Способ получения антибиотика
пп 470 964
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К ПАТЕНТУ
Соаз Советских
Социалисти вских
Республик (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. С 07g 11/00
С 12с1 9/14 (22) Заявлено 21.01.72 (21) 1739199/31-16 (32) Приоритет 12.10.71 (31) 188058 (33) США
Опубликовано 15.05.75. Бюллетень № 18
Гасударственный комитет
Совета йтинистрав СССР ао делам изобретений и открытий (53) 4тДК 615 779 931 (088.8) Дата опубликования описания 11.09.75 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Роберт Л. Хамил и Марвин Мартин Хун (CLUA) Иностранная фирма
«Эли Лилли энд Компани» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА
Изобретение относится к области получения антибиотиков.
Предложенный способ получения антибиотика (А-201А), ранее в патентной литературе не описанный, заключается в том, что культуру Streptomyces capreolus МКК1. 3817 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 30 — 50 С и рН б,2 — 7,2 в течение 72 — 120 ч. Фильтрат культуральной жидкости экстрагируют хлороформом при рН 8,5, экстракт упаривают досуха. Остаток обрабатывают метанолом, мета нольный экстракт упаривают досуха, остаток растворяют в хлороформе, хлороформный раствор вливают в петролейный эфир, осадок растворяют в хлороформе, пропускают раствор через колонку адсорбента, например силикагеля, элюируют целевой продукт ацетоном с последующим выделением известными приемами.
Предложенный штамм Streptomyces capreolus ИКК1 выделен из образца почвы, собранной в Венесуэле, имеет гладкие споры овальной или почти цилиндрической формы, расположенные в виде длинных извилистых переплетенных цепей, в количестве приблизительно 10 — 50 спор на одну цепь.
Предложенный штамм имеет следующие особенности на различных питательных средах. Цвета определяют по Maerza и Paul, М. R., Dictionary of Color, Чс бган-1-lill. XeaIork (1950).
Агар с томатной пастой и овсян о и к а ш е й. Хороший рост с недостаточ5 ным воздушным мицелием (белый), субстратный зшцелий имест цвет серовато-желтоватокоричневый (13 В 5). Растворимый пигмент отсутствует.
А г а р Ч а п с к а. Хороший рост с недоста10 точным воздушным мицелием. Субстратный мицелтш бледно-желтьш (10 В 2).
Агар с дрожжевым экстрактом.
Обильный рост при отсутствии воздушного мицелия или спор. Субстратный мицелий ин15 тенсивно желтовато-ярко-розовый (2 Г 9).
Растворимый пигмент отсутствует.
А г а р В е и и е t t. Обильный рост при отсутствии воздушного мицелия. Субстратный мицелий умеренно красный (3 Н 10). Раство20 римый пигмент отсутствует.
Питательный агар. Довольно хороший рост при отсутствии воздушного мицелия или спор.
Агар Эмср "она. Хороший рост прп от25 сутствии воздушного мицелпя. Субстратный мицелий Tei IHblll Ccpo->IieJITblll (13 K 3). Растворимый пигмент отсутствует.
Агар с глюкозой и аспарагином.
Хороший рост при отсутствии мицелия. Суб30 стратньш мицелий интенсивно желтовато-яр470964
30 засевают
35
2
1 л
65 ко-розовый. Растворимый пигмент отсу rcTâóет.
Агар с малатом кальция (кальциевой с ол ыо яблочной кислоты).
Рост на этой среде был настолько скудный, гго це было сделано никаких набл1одепий цвета.
Л г ".. p c т и р о з ц и о». Дово.lhno хороп1ий рост со скудным воздушным мицелием и бледно-желтыми спорами (1 С 1). Субстратцый мицелий бледно-желто-зеленый. Растворимый пигмент отсутствует.
Среда «Международный проек г
I S Р m e d i u m № 2». Обильный рост при отсутствии воздушного мицелия или спор.
Субстратный мицелий сероватый и красновато-оранжевый (11 А 8). Растворимый пигмент .>тсутствует.
Среда «Международный проект
l S Р m e d i ц «и № 3». Довольно хороший рост с довольно хорошим воздушным мицелисм и спорами. Цвет серовато-желтоватый, ярко-розовый (4А9). Растворимый пигмент отсутствует.
С реда «Международный пр оект
I S P m e d! u m М 4». Скудный рост со скудным воздушным мицелцем и спорами.
Субстратпый мицелий бледно-желто-зеленый
f 10 В 1). Растворимый пигмент отсутствует.
Среда «Международный проект
l S Р mc d i u m № 5». Рост этой среды был настолько ничто>кен, что пе было отмечено проявлении цвета.
