Способ определения происхождения животных
О П И C А Н И Е >743654
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Союз Советских
Социалистических
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 20.11.78 (21) 2685249/30-,15 (51) М. Кл. А 0.1 К 67/ОО
<1 01 N 33/16 с присоединением заявки Хе—
ГосударственныК комитет (23) Приоритет—
СССР по делам изобретений и открытий (43) Опубликовано 30.06.80. Бюл IcTcilb М 24 (53) УДК 636.081.082. .14 (088.8) (45) Дата опубликования описания 30.06.80 (72) Авторы изобретения В, А. Малыжев, Л. М. Романов, А. Г, Тимченко, О. H. Зряков и И. А. Балахнин (71) Заявители Киевский научно-исследовательский институт эндокринологии и обмена веществ и Опытная станция мясного скотоводствд -"- "
Украинской сельскохозяйственной Академии (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ПРОИСХОЖДЕНИЯ ЖИВОТНЫХ
Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в племенном животноводстве для уточнения происхождения сельскохозяйственных животных.
Известен способ иммуногенетического определения происхождения сельскохозяйственных животных по группам крови с помощью серологических реакций с применением моноспецифических сывороток (1).
Однако существующий способ определе. нпя происхождения животных не всегда дает возможность идентифицировать материнство пли отцовство, так как даже при наличии одинаковых эритроцптарных антигенов делается вывод о вероятном, а не
;инстинном родстве. Способ требует обязательного семейного анализа, и прц ошибочных записях матерей определение происхождения приплода становится практически невозможным. Использование иммунологического тестирования животных по группам крови ограничено огромными масштабами племенного животноводства и трудностями, возникающими при получении большого набора моноспецифпческдх сывороток.
Известен также способ определения происхождения сельскохозяйственных животных путем генетического анализа специфическпх полиморфных белков крови тестируемой пары потомок — родитель 12).
Однако известный способ не обеспечивает необходимой степени надежности опред=ления про:похождения животных.
Цель изобретения — повышение надежности установления истинного происхождения племенных или иных сельскохозяйственных животных.
Поставленная цель достигается предлагаемым способом, в котором генетический анализ проводят с антигенами гистосовмсстпмостп в реакции смешанных лимфоцптов, причем лимфоциты родителя предварительно инактивируют.
В способе применяется однонаправленная реакция смешанных лимфоцитов, которую в настоящее время широко используют при подборе донора в трансплантацпонной
20 медицине. По предлагаемому способу совместно культивируют лейкоциты периферической крови приплода и одного из предполагаемых родителей. При этом клетки последнего инактчвируют одним .из известных способов (например, облучением, митомицином-С и т. д.) . В этом случае реакция возможна лишь со стороны лимфоцптов приплода и то при условии чужеродности тестцруемого родителя. Реакция учитывается микроскопически плп радиометрическп
743@<)4
30 включени!о меченного предшественника
3 нуклеиновую кислоту, например, Н -тими-!!)па. Отсутствие реакции свидетельствует, ;то данное животное действительно явля)тся матерью пли отцом приплода, наличие
)сякции нсклн)чает отцовcTBo илп мятсринтво.
П p H,vt c p. Установление LI )Опсхож;!cHH5I животного складывается из следующих
-)тапов работы: взятие проб .крови, получение лейкоцитов, иняктивации лейкоцитов прс;!полагаемого родителя, постановка реакции и сс учет.
Кровь берут из яремн<ой вспы и стсриль ibie пробирки в объеме 4 — 6 3ил от кг)ж того животного. Для предупреждения вептыгания крови в пробирки предварительно вносят стерильный раствор гс.7арпча из расчета 40 ед. на 1 лгл крови. Кровь нсооходимо брать от приплода, предполагаемого родителя и для контроля от живот:ого, которос заведомо не может быть
3 б -)нзком родстве с приплодом.
Кровь доставляют в лабораторию и по;!сп:ают в тсрмостат на 37 С, г1срсз 1,5-2 н огби;)яют плазму, содержащую лейкоциты, и разводят се подходящей средой, напри<мер средой 199, тяк, тобы в 1 )ял одсржался лглн лейкоцитов.
