Способ получения антибиотического комплекса а-28086
Л Мю ыБ-, Союз Советских
Социалистических
Республик
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ (11) Я 13966 (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл. С 12 D 9/00 А61 К 35/74 (22) Заявлено 09.06.75 (21) 2143757/15
10.06.74 (23) Приоритет — (32) 21.04.75
477954 21.№75 (31) 56971 9 (33) США
569740 (43) Опубликовано 15.10.77. Бюллетень № 38
Государственный комитет
Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УЛК 615.779.9 (088.8) (45) Дата опубликования описания 17.11.77 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Дэвид Герберт Берг, Роберт Л. Хамилл, Мэрвир Мартин Хоен и Уолтер Мицуо Накацукаса (США) Иностранная фирма
"Зли Лилли заид Компани" (США) (7 I) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА А-28086
Изобретение относится к способам получения антибиотиков.
Известны способы получения антибиотиков микробиологическим путем, основанные на применении в качестве исходной культуры микроорганизмов вида Streptorhyces aurepfaciens, (11, (21. Антибиотики, продуцируемые данным микроорганизмом, пригодны в качестве антибактериальньтх средств, а также могут применяться в качестве добавки для повышения эффективности потребления корма животными.
Однако в связи с тем, что антибиотики отличаются различной эффективностью в отношении патогенных микроорганизмов, которые к тому же проявляют и стойкость | их действию, поиск новых более эффективных антибиотиков является важной проблемой, Цель изобретения — разработка способа получения комплекса антибиотика А — 28086 и факторов
А, В и 0;этого антибиотика, обладающих антнбактериальн тй, антигрибковой, антивирусной активностью, а также пригодных для использования их в качестве инсектицидных, акарицидных агентов, в особенности пригодных в качестве противокок1шднозного средства, и позволяющих использовать
2 их Лдя увеличения эффективности потребления корма жвачными животными.
Поставленная цель достигается тем, что испож„зуют культуру микроорганизма Streptomyces
aureofaciuns NRRL 5758 илн Streptotnysec aureofa ciens NARL 8092, которую выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода, азота н минеральных солей, с последующим вьщелением из культуральной жидкости целевого продукта. При этом из отделенного комплекса выделяют фракции, содержзщие А, 8: и D факторы данного антибиотика ;
Ь Фактор А антибиотика А - 28086 — кристаллическое соедннение белого цвета, которое растворяется в низших спиртах, диметилформамиде, днметилсульфоксиде, хлороформе, ацетоне и бензоле, но мало растворимо в гексане и нерастворимо в воде; т.пл. 98 — 100 С; точка застывания и точка плавления 195 — 200 С. Это соединение имеет: а) молекулярный вес 764, измеряемый спектрометрически; б) примегный элементарный состав: 66,69% углерода, 9,85% водорода и 23,10% кислорода; в) эмпирическую формулу С4зНт20, „измеряемую масс - спектрометрнческн;
576966
Значение Rf
0,1 1
0,41
3 4
r) удельное вращение — 54, (с - 0,2 метанол), о Относительная определяемое при 25 С; д) ИК - спектр поглощения в хлороформе сс ! следующими максимумами поглощения: 2,85;
3,34; 5,83; 6,84; 7,22; 7,53 (слабый), 5,78 (слабый), 8,76 (сильный), 8,95 (сильный),9,15; 9,50
9 (сильный), 9,55 (сильный), 9,60; 9,85; 10,15; 10,45
1 и 10,70 (слабый) мк;
> е) в его УФ - спектре в этаноле только концевое
1 поглощение ниже 200 ммк;
5,98 ж) спектр ЯМР в дейтерохлороформе со сле- 5,68 дующими характеристиками: б 6,01; 4,21; 4,1); 5,20
3,99; 3,89; 3,80; 3,67; 3,65; 3,57; 3,55; 2,83; 4,98 40
2,76; 2,74; 2,68; 2,66; 2,58, 2,56; 2,30; 2,22; 4,62 40
2,17 2,10 2 05 1,96 1 90 1 85 1 70 1,62; !5 4,21
1 1,60; 1,47; 1,39; 1,31; 1,25; 1,18; 0,95, 0,93; 3,48
0,90; 0,88; 0,85; 0,77; 0,7 5; 0,73; 0,68 и к) Rf = 0,24 при хроматографии в тонком
066 /млн слое на силикагеле в системе растворителя бен3) титруемую группу при величине рКа 7,9 в зол — этилацетат (3:2) с применением Baci I lus
80% - ном водном диметипформамиде; subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживаюшего и) рентгенограмму, полученную методом ди- организма; фракции рентгеновых лучей на образце в порошке л) значение Rfj указанных ниже системах при (Cu - радиация, 1,5405Л, никелевьй фильтр), хроматографии на бумаге с применением Baci I I us имеющую следующиемежплоскостные расстояния1в subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего ангстре уах (0): организма:
Система растворителя
Вода, насыщенная метилизобутилкетоном (МИБК)
Вода, насыщенная МИБК, плюс 2% паратолуолсульфокислоты и 1% пиперидина
0,54 Вода — метанол — ацетон (12;3:1) с добавлением
NHzOH до рН 10,5, затем НэРО4 до рН 7,5
0,48 1% МИБК, 0,5% NH4OH в воде
0,15 17,4 r Кз НРО4, 30 мл этанола на литр воды
0,24 Бензол, насыщенный водой
0,24 Вода
0,75 Вода — МИБК вЂ” этилацетат (98: 1; 1)
577 5,85; 6180; 7,20; 7,50 (слабьй), 7,72 (слам) кислотную функцию, способную образовать
) 868; бый), 7,80 (слабый), 8,57 (сильный), r - 8 90 (сильный), 9,10; 9,50;9,83 (сильньй), 9,90; н) одну по крайней мере гидроксильную груп4О 10,10; 10,17 (сильный), 10,43 (сла ыи, пу, способную к этерификации.
1080 (слабый) 1120 (слабый), 11,35 (слабьй), Изобретение предусматривает также.Сз — 6 -аци и иемлемые соли д) на людаемый
) б ый максимум в этаноле в его УФловые эфиры и физиологически приемле спектре при 220 ммк (E (= 137 5 Е=10,477); этих факторов.
° — - 45 е) спектр ЯМР в дейтерохлороформе со слеIl. Фактор В антибиотика А-28086 — кристаллиУ: Б 720 709 626; дующими характеристиками: ческое соединение белого цвета, когда кристаллизо615; 419; 412; 405; 395; 3 89 3 78 3,62; вано из смеси ацетона и воды, растворимо в низших
3,69; 3,52; 3,48; 2,81; 2,73 263 254 252. спиртах, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, 1,99; 1,91; 1,84; 1,71; 1,6,, 7, 164 155 143 этилацетате, хлороформе, ацетоне и бензоле; но
50 1,33; 1,18; 1,11; 0.96. 0,94; 0,90; 0 87 0 84 мало растворимо в гексане и нерастворимо в воде, 0,77; 0,74и 0,68 /млн ж) величину Ф =0,4- при хроматографии в
Соединение имеет следующие характеристики: б - тилв 53 С то иком слое на силикагеле в смеси енэол - э (3:2) с п именением Baci I I us subt i I is г б молек ля ньй вес 762, определяемый масс- ацетат (: ) с при
АТСС 6633 в качестве обнаруживающего оргаспектрометрией с высоким разрешением; в) эмпирическую ф р у у 43 7 фо м л С Н qO», опреде- низма; е- з) величины в указаннь ляемую масс - спектрометриеи с высоким разрешеRf нных ниже системах при
Вас llоа хроматографии на бумаге с применением ас оа следующими subtilis А1 СС 6633 в качестве обнаруживающего г) ИК - спектр в хлороформе со следую
".. 82; 3 30 ЯО организма: раэличнымк максимумами поглощения:
576966
Значение Rf
0,16
Система растворителя
Вода, насыщенная МИБК, плюс 2 паратолуолсульфокислоты и 1% пиперидина
Вода-метанол-ацетон (12:3:1) с добавлением
NH4OH до рН 10,5, затем Нз РО4 цо рН 7,5
1%МИБК, 0,5% NH40Н в воде
Бензол, насыщенный водой
Вода
Вода — МИБК вЂ” этилацетат (98: ): 1) 0,46
0,36
0,51
0,11
0,61 интенсивность
12,40 100
10,20 70
8,85 90
7,80 30
6,80 10
6,30 100
5,70 20 ,5,35 20
5,10 20
4,90 10
4,65 20
4,45 40
4,20 30
3,30 10
3,15 10
2,99 05
2,77 05
2,28 05 к) значения Rf в указанных ниже системах при хроматографии в тонком слое в силикагене с применением Bacillus subti I is АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма:
Значение Rf Система растворителя
0,26 Бензол — этилацетат (3: 2)
0,66 Этилацетат — диэтиламин (95:5) л) значения Rf в указанных ниже системах при хроматографии на бумаге с применением "Вас Низ.
subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма: тема растворителя метилизобутилкетоном (МИБК) ая МИБК, плюс 2% паратолуолсульфокислоты и 10% пиперидина
Вода — метанол — ацетон (12:3:1) с добавлением
NH4OH до рН 10,5, затем Нэ РО4 до рН 7,5
1% МИБК, 0,5%NHgOH в воде
17,4 r КзНРОз, 30 мл этанола на литр воды
Бензол, шсыщенный водой
Соединение имеет следующие характеристики: а) молекулярный вес 778, определяемыймассспектрометрией высокого разрешения; б) примерный элементарный состав: 67,59% углерода, 9,38% водорода и 22,77% кислорода; в) эмпирическую формулу CqqH>40t 1, определяемую масд. - спектрометрией высокого разрешения; 35
r) удельное вращение — 56 (c = 0,1 метанол), определяемое при 25 С; д) ИК - спектр в хлороформе со следующими максимумами поглощения: 2,89; 3,39; 3,43; 3,50;
5,88; 6,90; 7,25; 7,60; 7,84; 9,00; 9,26; 9,62;
10,31; 10,58; 11,10 и 11,49 мк; е) УФ вЂ” поглощение в 95 o-ном водном этаноле не наблюдается; ж) спектр ЯМР в хлороформе со следующими характеристиками:О 6,00; 4,20; 4,10; 4,00; 3,98;
3,92; 3,86; 3,83; 3,79; 3,67; 3,64; 3,57; 3,54;
2,88; 2,81; 2,71; 2,62; 2,58; 2,48; 2,37; 2,29;
2,21; 2,15; 2,10; 2,04; 1,97; 1,89; 1,83; 1,76;
1,68; 1,61; 1,58; 1,55; 1,47; 1,39; 1,30; 1,25;
1,18; 0,95; 0,90; 0,88; 0,84; 0,74 и 0,68 ч/млн; 50
Значение Rf Сис
0,10 Вода, насыщенная
0,26 Вода, насыщенн
0,36
0,29
0,25
0,26 и) кислотную функцию, способную образовать соли и эфиры; к) две кетогруппы; л) одну по крайней мере гидроксильнун.
Группу.
Предусмотрены и физиологически приемлемые соли этого фактора.
II!. Фактор 0 антибиотика А - 28086 — кристаллическое соединение белого цвета, когда кристаллизовано иэ смеси ацетона и воды, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этилацетате, хлороформе, ацетоне и бенэоле, но только мало растворимое в гексане и нерастворимое в воде; т.пл. 96 — 98 С. з) титруемую группу с величиной рКси 8,67 в 80 о-ном МЬдном диметилформамиде; и) рентгенограмму, полученную методом днфракции рентгеновых лучей на образце в порошке (Cu - радиация, 1,5405Х, никелевый фильтр), имеющую следующие межплоскостные расстояния, в ангстремах (d):
d Относительная
-г:А комплексе может изменяться в зависимости от примененных условий брожения.
