток кристаллизуют, добавляя этиловый эфир, и полученный продукт перекристалли- 6$ зовывают из смеси этилацетата (300мл) и метанола (50 мл), выход 56 r т. пл. 159-161 С, (д.l> 107,бо(С=1,0 метанол).
Найдено, Ъ: С 62,07; H 5,20;
N 11,62.
С„ Н,„О, И, Вычислено, Ъ г С 61, 77; Н 5, 19; и 11,38.
Пример 2. Бромгидрат и-нитроанилида L-пролина. и-Нитроанилин й-бензилоксикарбонил-L-пролина (55,4 r), растворяют в 26%-ном растворе безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (200 мл) при ОоС, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор примешивают в сухой этиловый эфир (2 л) для кристаллизации продукта, который выделяют декантацией, отмывают этиловым эфиром и сушат, выход 47 г.
Неочии енный продукт используют в следующих примерах без дальнейшей очистки. Пробу для анализа получают перекристаллизацией из смеси метанола с этиловым эфиром.
Т. пл. 225-226оС, 22 35, б o(C=1,0, СИ он).
Найдено, Ъ | С 41 75; H 4 34; и 13,30.
С „Н„+03й В.
Вычислено, Ъ: С 41, 79; H 4, 46; и 13,29.
Пример 3. и-Нитроанилид й-бензилоксикарбонил-глицил-L-Ilpo лина. й-бензилоксикарбонил-глициновый оксисукцинимидный сложный эфир (48 r, 0,16 моль) перемешивают в охлажденную смесь бромгидрата и-нитроанилида L-пролииа (47 г, 0,15 моль), триэтиламина (22 мл) и й-оксибензтриазола (1 г) в диметилформамиде (100 мл).
Всю смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, поддерживая в течение этого врейени рН раствора 8 с помощью триэтиламина, а затем раствор перемешивают еще в течение 19 ч при комнатной температуре.
Растворитель удаляют испарением при пониженном давлении, в остаток добавляют воду (350 мл), а затем продукт дважды экстрагируют этилацетатом (500 мл, 200 мл). Экстракты смешивают, последовательно отмывают водой (200 мл), 1 н. соляной кислотой (200 мл х 2), водой (200 мл) и
5%-ным раствором гидрокарбоната натрия (200 мл х 4) и водой (200 мл) и сушат над сульфатом магния, выход
67 r.
Гомогенность этого продукта была подтверждена методом тонкослойной газовой хроматографии на силикагеле с использованием в качестве растворителя смеси хлороформа, метанола и уксусной кислоты объемное отношение (95:5:3).
786853
Пример 4. и-Нитроанилид гли" цил- "пролина. и-Нитроанилид М-бензилоксикарбонил-глицин -L-пролина (61 г) подвергают взаимодействию с 26%-иым раствором безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (250 мл) и реакционную смесь обрабатывают так же,как в примере 2, в результате чего получают бромгндрат и-нитроанилида глицил-L.-пролина, выход 19 г.
Бромгидрат (20 г) смешивают с 1 М раствором карбоната натрия (100 мл) и суспензию экстрагируют хлороформом 8 раз (по 100 мл каждый раз) после насыщения хлористым натрием.
Экстракты смешивают, промывают насыщенным раствором хлористого натрия (100 мл) и сушат над сульфатом магния. Высушенный раствор концентрируют, а остаток кристаллизируют из смеси этилацетата с этиловьжл эфиром, выход 12,7 г, т.пл. 118-120 С, А)
115,8 С (С=1, метанол),.ЕД 11600 (0,1 н. хлористоводородная кислота).
П р.и м е р 5. Тозилат-и-нитроанилила глицил-L-пролина. и-Нитроанилид-глицил-L-пролина (584 мг) нейтрализуют раствором моногидрата и-толуолсульфоновой кислоты в этаноле (380 мг в 10 мл). Продукт кристаллизуют путем помещения раствора в холодильник. Неочищенный продукт перекристаллизовывают иэ смеси метанола с этиловым эфиром, выход
312 мг, т.пл. 223-225ОС (с разложени ем), ЕЦ 0 — 81,0 (С=1,0, метанол) .
Йайде.но, %: С 51,82; Й .5,19; и 12,24.