Лейкоциты предполагаемого родит< ля и онтро;п=ног0:кивотногn ннактпгируют i!IIгомицпном-С. Для этого к мл суспензпи
:леток дсбав.анют 30 лгнг )1 итс .!! цпня-Г месь инк, б) I)) ют 30 ., 77<я ня BÎ,lÿ:Iol) Оянс
7p)i 37 С. Послc этого клетки трижды от«tb!B3!oT средой 199 и вновь разводят cpe"LOli <О кон CHTp3UUH 1 7 !17 ËI г
Культивирование клеток производят B .Ii.ликонизированных стеклянных пробирках размером 16Õ I!25 ял!. Реакци!о проводят ю следующей схеме:
1. 1 лглн клеток приплода в 3 5ил с.)еды .99, содержащей 100 ед. пенициллина и !
00 ед, стречтомициня в 1 <ял (для опр дсТснпя фоновой актив!!ости клеток).
2. 1 лглн клеток приплода — 500000 пняктпвировянных клеток контрольlioT<) жи:отного в 3 лг.г среды того же состава (поо)кительпый! контроль) .
3. 1 лглк клеток приплода — 500000
;нактивпровапных клето)к TccT!Ip)емого рп:,птеля при тех же условиях.
Для каждого варианта ставят по 3 па аллсльных пробы. Смсшанныс культуры
:нкубируют в стерильных условиях B тср1остате при 37 C в плотно закрытых про.).ир к а х.
Через 5 суток в культуры стерильно добавляют Н -тимидип в дозе 0,5 лгкК)ори/
)гл в 0,1 лгл среды 199 и кульTIIBI!po!33HI!c родолжают еще 24 н.
Культуры после этого охлаждают на ,1сдяной базс и уровень включения изотопа определяют с помощью жидкостного сцин"иляционного счетчика любым подходлщиг!.,;СTo:,ovi, например о!7рег!0.7снисм радпоактцв<ности .кислотонерастворпмо: о осадка, т!ерсцесснного 13 ми7липоровые фи:1ьтры.
Результат выражают 3 количестве им!1ульсоВ радиоактивно, о распада в минуту на
)робу. При этом определяют среднее зна:снпс тр х параллельных проб, После этого
0U!)c;Lcля1от индекс реакции (ИР) по форМ ),:1 С.
1)ь,))<: як i;i)i,;)c; ь ))).)<с!)<у.)ьт) 1)) )
ИР =
) ) 0 ÑÒ И . .: ) . ) i j),, )3 i) )i i! Û Х К ) 77 Ь i )< j) " .акция считается положите;IbHQH при I I P p3);:I10ì l,á Il Въ|шс. Рез) льтяты рс3к1tHè учитываются лишь при зня 1ени5! ИР -,biLUi: 4 13 lip 0!) 3 1lcl !70.10)HI!Tc. I bH bi H IIOHтроль Рсякц1!я между клетками гриплода Il 20 .)няКт1!ЗиРованнымп клетками истинного ! )Од<нтеля всегда отр1п!ятсльна (ИР меньше 1 б! 1,:!яооорот. она всегда полож)ггельна (высокие значения ЕР) при с:.,";ш.1:3!I:":::1 нc,)îäñòâcííûõ лимфоцитов. ... о и сд.7аг3c»oi» способу проводят экспертизу происхождения бычков I телок ; )ер.пьн-ангvccKQIO скота. Полу1снные ..!анныс сравнивают с заключением экспертизы Uî группам крови. До постановки реакции З0 с:1" на ных 31...1фоцито.) ист!11 Нос происХг)Ж !Сlllii и РО.!СТ .301i! Ibl" ОTIIОПIСН IЯ 1 CС 11р;: мых пар пе пзвсст11ы.. 33)к.710чснис обоих экспертиз сопоставляют с зяп)<сямп B и ic:::л.; книга .:. Результаты уста.1013)!си:!51 Ipo:!схождения . ж потныv приве сны в табл, 1, я в т-1б;1, 2 ll 3 --- результаты смеш31!ных лимфоц!ггов при тестировя;!пп заве 7<)÷n рп-стi3i I: 1;Одствен))ых п3p I Ic!! nil! 3I)B3I,Hå прс,.! II!3eiioi о способа
