Способ подавления иммунитета к энтомопатогенным бактериям у насекомых
О П И С А Н И Е 11ц688!94
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Союз Советских
Социалистических
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 14,04.76 (21) 2346185/15 с присоединением заявки М (51) М. Кл
А 61к 39/Ik+ (43) Опубликовано 30.09.76. Бюллетень Гхе 36 (45) Дата опубликования описания 30.09.79 (53) УДК 576.8.097.5 (088.8) по делам изабретеиий и открытий (72) Авторы изобретения
Ю. Б. Валюкас, М. А. Бабянскас и П. А. Заянчкаускас, Институт зоологии и паразитологии АН Литовской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНИТЕТА
К ЭНТОМОПАТОГEHHblM БАКТЕРИЯМ У НАСЕКОМЪ|Х
Государстееииый комитет 3 (23) Приоритет
Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к защите растений от насекомых-вредителей, и может быть использовано в качестве биологических способов подавления развития насекомых-вреди- 5 тел ей.
Воздействие на насекомых физиологически активными веществами приводит к тому, что насекомые на время их действия заменяют обменные процессы и таким об- 10 разом сохраняют целостность популяции.
Цель изобретения заключается в повышении эффективности борьбы с насекомыми и предотвращении загрязнения окружающей среды. 15
Для этого в качестве активного вещества берут антигемоцитарную сыворотку насекомых.
Предложенный способ основан на новом принципе, который заключается в использо- 20 ванин иммунохимических свойств насекомых.
Способ осуществляют следующим образом. Гусеницы с очищенным пищеварительным трактом помещают в консервант, где 25 удаляют по одному сегменту от передней и задней частей тела и пищеварительный тракт, оставшееся тело измельчают и перемешивают, после чего полученный гомогенат фильтруют и центрифугируют. 30
Для длительного хранения клеток тела и гемолимфы при низкой температуре (до — 20 С) используют раствор СМЭП, который состоит из 0,24М сахарозы, 0,004М
ЭДТА, 0,01М фосфата натрия на 1000 мл дистиллированной воды, рН данного раствора =7,0.
П р и м ер. Гусеницы Galleria тпе11опе11аЬ
V — VI-ro возрастов дезинфицируют и оставляют на 5 — 6 ч для очистки пищеварительного тракта. Десять штук живых гусениц помещают в 1 мл консерванта для избежания агглютинации, мелинизации и оксидации гемолимфы. Удаляют по одному сегменту из передней и задней частей тела.
Затем удаляют пищеварительный тракт для предотвращения действия ферментов. Измельчают оставшееся тело гусениц, вместе с консервантом помещают на 7 — 10 мин в магнитную мешалку для полного выделения гемолимфы. Полученный гомогенат фильтруют и центрифугируют 6 — 7 раз по
1 мин при 1000 об/мин. Центрифугат оставляют на 30 мин при комнатной температуре и удаляют образовавшийся верхний жирообразный слой ватным тампоном.
Сливают плазму гемолимфы, а клетки заливают смесью СМЭП-а и глицерина:
1 мл гемоцитов, 2 мл СМЭП-а и 1 мл глицерина.
688194
Таблица 1
Доза 0,25 мкл
Доза 2,50 мкл
Варианты опыта, Мо
V VI возраст
II — IV возраст
П вЂ” 1Ч возраст
V — VI возраст после
24 ч до
24 ч до
23 ч после
24 ч до
24 ч до
24 ч после
24 ч после
24 ч
0
32
48
0
32
48
0
32
48
0
32
48
0
80
0
80
0
80
0
38
80
Работу проводят при +4 С. Полученныс клетки тела и гемолимфы хранят при — 20 С.
Во избежание агглютинации, мелинизацпи и оксидации клеток применяют конссрвант следующего состава, г:
Цитрат натрия 3,5
Глюкоза 2,0
Левомицин 0.015 на 100 мл дистилированной воды.
Для получения антигемоцитарной сыворотки иммунизировали 6 белых крыс по методике Вязова (1967) 4 раза с интервалом в 5 дней. Во время каждой инъекции вводили по 0,2 мл 50%-ной суспензии гемоцитов. Первую иммунизацию проводили подкожно, вводя каждой крысе по 0,2 мл
5%-ной суспензии в смеси с 0,04 мл адъюванта фрейнда. Последующие иммунизации проводили внутримышечно, вводя по 0,2 мл
50О/о-ной суспензии в смеси с 16666 т, е. пенициллина для предотвращения возможности инфекционного процесса.
Перед первой иммунизацией брали кровь для определения наличия у крыс естественных антител против гемоцитов гусениц.
