Способ получения -лизина

 

СО303 Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗО зРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (u)759056 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 240574 (21) 2032843/28-13 (23) Приоритет — (32) 24. 05. 73 (31) 58361/1973 (33) Я;;ония

Опубликовано 230880 Бюллетень М 31

Дата опубликования описания 23.0880 (5!)М. Кл.з

С 12 0 13/06

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (5Ç) УДК 668. 394 (088 ° 8) Иностранцы

Кой Кубота, Ясухико Есихара и Есио Хиросе (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Адзиномото Ко, Инк" (Япония) (71) Заявитель (:4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА

Изобретение относится к технике получения L ëèçèíà путем культивирова" ния микроорганизмов, используемого для приготовления пищевых продуктов и повышения их питательных свойств.

Наиболее близким к изобретению является известный способ получения

L-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода

Corynebacterium или Brevibacterium 1О на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии антибиотиков или поверхностно-активных веществ, или антиокислителей с 15 последующим выделением целевого продукта j1) .

Однако по известному способу выход L-лизина недостаточно высокий.

Для повышения выхода (: лизина в 20 предлагаемом способе иэ рода Coryne-.

bacterium или Brevibacterium используют штаммы Corynebacterium glutamicum FERMP-1987, FERMP-1613,FERMP-1982 8revibacterium lacto- 25

fermen turn ГЕВНР-1944, FFRHP-1711, FERMP-1857, FERHP-1572, FERHP-1574, FERHP-1575т FERHP-1841. Культивирование ведут на среде, содержащей в качестве источника углерода углеводы

2 или спирты,или органические кислоты, в присутствии антибиотиков, выбранных из группы хлорамфеникол, эритромицин, диоксистрептомицин, тетрациклнн, или поверхностно-активных веществ или антиокислителей в количествах, соответственно равных 3,525 мг/мл, 0,05-2в или 0,05-1,0 Mr/мл. спосоо осуществляют следующим образом.

Продуцирующие L-лизин микроорганизмы иэ рода Corynebactcrium или

Brevibacterium культивируют на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые минеральные соли в присутствии антибиотиков, или поверхностно-активных веществ, или антиокислителей, в количествах, соответственно равных

3,5-25 мг/мл, 0,05-2Ъ и 0,051,0 мг/мл.

- Hs a Corynebacterium или

Brevibacterium используют штаммы

Corynebacterium g .utamicum FERHP-1987, FERHP-1613, FERMP-1982 или Brevibacterium lactwfermentum FERMP-1944, F E RMP-1711, ГЕ йНР-1857, F E RMP-1572, F E RMP-1574, F RRMP-1575, F E RHP-1841.

В качестве источников углерода в среде культивирования используют

759056 углеводы или спирты, или opr анические кислоты.

Из углеводов используют глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, крахмал, гидролизованный крахмал и мелассу. Из органических кислот используют уксусную, пропионовую, бензойную или фумаровую кислоты, а из спиртов — метанол, пропанол или этанол.

Среда может содержать несколько источников углерода. Некоторые му- 10 танты ассимилируют углеводороды в качестве основного или второстепенного источника углерода.

В качестве источников азота применяют соли аммония, нитраты, карбамиды, аминокислоты и жидкости, получаемые после вымачивания кукурузы, дрожжевой. экстракт, мясной экстракт, рыбную муку, пептон, бульон, продукты гидролиза казеина и их смеси, а 20 также аммиак.

Необходимые неорганические ионы отмачивают сульфатом магния, фосфатом магния, первичным кислым фосфорнокислым калием, сульфатом железа, хлоридом марганца, хлоридом кальция, хлоридом натрия и т.п.

Антибиотики: выбирают из группы хлорамфеникол, казугамицин, тетрациклин, экситетрациклин, эритромицин, диоксистрептомицин„ митомицин "С", антиномицин "D", циклозерин, соединение группы пенициллина, цефалоспорина, полимиксин и аэосерин.

