Способ получения -дигидрокси -3-4-фенилаланина

 

о и Jr - й"и е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ (1 ц 452 I 0 3

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (51) М. Кл. С 12d 13/06 (22) Заявлено 21.01.71 (21) 1608535/28-13 (32) Приоритет 21.01.70 (31) 7002129 (ЗЗ) Франция

Опубликовано 30.11.74. Б;оллетень М 44

Государстваииый комитет

Совета Мииистров СССР (53) УДК 663.18(088.8) ло делам изобретеиии и открытий

Дата опубликования описания 30.09.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Жан Флоран, Жан Люнель и )Как Рено (Франция) Иностранная фирма

«Рон-Пуленк С. А.» (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

L-ДИ ГИДРО КС И-3,4-ФЕН ИЛАЛАН И НА (61) Зависимый от патента

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения 1 -дигидрокси-3,4-фенилаланина путем микробиологического преобразования тирозина.

Известен способ получения l -дигидрокси3,4-фенилаланина, состоящий в культивирозании продуцента на питательной среде, содержащей источник углерода и источник азота, в лрисутствии тирозина с последующим выделе- 10 нием L-дигидрокси-3,4-фенилаланина, Прп этом в качестве продуцента используют различные микроорганизмы, в частности Microspira tyrosinatica, Gliocladium deliques cens

llP. 15

Однако такой способ дает низкий процент выхода L-дигидрокси-3,4-фенилаланина.

С целью устранения указанного недостатка предложен способ получения L-дигидрокси-3,4фенилаланина, согласно которому в качестве 20 продуцента используют штамм Vibrio tyrosinaticus АТСС 19378.

Клетки этого штамма имеют удлиненную и искривленную форму, соединены в цепочки.

На питательной среде с агар-агаром штамм 25 образует обильную рыхлую культуру белого цвета Vibrio tyrosinat!cus АТСС 19378. Разжижает желатин, не гидролизует агар, не образует пигмент на питательной среде с агаром.

На питательной среде с агаром и тирозином штамм образует черный пигмент, содержащий

1 -дигидрокси-3,4-фенилаланин.

Процесс получения L-дигидрокси-3,4-фенилаланпна проводят в две фазы при различном значении рН. На первой фазе выращивают указанный продуцент |при рН 6,0 — 7,8, на второй — преобразовывают тирозин в l -дигидрокси-3,4-фенилаланин при рН 4,0 — 7,0. При этом тирознн вводят в виде щелочного и кислотного растворов.

На фазе преобразования тирозина добавляют глюкозу, 1.-аскорбиновую кислоту, антиокпсляющпй агент и соли меди.

Предложенный способ осуществляют следу1ощи м обр азом.

На первой фазе культивируют штамм Vibrio

1уrosinaticus АТСС 19378 на питательной среде при рН 6,0 — 7,8 (предпочтительно между

6,5 и 7,5) преимущественно при 25 — 26 С.

Выращивание культуры проводят при перемешпваппп и аэрации.

Питательная среда содержит источник углерода, источник азота и минеральные элементы.

452103

В качестве источников углерода используют глюкозу, мальтозу, декстрипы, крахмал, глицерин, мелассу и лругие вещества.

Взамен гидроуглеродистых соединений могут быть применены животные и растительные жиры и масла, такие как свиное сало или соевое масло.

Источниками азота могут быть минеральные или органические соли аммония, мочевпна и некоторые аминокислоты.

Они могут быть внесены и в виде казсина, лактобумина, клейковины, соевой, арахпсовой и рыбной муки, мясных экстрактов и дро>кжей.

В качестве добавляемых в питательную среду минеральных элементов могут быть использованы щелочные и гцелочноземельныс фосфаты или карбонаты кальция и магния.

Во второй фазе B питательную среду добавляют 1-тирозин в кол. честве, преимущественно, OT 3 до 10 г/л. Гго o Ioc rr " ) ciIIO ITil". c: hIIO после роста продуцспта г течение 16 — 2".- час, используя одновременно щелочной раствор тирозина и его раствор в сол;:ной кислоте.