М(елатин — не разжижает. Восстанавливает нитраты. 1 la агаре с железом и пептоннодро>кжевым экстрактом и на мясном отваре с триптоном и дрожжевым экстрактом меланинового пигмента не образует.
Полученный предложенным способом антибиотик А-201А представляет собой белое кристаллическое соединение, плавящееся при ! 70 — 172 С, при выкристаллизовывании из .::цетоца. Оно очень хорошо растворяется в спиртах, растворимо в ацетоне, хлороформе и этилацетате, нерастворимо в воде, углеводородах и простом эфире.
Электрометрическое титрование Л-20!Л в
67%-ном диметилформамиде показало первоначальное значение рН 7,8 и не обнаружило титрующихся групп в пределах рН от 3,5 до
13,5.
Микроанализ ом получен следующий примерный элементарный состав А-201А, %:
С 55,20; Н 6,72; N 10,45; О 28,05, молекулярньш вес на основе масс-спектрального исследования составляет около 693.
Инфракрасный спектр А-201Л, как кристаллического соединения в хлороформном растворе показан на черте>ке. Распознаваемые полосы в инфракрасном спектре поглощения в пределах 2,0 — 15,0 мкм: 2,96 (широкая); 3,45; 3,53; 5,89; 6,06; 6,26; 6,33; 6,40;
6,67; 6,92; 7,06; 7,15; 7,28; 7,46; 7,60; 7,76; 7,92;
8,10; 8,30; 8,60; 8,87; 9,06; 9,14; 9,32; 9,54; 9,65;
10,!2; 10,23; 10,59; 11,01; 11,30; 11,60 и 12,00.
Спектр поглощения в ультрафиолетовых луах Л-201А в 95%-ном этаноле: водный раствор показывает максимум поглощения примерно при 208 мкм, с коэффициентом экстинкции Elc „— 535 и максимум поглощения примерно при 275 мкм с коэффициентом экстинкцHH Е см = 490.
Антибиотик А-201Л обладает invivo активностью в отношении заражения цыплят Мусорlа ma да111зорticum.
При .введении через рот (перорально) дозами 100 мг/кг смесь антибиотиков А-201А эффективна при воздействии на молодых крыс, зараженных Entanoeba nistolutica.
Антибиотик А-201А при подкожной инъекции мышам обладает invivo антимикробной активностью против инфекционных организмов.
Лнтибиотик А-201А является также эффективным .средством для тормо>кения роста микроорганизмов, которые содействуют развитию периодонтального заболевания.
Пример 1. Штамм Streptomyces capreolus NRRL 3817 выращивают 6 дней при 30 С на питательном косом агаре следующего состава, г:
Глюкоза 5
Дрожжевой экстракт 10
Агар 20
Дистиллированная вода до 1 л
Суспензией, смытой с косяков, 100 мл среды следующего состава, г
Декстроза
Мука соевых бобов
Твердый водный экстракт зерен пшеницы или кукурузы
СаСО
NaC1
Вода водопроводная до до
Инкубацию проводят 48 ч при 30 С при непрерывном встряхивании на вращающемся устройстве, работающем со скоростью
250 об/мин.
Порции по 100 мл среды того же состава, что и вышеуказанный, помещают в Эрленмейеровские колбы емкостью 500 мл, подвергают стерилизации при 120 С в течение 30 мин и засевают полученной культурой.
Культивирование проводят при встряхивании в течение 72 ч при 30 С на вращающемся встряхивающем устройстве, совершающем
250 об/мин. рН привитой среды приблизительно 7,7. рН постепенно возрастает на протяжении периода времени брожения и при снятии урожая составляет около 7,5. Антибиотик экстрагируют из культуральной жидкости общеизвестными приемами.
Пример 2. Спорами Streptomyces capreolus ККК1 3817 засевают питательный косой агар следующего состава, r:
Глюкоза 5
Дрожжевой экстракт 10
470964
10 вода до 1 л
Декстроза
Бактопентон
Глицерин
Амбер, А1 В
Патока
Надрисол
Дистиллированная
0,02
5,00
1,50
0,30
0,25
100,0
Ферментацию проводят в течение 48 ч при
30 С при скорости перемешивания около
250 об/мин и аэрации с расходом
396,4 дм /мин. За этот отрезок времени добавляют стерильный раствор из 472 кг декст- 60 розы в 42 л воды. Ферментацию продолжают и последующие 48 ч.
900 л культуральной жидкости, полученной, как указано выше, фильтруют с использованием 27 кг коммерческого вспомогательно..о 65
Агар 20
Дистиллированная вода до 1 л
Привитой косой агар выдерживают в термостате при 30 С в течение 5 дней.