СД РH2Д.07 И„
Вычислено, %: С 51,72; H 5,21;
К 12,06.
Пример 6„ п-Нитроанилид т-бутилоксикарбонил-L-аланил-L-про" лина. т-Бутилоксикарбонил-L-аланин (5,7 г) и бромгидрат и-нитроанилида
L-пролина (9,5 r) растворяют в хлороформе (40 мл) с триэтиламином (4,2 мл, 0,03 моль) и в этот раствор добавляют раствор N,N-дициклогексилкарбодиимида (6,2 г) в хлороформе (5 мл) Всю смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 44 ч и после добавления нескольких капель уксусной кислоты перемешивание продолжают еще 2 ч. Осевшие продукты отфильтровывают, фильтраты концентрируют при пониженном давлении.
Остаток смешивают с водой и продукт экстрагируют этилацетатом.
Экстракт последовательно отмывают
1 н. соляной кислотой, водой, 5%-ным раствором гидрокарбоната, водой и .насыщенным раствором хлористого натрия и сушат над сульфатом магния.
Высушенный раствор концентрируют до получения остатка, который растворяют в этиловом эфире. Некоторое колит-бутилоксикарбонил-р-бензил-L-аспартил-L-пролина. т-Бутилоксикарбонил-Ь-бензил-L-.аспаргиловую кислоту (9,7 г 0,03 моль) и бромгидрат и-нитроанилида L-пролина (9,5 r, 0,03 моль) присоединяют друг к другу так же, как в примере 6.
Неочищенный продукт хроматографируют на колонке силикагеля (3,6см х 19 см), причем в качестве растворителя используют смесь хлороформа.и этилацетата (объемное отношение
5:1). фракции, содержащие основной пик, собирают и концентрируют до получения аморфного твердого вещества, выход 10,3 r.
Гомогенность этого продукта была подтверждена тонкослойной хроматографией.
Пример 9. п-Нитроанилид
L-аспартил-L-пролина. и-Ннтроанилид т-бутилоксикарбонил- -бензил-L-аспартил-L-пролина (10,3 r) хорошо смешивают с аназолом (8 мл) и раствор обрабатывают безводным фтористым водородом (около
50 мл) в течение 1 ч при 0 С. Фтористый водород отгоняют и продукт осаждают, добавляя этиловый эфир.
40 фЯ
Осажденное вещество дважды отмывают
55 этиловым эфиром, детактируют и сушат.
Неочищенный продукт растворяют в
0,1 И уксусной кислоты и раствор хорошо промывают этиловым эфиром, а затем пропускают через колонку с сильноосновной ионообменной смолой (Амберлит ИР-400, ацетатная форма, 200 мл), которую промывают 0,1 М уксусной кислоты. Элюат и промывки,смешивают и концентрируют при пони,женном давлении. Остаток кристалли чество нерастворившихся материалов отфильтровывают, фильтрат концентрируют и остаток отверждают титрованием н-гексаном, выход 12,9 г.
На тонкослойной хроматограмме этот, продукт дает одиночное пятно.
Пример 7. Хлоргидрат и-нитроанилида L-аланид L-пролина.
Раствор и-нитроанилида т-бутилоксикарбонил-L-аланил-L-пролина (12,9г) .в диоксане (20 мл) обрабатывают 6N раствором безводного хлористого водорода в диоксане (45 мл) в течение
55 мнн при комнатной температуре.
Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении, а остаток растирают для отверждения в этиловом эфире, затем отвержденный продукт кристаллизуют из этанола, выход
6,4 г, т.,пл. 130-14.0 С (с разложением), (О(® — 103,4 (С=1,0, мета3) нол).
Найдено, %: C 46,12; Н 6 09; и 15,50 .(.„4Д.щ04Н4Ж 5/4Н О
Вычислено, %: С 46,03 H 5,93;
2 И 15,34.
Пример 8. и-Нитроанилид
786853
10 эуют из небольшого количестова воды, выход 5,2 r, т пл. 144-145 С (с раз-. ложение@,٠— 100,3 (C=1,0 1N-
HC l ), f. 12170 (0,1N-НС1) .
Найдено, %: С 48,03; Н 5,63;
N 14,16.