После внесенпя щелочного и кислотного растворов тирозг па культуру выдер>кивают в течение одного-двух дней в тех >ке условиях.

В начале фазы преобразования тирозина B культуру может быть дополнительно введена глюкоза и добавка для контроля рН культуры.

Преобразование ти,.озина можно осуществлять в присутствии аскорбиновой кислоты, которую добавляют (в один или несколько приемов в количестве 1 — o г/л) в период фазы роста продуцеп,а либо после внесснця в питательную среду 1 -тирознна.

После завершения фазы преобразования тирозина приступают к выделению 1 -днгидрокси-3,4-фенилалапиíà. Для этого сусло после окисления до рН 2 подвергают фильтрации ил и центрифугированию. В этом случае L-дигидрокси-3,4-фепил алании мо>кет последовательно удерживаться на катионообменной смоле типа сульфидной и на глиноземе в присутствии этилендиаминотетрауксусной кислоты и метабисульфита натрия.

1 -дигидрокси - 3,4 - фенил алании, задор>канный на глиноземе, элюируется раствором щавелевой кислоты и, после ее удаления, очищается путем перекристаллизации.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава (г):

Дрожжевой экстракт 40

Пептон 80

Мясной экстракт 80

Моногидратная глюкоза 160

Хлорид натрия 80

Вода 17 (л).

Путем внесения в среду 22 см едкого натра (10 н) устанавливают рН 7,5.

Приготовленную среду стерилизуют при

122 С в течение 40 мин, Охлажденную среду при рН 6,95 засевают

200 см культуры Vibrio tyrosinaticus АТСС

19378 в колбе Эрленмейера. Культура развп20

65 вается при 26 С в течение 16 час при перемешивании и аэрации стерильным воздухом.

Затем рН культуры доводят до 5,3 путем внесения стерильного раствора соляной кислоты 2,4 н, После этого в среду добавляют 64 г тирозина в виде двух растворов одинакового объема — первый с 20% в соляной кислоте (2,4 н.) и второй с 20% в едком натре (2,4н.).

Кроме того, в питательную среду добавляют

350 см раствора, содер>кащего 160 г моногидратной глюкозы, и выдер>кивают культуру в течение 27 час, поддер>кивая рН 5,3.

В конечном объеме, составляющем 14 тигрованных литров, содержится 3,0 г/л 1-дигидрокси-3,4-фенилаланина.

П р и мер 2. Часть (1,8 л) преобразованной культуры, описанной в примере 1 и содержащей 5,4 г 1 -дигидрокси-3,4-фенилаланина, окисляют 50 см соляной кислоты 12 н. при рН» центрифугируют. Собранную жидкость пропускают ца столбик смолы Dowex 50%-х в виде кислоты (смола на основе полистиренсульфокислоты с 2 % дивннилбензола).

1 -дигидрокси-3,4-фенилаланин элюируется

2 и. соляной кислотой. Злюат (5,2 л), содержащий небольшое количество непреобразованного тирозина, очищают, устанавливая его рН

4,0 за счет введения 800 см едкого натра (d 1,33), 250 г глинозема, 5 г метабисульфита натрия и 5 г этилендиаминотетрауксусной кислоты в виде двусодистой соли. Смесь перемешивают, доводят рН до 8,6 путем внесения

200 см концентрированной соды и выдерживают в течение 15 мин.

Глинозем отделяют путем фильтрации и несколько раз промывают тремя литрами дистиллированной воды. Фильтрат и промывная жидкость, содержащие в ссбе тирозин, удаляются, а 1 -дигидрокси-3,4-фенилаланин отделяется при обработке глинозема 2,2 л щавелевой кислоты 2 и. Шавелевый раствор концентрируют в 0,7 л при пониженном до 30 мм рт. ст. давлении путем нагревания в водяной бане. Щавелевую кислоту удаляют фильтрацией. Затем фильтрат обрабатывают 3,7 л этилового спирта, доводят его рН до 5,5 и добавляют 150 см едкого патра (d 1,33) и 3,7 л ацетона для выпадения минеральных солей.