0,5 мл смытой с косяка суспензией засевают 50 мл стерильной среды следующего состава, г:
Амбер (Amber) А1  — торговое название для продукта молочного альбумина лаборатории Amber, Juncan, Висконзин 55039.
Надрисол (Nadrisol) — торговое название высушенного растворимого продукта винокуренного производства фирмы National Distillers Products Company, Нью-Иорк.
Инкубацию проводят 72 ч при 72 С при постоянном перемешивании на вращающемся встряхивающем устройстве, совершающем
250 об/мин.
Порцию в 20 мл полученной таким образом культуральной жидкости добавляют к 400 мл среды того же состава, что и приведенная выше. Выращивание ведут в теченис 48 ч при
30 С при постоянном перемешивании на вращающемся встряхивающем устройстве, совершающем 250 об/мин.
К ферментационному резервуару добавляют после стерилизации при 120"С 42 л среды из семян вышеуказанного состава с добавлением
0,2 г противовспенивающего средства на 1 л среды. В среду из семян добавляют около
400 мл полученной культуральной жидкости и культивируют около 24 ч при 30 С при перемешивании мешалкой, вращающейся со скоростью 135 об/мин, и аэрации с расходом
18,4 дм /мин. Спустя примерно 24 ч ферментации около 8,0 л культуры используют для прививки 946,25 л стерильной продукционной среды, содержащей, /о.
Противовспенивающий агент
Декстроза
Крупа соевых бобов
Патока (черная меляса)
Карбонат кальция
Дистиллированная вода до
6 фильтра (11п11о $ирег-cei). Филырат доводят до рН 8,5 с помощью 5 н. раствора гидроокиси натрия. Щелочной фильтрат дважды экстрагируют, используя 0,5 объема хлороформа. Хлороформные вытяжки собирают и выпаривают досуха под вакуумом. Образующийся остаток растворяют в 2 л метанола, а нерастворимые частички отфильтровывают и отбрасывают за ненадобностью. Фильтрат метанола,выпаривают досуха под вакуумом.
Образующийся остаток растворяют в 470 мл хлороформа и добавляют к 10 л петролейного эфира. При этой операции образовывается осадок. Осадок отфильтровывают, затем сушат под вакуумом с выходом 82,6 г сырьевой смеси антибиотика.
В 500 мл хлороформа растворяют 3 г сырьевой смеси антибиотика, полученной по вышеприведенному способу. Хроматографическую колонку размеpaiiH 7+60 см набивают кремнегелем (вегасе, 62, Davison Сhemical Со), измельченным со смесью хлороформа и ацетона (1: 1), а затем растворитель удаляют. Хлороформный раствор сырьевой смеси антибиотика вводят в верхнюю часть колонки и пропускают через слой кремнегеля.
После выхода 500 мл хлороформа из колонки слой силикагеля промывают 10 л смеси хлороформа и ацетона (1; 1). Сточную и промывочную жидкость отбрасывают за ненадобностью, После этого через колонку пропускают ацетон и элюат (экстракт из адсорбента), испытывают на активность антибиотика. Фракции, имеющие активность антибиотиков, собирают и выпаривают досуха под вакуумом. К полученному таким образом остатку добавляют
500 мл ацетона. Раствор нагревают, а затем дают ему 10 — 12 ч постоять при — 20 С для обеспечения протекания кристаллизации антибиотика А-201Л. Кристаллы отфильтровывают и высушивают под вакуумом, выход при этом составляет 13,3 г антибиотика А-201А с т. пл.
170 †1 С.
Проводя элюирование антибиотика А-201А, смесь ацетона и метанола (9: 1) пропускают через колонку и удаляют фракциями, которые испытывались на активность антибиотика.
Предмет изобретения
Способ получения антибиотика, о т л и ч аю шийся тем, что культуру Streptomyces
capreolus NRRL 3817 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 30—
50 С и рН 6,2 — 7,2 в течение 72 †1 ч, фильтрат культур альной жидкости экстрагируют хлороформом, метанольный экстракт упаривают досуха, остаток растворяют в хлороформе, хлороформный раствор вливают в петролейный эфир, осадок растворяют в хлороформе, пропускаю раствор через колонку адсорбента, например силикагеля, элюируют целевой продукт ацетоном с последующим выделением известными приемами.
470964
Составитель С. Щенева
Редактор Т. Девятко Техред Е. Подурушина Корректор Е. Рогайлина
Заказ 2206/4 Изд М 1502 Тираж 529 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
Я 4000 5000 2500 2000 ц м
80 ф 40
3 20
Частота, ем
1И0 1400 Q00 1200 1100 1000950 900 850 800 750 700 6
8 9 10 11 12 13 14 15
Иае//още//ае, м/гм
