Способ получения антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц

О П И С А Н И Е (IIt 594173

ИЗОБРЕТЕН Ия

Сспоз Советских

Социвлистииеских

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 25.07.75 (21) 2163324/30-1 (5l) N. Кл. с присоединением заявки №

С 12 К 1/OO

А 61 К 39/02

Гасударстееинвй аскете

Соавте Министров СССР оо делан изооретеией и аткрьпий (23) Приоритет (43) Опубликовано 25 02.78 Бюллетень ¹ 7 (45) Дата опубликования описания 02.02.78 (53) УДК 56 ?.8.097..2.57 6.851.49

{ 088.8) (?2) Авторы изобретения

Ф. С. Киржаев и Т. И. Бурмистрова

Всесоюзный научно-исследовательский институт по болезням птиц (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ

ПУЛЛОРОЗА - ТИФА ПТИЦ и

Изобретение относится к способам получения диагностических препаратов, в частности препаратов, используемых дпя массовой трижизненной диагностики пуллороза-тифа птиц. 5

Известны способы получения диагностических препаратов, включающие выделение антигенной фракции из микробных клеток, в виде деградированного ппи негидрадированного полисахарида или липопописахаридного 10 . Комплелса с последующей сенсибилизацией ею формалинизированпых эритроцитов (11.

Однако антигены, полученные известным способом, проявляют высокую серологическую активность только в реакции преципита- 15 ции и мало активны в других видах серопогических реакций, которые, в частности, необходимы для диагностики пуллороза — тифа птиц.

В птипеводческой практике дня серологи- 2в ческой диагностики пуплороза-тифа в полевых условиях применяется цветной корпускупярный пуллорный антиген.

Способ получения цветного пуплорного аптигена заключается в вырашнвании вор- 25 будителя пуллороза —.тифа на питательной

"реде, получении бактериальной массы центрифугироваиием, обеспложивании микробных клеток формальдегидом с последующей окраской их анилиновыми красками (2j.

Однако при осуществлении такого способа невозможно получить высокочувствительный и специфичный антиген. Даже многократные исследования цветным пулпорным антигеном не обеспечивакт выявления всех птицносителей возбудителя п лпороза-тифа в стаде. Осопенно низка диагностическая ценность этого антигена при исследовании птиц в раннем возрасте. Кроме того, прн исследовании этим антигеном часты случаи неспепи рических реакций у птиц. свободных от Возбудителя пуллорэза — тифа.

11овыспть чувствительность цельноклеточного пуллорн pro антигена практически невозможно. 310 I6) c!I03rreHo Ht.riocTоя п ым и очень низким уровнем агглютининов в крови птиц, больных и ллорозом — тифом, а ин« тенснвность и четкость видимой реакции аг гillOTHHQIIHII HQ СТеклi с IlerIÅõ×ÎÊËÐTÎ× .дым антигеном зависит т ькп От титра «г— глютининов. Другие виды циркулируюших антител, вступая в реакцию с бактериальной клеткой, не вызывают образование макроскоцически видимого комплекса антиген-антител (агглютината), 5

Бель изобретения — разработка способа получения пуллорного антигена, который позволяет получать высокочувствитепьныи, специфичный и стабильный диагностику м, пригодный для исследования нтиц в поле- 10 вых условиях в любом возрасте.

Зго достигается благодаря тому, что из полученной бактериальной массы выделяют полисахаридно-полипептидную фракцию и сечсибилизируют ею формалинизированные эритроциты барана.

Фоомалинизацию эритроцитов барана проводят 0,3%юным раствором формальдегида в течение 14 ч при 40 C.

Сенсибилизацию эритроцитов проводят 20 последовательно 45 мин при 80 С и 2 ч о при 40 С.

При таком способе получают. наиболее активный и специфичный растворимый антиген — полисахаридно-попилептидную фрак- 25 цию возбудителя .пуллороза — тифа для сенсибилизации эритроцитов барана, который вступает в макроскопически видимую реакцию не с одним видом антител (например, агглютининами, в частности с цельноклеточ 30 ным цветным пуллорным антигеном), а со всеми циркулируюшими антителами, суммарный титр которых в крови .больных птиц значительно выше титра агглютининов (например в 16 раз) и не реагирует с вйдонеспецифическими;антителами (например с антителами E.cob).

Консервация эритроцитов в 0,3%-ном растворе формапьдегида в отличие от более высоких концентраций (например 1,5-3%), надежно консервируя эритроциты, не изменяет их способность сорбировать полисахаридно-полипептидную фракцию, а сенсибилизация формалинизированных эритроцитов при

Ф

80 С обеспечивает прочную связь антигена с рецепторами эритроцитов и высокую степень их насышения антигеном.

Пример. Получение 50000 доз антигена для прижизненной диагностики пупдороза - тифа птиц.

А. Получение полисахаридно-полипептид-. ной фракции возбудителя,пуллороза — тифа.

