Способ количественного определения гидроперекисей липидов

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

<>775685 (61) Дополнительное н авт, свид-ву (22) Заявлено 06.0378 (21) 2588504/23-04 с присоединением заявки Нов (23) Приоритет

Опубликовано 30.1080. Бюллетень Hо 40

Дата опубликования описания 30.10.80 (51)М. Кл.з

G N 27/46

Государственный комитет

СССР но делан иэобретений и открытий (53) УДК 543.29 (088.8) (72) Авторы изобретения

Л.И.Деев и д.B.Ãóðoâè÷

Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного

Знамени государственный университет им. M.B.Ëoìoíîñoaà (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ГИДРОПЕРЕКИСЕЙ ЛИПИДОВ

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам количественного определения перекисных соединений и может быть применено в биохимии, биофизике, микробиологии, органической химии.

Известен способ количественного определения гидроперекисей липидов путем обработки анализируемой пробы

5%-ным раствором соли Мора в ЗЪ-ном растворе соляной кислоты с последующим добавлением тиоцианата аммовия и колориметрированием полученного окрашенного раствора $1).

Недостатком способа является низкая чувствительность определения и ограниченная область применения (можно определять только водорастворимые гидроперекиси липидов);

Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ количественного определения гидрсперекисей липидов путем обработ-25 ки анализируемой пробы смесью хлороформа и метанола, последовательной обработкой раствором йодистого калия и 2%-ным раствором уксусной кислоты и тиосульфатом натрия с последующим титрованием полученного раствора раствором йодита калия (2).

Недостатком способа является низкая чувствительность определения открываемый минимум 10 т М при необходимом количестве липидов не менее

5-20 мг, а также пло ая избирательность (определению мешают любые дру- гие примеси перекисей органических веществ).

Целью предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и избирательности определения.

Поставленная цель достигается описываемым способом количественного определения гидроперекисей липидов, заключающимся в обработке анализируемой пробы хлороформом и метанолом с последующим упариванием органического растворителя, растворении гидроперекнсей липидов в метаноле и добавлении раствора сернокислого железа так, что".ы конечная концентрация гидроперекисей липидов в полученной смеси составляла 0,05-0,1 мг/мл и измерении редокспотенциала смеси.

Отличительным признаком способа является предварительное упаривание органического растворителя, раство775685

Формула изобретения (, ) а Ее.Ч

Составитель Л. Соломенцева

Редактор Л. Герасимова Техред M.ÏåTêo Корректор И. Муска

Эакаэ 7736/60 Тирам 1019 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ЛПП "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Проектная, 4 рение гидроперекисей липидов в метаноле и использование в качестве химического реагента раствора сернокислого железа, которое добавляют так, чтобы конечная концентрация гидроперекисей липидов в полученной смеси составляла 0,05-0,1 мг/мл с последующим измерением редокспотенциала смеси.

Пример 1. 500 г печени гомогейизируют в 30 мл смеси Фолча (хлорофоРм - метанол = 2:1) в течение !

О

10 мин. Раствор отфильтровывают и упаривают на роторном испарителе.

По разнице веса отгоночной колбы,цо и после упаривания растворителя на аналитических весах определяют навес- 15 ку выделенных липидов 30 мг. Липицы растворяют в 60 мл 90%-ного метанола.

В измерительную ячейку наливают

9 мп 1 мМ раствора FeS0 4 в 9ОЪ-ном метаноле (рН 3,2) .Через 10 мин, ког- 2О да устанавливается равновесное значение редокспотенциала, равное 367 мв, в ячейку вносят 1 мп исходного раствора липидов. Потенциал монотонно возрастает и через 10 мин устанавливается на новом постоянном уровне, равном 369 мв. По калибровочной кри вой рассчитывают изменение концентрации железа в ячейке, соответствующее изменению равновесного потенциала, и равном 2 нмоль. По формуле где С вЂ” концентрация липида в ячейке, мг/мл; ь(Ге )- изменение концентрации железа в растворе;

L>0 ")†концентрация гидроперекисей в нмоль/мг липида, рассчитывают количество гидропереки- 40 сей в исследуемом липиде (ОООН)= 2/2 0,5 = 20 нмоль/мг липида.

Пример 2. 500 мг печени гомогениэируют в 30 мл смеси Фолча в течение 10 мин. Раствор отфильтровывают и упаривают не роторном испарителе. Ilo разнице веса отгоночной колбы до и после упаривания растворителя определяют навеску выделенных gg липидов 35 мг. Липиды растворяют в

35 мг 90%-ном метанола.

В измерительную ячейку наливают

9 мл 1 мМ раствора Ге504 в 90%-нoм метаноле (рН 3,2),Через 10 мин устанавливается равновесное значение редокспотенциала, равное: 367 мв. В ячейку добавляют 1 мл исходного раствора липидов. Через 10 мин устанавливается новое равновесное значение редокспотенциала, равное 370,5 мв.

По калибровочной кривой рассчитывают изменение концентрации железа, соответствующее изменению равновесного редокспотенциала, и равное

4 нмоль. По формуле определяют количество гидроперекисей в липиде(КОон)

4/2 0,1 = 20 нмоль/мг липида.

Предлагаемый способ позволяет определить 0,5-1 мг гидроперекиси липида в определяемой пробе, открываемый минимум 10 М, определению не мешают перекиси других органических веществ.

Способ количественного определения гидроперекисей липидов путем обработки анализируемой пробы органическим растворителем и химическим реагентом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и избирательности определения, полученный раствор анализируемой пробы упаривают, остаток, содержащий гидроперекиси липидов, растворяют в метаноле и метанольный раствор обрабатывают раствором сернокислого железа, который добавляют так, чтобы конечная концентрация гидроперекисей липидов в полученной смеси составляла 0,05-0,1 мг/мл с последующим измерением редокспотенциала.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Романова Л.А., Стальная И.Д.

Метод определения гидроперекисей липидов с помощью тиоцианата аммония.

Сборник "Современные методы в биохимии". Под ред. Ореховича В.Н. М., "Медицина", 1967, с. 62.

2. Владимиров Ю.А., Арчаков A.È.

Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., "Наука", 1972, с. 238 (прототип).