Способ исследования реакции антигена и антитела

ПИСАНИЕ ивщй фЩн%рш @чМВ,с = = у

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

ii» 652865

НПАTIEHУУ (61) Дополнительный к патентуг (51) М. Кл.

А 61 В 10/00 б 01 и 33/16 (22) ЗаявлЕно 2«м8.01м.7м6(«21)23191«08«/28-13

{23) Прноритбт - (32} 29.01.76 (31) 545066 (ЗЗЪ США

Гасударственные кетеетет

СССР пе деиам кзебретвккв м еткрыткк (53) УДК 576.8, . 077 (088.8) Опубликовано15.03.79«Бюллетень № 10 е«инн внишпвшьвеененвшш«гмет . м«. мм«й «вшшеш::

Дата опублсйкования описайймя20.03.79 и т

*ешнвме«=т«шп ---- -.— --""=-еи =-.:: — -- -- .-.т -- "-. т«" «"--.йсш= ==:- «-"=

Иностранцы юджин Ачтер,джером Кремен, Родольфо Родригес, П ол Прайарон и Карлтон Дитои

„„-„„-. -„и-.. (США)

Иностраййаяу фирма

"БМстсмр Лабораторйз, Инк" (США) . (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

«еы«ис э«ЖМшЪе«е»: ... - - е -.- е . мм. о«ми - Ф св :ыъЬ«вмттеммеФ4Ф«ВЕЕ«е!мвнв (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕАК11ИИ АНТИГЕНА и«В,м, н.б тивемъа - э4«нишмешввитинн вй

"-"„: И АНТИТЕЛА шэштевеутшйЖфф6М "сс- =-"=- ж" Рее.".еетш -Фсв нешеишеетэя«рн. ", . «в«беро«еви.месеые те«ио т«инин

Изобретение относится к обласб тй e- = " Неионное поверхностно-активное ве: е«оывввпенйв«ЩВЙ«»* -. -:: -% Ймев те « нинины в именно и иммунопогии., шество н попнэтипенгпииопь берут в соИвеввтви СПОСОб ИССПЕООВ«в суй Рву«во нНИНт " OiifOØÅÍéÈ 3:1. антигена и антитела путем инкубаоцйй". Инкубацию ведут в присутствии реаисследуемого материала в присутствии и гента, представляющего собой водный реагента, способствующего водораствори- . раствор смеси полсймэстоисленгпиколя и немости комплекса антиген- антитепо,"с ионного поверхностно-активного вешест- последующим фиксированием реакций ат -: ва. глютинации 1). Соотношения попиэтиленгликоля и

Однако известный способ не обеспе- t0 неионного поверхностно-активного вечивает высокой точности исследования. щества в смеси могут иэменяться в широких пределах, главным образом в заUemo изобретения является повЬтше= висимости от используемого поверхностй :: -,::;.: ==:==-:==:=-.;.--15 со держит йрймерно от 10 до 90 вес.%

ЭтО дОСтИГаЕтСя тЕМ, ЧтО ПО ттр цдбпат-"" ПОттйЭтй«ПЕНс"Г«ЛИКсОопмя И=От 90У дО 10 ВЕС.% гаемому способу инкубацию ведут в неионного поверхностно-активного вещеприсутствии 3,0-6,0 вес.% смеси, содер- ства, предпочтительно смесь содержит жащей 10-90 вес.% полиэтиленгликоля,от 15 до 85 вес.% полиэтиленгликоля и 90-10 вес.% неионного поверхностно- го и Ь5-15 весА неионного поверхностноактивного вещества. — активного BelJrer TBa.

В качестве неионного поверхосйостнтио; Й качестве полиэтиленгликольного активного вещества используют сополи- компонента смеси испольэуют один или мер окиси этилена и полиоксипройилойа". ": нескЪлйсо уйппвтнсполМэгйлейглйкоттей.

652865

Используемый полимер полнэтиленгликоля обычно имеет молекулярный вес от

200 до 10000, предпочтительно от

4000 до 6000.