Комплекс антибиотика А - 28086 получают при выращивании нового штамма Streptornyces
aureofaciuns NRRL 5758 при брожении в аэробных условиях в толстом слое до достижения значительного уровня антибиотической активности. Этот антибиотик, получают также при выращивании еще г одного нового штамма Streptomyces aureofaciens
NRRL 8092. Полученный! с помощью S, aureofaciens
NRRL 5758 или S.aureofaciens NRRL 8082 анти . биотик экстрагируют из бродил ного бульона и отделяют от мицелия полярными органическими растворителями. Экстрагированную смесь разде- 80 ляют при концентрировании растворов, добавлении к концентрату петролейного эфира для осаждения посторонних примесей с последуюгцим фильтрованием и выпариванием фильтрата до получения смеси антибиотика А - 28086. Эту смесь дополнительно очищают и разделяют на индивидуальные факторы методом хроматографии на колонке.
Содинения А - 28086 замедляют рост организмов, патогенных для животных и растений. Соединения А - 28086 являются агентами, замедляющими
10 рост кокцидий и, кроме того, они являются антибактерн.
BJII IIbIMH, антивирусными„активными против организмов, вызываю них пневмонии, инсектицидными, акарицидными агентами, а также веществами, повьшйющими эффективность использования корма жвачными животными.
Относительная интенсивность
12,00 100
45 10,10
9,25 90
8,00 40
7,50 15
6,92 90
6,40 40
5,98 05
5,60. 15
5,20 40
4,98 40
4,62 40
4,21 20
3,48,10
Удельное вращение фактора Л -. 54 (c. 0,2 ме танол), определяемое прн 25 C. м) кислотную функцию, способную образова:: соли и эфиры; н) по крайней мере одну гидроксильную rpynIIy, способную к зтерификации.
Предусмотрены и C2 — С < - ациловьIe эфиры и физиологически приемлемые соли этого фактора.
Факторы А,В и D антибиотика А - 28086
Я>вые члены группы полиэфирных антибиотиков.
К членам этой гру|шы относятся монензин, цианэмицин (нигерцин) и салиномицин, Термин "антибиотический комплекс" означает смесь совместно; образующихся индивидуальных антибиотических факторов. Отношение индивидуальных получаемых факторов в антибиотическом
На фиг. 1-8 изображены ИК - спектры поглощения в хлороформе.
На фиг. 1 — фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 2 — фактора В антибиотика А - 28086; на фиг; 3 — ацетилового эфира фактора А антибиотика
А. 28086; на фиг. 4 — пропионилового эфира фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 5 — бутириловс
ro эфира фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 6 — валерилового эфира фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 7 — капроилового эфира фактора А антибиотика А - 28086 и на фиг. 8 — ИК-спектр поглощения фактора D антибиотика
А - 28086.
ИБК вЂ” этилацетат (98;1:}}
Факторы А — 28086 структурно похожи пру на друга. Во время брожения совместно образун1тся по крайней мере четыре фактора в виде смеси. Факто. ры отделяют один от другого и факторы А,В и1э выделяют в виде индивидуальных соединений.
Смесь факторов А - 28086 растворима в болыией части органических растворителей, но нерастворима в воде.
Фактор А кристаллизуют из смеси ацетона и воды. Он имеет температуру плавления 98о
100 С, отверждается и снова плавится при
195 — 200 С. Элементарный анализ фактора А дает следующий состав: углерод 66,69%, водород 9,85; и кислород 23,10%. Эмпирическая формула этого фактора С4зНэ О I
Фактор А имеет молекулярный вес приблизительно 764, определяемый масс - спектрометрией.
На фиг. 1 показан ИК - спектр фактора А.
Наблюдались следующие максимумы поглощения: 2,85; 3,34; 5,83; 6,82; 7,22: 7,53 (слабый), 7,78 (слабый), 8,75 (сильный), 8,95 (сильный), 9,15; 9,50 (сильный), 9,55 (сильный), 9,60; 9,85:
10,15; 10,45 и 10,70 (слабый) мк.
УФ - спектр фактора А в этаноле показывает только концевое поглощение ниже 220 ммк.
Спектр ЯМР фактора А в дейтерохлороформе показал следующие характеристики: о 6,01; 4,21;
4,11; 3,99; 3,89; 3,80; 3,67; 3,65; 3,57; 3,55;
2 83; 2 76; 2 74; 2 68; 2 66; 2 58; 2 56; 2 30:
2,22; 2,17; 2,10; 2,05; 1,96; 1,90; 1,85;
1,70; 1,62; 1,60; 1,47; 1,39; 1,31; 1,25; 1,18, 0,95; 0,93; 0,90; 0,88: 0,85; 0,77; 0,75; 0,73; 0,68 и 0,66 ч/млн.
Фактор А, кристаллизованный из смеси ацетона и воды, Имел следующую рентгенограмму, полученную методом дифракции рентгеновых лучей на образце в порошке (Cu = радиация, 1,5405}, никелевый фильтр, d — межнлоскостное расстояние а ангстремах):
576966 интенсивность
12,40 100
10,20 70
40 8,85 90
7,80 30
6,80 10
6,30 100
5,70 20
5,35 20
5,10 20
4,90 10
4,65 20
4,45 40
4,20 30
3,30 10
3,15 10
2,99 05
2,77 05
55 2,28 05 о
Удельное вращение фактора D — 56 (с - 0 1 метанол), определяемое при температуре 25 С
Электрометрнческое титрование фактора в 80%î ном водном диметилформамиде показало при@ сутствие группы с рКа 8,67.
Электрометрическое титрование фактора А в
80% - ном водном растворе диметилформамида показывает присутствие титруемой группы с рК 7,9.
Фактор А растворим в таких органических растворителях, как метанол, этанол, диметилформамид, диметилсульфоксид, этилацетат, хлороформ, ацетон и бензол, но мало растворим в таких ненолярных органических растворителях, как гек".ан, и не растворяется в воде.
Фактор А антибиотика А ° 28086 имеет кислотную функцию, способную к образованию солей и эфиров, а также по крайней мере одну гидроксильную группу, способную этерифицироваться, Фактор В антибиотика А - 28086 — кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды), имеет т.пл, 150 <53 С.
Масс - спектрометрией с высоким разрешением установлено, что фактор В имеет молекулярный вес приблизительно 762 и предполагаемую эмпирическую формулу С43Н7О011 °
На фиг.2 показан ИК - спектр фактора В в хлороформе. Наблюдались следующие максимумы поглощения: 2,82; 3,30; 5,77; 5,85; 6,80; 7,20;
7,50 (слабый) 7,72,(слабый), 7,80 (слабый), 8,67 (сильный), 8,68; 8,90 (сильный), 9,10; 9,50;
9,83 (сильный), 9,90; 10,10; 10,17 (сильный), 10,43 (слабый), 10,80 (слабый), 10,20 (слабый), 11,35 (слабый/, 11,73 (слабый) и 12 03 (слабый) мк
УФ - спектр фактора В в этаноле показывает
ИЬ максимумы поглощения при 220 ммк (Е, 437,5; E=10,477).
Спектр ЯМР фактора В в дейтерохлороформе показал следующие характеристики: Ь 7,20; 7,09;
626; 615; 419; 412; 405; 395; 389; 378;
3,62; 3,59; 3,52; 3,48; 2,81; 2,73; 2,63; 2,54;
2,52; 1,99; 1,91; 1,84; 1,71; 1,64; 1,55; 1,43;
1,33; 1,18; 1,11; 0,96; 0,94; 0,90; 0,87; 0,77; 0,74 и 0,68 ч/млн.
Фактор В антибиотика А - 28086 растворим в таких органических растворителях, как, например, метанол, этанол, диметилформамид, диметилсульфоксид, этилацетат, хлороформ, ацетон и бензол; мало растворим в неполярных растворителях, например в гексане, и непастворим в воде.
Хотя химическая структура фактора В не выяснена, однако физические и химические свойства показывают, что фактор В имеет одну группу карбоновой кислоты, две кетонные группы и одну или более гидроксильных групп.
При получении с помощью S. aureofaciens
NRRL 8092 фактор D составляет до 1№ вьщеленной антиэиотической акгивности; при получении с помощью S. aureofaciens NRRL 5758 он является наименьшим sa факторов..
Фактор D антибиотика А - 28086 — кристаллический продук1 белого цвета (при кристаллизации о из смеси воль и ацетона) с т.пл. 96 — 98 С, Кажуцвгйся молекулнрц эй вес 778 (Определяется массспектрометрией с высоким разрешением) . Элементарный состав пика в масс-спектре натриеной соли фактора 0 800,5050 (вычислено для
C44H730i i 800,5050). В масс ° спектре фактора р
5 в форме свободной кислоты наблюдали небольшой максимум при 778 и больший максимум при 760, 5117 (вычислено для C44H730i р 760,5125); м/э 760 в масс - спектре свободной кислоты Hsляется результатом потери воды иэ молекулярного
l0 иона. Поэтому состав молекулярного иона фактора D в форме свобОдной кислоты C44H740i 1.
Предполагаемая эмпирическая формула фактора D C44H740i . Элементарный анализ фактора D дал следующий состав: 67,59% углерода, 9% во15 дорода и 22,77% кислорода.
Теоретически для С44Н740< 1 требуется 67,87% углерода, 9,51% водорода и 22,77% кислорода.
Фактор D в 95% - ном водном этаноле не
20 поглощает УФ - лучей.
Спектр ЯМР фактора D в дейтерохлороформе имеет следующие характеристики: Б 6,00; 4,20;
4,10; 4,00; 3,98; 3,92; 3,86; 3,83; 3,79; 3,67;
3,64; 3,57; 3,54; 2,88; 2,91; 2,71; 2,62; 2,58;
25 2,48; 2,43; 2,37; 2,29; 2,21", 2,15; 2,10; 2,04;
1,97; 1,89; 1,83; 1,76; 1,68; 1,61; 1,58; 1,55;
1,47; 1,39; 1,30; 1,25; 1,18; 0,95; 0,90; 0,88;
0,84; 0,74 и 0,68 ч/млн.
Фактор О, кристаллизованньш иэ смеси ацетона и воды, имеет следующую рентгенограмму, полученную методом дифракцип рентгеновых лучей на Образце в порошке (СО" - радиация, 1,5405, никелевый фильтр), d — межплоскостнае расстояние в ангстремах:
35 Относительная! 6966
=:уго образовать соли и эфиры и по краилей мере
4п у гидроксильную группу, способную зтерифици рова ться.
Значения Rf факторов А, В и D в разных систе5 мах хроматографии на бумаге с применением
Bacillus subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма, показаны ниже.
Фактор D растворим в таких орган;.ч "..-.,:х . ":ворителях, как метанол, этанол, диметкл р;";a:..: .д, Лиметилсульфоксид, этилацетат, хлороформ, апетo» и бензол; мало растворим в таких неполярных органических растворителях, как, например, гексан, и нерастворим в воде.
Фактор D имеет кислотную функцию, способВеличина Rf
М фактор А фактор В Фактор D
0 11 009 010 В
Система растворителя ода, насьпценная метилизобутилкетоном (МИБК)
Вода, насыщенная МИБК, плюс 2% паратолуолсульфокислоты и 1% пиперидина
Вода — метанол-ацетон (12:3:1) при добавлении
MH4ÎH установлено, а затем снижено до рН 7,5 НзРО4.
1% МИБК, 0,5% NH4OH в воде
17,4 г КзНРО4, 30 мл этанола в литре воды
Бензол, насышенный водой
Вода
Вода — МИБК вЂ” этилацетат (98:1:1) .
0,26
0,16
0,41
0,36
0,46
0,54
0,39
0,25
0,36
0,33
0,48
0,15
0,24
0,09
0,64
0,51
0,11
0,61
0,24
0,24
0,75
Величины Rf для факторов А, В и D в двух E.Мерк, Дармштат Г - 254, толщина слоя 0,25 см) системах при хроматографии в тонком слое на э5 прицрименении В. subtilis АТСС 6633 в качестве силикагеле (предварительно покрытые пластины обнаруживающего организма следующие.