С,1 Н18 Оь И4 3/2Н1 о
Вычислено, %: С 47,74; Н 5,61; и 14,85.
П р н м е р 1.0. и-Нитроанилид т-буТилоксикарбоннл-Э -бензил-L-глутамил-L-пролина.
Бромгндрат и-нитроанилида L-пролина (9,5 г) и т-бутилоксикарбонил-у-бензил-);глютаминовую кислоту, выделенную из дициклогекснламиновой соли (17,1 г), присоединяют с помощью l5
N,N -дициклогексилкарбодинмида, как в примере 6. Сырой продукт очищают на хроматографической колонке до получения аморфного твердого вещества, выход 12;7 г. 20
Гемогенность твердого вещества была подтверждена с помощью тонкослойной хроматографии.
Пример 11. п-Нитроанилид
L-глутамил-L-пролина. 25 и-Нитроанилид т-бутилоксикарбонкл-фбензил-L-глютамил-L-пролина (10 г, 0,018 моль) обрабатывают фтористым водородом (около 50 мл) и реакционную смесь обрабатывают как в примере 9. Конечный продукт получен в виде кристаллов, выход 4 7, т. пл. 117126оС (с разложением),)4l) - 82,8©С (C=1,0, вода).
Ь
Найдено, %: С 49,73; Н 5,91; и 14,54 35
С46 H%006N4- 5/4H O
Вычислено, %г С 49,66; Н 5,87; и 14,88. П р н м е р 12. п-Нитроанилид
N,N -дибенэилоксикарбонил-L-лиэил-,40
-L-пролнна.
Бромгидрат и-ннтроанилида 1.-пролина (9,5 r) соединяют с И,й -дибенэилоксикарбонил-L-лизином (12,4 r) и реакционную смесь обрабатывают, как в примере 6. Конечный продукт.получают в виде аморфного твердого вещества, выход 15,8 r.
Гемогенность продукта была подтверждена с помощьв тонкослойной хроматографии.
П р и и е р 13. Дитолизат и-иитроанилида L-лизки»(,-пролива. п-Нитроанклид И,йв-дибенэилоксикарбонил-L-лизил-L-пролина (9,5 r) обрабатывают 26%-ным раствором без« И водного бромистого водорода в уксусной кислоте (35 мл) и реакционную смесь обрабатывают по методике примера 2. Таким образом получают дибромгидрат и-нитроанилида L-лкэил-L-пролина, выход 7,8 r..
Бромгидрат растворяют в 0,1 М уксусной кислоте, раствор пропускают через колонку Амберлита 1 R-400 (в форме эцетата, 200 мл),которую промывали О, 1 М уксусной кислотой. Элюат и промывки соединяют и выпаривают до остатка при пониженном давлении; затем остаток растворяют в смеси этанола с моногидратом п-толуолсульфоновой кислоты (5,5 г). Концентрирование раствора при пониженном давлении дает остаток, который крнсталлнзуют, растирая его с этиловьэ4 эфиром, выход 10,1 г,,у. пл. 92-130 С (с разложением), Щ - 32,6 С (C=1,1, вода}
Найдено, %: C 49,76; Н 6,02;
N 9,26
С« нм01е Ме Ьз
Вычислено, %: С 50,05; H 6,11; и 9,42
П р н м е р 14. п-Ннтроанилид и -бЕнзилоксикарбонил-N -тознл-L-аргинид-L-пролина.
Бромгидрат п-нитроанилкда L-пролина (12,0 г) и й-бенэилоксикарбонил-. N -тозил-L-аргинин, который выделяют нэ соли циклогексиламида (23 г), растворяют в хлороформе (60 мл) и s раствор примешивают 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (6,8 мл) при ОЕС. Смесь перемешивают еще в течение 17 ч при комнатной температуре и далее обрабатывают, как в .примере 3, выход 22,3 г.
Гомогенность этого продукта подтверждена с помощью тонкослойной хроматографии.
П р к м е р 15. Дитозилат п-нитроанилида L-аргинин-L-пролина. и-Нитроанилкд й-бенэилоксикарбо-. нил-И -тОзил-L-аргинил-L-пролина в (8,2 г) обрабатывают безводным фтористым водородом, как в примере 9.