Бактериальную массу S. рмИ;и Um- аИмFute,выращенную на обычных питательных средах, осаждают центрифугированием при

5000 об/мин и дважды отмывают физиологическим раствором при том же режиме центрифугирования. Осадок отмытой бактериальной массы суспендируют в 0,1 н. растворе ледяной уксусной кислоты до кон-. иентрации 45 млрд. микробных клеток в

1 мл по оптическому стандарту мутности и ю экстрагируют при 00-92; С в течение

60 мин. Гидропизат освобождают от бакте-, риальных клеток центрифугированием прн

6000 об/мин в течение 45 мин, диапизируют против водопроводной воды до рН

5,0-5,5. Полисахаридно-попипептидную фракцию осаждают из гидролизата 8-10 объемами этанола, отделяют центрифугированием лри 4000 со/мин в течение 20 мин и растворяют в дистиллированной воде (рН 8,5-9,0) из расчета 10 г сухого вешества на 1 л воды.

Содержание обшего, остаточного и белкового азота в растворе полисахаридно-полипептидной фракции определяют по Кьельдалю, а редуцируюших сахаров — по Хагедорну- Иенсену. Количество указанных ингредиентов в 1%-ном водном растворе лолисахариднополипептидной фракции должно быть, мг%:

Редуцнруюших сахаров в пересчете на глюкозу 300-315

Общего азота 7 5-80

Остагочного азота - 55-60 . Белкового азота 20-25

Б. Формапинизацня эритроцитов барана.

1. л крови барана в равном объеме раствора Опсевера центрифугируют при

2000 об/мин в течение 10 мин, осадок эритроцитов трижды отмывают фосфатно-буферным раствором (рН 7,0-7,2) при том же режиме иентрифугирования и суспендируют в буферном растворе, содержащем 0,3% формальдегнда. Взвесь эритроцитов выдер» живают прн 40 С в течение 14 ч при пос тоянном помешивании магнитной мешалкой

90 об/мин. Формалинизированные эритроциты осаждают центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин и 5 раз отмывают

10 объемами буферного раствора.

В. Сенслбил,зация формалинизированных эритроцитов барана пэлисахаридно-полнпептидной фракцией возбудителя пуллороза— тифа.

На 1 л 1 0%-ной взвеси формалинизированньФ эритроцитов на фосфатно-буферном растворе (рН 7,0-7;2) добавляют 250-300 мп

1%-ного водного раствора полисахариднополипептидной фракции возбудителя пуплороза — тифа, тшательно перемешивают и подогревают в водяной бане при 80 С в течение 45 мин, а затем переносят в термостат на 2 ч при 40 С.

Эритроциты освобождают от раствора полисахаридно-полипептидной фракции центрифугированием при 2000 об/мин в . течение 10 мин. Осадок эритроцитов трехкратно отмывают 10 объемами раствора буфера при том же режиме центрифугирования.

594 1 73

Составитель Л. Мурая

Редактор Т. Загребельная Техред О. Андрейко

Корректор П. МакаРевич

Заказ 770/30 Тираж 567 Подписное

11НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Осадок сенсибилизированных и отмытых эритроцитов суспендируют в буферном растворе до 10%-ной концентрации добавляют. мертиолат 1:10000.

Пуллорный антиген, приготовленный

5 предлагаемы м способом, сохраняет активность и специфичность в течение года при

4эС

Результаты опытов свидетельствуют о том, что пуллорный антиген, полученный щ предлагаемым спосооом, по чувствительности превосходит известный антиген в пробирочной реакции в 15-30 раз, а в условиях птицефабрик выявляет в 3-6 раз больше больной птицы и не вступает в реакцию с видонеспецифическими антителами.

Высокая чувствительность и специфичность полученного антигена позволяет проводить исследование птиц на пуллороз — тиф в любом возрасте, начиная с 30-дневного, что очень важно в современном промышленном птицеводстве; в 2-3 раза сократить сроки оздоровления хозяйств от пуллороза-тифа; увеличить сохранность цыплят до

ЗО-дневного возраста на 1-2io и резко сни- 2р зить затраты на лекарственные препараты, применяемые с лечебно-профилактической целью при выращивании птицы.

Методика исследования птиц не меняется по сравнению с используемой для из- ЗО вестного антигена.

Формула изобретения

1, Способ получения антигена для диагностики пуллороза - тифа птиц, включающий получение бактериальной массы возбудителя пуллороза — тифа, о -т л и ч а ю ш и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности антигена, из nQлученной бактериальной массы выделяют аолисахаридно-полипептидную фракцию и сенсибилизируют ею формалинизированные эритроциты оарана.

2.Способпоп. 1,отличаюшийс я тем, что формалинизацию эритроцитев проводят 0,3%-ным раствором формальдегида в течение 14 ч. при 40 С.

3, Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а юш и и с я тем, что сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов барана провоо дят последовательно при 80 С в течение

45 мин и при 40 С в течение 2 ч.

4. Способ по п. 1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что полисахаридно-полипептидную фракцию выделяют путем гидролиза бактериальной массы 0,1 н. раствором уксусной кислоты при 90-92 С в .течение 60 мин с последующим осаждением ее из гидролизата 8-10 объемами этанола.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе;

1. Кэбот E., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, М., "Медицина ° 1966, с. 124-128, 550-554.

2. Коваленко Я. P. Применение биологических и химиотерапевтических препаратов в ветевннарин, Ж., Селькоэиздат, 1951, с. 63.