Величина Rf
Фактор А фактор:В фактор D Система растворителя
0,24 0,42 0,26 Бензол-этилацетат (3: 2)
0,54 0,34 0,66 Этилацетат-диэтиламин (95: 5)
Одновременно с комплексом антибиотика образовывать соли "Физиологически приемлемыми"
A-28086 образуется другое вещество, произволь- солями, которые приемлемы также как фармацевно названное А — 28086 — 1. Это вещество, не актив- тические средства, являются соли, у которых токное микробиологически, структурно родственно сичность в отношении теплокровных животных не превышает токсичности несолевой формы соедиА -28086 - 1 — кристаллическое соединение пений. Пригодными солями факторов А и В явбелого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона ляются соли натрия, калия, лития, цезия, рубидия, и воды) имеет т,пл. 160 — 162 С. Сравнительное ис- бария, кальция и магния. следование спектров ЯМР и других свойств А- К пригодным аминовым солям факторов А и В
-28086 - 1 и синтетически приготовленного метило- относятся соли аммония, первичного, вторичного н вого эфира фактора А доказывают, что А - 28086 - третичного С1 — С4 - алкиламмония и окси - С вЂ” C4
-1 представляет собой метиловый эфир фактора А - алкиламмония. или очень близкое соединение, т.е. стереоизомер. Соли щелочных и щелочноземельных металлов
Хотя А - 28086 - 1 осаждается совместно с факторов А, Ви D, также ациловые эфиры фактоактивными факторами антибиотика А - 28086, 45 ров А и D получают обычными способами приготоводнако он легко отделяется хроматографией на ления солей. Например, фактор в форме свободной силикагеле. А - 28086 - 1 имеет величину Rf, кислоты или эфира растворяют в подходящем растравную примерно 0,53 при хроматографии в тон- ворителе,напримертепломметанолеилиэтаноле, и ком слое на силикагеле с этилацетатом в качестве к раствору добавляют раствор, содержащий стеэлюента и при применении ви нии винилового реагента для хиометрическое количество неорганического осноопрыскивания (3% ванилина в метаноле плюс вания в водном метаноле, Полученную соль можно
0,5 мл концентрированной серной кислоты на выделить обычными способами, например фильтро100мл раствора) с целью обнаружения. После оп- ванием или выпариванием растворителя, рыскивания винилином и нагревания А - 28086 - 1
55 Таким же способом можно получать соли с дает синее пятно, в то время как факторы антибиотика А - 28086 дают яркие розовые пятна, органическими аминами. Например, газообразный которые быстро становятся темными, коричневато- или жидкий амин можно добавить к раствору синими. фактора в подходящем растворителе, например
Факторы А, В и D, а также указанные эфиры ацетоне, а затем выпарить растворитель и избыток карбоновой кислоты и факторов А и 0 способйы + амина. Формулу соли можно выбирать в зависи 769 6
7,60 (слабый), 7,80 (сильньй), 8,45 (сильный) 8,80. (сильный), 8,9 5 (сильньй), 9,10 (сильньй), 8 20; 9,63, 55
13 мости от удобства применения, токсичносги и эр:ономии.
Фактор А образует эфиры карбоновых кислот.
Этерификация происходит у одной из гидроксильных групп фактора А при обработке ангидридом или хлорангидридом С,--С, ° кислоты. Такие эфиры обычно получают при реакции фактора А с соответствующим ангидридом кислоты при комнатной температуре, Такие эфиры также пригодны в качестве антибиотиков и агентов, повышающих эффективность использования корма.
Ацетиловый эфир фактора А — кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды) имеет т.пл, 100 — 103" С и эмпирическую формулу С„, Н„дО, z. Молекулярньй вес его равен примерно 807 в соответствии с эмпирической формулой, предложенной для фактора А, Элементарный анализ ацетилового эфира фактора А дает следующий процентный состав:
Вычислено,% С 66,97; Н 9,24; О 23,79.
С4вН О г
Найдено,%: С 67,67; Н 8,71; 0 23,13.
ИК - спектр ацетилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 3. Наблюдались следующие максимумы поглощения: 2,85; 3,36;
3,38 (сильньй), 5,80; 6,83; q 7,25 (сильный), 9,80 (сильньй), 10,12 (слабьй) и 10,50 мк.
УФ - спектр (фактора А ацетилового эфира) в этаноле показывает только концевое поглощение.
Электрометрическое титроваиие ацетилового эфира фактора А в 80% - ном водном диметилформамиде показывает присутствие титруемой группы с рКа 8,5.
Пропиониловый эфир фактора А — кристаллическое вещество белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды) с т.пл. около 96 — 98 С.
Пропиониловьй эфир фактора А имеет эмпирическую формулу C< H sO> г и молекулярный вес около 821, вычисленный по эмпирической формуле, предложенной для фактора А.
Элементарньй анализ пропионилового эфира фактора А дал следующий процентный состав.
Вычислено,%: С 67,29; Н 9,33; О 23,38
С4ьН76011
Найдено,%: С 66,06; Н 9,17; 0 23,41.
ИК - спектр пропионилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 4. Наблюдались следующие максимумы поглощения. 2,85; 3,33;
3,38 (сильный), 3,45 (сильньй), 5,75 (силыьй), 5,82; 6,81; 7,22; 7,30 (сильный), 7,50 (слабьй), 7,60 (слабый), 7,80; 8,43; 8,75 (сильный), 8,90;
9,05; 9,15 (сильньй), 9,50 (сильный), 9,63;
9,83 (слабый), 10,05 (сильньй), 10,13; 10,20 (сильный); 10,45 и 10,68 мк.
УФ - спектр пропионинового эфира фактора А в э1аноне показан только концевое поглощение.
Бутприновый эфир фактора А - криетанни10
50 ческое соединение белого цвета (при кристаллизации иэ смеси ацетона н воды) с T.ïë. < кало 96 — 98 С. Этот эфир имеет эмпирическую формулу C47H7 $0) J монекулярньй вес около 835 и примерный состав: С 67,607., Н 9,41%, О 22.99%, вычисленный по эмпирической формуле фактора А.
ИК - спектр бутирилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 5. Максимумы поглощения следующие: 2,89; 3,40; 3 45; 3 51; 5,85;
5,92 (сильный), 5,97 (сильный), 6,90; 7.30;
7,84 (слабый), 8.55; 8,85 (слабый), 9,01 (сильный), 9,26; 9,76; 9,95; 10,31 и 10,64 мк.
Валериловьй эфир из фактор - А и валериановой кислоты — кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды) с т.пл. около 173 — 175 С имеет эмпирическую формулу С4аНаеО, молекулярный вес около 849 и примерньй состав: С 67,89%; Н 9,50%;
О 22,61%, как вычислено по предложенной эмпирической формуле фактора А антибиотика А - 28086.
ИК - спектр валерилового эфира фактора А в хлороформе показан на фнг. 6. Максимумы поглощения следующие: 2,90; 3,40; 3,45; 3,51; 5,87;
5,92 (сильньй), 5,99 (сильный), 6,81; 7,30; 7,69 (слабый),7,87 (слабьй), 8,16, 8,58; 8,85 (слабьпю),9,26;
9,76; 10,00 (слабый), 10,31 и 10,64 мк.
Эфир капроновой кислоты и фактора А, капроиловый эфир — кристаллическое соединение белого цвета (цри кристаллизации нз смеси ацетона и войты) с т.пл. около 163 — 167 С имеет эмпиричес. кую формулу С4 На,О, „молекулярный вес около 863 и примерньй состав: С 68,18%; Н 9,58%;
О 22,24%, определенньп по эмпирической формуле фактора А.
ИК - спектр капроилового фактора А показан на фиг. 7. Максимумы поглощения: 2,90; 3,40;
3,45; 3,51; 5,87; 5,92 (сильный), 5,97 (снльный), 6,90; 7,30; 7,66 (слабый), 7,84 (слабый), 8,16;
8,58; 8,85 (слабый), 9,05 (сильный), 9,17; 9,72;
9,96; 10,29 и 10,62 мк.
ИК - спектр фактора 0 (фиг. 8) имеет следующие максимумы поглощения 2,89; 3,39; 3,43;
3,50; 5,88; 6,90; 7,27; 7,60; 7,84; 9,00; 9,26; 9,62;
10,31; 10,57; 11,10è 11,49мк.
В результате ацилирования фактора А происходят следующие изменения спектра I ядерного магнитного резонанса: карбонильный резонанс, происходящий примерно при 4 ч/млн, перемешается примерно до 5,3 ч/млн (точное положение немного изменяется в разных ацнлпроизводных); смешаются также сигналы вининпротона. Эти характерные изменения представлены в частичной структуре:
H R
0Н СО 11
}1 11 RCOX
Н Н
О где R представляет С,--C, - анкил.
Эти частичные ст уктургн полностью еоответс1вуют экепернмен1ал1 но:1„ I омол1олекулярномч
/69ьь
1SPP3 (овсяная мука) ISPP4 (неорганическая соль — крахмальньй агар) $РP 5 (глицерин — аспарагиновый агар) Томатная паста — агар с овсяной мукой
Глицерин — глициновый агар
Пищевой агар разъединению и ЯМР - спектру 13 зф::-;".= у. у и пропионовой киаяот.
Ст — Сь - ацияаеыи эфир фактора А растворим в таких органических растворктелях, как метанол, этанол, диметияформамид, диметилсульфоксид, этилацетат,1хлороформ, ацетон и бенэол, но мало растворим в (неиояярных органических растворителях, например в гексане, и нерастворим в воде.
Каждый C> — Ce - ацеловый эфир антибиотика А28086 имеет кислотную функцию, способную образовывать соли и эфиры.
Новые антибиотики получают при выращивании штамма Streptornycer aureofaciens, обраэуинцего А- 28086 в.аэробных условиях глубинным способом в подходящей питательной среде до образования значительной антибиотической активности. Антибиотики выделяют, используя разные, обычно применяемые способы выделения и очисткц.
Характеристика 1чЯВ1 5758 в разных средах.
Среда ЯРЦ 2 (дрожжевой экстракт— солодовый экстракт) Глюкоза ° аспарагинов ый агар
Один из организмов, пригодных для приготовления антибиотиков А - 28086, был выделен из образца почвы, собранной на Арарате„Тур|шя. Этот организм классифицирован как штамм Streptnmy.
ces aureofaciens Луггара.
Культуры выращивали при 30 С в течении
14 дней, кроме особо отмеченных случаев, Характеристика штамма МНЯ1 5758, образующего А - 28086.
1Î Морфология
Гифы, образующие споры, состоят из блоков, петель и открытых спиралей. Наблюдался также морфологический представитель типа ректис эластичный. Споры короткие и цилиндрические, 16 образуют, цепи из 10 — 50 спор. Размер снор
1,3 х 1,75//в пределах от 1,3 до 1,96 х 1,3 р. Поверхность спор, наблюдаемая с помощью электронногс микроскопа, гладкая.
Характеристика
Обильньй рост; обратная сторона желтая; воздушный мицелий и спорообразование от удовлетворительного до хорошего; мицелий белый (w) 13 Ьа и темно - серый (Gy), 3ih; нерастворимьй пигмент.
Рост хороший; обратная сторона зеленовато>келтая (11В2); удовлетворительный воздушный мицелий (бу) темно-зеленый, 3ih; растворимый пигмент светло - коричневый.
Обильньй рост: обратная сторона светлая желтовато - коричневая (12ES); воздушный мицелий и споры (w) пурпурные и белые
13 Ьа до (Gy) светло - серых нерастворимый пигмент.
Рост хороший; обратная сторона светлая, желтовато - зеленая; хорошие воздушный мицелий и споры (Gy) желтовато - серые
2dc до светлых серовато - красновато-коричневых 5Фе; нерастворимьй пигмент.
Обильный рост; обратная сторона светлая, желтовато - коричневая (13Н7), воздушный мицелий и споры от удовлетворительных до хороших (w), от белого А до (G y) средне - серого g. Растворимый пигмент светло - коричневый.
Обильный рост; обратная сторона темная серовато - желтая (1216); хорошие воздушный мицелий и споры (У), светло - желтые 24Ь нерастворимый пигмент.
Обильньй рост; обратная сторона серовато-зеленовато - желтая (12Е2) обилие воздушного мнцелия и спор (Gy) желтовато - серого цвета 2dc; светльй коричневый растворимьй пигмент.
Рост хороший, обратная сторона сероватожелтая (12В2), цвет воздушного мицелия и спор не определен ввиду плохого развития; нерастворимьй пигмент.