После удаления избытка фтористого водорода остаток обрабатывают, как в примере 13. Конечный продукт получен в виде кристалла, выход 7,3, т. пл. 125-138оС (с разложением), QQ -31,4 С (С=1,0, вода).
Найдено, % С 47,79; Н 5,83;
И 12ю53
С34 Н4,0«й ьз 5/2Н О
Вычислено, %г C 47,67; Н 5,85;
И 12,56.
П р к м е р 16. п-Фенилазоанилкд
И-бензилоксикарбонил-L-пролина. п-Фенилаэоанилин (7,9 r) и N-бензклоксккарбонил-L-пролин-(10,0 г) соединяют и реакционную смесь обрабатывают, как в примере б. В результате получают твердый продукт, вы - . ход 10,8.
Этот продукт используют в следую щем примере 17 беэ дальнейней очистки. Образец для анализа получают рекрксталлиэацией из н-гексанэтилацетата.
14
Т. пл. 141-143 С Ы вЂ” 87 0 С (С* 1,0, дкметилформамид) .
Найдено, %: С 70,27; и 5,61;
И 12,93
С НзОай+
786853
Вычислено, %: С 70,07; Н 5,65; и 13,08
Пример 17. и-Фенилазоанилид й-т-бутилоксикарбонил-глицил-L-проли.на. и-Фенилаэоанилид й-бензилоксикарбонил- -пролина (4,3 r 0,01 моль) обрабатывают 25%-ным раствором безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (35 мл) и реакционную смесь обрабатывают, как в примере 2.
Бромгидрат и-фенилазоанилида
L-пролина, полученный таким образом, и т-бутилоксикарбонилглицин (2,5 г) соединяют, как в примере 6. Сырой продукт, полученный при этом, очищают на хроматографической колонке; после очистки получают конечный продукт в виде кристаллов, выход 3,4 г, т. пл. 172-176оС, оЦ о — 110,1 С .(С=1,0, диметилформамид).
Найдено, %: С 64,08; Н 6,73; и 15,18
СЛ Н 90 и
Вычислено, %: С 63,84; Н 6,47; и 15,51 .
Пример 18. Тозилат и-фенилазоанилида глицин L-пролина и-Фенилазоанилид т-бутилоксикарбонил-глицил-L-пролина (2,5 r) растворяют в уксусной кислоте (8 мл) вместе с моногидратом и-толуолсульфоновой кислоты (2,3 г). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч.
Продукт осаждают, добавляя в реакционную смесь этиловый эфир, выделяют фильтрованием и отмывают этиловым эфиром. Полученный твердый продукт дважды перекристаллиэовывают из смеси этанола с этиловым эфиром, выход 1,6 r, т. qa. 141-155©С (с разложением),gag> 68,7 С (С=1, диметилформамид), Я „ 25000(0,1 н. соляная кислота).
Найдено, %: С 57,53; Н 5,60; .
N 12,99
Cq@ Н280 Вычислено, %: С 57,65; Н 5,77; и 12,93. Пример 19. 4-Фенилазо-1 †нафтиламид N-бензилоксикарбонил-L-про-. лина. 4-Фенилазо-1-нафтиламин (4,9 г) и N-бензилоксикарбонил-L-пролин (5,0 r) соединяют и затем реакционную смесь обрабатывают,как в примере 6. Конечный продукт получают в виде кристаллов, выход 3,5 г. т.пл. 136-138 С, ГАЗ, -75,9 С (C=1,0, ди;метилформамид), Найдено, %: С 72,68; Н 5,57; и 11,93 С 9 Н 9 0>N„ Вычислено, %: С 72,78; Н 5,48; и 11,71. Пример 20 ° 4-Фенилазо-1-наф тиламид-т-бутилоксикарбонил-глицил-, -L-пролина. 4-Фенилазо-1-нафтиламид-й-бензилоксикарбонил-L-пролина (2,5 г) обрабатывают 25%-ным раствором безводного бромистого водорода и уксусной кислоте (25 мл) и реакционную смесь обрабатывают,как в примере 2. Вромгидрат 4-фенилазо-1-нафтиламида t-пролина, полученный таким обра. зом, и т-бутилоксикарбон L-глицин (1,36 г) соединяют с N М -psuaKxio0 гексилкарбодимидом и реакционную смесь обрабатывают, как в примере 6. Сырой продукт очищают затем на хроматографической колонке, после чего конечный продукт получают в кристаллическом виде, выход 1,1 г. На тонкослойной хроматограмме этот продукт проявился в виде одиночного пятна. Пример 21. 