I1 P C.7. C, 51 С Т С Я I! C B C P O H T H O C, 3 И С Т И П Н С отцовство (матер<7!нство); не требуется се3«Cli llbl 3;) и <7,; ПЗ Г С, I ini3biiU3 ТСЯ НЯ ", 1. .Жг сст). Оценки I )nècþ)H,TCHI!57; и кроме того, 50 1.0 TBc!)гc7"051 !iр11 ÎTO !е .IHЯ «ОрогОcT05! 1ЦИХ МОНОС7НЕЦнфпЧЕСКП.. СЫВОРО-ОК. Формула изобретения Гпособ определения происхо)кдения жиьч)7 ных. включающий генетический анализ янтигепов тестируемой пары; потомок— родитель, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с 60 целью повышения надежности определения происхождения, гснстп !Сск)ий! анализ проводят с BHTUI cí3)!U гпстосовмест;! .!Ости в реакц;1!1 смеша ны х lli! аюцптов, причем ЛП7)!фоц!!Т1! РО,!ПТСЛЯ 17PCTBBPIITC,"!ЬНО I!U3K65 7 113 !1р,.ю т 743654 Таблица 1 Т с Результат -> реакции мешанных л,.мфогитan {!!Р! Л х о Ъ к C сБ Заключение экспертизы по реакции смешан, ных лимфоцитов Происхождение но записям Заключение экспертизы по группам крови, 1 Родители п .потомс гио О k", с с QJ (-, C с 2 И с - с (5 ь С. rV Е &. Предполагаемый отец Предполагаемая мать -Потомок Отцов ств о не подтверждено Материнство подтверждено Бутон Бутон 1,02 0,91 12,8 и материнство не исклюа1отся 772 772 Отцовство исключено Материнство исключено,Теленок рожден от других родителей (провокацион. проба) Предполагаемый отец Предполагаемая .мать Потомок Отцовство и материнство не исключаются 10,5 Бутон 1 1,2 132 330 11,5 Предполагаемый отец Предполагаемая и ать Потомок Лотос Отцовство исключено Материнство нолтвсрждае, ся 1 Бутаа 326 730 Отрицается одни из родителей 10,3 23,3 326 730 1,6 Таблица Я Результаты реакции смешанных лчмфоцитов прн тестировании заведомо родственных и неродственных пар крупного рогатого скота Тестирование заведомо известных родителей и потомков Тестирование неродственных пар включение Нз-тимиднна в гробах спонтанное включение Н -тимидина спонтанное включение H- -ти миди и а включение Чз-тн.лидина в пробах индекс реакции индекс реакции и.ии нин и,ии, мин 2 5 7 9 11 12 13 14 16 17 18 19 21 22 23 24 26 27 183 201 201 383 383 213 213 l260 502 360 ! 511 511 329 39 283 283 97 97 ! 81 181 321 321 450 204 261 302 613 215 298 864 236 430 168 662 428 296 339 396 ,126 136 163 272 354 417 675 1,1 1,3 1,5 0,9 1,6 1,0 !,4 1,4 1,9 0,85 1,5 1,2 1,6 1,1 :1,4 1,3 0,9 1,2 1,4 1,3 1,4 0,9 1,5 1,1 1,3 0,9 1,5 84 84 437 437 411 502 511 511 329 329 283 283 97 97 97 1247 2012 5018 4602 2168 3315 5384 3671 15!2 1152 4957 4507 2972 2341 524 671 843 890 14,8 "3.9 11,5 10,5 5,0 4,3 6,0 9,2 ! 