Из поверхностно-активных веществ в среду вводят сульфат высшего спиртау алкилбензосульфонат; алкилфосфат и диалкил-сульфосукцинат; катионные вещества, например соли алкиламина и четвертичные аммониевые соли; неионные вещества, например алкильный 40 простой эфир полгокталкилена, моноалкильный простой эфир полиоктэтиленсорбитана и сорбитан монолауратр амфотерные вещества, как имидазолин и бетаин. 45

Из антиокислителей в среду вводят

4,4-диокси-3,3-диметилдифенил; 2,6-ди-З-бутилфенол, катехол, бутилкатехол, протокатеховую кислоту, 4 "

-токоферол, пирогаллал, галловую кис- go лоту, сложный эфир галловой кислоты, нафтол;фенольные соединения, например амфинофенол, амины, например нафтиламин, дифениламин, ди-2-бутил-h-фенилендиамин, б-этокси-2,3,4-триметил-1,2-дигидрохинолин, семикарбазид, фенотиазин и тетрафенилгидразин; соединение, содержащее серу, например тио-дипропионо ая и тио-дигликолевая кислота.

Водородный показатель рН фермента- 40 ционной среды контролируют и поддерживают на уровне, необходимом для оптимального получения L-лизина, преимущественно в -пределах от 5,0 до

9,0, добавлением карбамида., авмиака, углекислого кальция, органических и неорганических кислот в процессе ферментации. . Ферментацию осуществляют при =eMпературе 24-37ОС, значение которой зависит от культивируемого микроорганизма, при аэробных условиях в течение 2-7 дней. -лизин извлекают из жидкой среды (бульона) одним из известных способов, например путем адсорбции на подходящих ионообменных смолах, с последующим отмыванием, удалением клеточного Материала и концентрированием фильтрата, содержащего L-лизин.

L-лизин идентифицируют по его мингидринной реакции на бумажной хроматограмме, по значению показателя

"Rf" на бумажной хроматограмме, по данным электрофореза, качественного микробиологического определения и по реакции с декарбоксилизой лизина, а также по результатам, получаемым при применении тождественных образцов.

Количество L-лизина, выработанного в составе бульонной культуры, определяют калориметрическим методом, основанным на кислотной медной, нингидринной реакции.

Получаемые результаты относятся к солянокислому производству.

Пример 1. Готовят питательную среду для культивирования следующего состава,%: глюкоза 10; сернокжслый аммоний 4,5; первичный кислый фосфорнокислый калий 0,1, семиводный сернокислый магний 0,04; катион двухвалентного железа 2 млн катион двухвалентного марганца 2 млн ; биотин 50 мг/л; хлористоводородная соль тиамина 200 мг/л; продукт гидролиза соевого протеина (общее содержание азота 7%) 1; углекислый кальций (стерилизован отдельно) 5. Устанавливают рН 8,0 и делят на порции по

20 мл. К каждой порции добавляют хлорамфеникол или "Мирамол 2МСА (торговое наименование катионного поверхностно-активного вещества), в указанных ниже количествах добавляют s колбы по 500 мл, перемешивают встряхиванием и стерилизуют.

Отмеренные порции инокулируют, соответственно Brevibacterium lactofermentum — 1944 (штамм, устойчивый к действию "АЕС", полученный искусственным путем из Вrevibacteruim

1асtofermentum ATCC 13869 (и Corynebacterium g)цtamicum FKЯМР-1987 (штамм, устойчивый к действию "AEC," полученный искусственным путем из

Hicrococcus g1utamicus ATCC 13032), которые предварительно культивируют на косых желатиновых средах на бульоне, содержащем глюкозу. Культивирование проводят при 31ОС и встряхивании.

Затем отмеренные порции делят на две группы порций.

759056 количествах, указанных в табл. 1.

Процесс фермектации проводят

72 ч. о

1 аблица 1

K одной группе порций добавляют хлорамфекол сразу или через 15 ч, считая от момента инокулироваНия, в

Ъ счезатую "

FERMP"19 4 1

0 1,18

2,0 21

2 0 1,18 0,5

1 5 0,91 0,2 3,1 32

1 50 0,76 3,5 2,0 31

0 0 1,25 0

1,8 18

FERMP-1987

1 5 0,95 0,5 3,0 30

0 0 1,25 0

1,8 18

П р и м е ч а н и е. Рост — после 26-кратного разбавления, пс сравнению с первоначальным объемом определяют оптическую плотность при 562 тм.