Ненонный поверхностноактнвный ком- $ понент смеси может быть любым неионным поверхностно-активным веществом, которое обеспечивает в растворе реагента рассчитанное значение гидрофнпьнолипофильного баланса от 0,7 до 1,7

10 предпочтительно от 0,7 до 1,3 при конконцентрации смеси от 3 до 6%. Неионное поверхностно-активное вещество и попиэтипенгпикопь присутствуют в смеси

1$ в соотношении 3:1.

Предпочтитепьным поверхностно-активHbrM веществом явпяются бпок-сопопимеры окиси этилена и попиоксипропилена. Эти бпок-сопопимеры содержат примерно 50%

20 окиси этипена в молекуле, а мопекупярный вес гидрофобного основания попиоксипропипена составляет не менее 950.

Предпочтительными блок-сополимерами являются полимеры F-38 и F -68

2$

Рбцгс н1с F 38 содержит 80% полиокснэтнпеновых гидрофнп ьных звеньев в мопекупе, а поииоксипропипеновое гидрофобйое основание имеет молекулярный вес

950. F-68 содержит 80 о попиокси30 этиденовых гидрофильных звеньев в моле-. купе, а гидрофобное основание имеет мопекупярный вес 1750.

Раствор реагента содержит примерно одну часть по весу попиэтипенгпиколя, имеющего молекулярный вес примерно

4000 и около 3 частей по весу материаля Рйцготс F-38. Этот реагент го товят в солевом растворе (например, 0,9%Naca), инкубацию ведут в присутствии 3,0-6,0 вес.% смеси. Предпочтительно раствор приготовляют в виде 8% раствора смеси попимера в сопи, который затем разбавляют антисывороткой, пибо другим приемпемым разбавитепем перед иопопьзованием его при исспедовании реакции.

Можно использовать н другие неионНые поверхностно-активные вещества в качестве добавки к полиэтипенгпикопю в

$0 растворе реагента.

Например, можно использовать неион ные пойерхностно-активные вещества

TETRO М1С® Молекулярный вес

5S этих веществ может изменяться примерно от 1650 до 26000, предпочтитепьные поверхностно-активные вещества имеют молекулярный вес от 15000 по 27000 и значение гидрофильно-пипофипьного бапйнса от 20 до 30,5.

Используют также неионные поверхностно-активные веиаства 01URAF A С ®, имеющие значения гидрофипьно-липофидьного баланса от 10 до 20, и используют их в различных соотношениях с попиэтипенгпикопем, Другие, пригодные неионные поверхностно-активные вещества вкщочают моностеарат глицерина и семейство апкип-арил-супьфонатов.

При выборе неионного поверхностноактивного вещества спедует использовать такие вещества, которые обладают способностью давать прозрачный раствор реагента при исследовании реакции антигена и антитела. Это гарантирует, что реагент не, новпияет на резупьтат анапиза, ипи не вызовет неспецифического осаждения компонентов биологического образца ипи биопогических реагентов.

Реагент можно испопьзовать для увеличения относительных концентраций нерастворимых комппексов антиген-антитепо и увеличения исследуемого диапазона и чувствитепьности данной системы анас лиза.

Можно использовать эти реагенты в других системах анализа, основанных на осаждении антитепн, например в радиоиммунод1 ффузионном, энзиматическом анализах н в различных видах электрофоретических способов, например в иммуноэлектрофорезе в протнвоэлектрофорезе и в электронммуноднффузнонном анализе н других способах., Пример 1. Раствор реагента получают смешиванием 25 вес.ч попиэтипенгпиколя, имеющего молекулярный вес 4000, с 75 вес.ч. PLURONIC г -38 и смесь растворяют в нормальном солевом растворе {0,9% nc1Ce ) до концентрации 9 вес.% указнной смеси. Этот раствор можно пибо разбавить, например, антисывороткой, до концентрации смеси

4% (значение гидрофильно-пипофипьного бапанса Н1 В - 1,115) перед инкубированием и испопьзовать непосредственно в процедуре иммунопогического анапиза, пибо его можно держать при концентрации 8% до тех пор, пока он не будет готов дпя испопьзования.