576966
18
Обильный рост; обратная сторона сероватожелтая (12КЗ); скудные воздушный мицелий и споры (Gy) желтовато - серый 2dc; нерастворимый пигмент.
Хороший рост; обратная сторона сероватокоричневая (15C8); нет воздушного мицелия и спорообразования; коричневый растворимый пигмент.
Рост хороший, цвет не определен ввиду плохого развития.
Обильный рост; обратная сторона серовато - желтая (11,5), нет воздушного мицелия или спор; нерастворимый пигмент.
Обильный рост; обратная сторона светлая, сливково - коричневая (14,5) обильные возду ш ый мицелнй и споры от (w) Ь (центр) до (GV) светлых коричневато-серых
3fe (по краям); очень светло - коричневый растворимый пигмент.
Слабый рост; цвет не определен.
Агар с кальциевой солью яблочной кислоты
Агар с раствором Чапека
Агар Эмерсона
Тироэиновый агар
Триптоново - дрожжевой агар
Организм NRRL 5758 был исследован с целью определения некоторых физиологических свойств стандартным способом.
Свойства
Действие на молоко
Отрицательная
Отрицательная
Хороший рост при 26 — 30 С; отличный рост и спорообразование при 37 С; слабый вегетативный рост при 45 С; красноватый растворимый пигмент.
0- манчит
Изоинозитол +
Рамноза +
Рафиноза
Контроль, без углевода
Второй новый организм, образующий А - 28086, был получен из S. aureofaciens NRRL 5758 путем селекционирования, сопровождаемого химической мутацией. Этот организм, идентифицированный как
NRRL 8092, и классифицирован как разновидность
Streptornyces aureofaciens Дуггара. Эта классификация была основана на результатах исследования организма NRRL 8092 ранее описанными методами классификации Streptomices в таких же условиях оста.
Нитратное восстановление
Пищевой желатин
Образование меланинового пигмента на косом агаре с тирозином пептон Дифко — дрожжевом экстракте — железо — косом агаре на бульоне с триптоном и экстрактом
Необходимая температура ISP среда P2 - косая среда из дрожжевого и солодового экстрактов
Результаты опытов по определению утилизации углерода, проводимых с организмом NRRL 5758, следующие. Для характеристики роста применены следующие обозначения:
+ хороший рост положительное использование углерода; (+) рост от плохого до удовлетворительного; (— ) слабый рост, вероятно, беэ утилизации — нет роста, нет утилизации, Источник углерода Реакция
0 - глюкоза +
L - арабиноза
О - ксилоза +
О - фруктоза
Сахароза
Характеристики
Молоко пептонизировалось, белое кольцо; прозрачная область рыжевато- коричневая, рН 5,7.
Положительное
Разжижение на 30 o через 14 дней
Очень слабо положительная (пигмент через
4 дня) 576966
19
Характеристика штамма 1чйй1 8092, образующего А - 28086 1
Морфология
В шпательной среде TSP - P7 (агар с тирозином) культура образует редкие крючки, но главным ооразом короткие и прямые спороформы, Цепи аюр состоит из не менее 10 спор, обычно иэ 4 — 7 спор
Короткие прямые цепи спор наблюдыйкь в следуюХарактернстика 1чЯЯ(8092 в разных средах щих средах: 1$Р113 в агаре с раствором Чапека и
SPP5. Обильная коремня наблюдалась в агаре
Эмерсона. Наблюдения с помощью электронного микроскопа производили на агаре с тирозином (ISPP7) и на arape с глюкозой и асларагином.
Споры были гладкие длиной от 1,2 до 2,0 и диаметром около 1,0 мк. Средний размер пор
1,6 к 1,0 мк .
1$Р112 (дрожжевой и солодовый экстракты)
1$РДЗ (овсяная мука)
ISPP4 (агар с неорганическими солями и крахмалом)
ISPP5 (агар с гшщерином и аспарагином)
Агар с томатной пастой и овсяной мукой
Агар с глицерином и глицином
Агар с глюкозой и аспарагином
Пищевой агар
Агар Беннета
Агар с малеиновокислым кальцием
Агар с раствором
Чапека
Агар Эмерсона
Агар с тирозином
Характеристика
Рост удовлетворительный; обратная сторона светлая, желтовато - коричневая (12Н8); удовлетворительный воздушный мицелий; плохое спорообразование; мицелий светло - серый; нерастворимый пигмент.
Рост разбросанный; обратная сторона прозрачная; нет воздушного мицелия; нерастворимый пигмент.
Рост умеренный; обратная сторона сероватожелтая (11В2); скудный воздушный мицелий и плохое спорообразование; воздушный мицелий светльй, желтовато - серый; (10А1); нерастворимый пигмент.
Рост умеренный; обратная сторона светло - желтая (10P2); удовлетворчтельный воздушный мицелий; скудное спорообразование; мицелий белый (10A1); нерастворимый пигмент.
Рост умеренный; обратная сторона сероватая зеленовато - желтая; воздушный мицелий удовлетворительный; средняя степень спорообразования: бледно - серая (55A2); нерастворимый пигме п.
Обильный рост; обратная сторона серовато - желтая (11Е4); умеренный воздушный мицелий, белый (lOA1); спорообразование не происходит; нерастворимый пигмент.
Рост умеренный; обратная сторона светло - желтая (lOF2): умеренный воздушный мицелий н такое же спорообразование, белый (10A1) мнцелнй; нерастворимый пигмент, Рост скудный, обратная сторона светло - желтая (10В2); нет воздушного мицелия; нерастворимый пигмент.
Рост удовлетворительный; обратная сторона среды желтовато - пунцовая; очень скудный воздушный мицелий; спорообразование не происходит; нерастворимый пигме, т.
Рост очень скудный, просвечивающийся; нет воздушв ого мицелия; нерастворимый пигмент.
Рост очень скудный; обратная сторона прозрачная; нет мицелия; нерастворимый пигмент.
Рост умеренный; обратная сторона серовато - желтая (1115); пятнистый воздушный мицелий; спорообразования не происходит; нерастворимый пигмент, Рост умеренный; обратная сторона светлая желтовато - коричневая (12Н6); умеренный воздушный мицелий, светлый слабо - серый край (53A2): центр почти белый; спорообразование
576966
2l 22 умеренное; нерастворимый пигмент.
Рост очень скудный, просвечивающийся; нет воздушного мицелия; нерастворимый пигмент.
Фалиологические срок;ва.организма N R Щ 8092
Агар с триптоиом и дрожжами
Характеристики
Свойства действие ыв молоко
Очень слабо положите щи
Результаты опытов по определению утилизации углерода приведены ниже. Для указания степени роста использованы следуницие обозначения.
+; положительная утилизация; . (+) рост от плохого до удовлетворительного; (-) слабый рост, вероятно, без утилизации, * an роста, иет утилизации. Источник углерода Результат
D глюкоза + с - арабиноэа +
NRRL 5758 и ор
Признаки
Веге тативиый
NRRL 5758
NRRC 8092
От кремового до светло - желтого цвета на нескольких средах.
Короткие прямые спорофоры и случайные крючки
Желтый на нескольких средах
Спиральные спорофоры на среде из пасты томатной и овсяной муки; и на среде: неорганические соликрахмал
Рост удовлетворительныл, коричневый с просветлением
Умеренное спорообразование, воздушный мицелий цвет
Спороо бр азован
Рост скудный, светлый, без просветленна
Рост на яблочно ° кислом кальции
Неорганическая соль - крахмал
Скудное споробразование; мицелий светлый, желтовато - серый
Нитратное восстановление
Пищевой желатин
Образование меланинового пигмента на косом агаре с тирозином
- бульоне с триптоном и дрожжевым экстрактом
- морковной пробке
- картофельной пробке
Необходимая температура
I fSPP2); косая среда- дрожжевой экстракт и солодовый экстракт
Пептонизировалось (90%); светложелтое кольцо; прозрачная область светло-желтая; рН 4,6.
Положительное
Гидролизовался в течение 14 дней на 50%
Отрицательная
Обильный рост; светло - желтый; без воздушного мнцелия
Обильный рост; серовато-белый; без воздушного мицелия, без изменения в пробке.
При 25 С обильный рост; удовлетворительный воздушный мицелий; обратная сторона светло - коричневая нерастворимый пигмент. При 30 С обильный рост; удовлетворительный воздушный мицелий; обратная сторон светло - коричневая; нерастворимый пигмент.
При 37 C обильный рост; удовлетворительный воздушный мицелнй; обратная сторона коричневая; коричневый растворимый пигмент.
При 40 С обилыый рост; скудный воздушный мицелий . обратная сторона красновато-коричневая; растворимый пигмент красновато-коричневый.
При 45 С удовлетворительный рост; без воздушного мицелия; обратная сторона красновато-коричневая; умеренный красновато-коричневый пигмент.
О - ксилоза
0 - фруктоза
Сахароза
О - маннит
Изоинозитол
Рамноза
Рафиноза
Контроль без углевода
Различия в свойствах организма
45 ганизма ййй1 8092 показаны ниже:
1i 4Л 6
or светло-фиолетового до серого
Обратная сторона желтая l Обратная лорона роэоная
Агар Беннета
30
Культуры Streptomyces aureofaciens, пригодные для образования антибиотиков А - 28086, хранятся в коллекции культур Северного исследовательского отдела торговли и питания Министерства сельского хозяйства США, Служба сельскохозяйственного исследования, Пеория, Иллинойс, 61604, номера МНВК 5758 и МЯН1 8092.
Для выращивания Strepfomyces,aureofaciens
NRRL 5758 или Strepfomyces aureofaciens NRRL
8092 можно использовать любую из сред. Однако цля оптимального выхода и легкого выделения продукта предпочтительны определенные среды, Например, предпочтительными источниками углеводов для процессов брожения в промышленном масштабе являются декстрин тапиоки и сахароза, хотя можно применять также глюкозу, маисовый крахмал, фруктозу, маннозу, мальтозу, лактозу и т.п. Пригодными источниками углерода являются также кукурузное масло, арахисовое масло, соевое масло и рыбий жир. Предпочтительным источником азота является эизиматнческий гидролизат казеина, но пригодны также пептоны, соевая мука, мука хлопковых семян, такие аминокислоты, как глу твминовая и т.п. К неорганическим солям, которые можно вводить в питательную среду, относятся обычные растворимые соли, способные образовывать ионы хлорида, карбоната, сульфата, нитрата, натрия, магния, кальция, аммония и т.п.
Для роста и развития организмов в питательную среду необходимо включать также микроэлементы.
К питательной среде при ферментации в промышленном масштабе, если имеет место вспениванте, необходимо добавлять небольшие количества (т.е. 0,2 мл/л), противов спенивателя, например по; лип ропиленгли коля.
Количество антибиотика А ° 28086, образуемого штаммом Streptomyces aureofaciens, увеличивается при добавлении к среде небольшого количества соевого масла.
Для получения значительных количеств антибиотиков А - 28086 желательно применять аэрацию питательной среды в бродильных чанах. Небольшие количества антибиотиков А - 28086 можно получать при выращивании культуры во встряхиваемой колбе. Так как при инокуляции в больших чанах спорами организмов образование антибиотиков сильно замедляется, то желательно применять вегетативный посевной материал. Такой материал приготовляют при инокуляции небольшого объема питательной среды спорами или обрывками мицелия организма для получения свежей, активно растущей культуры. Затем вегетативный инокулум переносят в большой чан. Для вегетативного роста посевного материала можно применятыакую же среду, как используемая при брожении в большом масштабе, но пригоцньi и другие среды.
Организмы, образующие А - 28086, можно выращивать при температуре в пределах примерно от 20 до 40 С. Оптимальный рост А - 28086 происходит, по видимому, при температуре от 27 до
30 С.
Обычно в процессах выращивания при аэробных условиях питательную среду продувают стерильным воздухом. Для эффективного роста организма предпочтительный объем воздуха, применяемый в больших чанах, составляет больше одного объема на объем среды в минуту. Для эффектив ного образования антибиотиков А - 28086 в чанах желательно применять аэрацию больше 0,25 объема воздуха на объем питательной среды в минуту. Большие количества растворенного кислорода не тормозят образование антибиотика.