3,1 7,3 4,2 8,3 9,3 6,4 9,7 13,7 6,6 10,5 8,2 5,4 6,8 8,7 9,2 Ю (0 о о х CJ Г( о с о х С ( (о CC о CC (-, х . о С(=( о o —: х о 1 (:.1 сС х о f о сс с-, CJ Сс (- ( (-, o -„ х :.1 о о о (CJ CJ (С сс (0 f» г(Р. о. o o с .1 с-, о о с :.1 х х с(Г о о о о х f» C, ((o o х М о f о д х о о х ;Г(- -- o х с (.0 с=г о о о (: — f " "-- о ( о 1 с» о г Х х о (0 х х о, Bсо СО сс(СС(OI 00 0 О: \с„ с г1 CJ с>:з " сс Х 0 0 (1(ЗС(СО ссС х 1 (! Г,1 (а,1 1 со х о Сл, — (-"-. 00 с .. х х о c (0J С 00 г - Ч 00 (х х о fo = С» f о о о. С.l,L сч 1 J г(С(O 1 =: о 1Г (1 о: х 1(; 1 х со х со 1 " o ! -: о г- (00 .. г х..1 D о С» CCl 1 с(х о (в с((о о а., ( г х о ОЭ 2 х х С» Б х о сх о х I1l о CJ о г о Ы г, о а 1 J (О С(-г 01 ( со "г tw О1 х о вэ (О (0g СЯ L г У, .О х о сс с( (-. o ( сХ и 0 о о„ о х CJ (J х х х х «х CJ С, х С.( о (с х о S с х С. сс CJ о. 0- O CJ Х ! о С.1 с:г о а< О о с» х ,о о о о а о х ( илпяюй ЭХЗМни и пк)и и н g 0d(I н книьики,(.-,.ц эи((эьо(ь.мц НН(((1(JII JI н и)! ъ и (с (13.— Эй f i Jh(JI!.">t ff 3OIIIf IJIII0. I ) 743654 С-?::3 С ("-1: 1 С.(O г, o-. а Hсн сгс :- о (((с О1 Г-- —, О о, 00 (О("1 ХССАХ о с о с (- (- (.;ОСС О1 - С, Х С 1 Х (1 — -i С l 1. х t с -: Г- 1." с;с.(с:с С.С:С з I c 1 Г г 0:1 C: 10 5С F» 5-5 О Х с» а с» CL! 555 о Ф:(5- О О 5С С» Cd с5 cl Х о, О CI5 с» «5 5= о О 5о О с» ! О О, С» С! CI5 с» N о, O 5о о о F 5» d5 С5 с5 сс =(%% а р. О С) C- 5 o o ! к 5с V О ! g с5 с« н а а С» О СС5 д ѫѫ о о И сс о Е С» сс с5 о f" а С» С» Cll с» «1 \» с- о. о ! о 0 0 Е" o o сб й(М л о о dl с» 5 о о Я Cd сс о л! a o CCI р Г о oо 5С о с! CI5 М С» о„ с» с» СС5 с». к о о д » =/=(w O Q О с Ы = 5 с5 С» О 55 Д 5- 5 оооо.55 5 О No с =5 =5 =5 С» С» О оооо ф 2 о о С» CI» CI» cO « 5-с!» о о с СС! f» о о с5 о 5О с» о о о сс» сс> о соo о С 5 "» >,О о I 5a =., ЯФя C CД E со Lo X С«сс < + 0 CO»: O 5 5 со 555 с » СЧ ся о5 с,с! Х со СУ» Cd а 5О Я С» о C»C» O о » » О Ыц Я,=-,я Я с!» сО о о 5 о о F со о о о \» . о < v o o 5 F о д Е 5» cd о. l» Б сс с» 5-» I с сс5 5 5 С » «55 С5 О4 О» «» O» »cC» C «Рса ФСОCOЯ СО«»M С »t 5< »Я«2 С 5 5 С »С 4 ЯЯБ БФ@Я М о ФЯ ф яЖ Фо с»5с 5Я 1т И «»с-5 с5С»с&I сосо с»R < >С:5, С«» С-Г-С»СΠѻѻ 5!» CO сО 5 M 5 СС Р 3 :5 О» СЧ " ч с! О р о с; а= сс еа сс» X Х сс с» с5 Cd о. v, О о Х 5 хо Л -05 »» o >. о 5»Щ с» -- =x сс о аО с! с( о о х х— 0 о » ! Cd с! o e с» Cd -с= l о о»» л оС5 а о д 743654 Составитель Л. Мурзя Техред Л, Куклина Корректор С. Файн Редактор А. Соловьева Заказ 681/883 Изд. М. 324 Тпрахк 729 Подписное НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4/5 Тип. Харьк, фил. пред. «Патент» Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1. Авторское свидетельство СССР ¹ 330842, кл. А 01 К 67/00, 1972. 2. Эйдригевич E. В. и Лапкина М. М. Генетические методы определения происхождения сельскохозяйственных жлвютных, Киев, Урожай, 1975, с. 19 — 27.