Спустя 7 дней после последней иммунизации крысы обескровливались. Полученную антисыворотку инактивировали при +56 C в течение 30 мин и хранили при — 20 С. В результате получен ряд антигемоцитарных сывороток. Титр гемоцитоглютиненов
1: 256 — 1: 2048.
Антигемоцитарная сыворотка подавл яет механизм иммуносистемы, в результате чего в клетках уменьшается выработка прецппитирующих антител. (Антигемоцита р н а сыворотка получена при иммунизации крыс клетками Galleria гпеllопеllа L, по Вязову
1967) .
Все варианты проверки были исполнены в пятикратной повторности, а в каждой повторности было использовано 100 гусегнщ.
В связи с тем, что иммунитет передается по наследству, была проведена повторная
Использование предлагаемого способа по данным заявителя позволяет одновременно получать значительное количество клеток и плазмы гемолимфы; избегать оксидации, мелинизации и агглютинации; лучше отделять клетки от плазмы. Кроме того, клетки и плазма гемолимфы хранятся длительное время прп низкой температуре (до — 20 С).
Полученную сыворотку использовали при закладке опыта со следующими вариантами:
1. Контроль — без обработки.
2. Контроль — чистая вода.
3. Контроль — гетерогенные белки (белых крыс).
4. Вариант с антигемоцитарной сывороткой.
5. Энтомапатогенными бактериями Вас.
thuг1пgiensis.
20 6. Антигемоцитарная сыворотка и энтомопатогенные бактерии.
Варианты с контролями н антигемоцитарной сывороткой осуществляли посред25 ством опрыскивания по поверхности тела гусениц, а вариант с энтомопатогенными бактериями осуществляли дополнительной дачей в корм гусеницам энтомопатогенных бактерий Вас. thuringiensis cereus Var.
30 galleria из расчета 0,016 мл суспензии в
0,1% концентрации раствора на одну гусеницу, содержащей около 200000 спор бактерий.
Кроме того, все варианты опыта были
35 повторены с дозами антигемоцитарной сыворотки 0,25 мкл п 2,50 мкл из расчета на
1 гусеницу и второго и шестого возрастов гусениц.
Резулы аты испытаний изложены в
I0 табл. 1 (гибель гусениц в / до 36 ч). проверка с гусеницами Galleria mellonella L., второго поколения полученного от бабочек, выживших от первой проверки.
Результаты испытаний изложены в
15 табл. 2 (гибель гусениц в /в до 36 ч).
68819ч
Таблица 2
Доза 0,25 мкл
Доза 2,50 мкл
Вариант опыта, №
V — VI возраст П вЂ” IV возраст V — VI возраст
П вЂ” IV возраст после
21ч после
24 ч до
24 ч после
24 ч до
24 ч после
24 ч до
24 ч до
24 ч
Комиссия считает, что гусеницы после
48 ч воздействия на них бактериями приобретают иммунитет против них.
Сопоставление первой и второй таблиц (первое и второе поколения) показывает, что при воздействии на гусениц одними только энтомопатогенными бактериями способствует приобретению гусеницами стойкого иммунитета против указанных бактерий.
Воздействие же на гусениц антигемоцитарной сывороткой способствует полному подавлению иммунитета у гусениц против энтомопатогенных оактерпй и 100 /о-ной гибели вредных насекомых во втором поколении.
По данным заявителя, по сравнению с существующими химическими средствами борьбы с вредными насекомыми использование природных факторов — подавление иммунитета насекомых — имеет следующие преимущества:
Подавление илтунип1ета
Хилiичесние cpedcmoa
Уничтожают насекомых посредствдм подавления их иммунитета
Применение аптигемоцптарной сыворотки вызывает наследуемое снижение устойчивости к бактериям
Для окружающей среды безвреден
Узкоспецпфпчньш и действует только на тот вид насекомых, против которого их применяют
Уничтожают насекомых посредством отравления их организмов
Применение химических средств вызывает адаптацию насекомых к ним
Вызывает отравление окружающей среды
Токсичный для теплокровных
Формула изобретения ния эффективности борьбы с насекомыми и предотвращения загрязнения окружающей среды, в качестве активного вещества берут антигемоцитарную сыворотку насекомых.
Способ подавления иммунитета к энтомопатогенным бактериям у насекомых, отличающийсяя тем, что, с целью повышеСоставитель В. Косовец
Техред Л. Орлова
Редактор Е. Дайч
Корректор Р. Беркович
Заказ 2355/15 Изд. № 565 Тираж 681
НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изооретений
113035, Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5
Подписное и открытий
Типография, пр. Сапунова, 2
0
32
100
0
32
100
0
32
100
0
32
100
0
100
0
100
0
100
0
38
S0
100