За образованием антибиотиков можно следить во время ферментации путем отбора проб бульона или экстрактов твердых веществ мицелия. В этих пробах определяют активность в отношении организмов, чувствительных к антибиотикам. Одним из организмов, пригодных для испытания антибиоти,ков данного изобретения, является Bacillus subtil is
АТСС 6633. Испытание обычно производят с помощью бумажного диска на агаровых пластинках.
Первоначальная величина рН инокулированной питательной среды зависит от примененной среды, Вообще, рН должно быть в пределах от 6,0 до 7,5. В конце ферментации рН обычно несколько выше и лежит в пределах от 6,5 до 8,0.
Антибиотическая активность проявляется на второй день ферментации. Максимальная антибиотическая активность обычно достигается на шестой»
- седьмой день.
Образовавшиеся в результате брожения антиоиотики А - 28086 можно выделять из бродильной среды обычными способами. Антибиотической активностью обладают как мицелярная масса, так и профильтрованный бульон, Поэтому максимальное выделение антибиотиков А - 28086достигается при комбинации фильтрования, экстракции и адсорбционной хроматографии. Предпочтительным растворителем для выделения этих антибиотиков из цельного или профильтрованного бродильного бульона является этилацетат, хотя можно применять и другие растворители, обычно используемые для этой цели.
Особенно выгодный способ выделения факторов А, В и D антибиотика А - 28086 состоит в снижении рН всего бродильного бульона примерно цо рН 3,0. По этой величине рН факторы А,В и 0 обычно отделяют фильтрованием совместно с мицелярной массой, Другой способ выделения факторов
А - 28086 связан с добавлением к цельному бульо- .
l ну бикарбоната, например, бикарбоната натрия. в количестве равном примерно 1 r/ë. Обычно фак1оры Л-28086
576966 можновысушить при лиофилизации и смешать с кормом.
С другой стороны, после окончания ферментации в питательной среде можно отделить мнцелий и после сушки его получить продукт, используемый непосредственно для приготовления предварительной кормовой смеси При отделении мнцелня для этой цели добавка карбоната кальция (примерно
10 г/л) облегчает фильтрование и дает сухой продукт лучшего качества.
Штаммы Streptomyces aureofaciens, названные
NRRL 5758 и NRR L 8092, образуют преимущественно фактор А антибиотика А - 28086. Хотя отношение факторов изменяется в зависимости от примененных условий брожения, но вообще фактор А составляет более 99% общей антибиотической ак5
15 тивности, выделенной из ИНЯЗ 5758 и примерно
90 антибиотнческой активности, выделенной из
1ч Яйся 8092. Фактор В составляет большую часть остальной активности, выделенной из ИЯВ1 5758, фак тор 0 является второстепенным. С другой стороны, 20 фактор 0 составляет примерно 8-10% антибнотнческой активности, выделенной из NRRL 8092, а фактор В является второстепенным.
Факторы А,В и 0 разделяют н выделяют в виде индивидуальных соединений известными способами,как например, хроматография на колонке, хроматография в тонком слое и т.п.
Например, для выделения факторов А,В и 0 применяют хроматографию па колонне с снликагелем и колонну элюируют смесями разных раствориI гелей, например бензола и этилацегата. При применении такой смеси в колонке с силикагелем вначале элюируется фактор В, а затем факторы А и О.
Обычно для регулирования процесса элюирования применяют хроматографию в тонком слое.
Соединения А - 28086 задерживают рост бактерий и грибов, патогенных в отношении животных и растений. Ниже указана активность фактора А и В антибиотика А - 28086 в отношении ряда микроорганизмов.
Испытание производили обычным методом
"диск - диффузия" (6 - миллиметровые томпоны погружали в растворы, содержащие 1 мг соединения в 1 мл; томпоны помещали на агаровые пластины, засеянные испытуемым организмом):
Испытуемые организмы
Staphylococcus aut eus
В ttuS анЬЫйьь ATCC 6633
Яат с(ттш т.utea АТСС 9341
Ngeobacter turn aviv ATCC 7994
ЗассЬс готт цсе1 раъ|огшттптттт АТСС
Catt d icLa tr.opica.tie
Рцяаг1цтп lYletlifL.f0tта. отделяют совместно с мицелярной массой в форме солей. Предпочтительным растворителем для отделения антибиотиков от мицелярной массы является метанол, одиако пригодны и другие низшие спирты и хетоны.
Для выделения антибиотиков А - 28086 с успехом можно применить азеотропную перегонку.
В этом случае к водному бродильному бульону добавляют органический растворитель, образующий соответствуяяций а еотроп, и полученную смесь подвергают азеотропной перегонке для удаления по крайней мере половины воды из бульона. В результате остается смесь воды и растворителя, при этом антибиотики А - 28086 растворены в органическом растворителе. Нерастворимые побочные продукты можно отделить подходящим способом, напримет1, фильтрованием или центрифугированием. Затем антибиотики можнс выделить из органического раствора хорошо известными способами, например выпариванием растворителя, осаждением при добавлении нерастворителя нли экстракцней.
К органическим растворителям, образующим требуемые азеотроцы с водой при процедуре выделения, относятся, например, бутиловый спирт, амиловый спирт, гексиловый спирт, бензиловый спирт, бутилацетат, амилацетат, 1,2 - дихлорэтан, 3
--пентанон, 2 - гексанон, бензол, циклогексанон, толуол, ксилолы и т.п, Азеотропная перегонка особенно выгодна при процессах брожения в большом масштабе. Воду и растворитель, отбираемые из верхней части колонны, можно разделять известными способами и воз вращать для дальнейшего использования. Отделенная вода не содержит загрязнителей. Выделенный растворитель можно возвращать в процесс.
Дальнейшая очистка антибиотиков А - 28086 включает дополнительную экстракцню и адсорбцию. В качестве адсорбентов можно использовать силикагель, уголь, флорисил (силикат магния фирмы Флоридин комп.) и т.п.
С другой стороны, твердые вещества культуры, включая компоненты среды и мицелий, можно использовать без разделения, но предпочтительно после удаления воды, в качестве источника антибиотика А - 28086. Например, питательную среду
Зона сдерживания роста, мм фактор А фактор В
19 21
28 31
26 16
12 12
2366 17
14 14
12 Не испытывался
576966
28 ленная стандартным Методом "агар - разбавление", следукидая (показатели получены после 24 - часовой инкъбащц ; .Минимальная концентрация, г/мл
Иавпуемыв oyramsssst
AotLnomgces bovis
CtQstridium. inocuum
Qtostridium рег ring ens .И06Ь"Ыс um ramoseurn
dtostridium seg ьсцт
Ctostridi septicum bovine
6 оЬ аcterium aегоfacien s
PePtococcus anaегоbius
PeptostrePtococcus intermedius
Prop ionibacterium acnes pp
Propi0nibacterium acnes 7S
5actегоides fragitis ssp. fragitis
Sactегоides fraqitis as . t1tetaiotacmicron
Bactегоides fragitis ssp. vufgaris И63
Bactегоides )rag itis ебр. vu5garis ЮИ
Fusobacterium sgwtiosum
Pus0bacterium Рвст 0Я1ьОгмтн
VeittoneMa а(аа(аscene, Соедбкиия А - 28086 обладают также антимикробиальной активностью в отношении микоплазмы.
Агенты, активные в отношении организмов РР1 О, особенно необходимы при разведении домашней птицы. Ниже показаны минимальные концентрации фактора А антибиотика А - 28086, задерживающие рост разновидностей микоплаэмы, определенные in
vitro при исследовании методом разбавления бульона.
Организм Минимальная ко нцентрация, мкг/мл
М. galiseptjcum 12,5
М, hyorhims 12,5
М. synovial 6,25
М. hypopneumoni ee 6,25
M hyosynoviae 6.25
Facrsopet>cogepmaume ecего ли 1О а ибнотика А - 28086 в 1 мл, применялись для дезинфекции поверхностей с целью защиты животных от разных видов микоплазм.
Соединения А - 28086 обладают также способностью нейтрализовать действие вирусов. Фактор А активен в отношении поливнруса типа 1П, вируса вакциния, лишайного вируса и лесного вируса Семлики.
Фактор А активен также в отношении передающегося вируса, вызывающего гастроэнтерит, виру27
Соединения А-28086 i oco5;aao эффективно задерживают рост анаэробных бактерий. Мияималв- ми концентрация." при которой фактор А задержи- вает рост различных аназробных бактериг1, опредеСз-С, - ациловые эфиры фактора А также обладают антибактериальной и противогрибковой 85 активностью. Эти производные обладают повы юнной активностью в отношении грамположительных микроорганизмов. Такая активность некоторых из таких производных сравнима с активностью фактора А. Соединения испытывали нефелометрнческим методом на полуавтоматическои системе. При испытании антибиотиков А - 28086 были использованы следуюшие параметры: fl%phylococcus eureus (Н - Хитли) NRRL В - 314 в питательной среде (рН 7) инкубировали 4 часа при 37 С. Пробы и эталон 45 растворяли в смеси метанола с водой (10:90).
Эталон, фактор А, находился в концентрации 2,3,4 и 5 мкг/мл. Соединения разбавляли до содержания примерно 3 или 4мкг активности в 1 мл перед
|омещеннем в аппарат. Ниже показаны относитель- 50 ные активности соединении в сравнении с активностью эталона.
Соединения Относительная активность С
1 55 ,2,5
8
14
20 60
Фактор А (эталон) ,Ацетиловый эфир А - 28086 - А
Пропиониловый эфир А - 28086 - А
Бутириловый эфир А - 28086- А
Валериловый эфир А - 28086- А
Капроилавьй эфир А - 28086 - А
<0,5
<0,5
<0.$
4,О
<0,5
<0,5
1,0
<0,5
16,0
16,0
2,0
8,0
8,0
8,0
2,0 (0,5 ц,0
16,0
576966
30
l0 100
0,02
82
0,20
0,01
94
0,20
Контрольные зараженные
68
365
Контрольные нормальные
0,02
0,01
0,005
91
2,80
0,0025
10
3,85
Контрольные зараженные
3,85
Контрольные нормальные
20 са, вызывающего болезнь Ныонкасла и вируса, вызывающего ршотрахеит быков.
Поэтому соединение А - 28086 можно давать внутрь, местно или минуя пищемрительный тракт., Доза для предотвращения или лечения вирусного заболевания изменяется примерно от 1 до 5 мг/кг веса тем млекопитающего, в зависимости от вируса
; ц от назначения лекарстм, т.е. с профилактической нли терапевтической целью.
Кроме того, растворы, содержащие соединения
А - 28086, предпочтительно совместно с поверхностно,активным веще твом, можно применять для обежюраживания участков, инфицированных, например, вирусом лишая или полиомиэлита. Для борьбы с вирусом эффективны растворы, содержа1щие примерно от l до 500мкг/л соединения
А - 28086
Токсичность фактора А антибиотика А - 28086, введенного внутрибрюшинно мышам, определяется . как s a 7,15 мг/кг.
Соединения А ° 28086 являются также инсектицидами и аскарицидами. Этн соединения активны в отношении таких насекомых, как мексиканские бобовые жуки, жуки молочая и домашние мухи, а также в отношении таких клещей, как двупятнистый паукообразный клещ, при применении в колычестве 500 ч/млн. Кроме того, соединения А - 28086 активны в отношении личинок москитов при при менении в количестве 1 ч/млн
Важным свойством соелиненнй А - 28086 яв ыется способность их воздействовать на кокцндии.
Например, эксперименты по использованию его в кормлении показывают, что при содержании соединения А - 28086 в корме цыплят даже в таком небольшом количестве (0,003%) наблюдается увеличение в весе, а при содержании в количестве
0,005% - уменьшается смертность цыплят, заражен. ных кокцидиями.
В табл. 1, 2 и 3 показаны результаты опытов по
20 применению фактора А для лечения цыплят. зараженных разными видами Е i rneria.