4-Фенилазо-1-нафтиламид глицил-С-пролина. 2Q 4-Фенилазо-1-нафтиламид т-бутилокси-глицил-L-пролина (1,0 г) обрабатывают моногидратом н-толуолсульфоновой кислоты (0,76 r) и реакционную смесь обрабатывают, как в примере 17. Тозилат 4-фенилазо-1-нафтиламида глицилпролина, полученный таким образом, растворяют в метаноле и нейтрализуют 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия для высаждения продукта. Высаженный из раствора продукт выделяют фильтрованием, отмывают водой, сушат и перекристаллизовывают иэ смеси метанола с водой, выход 0,67 г, т. пл. 127-138 С (с разложением), f43>g — 87,7 С iC=1, днметилформаЯЯ 376 мид, Я, 14.400 (0,1 н. соляная кислота). Найдено, %: С 66,45; Н 5,81; и 16,69 С Н1 0 й3 3/4Н О 40 Вычислено. %: С 66,56; Н 5,95; и 16,88 Hp и м е р 22. Изучают связь между инкубационным периодом и количеством гидролизованного субстрата, используя и-нитроанилид глицил-(-пролина и сыворотку человека в качестве субстрата и источника фермента соответственно, и пробу гйдролизованного субстрата отбирают для последующего прямого фотометрического измерения. Тозилат и-нитроанилида глицил-L-пролина растворяют в 2%-ном водном растворе неполного детергента (Nikkoi NP-1О, Nikko, Chemiсаi, 0saca, Japan) в концентрации 3 мм для получения раствора субстрата. Затем приготовляют следующие 4 пробирки: экспериментальная пробирка, содержащая 0,5 мл 0,15 М глицин-NaOHв качестве буфера (рН 8,7) 0,5 мл раствора субстрата и 0,5 мл человечес кой сыворотки; пробирка, содержащая 0 5 мл 0,15 г. глицин-NaOH в качестве буфера 0,5 м : раствора субстрата и 0,05 мл воды; 786853 Таблица 1 18,11 35,43 71,65 100,79 135,43 30 90 120 Результаты этих испытаний подтверждают, что реакция ферментации линейно зависит от времени. Ту же самую процедуру повторяют с той разницей, что вместо человеческой сыворотки используют гомогенный фермент, выделенный препаративно из подчелюстной железы человека. Пример 23 ° Зависимость между количеством фермента и количеством гидролизованного субстрата изучают на тозилате и-нитроанилида глицил-L -пролина и человеческой сыворотке, которые используют в качестве субстрата и источника фермента .-.оответственно, и пробу на гидролизуемость субстрата осуществляют по следующим азосочетаниям. Приготовляют следующие пробирки: экспериментальная пробирка; содержащая 1,0 мл 0,15 М глицин-йаОН в качестве буфера (рН 8,7), 1,0 мл раствора субстрата, приготовленного в примере 21, и человеческую сыворотку в объеме, укаэанном в табл.2, 45 0,01 14,24 32,91 45,89 62,50 82,44 155,06 0,02 0i03 0,04 0,05 0,10 Результаты этих испытаний подтверждают, что реакция ферментации линейно зависит от количества фер65 эталонная пробирка, содержащая 0,5 мл буфера, 0,5 мл субстрата и 0,5 мл водного раствора и-нитроанилина; контроль ная пробирка, содержащая 0,5 мл буфера и 0,5 мл субстрата. Все пробирки инкубируют при 37 -C в теченце времени, указанного в табл.1, и затем реакцию останавли, вают добавлением 3,0 мл 1 M ацетата в качестве буфера (рН 4,2) в каждую пробирку. В контрольную пробирку добавляют 0,05мл человеческой сыворотки после остановки реакции. Фотометр устанавливают на нуль с помощью хо" лостой пробирки, а затем измеряют поглощение экспериментальной (Э), контрольной (К) и стандартной (С) пробирок на длине волны 385 мл в кювете толщиной 1 см. Количество п-нитроанилина, освобожденного в реакции с ферментом, рассчитывают