Способ приготовления тест-системы для оценки противовирусных конъюгатов
1
2Ь 4Ря
»ieCSzg
»ОЛ 1 Е:700110
Союз Советскнх
Соцналнстнческнх республик
ОП И
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Зая влено 04,05,78 (21) 2626841/28 — 13 с присоединением заявки М (23) Приоритет
{51)M. Кл.
А 61 В 10/00
G 01 N 33/16
Геще,ерстеенньй неннтет
СССР ее делаем нзебретеннй к етнритнй
Опубликовано 30.11.79. Бюллетень 1Не44
Дата опубликования описания 30.11.79
{53).-УД К6 616-07 (088.8) (72) Автори изобретения
С, А. Журов, Б. М. Лялюк и В. И. Васерин (71) Заявитель
Свердловский научно-исследовательский институт вирусных инфекций (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ТЕСТ вЂ” СИСТЕМЫ
ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ КОНЬЮГАТОВ
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при экспресс-диагностике вирусных заболеваний.
Известен способ приготовления тест-системы для оценки противовирусных конъюгатов путем присоединения к стабилизированным эрит-
5 роцитам антигена (1) .
Однако известный способ не позволяет получить высокоактивные и специфичные тестсистемы, так как используемые химические по.10 средники не способны избирательно реагировать как с вирусными, так и с клеточными антигенами.
Целью изобретения является увеличение на поверхности эритроцитов числа рецепторов, спо15 собных избирательно соединяться со специфическими вирусными или клеточными антигенами.
Эта цель достигается тем, что 0 001 — 0,005%-ную суспензию стабилизированных эритропитов обрабатывают предварительно агрегированным глутаровым альдегидом специфическим гаммаглобулином в концентрации 0,005 — 0,05%, затем присоединяют гомологичный к активным
2 центрам антител агрегированного гамма-глобулина антиген и полученную тест-систему стабилизируют.
Способ осуществляют следующим образом.
Эритроциты 0 группы крови человека, отмытые от отрицательной реакции надосадочной жидкости с 50%-ной четыреххлоруксусной кислотой стабилизируют глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0,25% при нейтральной рН и температуре 37 С в течение 3 ч.
Выделяют иммуноглобулиновую фракцию из сыворотки крови кролика (с титром по
PlTA не менее чем 1:320 к вирусу гриппа
А или В) методом осаждения сернокислым аммонием в концентрации 37,5% от насыщечного раствора в течение 6 ч при температуре
4 С с освобождением от соли методом гельфильтрации на сефадексе G — 25.
К 5 мл гамма-глобулина кролика, разведенного забуференным физиологическим раствором с рН 7,2 до концентрации белка 0,005—
0,05%, добавляют 0,3 мл 2,5 о-ного глутаровоо го альдегида и агрегируют при 37 С в течение 1 ч, после чего добавляют 0,1 — 0,2 мл
70И l0
0,5%-ных глутаризнрованных эритроцитов ч:ловека и присоединяют к ним агрегированный гамма-глобулин при температуре 56 С в течение 90 мин и встряхивании через каждые
15 — 20 мин. После осво" îæäåíèÿ от крупных агрегатов декантацией и отмывки в физио.тогическом растворе нагруженные специфическим гамма-глобулином эритроциты выдерживают
4--17 ч нри 4 — 25 С в аллантоисной вируссодержащей жидкости: к 1 — 10 мл аллантоисной вируссодержащей жидкости с титром по РГА
1%-ными куриными эритроцитами от 1:16 до 1:2048 добавляют 10 — 10 эритрощгтоа.
Результаты Оценки иммунофлуоресцентной
ИФ-активности флуоресцнрующих антител, спе- 15 цифичных к гриппу А2 и 8, представлены на графике (см. чертеж), где: на оси абсцисс степень нагрузки в вибрионах на 1 зритроцит„ па оси Ординат — ИФ-активность, выраженная
Величинами ооратными использованным разве- ?О дсниям конъюгатов; кривая A показывает зависимость специфической ИФ-активности флуор солирующих антител (ФА) K гриппу А2 О r стс:, ени нагрузки эритроцитов вирусом гриппа Аэ, кривая b -- зависимость специфической ИФ-активности ФА к гриппу В от степени нагрузки эритроцитов вирусом гриппа 8; кривая В -- зависимость перекрестной ИФ-активности ФА к гриппу А2 от степени нагрузг) кн эритроцнтов вирусом гритша 8; кривая Г= зп зависимость пепекрестной ИФ-активности ФА к гриппу В от степени нагрузки эритроцитов вирусом гриппа А .
Иэ представленных: данных видно, что . !r1 -активность противогриппозных конъюгатов ,:н=аходигса в прямой зависимости от количестIra вибрионов в использованной тест-системе.
Максимальное количество вируса, присоеди.4 О пенное к эрптроцитам с помощью предлагаемого способа, составляет для гриппа В 2— -1 тысячи,,для гриппа А2 8 — 16 тысяч вибрионов на 1 эритроцит (теоретически возможная нагрузка эритроцитов, при условии расположения вибрионов в один слой, в пределах 5—
20 тысяч вибрионов на 1 эритроцит). Благодаря использованию тест-системы с болылим количеством вируса удается выявить даже незначительную перекрестнуто активность оцениваемых конъюгатов. С помощью полученных
ТЕСТ-НРЕНЯРатон Ь10жно ЛаТЬ ДОСТаТОЧНО ПОЛНУЮ ,<арактсристику иэучаемь::м конъюгатам, кото. рая включает в себя: чувствительность и перекрестную активность иммунофлуоресцентных реакций в зависимости От взятого рабоче,о разведения конъюгата, титры специфической и, неспелмфической ИФ-активности оцениваемых конъю гатов.
Предлагаемый способ позволяет получить достато нный набор специфичных и с пеобходи. мым количеством присОединенного антигена лиофилизированных тест-систем, пригодных для оценки красящей активности, специфичности, и выбора оптимального рабочего разведения противовирусных конъюгатов не только в процессе их производства., но и в конкретных условиях работы вирусозогических лаборатория (оптические системы люминесцентных микроскопов, светофильтры, источники ультрафиолетового света). Приготовление тест-систем улрОстит и ускорит кон|поль конъюгатов. ПОВНсит эффективность экспресс-диагностики вирусных заболеваний.
Формула изобретения
Способ приготовления тест-системы для ОценК:: лротивовирусных конъюгатов путем лрисоед .л,еп*,гя к стабилизированным эритроцитам антигена„отличающийся тем, что, с целью увеличения на зовсрхчости эритроцитов писля рецепторов, способных избирательно соединяться со специфн ескими вирусными или клеточными антигенами, 0,001 — 0.005,ь -ную суспензию стабилизированных эритроцитов обрабатыва,"от предварительно агрегированным глутаровьтм ar,ьдег1лдом специфическим гаммаrrIooyлинОм а концентрации 0,005 — 0,05;4, затем присоединяю-. гомологичный к активным центрам ант ьтсл агрегированного гамма-глобулина антиген и полученную тест-систему стабилизируют.
Источники инвормации, принятые во внимание лри экспертизе
1. Barasa И. И. Оценка иммунофлуоресцентНоН активности ФА H иммунных сывороток против возбудителей ОРЗ с помощью эритроци арнъ|х тест-объектов. Kríö. дис. Л., 1972.
700110
Составитель С. Малютина
Техред Н.Бабурка
Редактор Н. Хубларова
Корректор И. Михеева
Заказ 7282/3
Тираж 672 Подписное
1.1НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открьгтий
113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4
80 120 2ХОХЖ 1 2 + 3 18 псе тыс тич тм мыс