576966
31
Таблица 2
6,15 83
4,91 86
0;75
1,25
87
0
0,005
0 0025
Eimeria
acerni lina
Контрольные зараженные
36,32
160
Eirneria
maxima
1,95 40
0,2
0,005
Контрольные зараженные
3,24
1,3
Eimeria
brunet ti
2,31 58
1,2
0,005
Контрольные зараженные
5,55
1,7
") Средние показатели четырех ааьааав; 5 молоденьких петушков в каждом.
Таблица 3
Прибавление в весе,%
Е, neratrix
Е. tenella
Контрольные зараженные
0,005
0 94
0,7
59
1,75
20 52
0 91
1,7
3,5
Е. rnuvati
0,01
0,4
0,9
Контрольные зараженные
50 12 1,9 3,3
«) Четыре опыта в каждом случае; 5 молоденьких петушков в каждом опыте.
Для предупреждения или лечения болезни, вызванной кокцидиями, птицам дают ежедневно, предпочтительно через клюв, нетоксичное количество соединения А - 28086. Такое соединение можно применять в разной форме, но лучше всего давать совместно с физиологически приемлемым 66 носителем, предпочтйтельно в смеси с кормом. Дли . определения подходящей концентрации соединения
А - 28086 следует учитывать ряд факторов, но вообще пригодна концентрация от 0,003 до 0,4% или предпочтительно or 0,005 до 0,02% веса корма. Ю
Важным свойством соединений А - 28086 является также их способность улучшать эффективность использования корма. Например, соединения
А - 28086 улучшают эффективность использования корма. Например, соединения А - 28086 улучшают эффективность использования корма жвачных животных, с развитой функцией рубца.
Эффективность использования углеводов у жвачных животных увеличивается при стимулировании флоры в рубце животного к образованию производных пропионовой кислоты, à не соедине576966
34
0,004
0,004
0,002
MnSO< НгО
ZnSO -7H г О
CuSOq 5HäO
0.316
0,152
2,260
0,375
0,375
0,112 ,„0.050
0,008 йаг НРО
КН2 4
N4HCO3
KCl
ИаС1
МЯ804
СаС1г 2НгО казб4 ° 78г О
Таблица 4
Кол-во в рубцовой жидкости, ч/млн
Ацетат, мол.%
Бутират, мол. %
Пропионат, мол. %
Всего летучих жирных кислот, мм/л
Фактор А
Фактор В
0,94
8,87
1,34
1,26
0,97
0,96
1,15
1,29 08MR эфир ректора А
0,79
0,76
2,04
Пропиониловый эфир фактора А
Бутириловый эфир фактора А
0,90
0,68
1,73
1.25
0,91
0,81
1,56
1,19
Валериловый эфир фактора А
0,92
0,79
1,55
1,18
Капроиловый эфир фактора А
0,86
0,97
1,57 ний уксусной или масляной кислоты. Управлять эффективностью использования корма можно при наблюдении за образоваыием и концентрацией соединений пропиоиовой кислоты в рубце следуяицими способами. Рубцовую жидкость отбирают у животного через хирургически сделанную фистулу в рубце. Животным скармливают рацион с большим количеством зерна. Пробу рубцовой жидкости процеживают через четыре слоя суровой марли, и фильтрат собирают. Продукт, оставшийся на марле, снова суспендируют в физиологическом буфере, взятом в количестве, достаточном для получеыия объема, равного первоначальному объему рубцовой жидкости, и зту суспеизию снова процеживают.
Применяется буфер следуикцего состава.
Ингредиенты Концентрация, г/л
Эффективность утилизации углеводов была показана на опытах с животными с фистулами в рубцах.
Опьпы проводили на животных весом около
454 кг каждое. 1Ьа животных получали нормальmR корм и четыре животных в каждой подопытной группе получали такой же корм, содержавший фактор А. Отбирали аликвотные количества (100 мл) рубцовой жццкосщ и добавляли к ней t
СоС!г. 6НгО 0,001
Оба фильтрата объединяют и выдерживают. пока не соберется отделеныая масса s форме мелких частиц. Прозрачыый слой отделяют, разбавляют тем же буфером (1:1) и устанавливают рН от 6,В до 7,0.
Разбавленную рубцовую: жидкость (10 мл) поьяпцают в 25 - миллилитровую колбу совместно с описанным вьшю кормом и добавляют 1 м. соевого белка и испытуемое соединение. В каждом случае применяли четыре колбы, а также два ыабора из четырех колб для контроля. Все колбы выдержива15 ли при 38 С в течение 16 часов. После инкубацни
О измеряли рН и в каждую колбу добавляли 25% метафосфорной кислотьь После осаждения надосадочный слой анализировали газовой хроматографией для определения содержания HpoIIHOHRIB, ацетата и бутирата. Активные соединения значительно усиливали образование пропионата по сравнению с контрольными составами.
В табл.4 показано отношение концентраций летучих жирныхкислот в обработанных колбах к концентрации в конт,юльных колбах.
10% метафосфорной кислоты. Пробы вьщерживалн . до осаждения и надосадочный слой анализировали методом газовой хроматографии для определения
65 . концентрации пропноновой кислоты.
Результаты опытов показывают увеличение концентрации пропионовой кислоты в рубцовой . жидкости, определенной по пяти анализам в течение 14 дней.
Кроме того опыты in vivo показали, что фактор
А увеличивает утилизацию корма овцами.
Производные. фактора О антйбиотика А - 28086 являются антивирусными агентами. Фактор 0 axisвен в отношении вируса Мэриланд В, поливируса типа }!1„вируса СОЕ, герпетического вируса и лесного вируса Семлнки. Фактор О активен также s отношении вируса, вызывающего гастроэитерит, вируса болезни Ньюкасла и вируса ринотрахеита крупного рогатого скота.
Тот факт, что производные фактора О активны в отношении вирусов и анаэробных бактерий, делает эти соединения особенно благоприятными для профилактики знтеритов у цыплят, свиней, рогатого скота и овец. Соединения фактора О пригодны также для лечения энтеротоксемии у жвачных животных.
Важным свойством соединений фактора D является нх активность в отношении кокциднй. Эксперименты in vitro показывают, что фактор 0 активен в отношении Eimeria tenel la.
Прн заражении клеточных культур жизнеспособными спорозонтами с последующим добавлением фактора О были получены следующие результаты. Активность в отношении кокциднй фактора
О антибиотика А - 28086;
Концентрация фактора, Характеристика
1 мкг/мл
5 С
1 С
0,2 С
0,4 А,С"
0,03 А
0,02 А
0,01 1А
0,08 Н
" Результаты двух испытаний.
Другой полезной особенностью производных фактора О является нх способность улучшать эффективность утилизации корма жвачными животНЫМИ
Соединения эти эффективно увеличивают количество пропионатов и тем самым способствуют эффективной утилизации корма при введении через рот жвачным животным в количестве примерно m
0,05 до 5,0 мг/кг в день. Наиболее благоприятные результаты достигаются при дозах примерно от 0,1 до 2,5 мг/кг в день. Соединение предварительно смешивают с кормом, но его можно применять также в форме таблеток, шариков и в капсулах.
Такие препараты приготовляют способами, хорошо известными в ветеринарной фармация. Каждая отдельная доза должна содержать количество соединения соответствующее дневной дозе для животного.
Антибиотик А - 28086 можно применять в составе корма, предназначенного для откармлнва576966
36 ния скота, в количестве от 1 до 30 г соединения н тонну корма.
Как сказано выш, соединения А - 28086 представляют собой антивирусные агенты и активны также в отношении анаэробных бактерий, в частности в отношении Clostridium perfringeuaHoatoму такие соединения пригодны для лечения и предупреждения энтеритов цыплят, свиней, рогатого скота н овец. Они пригодны также для лечения энте ро. токсемии жвачных жнвотнык!
Пример 1. А. Ферментация А - 28086 при взбалтывайий в колбе с пРименением S. aureofa.
ciens NRRL 5758.
КУльтуру Бтгертовусез aureofaciens NRRL 5758 поместили на косой агар следующего состава:
Ингредиенты Количество, Агар 20
Декстрин 10
Гндролизованный энзнмом казеин 2
Мясной экстракт 2
Дрожжевой экстракт 2
Дистиллированная вода до 1л.
Косой агар инокулнровали Streptomyces
aureofaciens NRRL 5758 и инкубнровали нри 30 .С от 6 до 10 дней. Созревшую культуру покрыли бычьей сывороткой н стерильной петлей разрыхляли споры. Полученную суспензию спор и обрыв45 S. aureofaciens NRRL 5758
Для увеличения объема посевного материала
10 мл полученной ннку ированной вегетативной среды использовали для ннокуляцин 400 мл вегетативной среди второй стадии того же состава. Эту среду в 2-литровой колбе инкубировалн прн 30 С в течение 24 часов в аппарате, вращающемся по дуге диаметром 50,8 мм со скорстью 250 об/мнн.
Вегетативную среду второй стадии (1 л) использовали для ннокуляцнн 100 л стерильной среды следующего состава:
Ингредиенты
Количество, г/л
60,0
8,0
15,0
Декстрнн тапиока
Казеин, гндролнзованньй энзимом
Мела сса ков мнцелня,в бычьей сыворотке подвергали лиофилнэации.
30 Один из шести лиофилнзированных шариков ис„.
"пользовали для инокуляцни 50 мл вегетативной среды, имеющей следующий состав:
Ингредиенты Количество, г
Глюкоза 20
Зб Соевая крупа 15
Водный настой кукурузы 10
Углекислый кальций 2
Водопроводная вода до 1л.
Инокулированную вегетативную среду в колбе
4(} Эрленмейера емкостью 250 мл инкубировалн при
30 С в течение 72 часов на аппарате для. встряхивания, вращающемся по дуге диаметром 50,8 мм со скоростью 250 об/мин.
Б. Ферментация А-28086 в чане с применением
576966
Vga „-7Н О 0,5
СзСОэ 2,0 а. афинированиое апещае васяо 5,0
Деиоиизированная вода ю 1 литрй.
После стерилизации в автоклаве ay@ 126 С в течение 30 минут под давлением 1,05 - 1,4кг/ема величина рН была равной 6,7. В 165 - литровом бродильном чане инокулироваювя среда подвергалась брожению в течение 10 дней при температуре
29 С. Бродильную среду аэрировали стерильным 1@ воздухом, подаваемым со скоростью 0,4объема воздуха на 1 объем среды в минуту. Среду перемешивали обычными мешалками со скоростью
250 об/мин.
Пример 2. Выделение антибиотического комплекса А - 28086, образованного S.aureofaciens
NR RL 5758.
Сброженный бульон (132 л}, полученный, как описано в примере 1, профильтровали с помощью фильтра (Гифло Суперцел, инфузорная земля, фир- З1 мы Джонс - Mamma Продактс корп.) и получили
97 л фильтрата, который экстрагировали примерно равным объемом этилацетата. Экстракт отделили от водной фазы и сконцентрировали до объема, равного примерно 500 мл. Этот концентрированный этилацетатный экстракт добавили к большому избытку петролейиого эфира (Скелли Зольв; около 10 л) для осаждения и тем самым для отделения нежелательного продукта. Отделенный фильтрат выпарили в.вакууме и погпгчили комплекс антибиотика З1
А- 28086 (6,9г).
Мицелярную часть этого комплекса по лучили при двойной экстракпии отфильтрованного мицелия примерно половинными объемами метанола (62 и 59 л). Экстракты объединили и скон- 86 центрировали в вакууме для удаления метанола.
После концентрирования осталось примерно 10л водной фазы, к которой добавили разбавленный раствор гидроокиси натрия до рН 7,5, Полученный раствор дважды экстрагировали примерно одинаковыми объемами этилацетата (9 и 10 л}. Экстракты объединили и сконцентрировали до объема, равного примерно 400 мл. Этот экстракт добавили к большому избытку петролейного эфира с целью удаления нежелательных продуктов при описанной выше 4о процедуре концентрирования профильтрованного бульонного экстракта. Мицелярная порция комплекса, полученная из фильтрата, весила 20,6 г.
