Способ иммобилизации люциферазы светляков

ОП ИИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

66ОЗ78

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61)Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 22. 11. 77 (2> ) 2548028/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет

Опубликовано 231282. Бюллетень ¹ 47

Дата опубликования описания р3.01 83 рц м.кл.

С 12 N 11/02

А 61 К 37/50

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (53) УДК 547 ° ()7 (088. 8) (72) Авторы изобретения

И.В.Березин, Н.Н.Угарова и Л.Ю.Бровко

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В.Ломоносова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ

Изобретение относится к неописан ному ранее способу получения иммобилизованной люциферазы светляков.

Указанный фермент является уникальным для аналитического определения аденоэинтрифосфата (АТФ) в различных биологических препаратах, поэтому раз. работка методов его получения, особенно в иммобилизованном состоянии, важна для целей медицинской биохимии, в частности для диагностики инфаркта миокарда. Растворимая люцифераза светляков является очень лабильным ферментом и легко инактивируется.

Препарат люциферазы светляков за четыре дня хранения при комнатной температуре теряет почки 99В своей активности. В литературе отсутствуют данные о возможных путях ее стабилизации и создании таких нерастворимых форм фермента, которые могли. бы быть использованы многократно.

Предлагаемый способ основан на химическом методе иммобилизации путем образования ковалентной связи между ферментом и полимерным носителем, модифицированным введением групп способных реагировать с ферменt; 13.

Предлагаемый способ иммобилизации люциферазы светляков заключается в том, что слабощелочный экстракт лампочек светляков с рН 7,5-8,0 и ионной силой 0,1-0,2 М обрабатывают при 2-15 С предварительно модифициро ванными введением групп, способных реагировать с ферментом, полимерами на основе полисахаридов или полиакрилатов. Полученную твердую фазу отделяют обычными приемами, Предпочтительно в качестве полимеров на основе полисахаридов использовать сефароэу или сефадекс, модифицированные BrCN или — в качестве полимеров на основе полиакрилатов — полиметакриловую кислоту, модифицированную карбодиимидом,и процесс осу.ществляют при 2-5 С.

Цель изобретения — решить как проблему стабилизации люциферазы, так и проблему получения фермента, пригодного.для многократного использования.

Сущность спосо6а заключается в следующем. Водный экстракт люцифера,эы, полученный экстракцией обеэвоженных лампочек светляков буферным раствором с рН 7,5-8,0 и ионной силой

0,1-0,2 М обрабатывают предваритель660378

)5

45

60 но модифицированными полисахаридами (сефароза или сефадекс, обработанные

BrCN„ целлофан, модифицированный периодатом калия) или полиакрилатом (полиметакриловая кислота, модифицированная карбодиимидом) при 2-15 С.

Для предотвращения инактивации Фермен та все операции лучше проводить при

2-5О С. Полученную иммобилизованную люциферазу отделяют известными приемами, например отфильтровывают. Ста бильность фермента, полученного способом изобретения, в 10 раз (22 С) превышает стабильность растворимого фермента в тех же условиях.

Выбор для иммобилизации люциферазы полимеров указанной природы (полисахариды, полиакрилаты) создает условия, при которых носитель химически взаимодействует преиглущественно с молекулами белка и не взаимодействует с другими низко- и высокомолекулярными примесями, содержащимися в экстракте, в частности с субстра тами люциферазы люциферином и АТФ. В результате помимо иммобилизации происходит также очистка люциферазы от сопуствующих низко- и высокомолекулярных примесей.

Пример 1. 60 мг предварительно высушенных над Са С0< в вакууме лампочек светляков растирают в тонкий порошок и экстрагируют 3 мл трис-ацетатного 0,02 М буфера, 2 мМ

ЭДТА, (этилендиаминтетрауксусная кислота) 0,1 М Na С, pH 7,9 при

5 С в течение 30 мин. Полученную суспензию центрифугируют (15000 об/ми

5 C) в течение 10 мин. Раствор отделяют, а осадок промывают 2 мй того же буфера и вновь центрифугируют. К соединенным водным фракциям (5 мл) добавляют набухший порошок (283 мг)

BrCN актифированной сефарозы. Суспензию встряхивают при 4 С в течение 25 ч. Полученный в результате полимер с ковалентно присоединенным к нему ферментом отделяют на пористом стеклянном фильтре и осадок промывают 10 раз по 5 мл попеременно ацетатным буфером (0,02 М; 1 М NaC ) и трис- ацетатным буфером (0,02 М;

1 М NaC ), а затем 5 раз по 5 мл дистиллированной водой до тех пор, пока в промывных водах люциферазная активность упадет до нуля. Полученный в результате препарат иммобилизованной люциферазы содержит 12% от общей активности сырого экстракта.,-Суспензию хранят в 0,02 M трис-ацетатном буфере, рН 7,.75, 2 мМ

ЭДТА. При хранении в течение месяца при 4 С суспензия иммобилизованной

Люциферазы сохраняет более 30% ферментативной активности.

Пример 2. Экстракцию и иммо билизацию люциферазы проводят точ25 за

35 н

40 но также, как указано в примере 1 при 2 С но в качестве носителя к сырому экстракту добавляют 260 мг полиметакриловой кислоты, предварительно обработанной 1-этил-3-(3-диметил-.

-аминопропил)-карбодиимид гидрохлоридом. Полученный в результате препарат иммобилйзованной люциферазы,светляков содержит 8% от активности сырого экстракта.

Пример 3. Экстракцию и иммобилизацию проводят точно также, как указано в примере 1 при температуре 15 С. Полученный в результате препарат иммобилизованной люциферазы светляков содержит 0,09% от активности сырого экстракта.

Применение иммобилизованной люциферазы светляков дает большие преимущества по сравнению с растворимым ферментом, так как появляется возможность многократного использования люцйферазы„ что значительно уменьшает расход дорогостоящего фермента. После иммобилизации резко возрастает срок хранения фермента, так в течение месяца при 4 С иммобилизованный фермент сохраняет более 30% активности, в то время как препарат высокоочищенной растворимой люциферазы только

4%. Все выше указанное делает иммобилизованную люциферазу более перспективной для использования в клинических условиях для определения уровня

АТФи АТФ вЂ” зависимых ферментов в различных тканях. Существенным достоинством изобретения является то, что в качестве источника фермента используется не чистый фермент, а сырой экстракт. При этом в процессе иммобилизации достигается очистка люциферазы от ряда сопутствующих низко и высокомолекулярных примесей.

Формула изобретения

1. Способ иммобилизации люциферазы светляков, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что слабощелочный экстракт лампочек светляков с рН 7,5-8,0 и ионной силой 0,1-0,2 М обрабатывают при 2-15 C предварительно модифицированными введением групп, способных реагировать с ферментом, полимерами на основе полисахаридов или полиакрилатов.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем,что в качестве полимеров на основе полисахаридов используют сефароэу или сефадекс, модифицированные BrCN.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве полимеров на основе полиакрилатов исполь660378

Составитель

Редактор Е.Зубиетова Техред T.Ìàòo÷êà Корректор М.лароши

Заказ 10871/13 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035,. Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, зуют полиметакриловую кислоту, модифицированную карбодиимидом.

4. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что процесс ведут при 2-5 С.

Источники информации, принятые во внимание при эксйертизе

1. Березин И.В. и Антонов В.К. Иммобилизованные ферменты. М., МТУ, Э 1, 126-158, 1975.