Способ определения т-лимфоцитов

.. -ч . -с ватт;ь., .. -,.:;-,ч;бн 4!аахене 1,11=А

Союз Советских

Соцкалистических

Республик

ОП ИКАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

»» 721084 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 10.05.78 (21) 2612691/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (5!) М. Кл, Аб! В IO/00

G OI N 33/!6

Государственный комитет

СССР па делам изобретений и открытий

Опубликовано 15.03.80. Бюллетень № 10 (53) УД К 6! 6-003.

2!5(088 8) Дата опубликования описания 25.03.80 (72) Авторы изобретения

A. И. Маркявичюс, В. И. Гирюнас, П. Б. Садаускас и В. С. Домкус

Институт биохимии АН Литовской ССР и Всесоюзный научноисследовательский институт прикладной энзимологии (71) Заявители (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ

Изобретение относится к области иммунологии.

Известен способ определения Т-лимфоцитов путем центрифугирования крови с последующим отделением мононуклеарных клеток, инкубирования их с эритроцитами барана в среде Хенкса, отделением полученного осадка, ресуспендирования его и подсчета Т-лимфоцитов (11.

Однако известный способ не позволяет точно определить Т-лимфоциты.

Целью изобретения является повышение

10 точности способа.

Цель достигается тем, что инкубирование проводят в среде Хенкса, дополнительно содержащей хлорид цинка в концентрации

1 ° 10 5 — 3. 10 5 г/мл среды при 8 — 22 С. is

Пример 1. Выявление Т-лимфоцитов крови у людей. Лимфоциты выделяют из венозной крови. Гепаринизированную (10 ед/мл) кровь (5 мл) разбавляют раствором Хенкса (без Са2 и Mg2 — для предотвращения эффекта слипания клеток) в соотношении го

3: 2. Затем 8,3 мл разбавленной крови осторожно наслаивают в центрифужных стаканах (емкостью 25 мл) над 7 мл раствора, состоящего из 5,2% фиколла 400 и 60% верографина плотностью 1,077. Центрифугирование проводят в центрифуге К-23 на роторе-крестовине при 900 g в течение 70 мин при 18 С. Мононуклеарные клетки (96% лимфоцитов), находившихся на границе плазмы крови и фиколла-верографина, отсасывают пастеровской пипеткой, дважды промывают раствором Хенкса (без Са и Mg ) по

20 мл и дважды центрифугируют при 200 g в течение 10 мин. Полученный осадок клеток ресуспендируют в растворе Хенкса (с Саа и Mg ) с добавлением к нему 2nCI> в конечной концентрации 1 10 г/мл (0,001 /0)

Жизнеспособность клеток составляет 98—

100%. Определяют концентрацию клеток и доводят ее до 2. 106 на 1 мл.

Далее в силиконизированные центрифужные пробирки, содержащие по 1 мл суспензии лимфоцитов (2. 10 клеток/мл), добавляют по 0,1 мл дважды отмытых раствором

Хенкса эритроцитов барана (хранившихся не более 10 дней в растворе Альверсера при 4 С) в концентрации 108 на 1 мл. В некоторые пробирки добавляют еще абсорбированную сыворотку эмбрионального те721084

Т а блица 1

Среда Хенкса

53, О+5,0

72,5 3,5

40,0-6,5

7,3,0-3,0

5(3-10)

9(3-17) 4(3-10)

10(3-1 8) Среда Хенкса с се, Среда Хенкса с

a Hq и 50;о сы-воротки

72,0-4,5

70,5-4,0

10(3-19) 11(3-18) Среда Хенкса и

5 0 i сыворотки

46,0-5,5

57, 0-4,,5

6(3-11) 5(3-12) ленка. Инкубационную суспензию клеток перемешивают, центрифугируют при 100g в течение 10 мин и оставляют йа 8" — 20ч при 8 — 22 C. После инкубирования надосадочную жидкость отсасывают, осадок клеток ресусйендируют путем осторожногб вращения (1 об/с) рукой пробирок с наклоном

30 — 45 . Суспензию клеток вводят в камеру Горяева или наносят на объективные стекла пастеровской пипеткой. Мазки делают общеизвестным способом, фиксируют абсолютным метанолом и окрашивают по

Романовскому-Гимзе.

Процент розеткообразующих лимфоцитов определяют просматривая по 200 лимфоцитов. Розеткой считают лимфоцит с прикрепившимися к нему не менее трех эритро: цитов барана.

В табл. 1 приведены средние арифметические измерения, стандартные отклонения или нижний и верхний пределы измерений.

Таким образом, при инкубировании клеток в среде Хенкса с хлоридом цинка колите . чество выявленных розеток наиболее высокое и в 1,4 — 1,8 раза превышает их число при инкубировании клеток в среде Хенкса, не содержащем хлорида цинка.

Пример2. Выявление Т-лимфоцитов в крови у крупного рогатого скота. Все операции выявления розеток у крупного рогатого скота идентичны методике определения розеток у людей за исключением того, что слой мононуклеарных клеток образовался на границе слоев плазмы крови и смеси из фиколла 400-верографина, плотность которого была 1,069 при центрифугировании

1000 g в течение 80 мин.

В табл. 2 приведена характеристика розеткообразующих лимфоцитов в крови крупного рогатого скота.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение в инкубируемую суспензив клеток 1 10 5 — 3. 10 5 г/мл (а для лимфоцитов крупного рогатого скота еще и

50% сыворотки) позволяет получить наибольшее количество сохранных розеток как в камере Горяева, так и на мазках, а число прилипших эритроцитов к розеткообразующим лимфоцитам значительно увеличено.

Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью определить Т-лимфоциты как у людей, так и у крупного рогатого скота.

721084 таблица 2

4(3-8)

9(3-16)

8,0-3,0 5(3-7)

56,5 3,5 1Q(3-16) 11,5++3,0

59,5+4,5

Среда Хенкса

Среда Хенкса с

7 се, Среда Хенкса с а и@ и 50% сыворотки

6 3, 5-4, 0 1 2(3-20) 64,0-3,5

1 2(3-1 9) Среда Хенкса и

50% сыворотки

34,0-6,0 7(3-12) 49, О+6,5

6(3»»14) / /

Составитель С. Малютина

Техред К. Шуфрич Корректор Ю. Макаренко

Тираж 673 Подписное

ЦН ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ПП П «Патент», r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор В. Трубченко

Заказ 23/4

Формула изобретения

3С

Способ определения Т-лимфоцитов путем центрифугирования крови с последующим отделением мононуклеарных клеток, инкубирования их с эритроцитами барана в среде

Хенкса, отделением полученного осадка, ресуспендирования его и подсчета Т-лимфоцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, инкубирование проводят в среде Хенкса, дополнительно содержащей хлорид цинка в концентрации

1. 10 — 3 10 г/мл среды при 8 — 22 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Neurology 1976, 26, 10. с. 997 — 999