Способ иммобилизации ферментов в полиакриламидном геле

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик.цц673642

Ь (i т В" (6I) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 151177(2I) 2543103/23-05 ($ f) Кл.

С 08 F 220/56 с присоединением заявки Но

Государственный комитет

СССР оо делам изобретении и открытий (23) Приоритет (S ) УДК 678.745. .842 (088.8) Опубликовано 150 7.79. Бюллетень Nо 26

Дата опубликования описания 1507.79, (72) АвтОрЫ В.А -1 росинг, Х. Я.Кальюла, А.И.1(естнер, 3ОбрЕтЕИИя .3. р ков, Б.З. лас .ва и Р.И. Улу ко (71) Заявитель

Таллинский политехнический институт (5 4 ) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

В ПОЛИ АКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Изобретение относится к биохимичесФ асой технологии, связано с разработкой биохимических методов анализа.

Примен ени е иммобили э ов анных ферментов позволяет создать новые методы анализа веществ биохимического характера, основанные на применении ферментных электродов, колонок. с иммобилиэованными ферментами и т.д.

l0

Известен способ иммобилизации ферментов в полиакриламидном геле путем радикальной полимериэации в водном растворе, содержащем 0,1-2 вес.Ъ ферI мента, акриламида и N, N-метиленбисакриламида в соотношении 95:5 соответственно. В полимеризационную смесь дополнительно вводят высокомолекулярный йолисахаридкрахмал (11. Так, на- пример, полимеризационную смесь, содержащую (%) 16,7 акриламида, 0,53.

N,N-метиленбисакриламида, 10 акрилата натрия, 0,17 фермента каталазы и

1,67 крахмала замораживают и облучают радиацией ОСо дозой 54 крал. 25

Иммобилиэованная каталаза сохраняла

94,lt исходной активности.

Этот способ ускоряет полимериэацию и увеличивает степень полнмеризации мономеров нри радиационной полимеризации замороженной смеси. В случае особенно чувствительных ферментов, таких как пропионилхолинэстераэа, применение крахмала не дает нужного эффекта. Это связано с тем, что из— за высокого молекулярного веса крахмала практически невозможно ввести его в реакционную смесь в концентрации более нескольких процентов.

Недостатком известного способа является то, что низкая концентрация полисахарида не обеспечивает достаточное сохранение активности пропионилхолинэстеразы во время иммобилизации .

Целью изобретения является уменьшение инактивации фермента в ходе полимеривации.

Укаэанная цель достигается тем, что в водный раствор вводят сахарозу в количестве 15-50 вес.В. Применяют радиационную полимеризацию, а также химическую полимеризацию с использованием в качестве катализатора смеси надсернокислого аммония и N,N,N,N —

-тетраметилеидиамина в соотнскаении

1:1 соответстьенно.

Н р н м е р 1. Пропионилхолинэстеразу растворяют в 25%-ном растФормула изобретения

Составитель А .Переверзева

Техред О. Андрейко Корректор О. Ковинская

Редактор E.Хорина

Заказ 4011/24 Тираж 584 Подписи ое

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытиЯ

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5!

Филиал ППП Патент, r.ужгород, ул.Проектная,4

3 6736

Воое сахарозы в 0,06 И боратном буфере,p8 6,0. 6 объемов полученного раствора смешивают с 2 объемами 50%ного раствора мономеров (акриламид и

N,N-метиленбисакриламид в соотношении 95 5), в качестве иницйато ав добавляют 1 объем 2,5%-ного раствора 5

N,N,N,N -теГраметилэтйлеидиамина и 1 объем 2,5%-ного раствора надсернокис.лого аы4ония. Все растворй перед смешением охлаждают до 1-2С и получен- . йуЖ смесь выдерживают при той же тем- 10 пературе 2 мин. Полученный блок геля

" " -измельчают протиранием Через сито с отверстиями 0,6 мм, далее препарат промывают вышеуказанным буферным раствором и сохраняют до применения в холодильнике. Сохранение активности при иммобилизации не ниже 30% 6г ис- . ходной.

Пример 2. Пропионилхолин эстеразу растворяют в 50% HoN растворе сахарозы s 0,06 И боратном буфере, рН 6,0. 8,6 объемов полученного раст- вора смешивают с 1,4 объемами 50%-но- . го раствора мономеров. Полученную . . смесь облучают1-лучами, доза радиации

6 крад. Раствор выдерживают во время облучения при 0 С. Измельчение и промывку проводят, как в примере 1. Сохранение активности не ниже 15% от исходной. Без наличия сахаровы в этих условиях гель ие образуется. 30

Пример 3. Аминоацилаэу растворяют в 50%-ном растворе сахарозы в

0,1 М фосфатном буфере, рН 7,2. 7 объемов получейного раствора смешивают с 3 объемами 50%-ного раствора мо- З5 номеров (акриламид и И,Б)-метиленбисакриламид в соотношении 95:5) . Полученный раствор облучают -лучами, доза радиации 15 крад. Раствор выдер-: живают во время облучения при 0 С ° 4p о

Полученный блок геля измельчают проти42 4 раннем через сито с отв ерсти ями

0,4 мм, полученный препарат промыва- ют вышеуказанным буфером. Сохранение активности не ниже 15% от исходной.

Полученные результаты показали, что высокие концентрации (15-50%) сахароэы значительно ускоряют образование полиакриламидного геля из мономеров и придают гелю более однородную структуру. Опыты показали, что в присутствии сахароэы реакцию полимериэации акрильных мономеров можно провести при более низких концентрациях инициаторов или при зна- чительно более низких дозах радиации, что уже.само собой уменьшает инактйвацию фермента в ходе полимериэации. кроме того, проведение полимериэации в присутствии сахароэы выявляет опре деленное защитнор действие и позволяет получить гели, стабилЬность которых при работе в несколько раз выше стабильности, полученной. обычной полимеризацней.

Способ иммобилизации ферментов в полиакрилаиидном геле путем радикальной полимеризации s водном растворе, содержащем 0,1-2 вес.% фермента, акриламида и N,N t-метиленбисакриламида в соотношений 95:5 соответственно, отличающийся тем, что, с целью уменьшения степени инактивации фермента в процессе полимериэации, в водный раствор вводят сахароэу в количестве 15-50 вес.%.

Источники информации, принятые во внимание ври экспертизе

1. Патент Японии Р 7442876, кл. 36/2/ С 05, 22.04.77.