Из ферментационных бульонов, в свидетельствует также об отсутствии которых культивируют оба штамма в явления, обратной мутации для примесреде, к которой не добавляют анти- нения мутанного штамма даже после биотики, отбирают более 300 колоний 72 ч культивирования. для каждого и исследуют на способность вырабатывания L-лизина. При К другой гРУппе rlopttHA добавляют этом устанавливают, что все они "МиРанол 2NCA" (торговое наименоваобладают устойчивостью к "AEC что ние) сразу или через 7 ч после инокуслужит доказательством пригодности лирования в количествах, приведенштамма для выработки L-лизина. Это 35 ных в табл. 2.

Таблица 2

Наименование штамма

0 . 2,0

0 2,3

0,01

FERMP

-1944

0,05

0,5

0,1

2,3

2,4

1,8

0 2,1

F E RMP-1987 0 05

0,1 2,5

0 1,8 на через 15 ч после инокулирования.

Культивируют 82 ч,при этом колйчество L-лизина, накопившегося в бульоне, приведено в табл. 3.

Таблица 3

Пример 2. Для получения L-лизина проводят ферментацию способом, описанным в примере 1, но добавляют

0,5 мг/мп эритромицина в начале инокулирования и 3 мг/мл эритромициДобавлен 0,94

Не добавлен 1,25

ГЕБУ

1944

3,3

1,8

759056

Продолжение таблицы 3

Наименование штамма

Добавле ние зри рсмкцин

) Накопление

L-лизина, г/дл

FERMP

° -1987

Добавлен

Не добавлен

0 95

3,1

1,25

1,8

Таблица 4

Наименование штамма

0,1

2,0

FERNP — 1944

2,3

0,2

0,1

2,2

0,2

2,5

1,8

FERMP

-1987

2,4

0,2

2,5

0,2

1,8

П р и. м е р 4. Ферментацию проводят, как описано в примере 1, применяя штаммы Brevibacterium iactofermentum FERMP-1711 (обладает устойчивостью к AEC и потребностью в аланине), Соiynebacterium glutamicum

FERMP-161 3 (обладает устойчивостью 45 к "AEC" и потребностью в серине), Corynebacterium giutamicum FERMP-1982 (обладает устойчивостью к "AEC" и потребностью в пролине), Brevibacterium iactofermentum FERMP-1857 (обла- 50

Таблица 5

Brevibacterium

Xactofermentum

FERMP-1711

Диоксистрептомицин, мг/мл: вначале — 0,5 через 24 ч — 4 без добавления

Тетрациклин,мг/мл: вначале — 1,0 через 24 ч *- 7,0 без добавления

0,97

4,7

1,05

4,2

Co ryneba ct eri um .qiutamicum FERMP .1613 1.

2,8

1,0

2,5

Пример 3. Ферментацию проводят способом, описанным в примере 1, но добавляют продукт

"Твен-20" (торговое наименование полиоксиалкиленовых .производных сорбитан-монолаурата).

Культивируют 72 ч. Количество накопившегося в бульоне L-лизина приведено в табл. 4. дает устойчивостью к "AFC" и потребностью в аланине и лейцине), Brevibacterium 3actofermentum FERHP-1574 (обладает устойчивостью к "AEC" и потребностью в никотиновой кислоте или никотинамиде) и Brevibacterium

1actofermentum FERMP-1575 (обладает устойчивостью к "AEC" и потребностью в гипоксантиие).

Культивируют 72 ч. Количество

L-лизина, накопившегося в бульоне, приведено в табл.5.

759056

Пеницилин,ед/мл: вначале — 1,0 ед/мл через 24 ч

5,0 ед/мл без добавления

Corynebarter1um

glutamicum FERMP

-1982

0,93

3,3

1,02

3,0

Brevibacterium

Iactofermentum

ГЕВМР

-1857

Хлорамфеникол, мг/мл: вначале — 1,5 мг/мл через 24 ч вЂ, 5,0 без добавления

0,75

5,8

0,88

5,1

Азазерин,мг/мл: вначале — 5,0 мг/мл через 24 ч - 20,0 без добавления

В rev i bacter i um

Iactofermentum

FERMP

-1574

0,98

3,4

3,0

1,08

Полимиксин В ед/мл. вначале -1 ед/мл через 24 ч — 4 без добавления

Brevibacterium

lactofermentum

0,93

3,5

FERMP

-1575

3,0

Таблица 6

3,5

Coryneba,cterium

qlutamicum FERMP—.161 3

Ринон LE110 i

0,05% без добавления

3,0

3,3,Рипонол 1? 103:

0,1Ф без добавления

Corynebacter i um

glutamicum FERMP-1982

3,0

0L-метионин-15 Рипомин LH:

0,1Ъ без добавления

4,3

Micrococcus gluta—

micus ATCC 13286

3,8

Ованол 516:0,05Ъ без добавления

5,1

4,6

Brevibncterium

lactofermentum

FE RMP-1572

Вгеч1Ьасйеrium

lactofermentum

FE RMP — 1574

Рипонокс ИСК: . О, 1 без добавления

3,6

3,1

Пример 5. Ферментацию проводят, как описано в примере 1, используя штаммы Corynebacterium

g1utamicum FERMP-1613; Corynebacterium gIutamicum FERMP"1982; Micrococ- 30

cus glutamicus ATCC 13286 (обладает потребностью в гомоозерине); Вгеч1bacterium lactofermentum. FERMP-1572 (обладает устойчивостью к "AEC" и потребностью в серине совместно с лейци-35

Mow); Brevibacterium lactofermentum

FERMP.-1574, Brevibacter1ил lactoferПродолжение таблицы 5

men turn FERMP-1575 и Brev i bac ter ium

lactofermentum FERMP-1841.

Добавляют также питательные вещества, поверхностно-активные вещества, соответственно, после 16 ч культивирования.

Культивируют 72 ч. Количество на,копившегося в бульоне L-лизина приведено в табл. 6.

759056

Продолжен ие т а блицы 6

8rev i bac ter ium

l ac tof e rmen turn

FE RMP-1575

3,8

Ниссаннонион

LT 221: 0,2%

Гипоксантин-10 без добавления

3,0

Brevibacterium

Iactofermentum

FE RMP-1841

2,9

Катионал

HTBr0,01% без добавления

0 Е- Метионин-.

-150

2,3

П р и м е ч а н и е. Рипон LE110 — этаноламнновая соль алкилбензолсульфокнслоты; Рипонол LL103 — лаурия сульфат, Рипомин LH — аифотерные поверхностно-активные вещества типа имидазолина, Рипонокс ИСК вЂ” простой алкильный фенольный эфир полиоксиэтилена; Ованол 516 — амфотерное поверхностно-активное вещество типа бетаина; Катионал НТ — бензолконийхлорид, .Ниссаннонион LT221 — неионное поверхностноактивное вещество.

Т а б л и Ц а 7

Галловая кислота: вначале — 0,5 без добавления

8revibacterium

Iactofeгвепйыа

FE RIP-1944

2,5

1,8

Srevlbacterium

lactofermentum

FERNP-1711

Brevibacterium

lactofermentum

FEЯИР-.1572

Тио-дигликоль: через 12 ч — 0,05 без добавления

5,0

4,6 б-токоферол: через 12 ч — 0,1 без добавления

Brevlbacterium

lactofermentum

F E RMP-1574

3,7

3,1

Бутилоксиакизол (ВНД): через 12 ч - 0,05 без добавления

Srevibacterium

lactofermentum

F E RMP-1575

3,4

3,0

Гипоксантин-10

Бутилкатехол: через 12 ч - 0,1 без добавления

Brevibacterium

lactofermentum

FERMP -1841

2,7

2,3

Об-метионин-150

Протокатеховая кислота! .вначале 1,0 без добавления

Corynebacterlum

gIutamicum

F E RMP-1987

2,2

1,8

Пример 6. Процесс получения

L-лизина проводят, как опнсано в примере 1, но s качестве микроорганизмов используют атавмы Вгеч!Ьас еrium lactofermentum FERMP-1944, FERMP1 711 e FERMP 1572 FERMP 1574 °

FERMP-1575, FERMP-1841, Corynebacterium glutamiсие FЕкИР»1987,FERMP-1613, FERNP-1982 и Micrococcus glutamicus

ATCC-13286.

В среду добавляют питательные вещества, необходимые в некоторых случаях, и антиоксйданты.

Культивируют 72 ч.