по уравнению Е-с I — — 150 (н моль) . Результаты приведены в табл.1. Инкубационный Количество образопериод, мин вавшегося и-нитроанилина, и-моль контроЛьная пробирка, содержащая 1,0 мл глицин-МаОН в качестве буфера и 1,0 мл раствора субстрата. Обе пробирки, как экспериментальную, так и контрольную, инкубируют при 37 С в течение 30 мин, а затем добавляют 0,1 мл человеческой сыворотки в контрольную пробирку. Реакцию останавливают добавляя 0,4 мл ЗОЪ-ного водного раствора хлорной кислоты. После центрифугирования со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин каждые 0Ä5 мл надосадочной жидкости переносят в другую пробирку, кроме того 0,1 мл водного раствора и-нит15 роанилина и 2,4 мл ЗОЪ-ного раствора хлорной кислоты добавляют в эталонную пробирку, а 2,5 мл раствора хлорной кислоты — в холостую пробирку. 20 Во все четыре пробирки добавляют по 0,5 мл 0,2%-ного водного раствора нитрита натрия при 4оС и при этой температуре их выдерживают в течение 10 мин. Затем добавляют 0,5 мл свежеприготовленного 0,5Ъ-ного водного раствора сульфата аммония. Через 2 мин добавляют 1,0 мл 0,05%ного раствора N-(1-нафтил)-этилендиамина и пробирки инкубируют при 37 С в течение 30 мин в темноте. Фотометр устанавливают на нуль с помощью холостой пробирки, измеряют поглощение экспериментальной (Э), контрольной (К) и стандартной (С) пробирок при 548 нм. Количество П-нитроанилина, образовавшегося с помощью фермента, рассчитывают по уравнению (Š— с) х 500 А 2,5 0,5 4Q где А есть объем 0 5 мМ водного раствора п-нитроанилина, использованного в стандартной пробирке (мл). Результаты приведены в табл. 2. Таблица 2 Объем сыворотки, Количество образомл вавшегося и-нитроанилина, и-моль 786853 16 Субстрат Оптимум рН рН 7 0 Человеческая сыворотка рН 8,7 Очищенный фермент подчелюстной железы человека Человеческая сыворотка рН 7,0 и-Нитроанилид-L-лизид-L-пролина 8,5-8,7 1,2х10 122 121 и-Нитроанилид-L-аргинин-L-пролина 7,8-8,0 2,3х10 86 55 и-Нитроанилид-глицил-L-пролина 8,5-8,7 3,3х10 100 100 100 и-Нитроанилид-L-аланил-L-нролина 8,5-8,7 1,4х10 86 83 и-Нитроанилид-L-глутамил-L-пролина 8,5-8,7 2,3х10 37 54 и-Нитроанилид-L-аспаргил-L-пролина 8,5-8,7 8,1х10 28 Пример 24. 3 мМ раствора субстратов приготавливают, как в примере 2, причем в качестве субстратов используют различные дипептидные производные или их соли, Лктивности фермента по отношению к различным субИзмеряют активности очищенного фермента подчелюстной железы человека в 0,15 N трисмалеат буфере с рН 5,6-8,8 и в 0,15 М глицин-NaOH буфере с рН 8,2-0,4. Для п-нитроанилида L-аланил-L-пролина в качестве 40 буфера вместо глицина используют индол, так как глицин затрудняет фотометрирование при значениях рН 9-10. Значения Км измеряют для трисмале- д ат буфера с рй 7,0 с применением фермента подчелюстной железы человека. Приведенные значения являются СРЕДНИМИ ИЭ IIOBTOPHbIX 9КСПЕРИМЕНТОВ» Измеряют активности при рН 7,0 в 0,15 М трисмалеат буфере или при рН в 0,15 М глицин-ИаОН буфере, Приведенные значения являются средними из повторных экспериментов. Очищенный фермент получают следующим способом. Фермент переводят в растворимое состояние из микросоматической фракции автодигерированием и последовательно очищают фракционированием с помощью (NH4)>SO+ с последующей очисткой Sephadex G-200 ф9 хроматографией. Субстрат используют в виде дитозилата. Субстрат используют в виде хлор, гидрата. 