Пример 2, Повторяют пример

1, за тем искпючением, что заменяют попнэтипенгпикопь, имеющий мопекупярный вес 4000, эквивалентным копичестI

C) 6 вом материапн с мопекупярным "ttecD 4. """ -" Пробирки переме цнвают инверсией и

6000. инкубируют в течение 1 ч при комнатПример 3. Повторяют пример 1, ной температуре (20-25 С). за тем исключением, что заменяют рЕи- Пустые образцы готовят, испопьзуя

Йй М ;: ЗРИ. % 4%

ron c F -38 эквивалентным копичест- 5 1 мп отфйпьтрованиых, реагентов иэ вом F-68. -„; —.— „-,; —, примеров 1-4 (в зависимости от спучая), Пример 4. Повторяют пример 1, попученных так, как описано выше, за за тем исключением, что заменяют F-38 тем искпючением, что 8%-ный раствор на разп нчные количества Те1гомс 7 07, разбавпяют сопевым раствором, вместо

908, 1107, 1307, 1508; Pffft oTac 10 антисыворотки. Пустые образцы помешают

17К8, 25КЯ,Э25, А38 «А39; Pluto в идентичные помеченные пробирки.

ttjc L 125, ctt Сосей 165; и С-3000, Одинаковые объемы контрольноГо и в ряде опытов, чтобы попучить бопьшое исследуемого образцов добавляют в кажмногообразие растворов реагента., дую пробирку как указывалось выше.

Пример5,,Растворы иммунойо гических реагентов, попученные в приме -" " Все йробйрки исследуют в лазерном рах 1-4, испопьзуют в отдепьных нефе- нефелометре для относительного светораслометрических анализах иммуноглобупинов сеяния. (lg А, 1g Ñ, l ф М), комппемента СЗ Пустые пробирки (нупевые значения) и трансферрина, причем каждый анализ были. измерены и вычтены электронной проводят спедующим образом.. --.,-- .—. = -- . схемой из эйачений реакции при йомощи

Контрольные образцы 1-6 (рвнс гйо= прибора. го анализа) для каждого указанного 6ио- - Койтролькые значения наносят на лилогического компонента разводят в cооч» неиной миллйметровке в виде графической ношении 1:100 в растворе соли.- " " зависимости относительного процента

Неизвестные затем также аналогичйо светорассеяния от концентрации контройь= разводят в соотношении 1:100 в сопевом ных образцов. растворе. — Неизвестные значения опредепяют пуПредварительно разведенные анти- тем -считывания значения-из графической у1, 3Q сыворотки к 1 С, l о М, 1 А, С3 и к зависимости контропьных образцов. трансферрину разводят по отдепьйостй в Иммунологическйе реагенты, используесоотношении 1:2 8%-ной смесью имму -. мые в этом образце, дают существенно нопогического реагентов из примеров" = " " большее осаждение комплексов антйген1-3 ипи 4 (в зависимости от спучм) и антитело, обеспечивают большую линей смешивают инверсией, чтобы пойучйть"": "" ность в более широком диапазоне и боль4%-ную концентрацию попиэтипенгпйкопя шую чувствитепьность, чем в спучае реви неионного поверхностно-активного ве- гента, содержащего только одйн попиэтищества в растворе н рассчитанное значе- пенгпнкопь. ние гидрофипьно-пипофипьного баланса Пример 6. Исйользование им40

HLB от 0,7 до 1,7 во всех слуФЙх ." - мунологического реагента по предпагаеАнтисыворотку фильтруют через мому способу в процедуре радиоиммуно0,45-микронный фильтр миллипоры. анализа для определения тироидных стиПриготавливают ряд эксперименталь- мулируюших гормонов человека (НТ Ь Н). ных пробирок (10 мм х 75 мм открытые, Образец иммунологического реагента пробирки дпя купьтуры), соответственно получают смешиванием 8,4 мл 5%-ного помеченных: пустая, контрольные 1, 2, 3, раствора полиэтиленгликоля в 0,9 /-ном