Количество накопленного L-лизина приведено в табл. 7.. -аспаратновая кис. лота и лаурилгаллатг через 12 ч - 0,05 5,0 без добавления 4,6

759056

ПРодолжение табл. 7

Corynebacterium

glutamicum

РЕ ВМР-1613

Br ev i Ьас te r i um

1actofermentum

F E RMP-1982

BHA и тио-дигликолевая кислота: через 12 ч — 0,02 и 0,1 соответственно беэ добавления

3,8

3,0

M i c rococcu s

g1utamicus

АТСС 13286

Зтилгаллат: через 12 ч — 0,1

0L-метионин-15,0 беэ добавления

4,4

3,8 помещают в 500 мл колбу, перемешивают встряхиванием и =терилиэуют.

Затем отмеренные порции инокулируют штаммом Brevibacterium lactofermentum FERMP-1711, культивированную ранее на косых желатиновых средах на бульоне, содержащем глюкозу.

З0 Культивируют при 31 С 72 ч при встряхивании и добавлении к среда хлорамфеникола, эритромицина, "Миранола 2NCA" и/или "Твена 20".

Количество накопленного L-лизина

35 приведено в табл. 8.

Таблица 8

4,3

25,0 мг/мп

15,0 мг/мп

0,1%

Хлорамфеникол

Эритромицин

Миранол 2МСА

Твен 20

4,1

3,9

18

3,8

0,2%

4,6

Контроль (отсутствие) 3,5

Пример 8. Brovlbacterium

lасtofеrmentum FERMP-1711 культивируют, как в примере 7, но применяют содержащую 15% свекольной мелассы (в пересчете на глюкозу), а 0,1В "Миранола 2МСА" добавляют через 26 ч после инокулирования. gj

Культивируют 90 ч, при этом накопление в бульоне L-лизина равно

5,8 г/дл. При культивировании без

"Миранола 2МСА" накопление L-лизина равно 5,2 г/дл.

Пример 7. Готовят питательную среду для культивирования при рН 8,0, содержащую компоненты, Ъ: свекольная меласса (в пересчете на глюкозу) 10; сернокислый аммоний 4,5; первичный кислый фосфорнокислый калий 0,1:

MgS04 7Н 0 0,04; продукт гидролиза осевого протеина (общее содержание азота — 7%) 1,5;углекислый кальций

5,0;катионы двухвалетного железа и двухвалетного марганца по 2 млн ; биотин 50 мг/л и хлористоводородная соль тиамина 200 мг/л.Среду делят на отдельные порции по 20 мл и каждую

Хлорамфечикол 25 мг/мл и Твен 20 0,2%

Бутилокситолуол: через 12 ч — 0,05 3,3 беэ добавления 3,0

П p H м е р 9. Corynebacterium

g lu tamicum FERMP-1982 культивируют, как в примере 7, но применяют патоку тростниково-сахарного производства вместо свекольной мелассы и к среде добавляют тетрациклин, "Ниссаннонион

LT221" или галловую кгслоту. Культивируют 72 ч.

Количество накопленного L-лизина в бульоне приведено в табл. 9.

759056

Таблица 9

Наименование добавок

Концентрация

Время добавления, ч

Накопление

L-лизина, г/дл

Тетрациклин 15 мг/мп

4,2

Ниссаннонион 0,2%

LT 221

3,6

Галловая кислота 0,5%

3,5

Контроль (отсутствие) 3,1

Формула изобретения

Составитель A. Бражникова

Техред А;93енанская Корректор В. Синицкая

Редактор Т. 1Пагова

Заказ 5664/53 Тираж 522 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ЛПП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения L-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода Corynebacterium или Brevibacterium на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии антибиотиков, или

1 оверхностно-активных веществ, или нтиокислителей, с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а и шийся тем, что, с целью повышения выхода лизина, из рода

Corynebacterium или Brevibacterium используют штаммы Corynebacterium

g3utami curn FERMP- 1987, ГЕйИР-1613, FERMP-1982 или Вгеч i bacterium 1actofermentum FERMP-1944, FERMP-1711, FEИИР-1857, ГЕДИР-1572, ГЕДИР-1574, Щ FERMP-1575, FERMP-1841, при этом культивирование ведут на среде, содержащей в качестве источника углерода углеводы или спирты, или органические кислоты, в присутствии антибиотиков, выбранных из группы: хлорамфеникол, эритромицин, диоксистрептомицин, тетрациклин, или поверхностноактивных веществ, или антиокислителей в количествах, соответственно равных

3,5-25 мг/мя, 0,05-2% и 0,051,0 мг/мп.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Франции 9 2050080, кл. С 12 0 13/00, опублик. 1971.