65 стратам, скорости гидролиэа и оптимальные значения рН различных cóáстратон с помощью фермента иэмеряют, как в примере 22. Результаты приведены в табл. 3. Таблица 3 Относительная активность фермента В Пример 25. Продукты, полученные после инкубирования в течение 30 мин различных и-нитроанилидов Х-L-пролинов с очищенным ферментом подчелюстной железы человека или с ,человеческой сывороткой, как в примере 22, используют с помощью бумажной хроматографии, причем в качестве N-конечных аминокислот (Х} используют остатки глицина, L-аланина, L-глутаминовой кислоты, L-аспаргиловой кислоты, L-лизина и L-аргинина. В этом случае, когда используют очищенный фермент, на хроматограмме идентифицируют кроме субстрата только Х; -пролин и п-нитроанилид, а Х-ОН, L-пролин или и-нитроанилид -пролина не наблюдались» В этом случае, когда в качестве фермента используют человеческую сыворотку, а в качестве субстрата и-нитроанилид — глицил-пролина, на хроматограмме идентифицируют глицил-L-пролин-глицин, L-пролин и и-. нитроанилид, а и-нитроанилид L-пролина обнаружен не был. При исследовании скорости гидролиза и-нитроанилида L-пролина человеческой сывороткой обнаружено, что гидролизу подверглось всего лишь 0,7% и-нитроанилида глицил-L-пролина. Выло показано, что человеческая сыворотка гидролизует 786853 18 глицин-L-пролин иэ глицина и L-пропина. Эти результаты показывают, что глицил-L-пролин может быть гидролиэован предпочтительно Х-пролилдипептидиламинопептидавой, содержащейся в сыворотке человека, с получением вначале и-нитроанилида и глицил-L-пролина, который далее гидролизувтся до глицина и L-пролина другим ферментом в человеческой сыворотке. Пример 26. 3 мМ раствора субстрата приготавлйвают, как в примере 22, причем в качестве субстрата используют тоэилат п-фенилазоанилида глицил-L-пролина и 4-фенилаэо-1-нафгаламид глицил-L-пролина. Испытание активности фермента осуществляют, добавляя 0,05 мл человеческой сыворотки в смесь 0,5 мл 1,5 мМ буфера глицин-МаОН (рН 8,7) и 0,5 мл субстрата раствора в экспериментальной пробирке, выдерживая полученный раствор в течение 30 мин при 37оС и останавливая затем реакцию добавлением 3,0 мл 1 н. соляной кислоты. Поглощение и-фенилазоанилиЧисло обследованных Возраст, Средняя активность фермента годы п-Mîëü/ìèí на 1 сыворотки Группа Ы8 1 5-ф1 20-76 1 5-40 1S-40 20-40 41-81 41-81 48-76 42 18 17 Значения активности у молодых лужчин (не старше 40 лет) были значигельно выше, чем у молодых женщин, р с 0,001. Значения активности у пожилых женщин были значительно выше, чем у молодых женщин, р а 0,05. ° ф Таблица 5 Normal (control ) Hepa t i tvs 54,9+1,5 75,8+28,5 P <0,01 Всего Мужчины Женщины Молодые Мужчины Женщины Пожилые Мужчины Женщины да глицил-L-пролина A 493 нм 0,18 и для 4 фенилазо-1-нафтиламида П 532 мм 0,80. Эти значения сопоставимы с теми которые были получены для и-нитроанилида глицил-L-пролина. Пример 27. Была измерена ско- рость гидролиза и-фенилазоанилида глицил-L-пролина по методике примера 26 с применением человеческой сыво ротки в качестве фермента. Однако холостая пробирка содержала воду вместо раствора фермента, как это было в экспериментальной пробирке, а стандартная. пробирка содержала 3 мМ раствор и-фенилаэо-анилина вместо раствора фермента в экспери15 ментальной пробирке. В результате скорость составила 18,7 г моль/мин/1 сыв. Пример 28. По методике