Пример 3. Выделение индивидуальных факторов А и В. 50
Мицелярную порцию комплекса антибиотика А- 28086 (235 г, как описано в примере 3) растворили примерно в 80 мл бензола. Этот раствор ввели в колонку силикагеля (9Х 130 см, 8 л силикагель
Матезона сорт 62). Колонку элюировали разными 55 смесями бензола и этилацетата. Элюирование сопровождалось хроматографией в тонком слое. При при менении системы растворителя бензол- этилацетат (90:10) вначале элюировэли фактор В, который выделпли как индивидуальньй фактор. Этот фак- 60 тор после кристаллизации из ацетона вежя 43 мг и имел тлл 150-153 (..
Продолжая злющювание смесями бензола и этилацетата, но постепенно увеличивая юпюсительное количество этилацетата, выдыиэж фактор А.
Фракции, содержавшие фактор А, объединили и сконцентрировали в вакууме Остаток растворили в ацетоне (примерно 150 мл) и к раствору добавили примерно 160 мл воды При добавлении 1 н. соляной кислоты установили рН 3 раствора. Подкисленяую смесь перемешивали в течение 1 часа. в результате чего образовался осадок. Этот осадок отфильтровали и перекристаллизовали (примерно 150 мл) после добавления воды (примерно 60 мл) . Продукт сушили в течение ночи в вакууме и получили фактор А (примерно 6,6 r). После частичного испарения ацетона иэ фильтрата получили дополнительае примерно 1,2 r фактора А.
Пример 4.
Ацетиловый эфир фактора А. Фактор А антибиотика А - 28086 (7,41 г) растворили в пиридине (150мл) и к раствору добавили 50мл уксусного с ангидрида. Полученный раствор тщательно сл1ешали и выдержали в течение ночи при комнатной температуре.
Затем добавили 200 мл воды, тщательно смешали, и смесь выдержали в течение 4 часов при комнатной температуре. Образовавшийся твердый осадок белого цвета отфильтровали, промыли водой и высушили на воздухе. Полученное твердое . вещество растворили в ацетоне (100 мл) и раствор выпарили досуха в вакууме (эту процедуру повторили 3 раза). Остаток кристаллизовали иэ смеси ацетона (100 мл) и воды (50 мл) и получили ацетиловый эфир фактора А (614 г) с т.пл. 100-103 C.
Пример и 5-9. Пропиониловий эфир фактора А, полученный при реакции фактора А с ангидридом пропионовой кислоты в присутствии пиридина способом примера 5, имел т.пл. 96-98 С.
Бутириловьй эфир фактора А получили при реакции фактора А с ангидридом масляной кислоты в присутствии пиридина способом, описанным в примере 5; т.пл. 79-81 С.
Капроиловый эфир фактора А приготовили при реакции фактора А с ангидридом капроновой кислоты в присутствии пиридина способом, описанным в примере 5; т.пл.16 -167 С.
Валерлловьтй эфир фактора А получили при реакции фактора А с ангидридом вариановой кислоты в присутствии пиридина способом, описанным в примере 5; т.пл.173-175 С.
Пример 10. Приготовление натриевой соли фактора А.
Фактор А (500г) растворили в ацетоне (50 мл).
К этому раствору добавили воду (50 л л) и 5н. раствор гидроокиси натрия до рН 10,5-11. Полученный раствор перемешивали 1 час, а затем экстрагировали этилацстатом. Экстракт выпарили досуха в вакууме и остаток переосадили из раствора в смеси
576966
39 ацетона и воды, получили 378мг натриевой соли фактора А с т,пл. 120-123 С.
Пример ы 11-15. Вариевую соль фактора А приготовили из фактора А (500 мг) и насьпценного раствора гидроокиси бария способом примера 10.
Получили 369 мг бариевой соли фактора А с т.пл. 199-190 С.
Калиевую соль фактора А получили из фактора
А (500 мг) и 5н. раствора гидроокиси калия способом примера IO: получили 363 мг калиевой соли фактора А; т.пл. 165-167 С.
Цезиевую соль фактора А приготовили из фактора A (500 мг) и 1н, раствора гидроокиси цезия способом примера 10 получили 540 мг цезиевой соли фактора А; т.пл. 190-210 С.
Натриевую соль фактора В приготовили из фактора В и 5н. раствора гидроокиси натрия способом примера 10.
Пример 16. Ферментация А - 28086 в встряхиваемой колбе с применением
S. anreofaciens NRRL 8092.
Культуру Streptornyces aureofaciens ййй1
8092 приготовили и выдержали на косом агаре, имевшем следующий состав:
Ингредиенты Количество, г
К2 НРОа 2,0
MgSO4" 7Н20 0,25
МНд йОа 2,0
СаСОз 2,5
FeSO4 ° 7Н20 0,001
МпС!2 ° 7Н О 0,00!
ZnSG4 ° 7Н20 0,001
Глюкоза 10,0
Агар 20,0
Деионизированная вода до 1 л рН (сам одроизвольное)
7,7.
Косой агар инокулировали S t rep tom yeas
aureo faci ens NRR1 8092 и инкубировали при 30 С в течение примерно 7 дней. Созревшую культуру на агаре покрыли стерильной бычьей сывороткой и стерильной петлей сняли культуру для приготовления суспензии спор и мицелия. Полученную суспензию подвергали лиофилизации.
Один из полученных лиофильиых шариков использовали для инокуляции 50 мл вегетативной среды, имевшей следующий состав: Ингредиенты Количество. г
Глюкоза 20
Соевая мука 15
Водный кукурузный настой 10
СаСОз 2,0
Водопроводная вода до 1 л, рН после добавления NaOH
6,5.
Инокулированную вегетативную среду в 250миллилитровой колбе Эрленмейера инкубировали при 30 С 48 часов на аппарате для взбалтывания, вращающемся со скоростью 250об/мин по дуге диаметром 50,8 мм.
Описанную выше инкубированную вегетативную среду использовали (0,5 мл 1%) для инокуля. ции 50 мл бродильной среды следующего состава:
Ингпедиенты Количество, г
Декстин топиока 60,0
Казеин, гидролизованн ый энзимом 6,0
Энзиматический гидролизат казеина з
10 Cams
Мд$04 7НзО
Черная тростниково - сахарная меласса 15,0
Рафинированное соевое масло 5,0
Водопроводная вода до 1 a» pH (carr ппоизвольное) 6,6
1) Декстрин Сталей fi 11 фирмы А. Е. Сталей, Декатур, шт. Иллинойс
2) Амбер ЕНС, Лаборатории Амбер, Джюно, шт. Висконсин
3) NZ Амин А, фирмы Шеффилд Кемикал, Норвич, шт. Нью-Йорк
Приме р 17. Ферментация в чане А- 28086 с применением S. aureofaciens NRRL 8092.
В данном случае применяли первоначально описанную в примере 16 процедуру ферментации
А-28086. Для получения большего объема посевного материала 10 мл инкубированной вегетативной среды использовали для инокуляции вегетативной сре30 ды второй стадии (400 мл), имевшей тот же состав.
Среду второй стадии в 2 - литровой колбе Эрленмейера инкубировали при 30 С 24 часа во вращающемся аппарате для взбалтывания при скорости
250 об/мин.
Инкубированную вегетативную среду второй стадии (800 мл) использовали для инокуляции
100 л стерильной бродильной среды, имевшей следующий состав:
Ингредиенты
40 Дек стрик тапиока
Гидролизованный энзимом казеин 6,0
Энзиматический гидролизат казеиназ 2,0
45 СаСОз 2,0
Мд804 7Н,О 0,5 г/л
Черная тростниково - сахарная мела сса 15,0
Рафинированное соевое масло 5,0
50 Водопроводная вода до 1л.
1) Декстрин Сталей Х 11 фирмы A. Е, Сталей, Декатур, шт. Иллинойс.
2) Амбер Н С, Лаборатории Амбер, Джюно, шт. Висконсин.
3) NZ Амин А, фирмы Шеффилд Кемикал, Норвич, шт. Нью-йорк.
2,0
2,0
Количество» г/л
60,0
После стерилизации в автоклаве (в течение
30 минут при температуре 121 C и давлении
1,05-1,4 кг/см ) среда имела рН 6,8+ 0,1. Фермента60 ция протекала в течение 10-12 дней при температуре 28+
15
+ 1 С в 163 - литровом чане при аэрировании среды стерильным воздухом, подаваемым в количестве
0,4 объема воздуха на 1 объем кулътурной среды в минуту. Среду перемешивали мешалками, вращающимися со скоростью 300 об/мин, Пример 18. Антиоиотики A - 28086 получили, как описано в примере 17, но с примемнием среды для сбраживания в колбе и чане, имевшей следующий состав:
Ингредиенты Количество, г/л l 0
Декстрин тапиока 30,0
Глюкоза 15,0
Казеин, гидролиэованный знзн мом 3,0
Энзиматический гидролизат казеинаЗ 1,0
Дрожжевой экстракт ..45
С Соэ 2,0
МцЗО, 7Н О 1,0
Черна я тростниково - сахарная
20 мела сса 15,0
Рафинированное соевое масло 5 0
Водопроводная вода до1л.
1) Декстрин Сталей Р 11, А.Е.Сталей, Декатур, шт. Иллинойс.
2) Амбер Н СЛаборатории Амбер,,Джюно,,шт.
Висконсин, 3) NZ Амин А, Шеффилд Кемнкал, Норвич, шт.
Нью-йорк.
После стерилизации в автоклаве, как описано а ЗО примере 17, среда имела рН 6,4.
Пример 19. Выделение комплекса антибиотика А ° 28086, полученного с помощью
S. aureofaciens NRRL 8092.
Цельный бродильный бульон (60л), получен. ный способом, описанным в примере 17, после добавления разбавленной соляной кислоты имел рН
3. Этот раствор профильтровали через фильтр (Гифло Супер - цел, инфузорная земля, фирмы
Джон - Манвилл Продактс корп.). Мицелярный 40 остаток на фильтре экстрагировали 30 л метанола и к экстракту добавили при перемешивании 1,56 кт бикарбоната натрия. После отделения этого экстракта мицелярный остаток снова экстрагировали в вакууме для удаления метанола. Оставшийся 45 водный раствор (окол< 7 л) подкислили разбавленной соляной кислотой до рН 7,5 и полученный раствор дважды экстрагировали этилацетатом (дважды по
7 л). Экстракты объединили и концентрировали в вакууме до получения маслообразного остатка, 50 который растворили в 1500 мл ацетона. К этому раствору добавили разбавленную соляную кислоту до рН 3 и перемешивали 1 час. Образовавшийся осадок отфильтровали, растворили в ацетоне (1500 мл) и к раствору добавили 400 мл воды. 55
Полученный раствор выдержали 16 часов дпя кристаллизации. Кристаллы отфильтровали, высушили в вакууме и получили 74 г кристаллического продукта, содержавшего факторы А и О и кристал. пическне примеси. 60
Сырой кристаллический продук г (40 r ) pan порили примерно в 250 мп бензопа н раствор пропустили через колонку с сипикагепем (9хl20см; снликагель сорта 62 Грайс- Давидсона). Колонку элюировалн последовательно 40 и каждого из спе дующих растворителей:
1) Бензол
2) Бензол - этилацетат (9:1)
3) Бензол - этилацетат (4:1)
4) Бензол - этилацетат (7:3)
5) Бензол - этнлацетат (1:1)
6) Этнлацетат
7) Метанол.
Каждую фракцию проверяли, определяя активность в отношении Bacillus subtilis и хроматографировали в тонком слое дпя идентификации элюированных соединений А - 28086, элюировали смесью бензола и этилацетата (4:1). Фактор В элюировали смесью бензопа и этилацетата (7:3).
Факторы А и D элюировали смесью бензола и зтилацетата (7:3 и 1:1), фракции 119-156. Эти фракции объединили, вьшарили досуха и остаток растворили в 500 мл ацетона. К полученному раствору добавили 500 мл воды, подкнслили его разбавленной соляной кислотой до рН 3 и перемешивали в течение 1 часа. Образовавшийся осадок от. фильтровали и кристаллизовали из смеси ацетона (500 мл) и воды (180 мл). Кристаллы отфильтровали, высушили в вакууме н получили 20,1 г смеси факторов А и О, П р н м е р 20. Разцеление н очистка индивид дуальных факторов А и О.