4, 5 6 и неизвестная. —,=,j;-,.,-.-."-., -- ...,-,... со IEBohl растворе с 20 мп 6%-ного неK каждой пробирке добавляют 1 мл - ионного поверхностйо-активного вешестразбавпенной смеси антисыворотки и реа- ва Pluvonic Р -38. Объем смеси затем гента. ай» =-.-,.:- доводят до 30 мп при помощи 0,9%-ного

K соответствующим пробирками добав» .раствора сопи, чтобй попучйть в реагенпяют по 25 микропитра растворов койТр%== - те окончатепьную концентрацию 1,4% пьных н неизвестных для lg С, lg А и попнэтипенгпикопя и 4,2% F-38. трансферрины (100 микролитров "дйя" jj - Радиоиммуноанализ проводят спедую1ф М и СЗ). шим образом.

В соответствующую пустую пробирку 0,050 MH анти lfT9 Н кропика с позаливают 25 ипи 100 мнкропнтр73Ь" сопе. „гпошенным хориойным гбнадотропином вого раствора.

»й а " (НО() смешивают с 200 мл HTSH конт652865

eaegi4 9

° »»»»мй» :»»»»» фМ ь::,» »: .. .»»»»»» в . »»»»»»»»»» . »»в»»» н»»

652

Составитель С, Малютина

Редактор H. Батанова Техред И. Лсталош Корректор П. Макаревич

Заказ 1082/56 Тираж 671 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035; Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, уп. Проектная, 4.М,.:" ". . " . г 4g 7, ф рольнйх образцов различной силы. Затем к смеси добавляют 50 мп фосфатного буфера с рй 7в4 и смесь 4нкубируют в течение 2 ч при 37 . В этот момент добавляют 0,100 мл НТ." Н, меченного йодом ХИБ, и смесь инкубируют еще в течение 3 ч при 37 С. Затем добавляют

0,1 выщепопученного реагента и смесь инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Вследствие раэ- Ю бавпения реагента при добавлении к смеси концентрации попиэтипенгпикопя и Г-38 уменьшились от значений 1,4% и 4,2% до значений 1% и 3% по весу соответственно. Смесь центрифугируют при 1000 х g I5 в течение 10 мин. Если требуется про,мывка отцентрифугированного твеpaor о вещества, то раствор дпя промывки-должен содержать ту же концентращпо, что и реагент в тот момент, когда реагент впервые используют в анализе, т.е. 1% полиэтипенгпиколя и 3% F.-38. Плаваю*щую сверху жидкость декантируют„а оса док исследуют. Эту процедуру повторяют дпя различных контрольных образцов

HTS Н и получают калибровочную кривую, .нанося число распадов в различных ocagzax в зависимостй or концентрации cooraercrsyющего контрольного образца HTSH.

При получении калибровочной кривой проводят анализ неизвестного пробного образца, используя процедуру, описанную выше, за исключением того, что контрольный образец НТ5Н заменяют исследуе35 мь!м образцом. Содержание HTS H в исследуемом образце затем легко опре депяю1, исходя из положения числа распадов осадка на калибровочной кривой.

-Использование раствора реагента увеличивает степень осаждения, которая получается больше той, которую можно по» лучить с реагентом, использующим толь

Ко один попиэтипенгпиколь, и это приводит к упучшенщо радиоиммуноанализа.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение точности исследования, умень шается время инкубации, повышается чувствительность..

Формула изобретения

1„Способ исследования реакции антигена и антитела путем инкубапии исследуемого материала в присутствии реа.гента, способствующего водораствори- . мости комплекса алтнген-антител о, с последующим фиксированием реакции аг глютннацнн, о т ц н ч а ю щ н и с я тем, что, с цепью повышения точности нсследованйя, ннкубацню ведут в присутствии 3,0-6,0 вес.% смеси, содержащей

10-90 весЛ полиэтнленглнколя и 9010 вес.% ненонного поверхностно-активного вещества.

2. Сйособ по п.1, î т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве неионного поверхностно-активного вещества используют сополимер окиси этилена и попиоксипропипена.

3. Способ по ir.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что неионное поверхностно-активное вещество и попиэтипенгпикопь берут. в соотношении 3:1.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Х.СЦи1са6 С @аъЫ,1ъ 20, 1974, р. 415-420,