примера 22 была измерена активность Х-про2О пилдипептидиламинопептидаэы, в качестве фермента испольэовали 88 и человеческую сыворотку и и-нитроанилид глицил-L-пролина в качестве субстрата. Результаты приведены в табл.4. Таблица 4 54,88 «+ 1,50 56,30 «+ 1,90 52,49 + 2,47 54,76 + 2,07 60,10 + 2,84 а 47,59 + 2,07 55,04 + 2,23 53,18 + 2,43 Ь 58,16 + 4,37 Пример 29. Была измерена активность Х-пролилдипептидиламинопепО тидаэы, как в примере 22, с использованием п-нитроанилида глицил-L пролина и человеческой сыворотки в качестве субстрата и фермента соответ.ственно. Результаты приведены в табл. 5. 786853 Продолжение табл. 5 ю 2 3 20 80, 94+3,87 Early essential nypertension Fixed essential P < 0,001 nypertension Gastric Cancer 89,29+3,69 38,4+2,3 39,8+2,6 38,8+11,9 36,3+5,6 31,0+9 5 P 0,001 < 0,001 < 0,001 с 0,01 P (0,01 Pulmonary Cancer 17 Acute lymphocytic 1eukemia 22 Lymphosarcoma 11 I, Hodgkinis disease 15 P < 0.01 Нормальная (контроль) Гепатиты Рано выявленная гипертония Хроническая гипертония Рак желудка Рак легких Острая форма лейкемии 25 исло случаев ктивность фермента Группа Gly L-Ala.Нормальная 3 (контроль) Гепатиты 3 Рак желудка 3 50 4+15,0 36,6+9,6 37,7+9,0 27,5+7,6 18,2+4,7 13 8+3,6 143,0+31,8 99,5+17,0 102,5+17,5 74,8+17,6 49,7+10,2 35,5+6,8 25,3+3,0 18,5+1,9 17,6+1,6 13,9+1,3 8,2+0,8 6,0+0,7 ВНИИПИ Заказ 8872/63 Тираж 673 Подписное Филиал ППП Патент, г. ужгород, ул. Проектная, 4 Названия исследованных групп. при щ веденные в левом столбце табл. 5: (сокращения Gly, L-Ala, L-Asp, L-Glu, L-Lys u L-Агд в таблице означают группу X-n-нитроанилида Х-L- 4О -пролина), Пример 31. 0,23 мг кристаллического тозилата и-нитроанилида глицил-L-пролина растворяют в 100 мл воды при помешивании. Для хорошего 4S растворения понадобилось 30 мин при 20вС или 18 мин при 30 С. С другой стороны, 0,23 мг пористого тоэилата п-нитроанилида глицил-L-пролина, который получают при Я замораживании 15 мИ водного раствора тозилата п-нитроанилида глицил-Lпролина при -40ОС и последующем высушивании замороженного вещества при 0,05 ..ee рт.ст. растворяют в 100 мл у воды при помешивании, как и в предыдущей процедуре. Для хорошего растворения понадобилось всЕго лишь 10 с при 20 С и 5 с при 30 С. Предлагаемый способ позволяет определить активность Х-пролилдипептиЛимфосаркома Болезнь Ходкина Пример 30. Была измерена активность Х-пролилдипептидиламинопептидазы по методике примера 22,причем, в качестве субстратов использовали различные Х-L-пролил-п-нитроанилиды, а в качестве источника фермента— человеческие сыворотки от пациентов ° Результаты приведены в табл. 6 Т а б л и ц а 6 L-Asp L†- Gly L-Lys L-Arg диламенопептидазы, что имеет важное значение для диагностики различных заболеваний. Формула изобретения 1. Способ определения активности Х-пролилдипептидиламинопептидазы, отличающийся тем, что фермент инкубируют с субстратом общей формулы Х-L-пролин-J или его кислой солью при температуре от 30 до 45 С в водной среде при рН 6-9 и определяют количество высвободившегося вещества формулы Y-Н, где X — остаток глицина, L-аланина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты, L-лизина, L-аргинина, Y — остаток п-нитроанилина, п-фенилаэоанилина, или 4-фенилазо-1-нафтиламина. 2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве кислой сОли используют сОль, солянОй кислОты бромистоводородной кислоты или и-толуолсульфокислоты.