Кристаллическую смесь факторов А и О, полученную, как описано в примере 18 (18,8 r), растворили в бензоле (50 мл) . Раствор поместили в колонке силикагепя (7X100 см) (сипикагель сорта
60 фирмы Мерк, тоньше 230 меш ASTM), Колонку элюнровапи при скорости потока 90 мп/час последовательно следующими растворителями:
1) 12л бензола;
2) 12л смеси бензола н этнпацетата (9:1); 3) 12 л смеси бензопа и этилацетата (4: 1);
4) 32 л смеси бензола и этнлацетата (7: 3);
5) 10л метанола.
После хроматографии в тонком слое (Целлюлоза Мерк, Дармштат на алюминиевой подложке) проводили биоавтографию с помощью В. subt i I >s для регулирования процесса эпюнровання, Применили следующую систему растворителя: вода - метанол °
-ацетон (12:3:1), добавляя вначале гндроокись ам мония до рН10,3, а затем соляную кислоту до рН
7,6.
Фракции объемомот одного до двух литров отбирали, пока обнаруживали активность: затем собрали 200 - миллилнтровыд фракции, содержавшие только фактор О, которые объединили и выпарили в вакууме досуха. Остаток кристаллизовали из смеси ацетона и воды. Кристаллы отдепипи и высушили в вакууме; получили 140 t крис аппп ческого фактора О.
576966
Энэиматический гидролизованный каэеинэ 15,0
Тростниково - сахарная MCJlsccs 15 0
Карбонат кальция 2,0
Сульфат аммония 1,0
Сульфат магния 0,5
Рафинированное соевое масло 4 ;б
1) Декстрин Сталей Р 11, А.Е.Сталей, Декатур, шт.Иллинойс. 2) Амбер ЕНС,лаборатории Амбер, Джюно, шт. Висконсин.
Пример 23, Антибиотики А - 28086 приготовили в процессе примера 21, но с применением промежуточной вегетативной среды второй стадии, имевшей следующий состав:
15 Ингредиенты Количество> г/л
Церелоза 20,0
Водный кукурузный настой (сырой вес) 10,0
Соевая крупа 15,0
2О Карбонат кальция 2,0
Дрожжи 2,0
Свекольная меласса 5,0
Пример 24. Модифицированный А - 28086корм для лечения болезни цыплят, вызванной кок25
Сбалансированный высококачественный корм для цыплят, обеспечивающий быстрое прибавление в весе, приготовили по следующему рецепту:
Количество
; . .Г
Ийгредиейты Измельченная желтая кукуруза
Соевая мука, экстрагированная растворителем, обрушенная, тонкого помола, 50% белка животный жир (говяжий топленый)
Сухая рыбная мука с растворимыми веществами (60% белка)
Растворимые вещества кукурузы с винно - водочного завода
Дикальцийфосфат пищевого сорта
Карбонат кальция
Витаминная смес1 (витамины А, О, Е, К, н В1 g хОлин ниацин, пентотеновая кислота, рибофлавин, биотин с агентом, свяэывавнцим глюкозу)
Смесь минералов, содержащихся
s виде следов (представляющая сульфат магния, окись цинка, йодистый калий, сульфат железа и карбонат кальция)
2- Амин - 4- оксимасляная кислота (оксианалог метионина)
Фактор А антибиотика А - 28086
Эти компоненты смешали обычным способом, ээ применяемым для смешения кормов. Цыплята,, которым скармливали этот корм, противостояли воздействию кокцидий и прибавляли в весе так же быстро, как цыплята здоровые, получившие так же корм. Ио без антибиотика.
% кг
50 453,S
31,09
6,5
282
58,9
45,3
5,0
36,3
16,3
7,25
4,0
1,8
0,8
4 4
0,5
1,8
0,2
Сбалансированный с большим содержанием зерна корм для Откармливаемого скота приготовили по следующему рецепту:
43
Так же обработали фракции, содержавшие фактор D и следы фактора А, и получили дополнитель.но 150 мг кристаллического фактора О, содержав шего небольшое количество фактора А.
Фракции, содержавшие только фактор А, обработали так же, получили 4,7 r кристаллического фактора А.
Пример 21. Антибиотики А - 28086 получили в процессе примера 16, но с применением косой среды следующего состава:
Ингредиенты Количество, r
Мясной экстракт 2,00
Дек стрип 20,00
Дрожжевой экстракт 2,00
Знэиматический гидролизат казеина 4,00
СОС! g 6НэО 0,02
Агар 20,00
Деионизированная вода до1лС помощью КОН установили рН 7,0 и инокулированную косую среду инкубировали при 28 С примерно 7 дней, Пример 22. Антибиотики А - 28086 приготовиЛи в процессе примера 17, но с применением среды, следующего состава:
Ингредиенты Количество, г/л
Декстрин тапиока 80
0,1 0,9 и 40 0,09
П р и и е р 25. Корм мясного скота с добавкои
А - 28086. !
576966
Количество
6,78
90,7
9,9956
0,6
0,0044
0,5
0,5
0,3
0,03
0,07
Еаприиовый эфир фактора 0 приготовили при реакции фактора О с ангидридом капроновой .,Ингредиенты
453,5
Молотая желтая кукуруза Мука из обрушенной соли, экстрагированная растворителем и тонкоизмельченная;
50% белка
31,09
Инг11еддеиты кг
Тоыкоизмельчанная кукуруза 617
Измельченный стержень початка кукурузы 10
Обезвоженная мука иэ люцерны, 17% белка S 45,3
Мука из обрушенной сои, экстрагнрованная растворителем 900
Тростниковая меласса 45
Мочевина 5,4
Фактор А - 28086 0,04
Дикальцийфосфат пищевой 4,5
Ка рбонат кальция 4,5
Хлористый натрий 2,7
Смесь минералов в виде следов 0,27
Смесь витаминов А и Оз к
0,63
Предварительная смесь, витамина Е 005 0,45
Пропионат кальция 0,15 1,36
1) . Содержит в 1 фунте (О 453 кг) 2000000 ед. витамина А;
227200 ед витамина 0з и 385,7 r соевого корма с добавкой 1% масла, 2} Сухие кукурузные зерна с растворителем, содержащим й, й- токофериловый эфир уксусной кислоты в когичестве 20000 ед/фунт.
Смещанный корм прессовали в форме табле- кислоты в присутствии пиридина способом, описанток. Средний дневной рацион - 6,8 кг для одного ным в примере 26. животного. Этот корм содержит примерно 300 мг Валериловый эфир фактора 0приготовилипри фактора А на каждое животное. реакции фактора D с ангидридом валериановой
Пример 26, Ациловый эфир фактора 0 кислоты в прнсутствиипнридина способом, описанаитибиотика А - 28086.
30 ным в примере 26.
Фактор О растворили в пиридине и к раствору Пример 31. Получение натриевои соль, добавили стехиометрическое количество уксусного фактора D. Фактор D растворили в ацетоне и к) ангидрида, Полученный раствор тщательно переме- раствору добавили эквивалентное количество воды пали и выдержали в течение ночи при комнатной и 5н. раствор гидроокиси натрия в количестве, 35 температуре. достаточном для установления рН 11. Полученный
Затем добавили избыток воды, тщательно сме- раствор перемешивали в течение примерно 1 часа, а
1 шали и выдержали несколько часов при комнатнои затем экстрагировали этилацетатом. Экстракт вытемпературе. Образовавшийся осадок отфильтрова- парили в вакууме и получили натриевую соль ли, промыли водой и высушили. Полученное твер- фактора D.
40 дое вещество растворили в ацетоне и выпарили Пример и 32-34. Калиевую соль фактора 0 досуха в вакууме; получили ацетиловый эфир полущли из фактора 0 и 5н. раствора гидроокиси фактора 0- калия способом примера 31.
Пример ы 27-30. Пропионовый эфир Бариевую соль фактора D получили иэ фактора фактора 0 получили при реакции фактора 0 с 0 и насыщенного раствора гидроокиси бария спосо45 ангидридом пропионовой кислоты в присутствии бом примера 31. ,пиридина способом, описанным в примере 26. Цезиевую соль фактора D получили из фактора
БУтиРиловый эфиР фактоРа 0 пРиготовили при 0 и 1н. раствора гидроокнси цезия способом примеРеакции фаКтоРа О с ангидРИдом маслЯной кисло- ра 31 ты в присутствии пиридина способом, описанным в
Пример 35. Корм для цыплят, содержащий примере 26. фактор 0 и пригодный для лечения кокцидиоза.
Сбалансированный высококачественный корм,,пригодный для быстрого увеличения веса цыплят, приготовили по следующему рецепту:
Количество кг
576966.Животный жир (топленый говяжий)
Сухая рыбная мука с растворимыми;
60% белка растворимые вещества кукурузы. отхода спирто - водочного производства
Дикальцийфосфат пищевой
Карбонат кальция
Смесь витаминов (витамины А, 0> F К и В> g XOJIHH> ниацин, цантотеновая кислота, рибофлавии, биотин с агентом, связываянцим глюкозу)
Смесь минералов, содержащихся в виде следов, 2- амин - 4- окси-масляная кислота (оксианалог метионина)
Фактор 0
58,9
6,5
5,0
36,3
l6,3
7,27
4,0
1,8
0,8
4,53
0,5
0,1
0,1
0,9
0.09
П ри ме р 36. Корм для мясного скота, со о держащий фактор О.
Сбалансированный высокосортный корм для скота, идущего на мясо, приготовилн lio следующему рецепту:
Количество
Эти компэжнты смешали обычным способом. цыплята ив таком рационе противостоят воздействию кокцидий; вес их увеличивается так же,, как вес цыплят не зараженных кокцндиями и иолучакяцих тот же корм, но без антибиотика.
Ингредиенты
% кг
615
Тонко измельченная кукуруза 67,8
Измельченный стержень початка
90,7 кукурузы
Обезвоженная мука иэ люцерны;
17% белка 5
Мука иэ обрушенной сои, экстрагированная растворителем;
50% белка 90,7
Тростниковая меласса 45,3
Мочевнна 5,4
Фактор 0,4
Дикальцийфосфат пищевой 4,53
Карбонат кальция 4,53
Хлористый натрий 2,7
Смесь минералов в виде следов 0,27
Смесь витаминов А и 0 э
0,63
Смесь витаминов Е 0,45
Пропионат кальция 1,36
Ц Содержит в 1 фунте (0,453 кг) 2000000 ед. витамина А, 227200 ед. витамина 0э и 385,7 г сои с добавлением 1% масла.
2) Сухое зерно с раствоуимыми веществами-отходами спирто-водочного завода, содержащее 20000 ед й-, а- токоф ерилацетата в 1 фунте.
45,3
9,9956
0,6
0,0044
0,5
0,5
0,3
0,03
0,07
0,05
Ы5 культуру микроорганизма Stre ptornyces aureofaciens ИВНЕВ 5758$ или Streptomyces aureofaciens
NRRL 8092 выращивают в аэробных условиях на йитательной среде, содержащей усвояемые и точники углерода, азота и неорганических солей с последующим выделением из культуральной жидкости целевого продукта, Смешанньй корм прессовали в форме таблеток. При среднем количестве корма, равном
6,8 кг в день, каждое животное получало примерно
300 мг фактора D ежедневно.
Формула иэоЬретения
1. Способ получения антибиотического комп- 2. Способ по п.1; отличающийся тем, что нэ, ca А - 28086, отличающий с я, тем, что 6О отделенного коьптлекса антибиотика выделяют
576966 фракции, содержащие А,В и О факторы данного антибиотика.
Приоритет по,признакам: ,10.06.74 (заявка М 477954) по и) чзнаку п. I °
Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 — и по призна-. ку и. 2 — фактор А;
2) .04.75 (заявка N 569740) по признаку п. 1Streptomyces aurefaciens NRRL 5758 — н по признаку п. 2 — фактов Р:
21.04.75 (заявка N 569719) по признаку п. )в
Strep tomyces aurefaciens NRRL 8092 — и по признаку и. 2 — фактор ОИсточники информации, принятые во внимайие прн экспертизе:
1 Ав торское < свидетельство N 121542. кл. С 12 D 9 18, 1959.
2. Патент США Р 3155578, кл. 424 — 115, 1964.