Полученный осадок фильтруют, а фильтрат концентрируют под давлением 30 мм рт. ст. путем нагревания в водяной бане до 0,8 л.

Концентрацию фильтрата заканчивают при нормальном давлении в атмосфере азота и нагревании с помощью,парафиновой бани до получения 70 см раствора. Полученный раствор выдерживают в течение 10 час при 40 С, после чего из него выделяют 2,54 r неочищенного 1 -дигидрокси-3,4-фенилаланина.

Очистку этого продукта проводят путем перокристаллпзации воды после осветления вод. ного раствора с помощью активного углерода.

Таким образом получают кристаллизованное вещество L-дигидрокси-3,4-фенилаланин с выходом 49%, 452103

55

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава (г):

Дрожжевой экстракт 100

Пептон 200

Мясной экстракт 200

Хлорид натрия 200

Вода 33 (л).

PH среды устанавливают равным 7 путем добавления 40 см соды 10 н. Среду стерилизуют, барботируя ее паром при 122 С в течение 40 мин. Охлажденная среда имеет объем

38,5; его доводят до 40 л за счет добавления

1,5 л стерильного водного раствора, содержащего 600 г моногидратной глюкозы.

Среду с рН 6,9 засевают 200 см культуры

Vibrio tyrosinaticus АТСС 19378 в колбе

Эрленмейера.

Культуру ",,ûðàùèâàþò при 30 С в течение

10 час при перемешивании и аэрации стерильным воздухом. Производственную культуру rîтовят в бродильном чане емкостью 800 л с

2,2 кг corn steep (50 /О сухого экстракта), 0,220 кг сульфата марганца и 390 л воды, После установления рН 6,6 " помощью

120 с» 10 и. едкого натра в чан добавляют

1,1 кг карбопата кальция. Полученную среду стерилизуют путем ее парового барботпрования при 122 в течение 40 мин.

Охлажденная питательная среда имеет объем 425 л, его доводят до 440 л за счет внесения в среду 10 л стерильного водного раствора, содержащего 4,4 кг моногидратной глюкозы, и 5 л стерильного водного раствора, содержащего 0,880 кг сульфата аммония.

Полученную питательную среду с рН 7 засевают 6 л культуры Vibrio tyrosinaticus в бродильном чане емкостью 75 л. Культура развивается при 30 С в течение 20 час при интенсивном перемешивании с помощью центрифуги, вращающейся со скоростью

180 об/мин, и аэрации стерильным воздухом, иопользуемым в количестве 20 м /час.

PH среды поддерживают 6,6+1-0,05 путем добавления 6 н. аммиака пли 4 и. соляной кисл отьь

Через 20 час роста продуцента объем сусла устанавливают равным 400 л, а рН доводят до 5,5 с помощью 6 н. соляной кислоты.

Затем в питательную среду вводят 1,1 л водного раствора (рН 5,5), содержащего 215 г

1 -аскорбиновой кислоты, и выдерживают в течение 2 час при 30 С и интенсивном перемешив анин.

В выдержанное сусло вводят 1,1 л водного раствора (рН 5,5), содержащего 215 г 1 -аскорбиновой кислоты, и 1,720 кг 1 -тирозина в виде двух растворов концентрации 6,15О/о — в 1 н. едоком натре и в 1 н. соляной кислоте. Затем в сусло последовательно с интервалом в 1 час вводят 1,1 л водного раствора 1 -аскорбиновой кислоты при рН 5,5.

После введения указанных добавок культуру выдерживают в течение 7 час при рН 5,5.

Окончательный объем сусла составляет 430 л.

Количество 1 - дигидрокси - 3,4 - фенилаланина, присутствующего в нем, составляет 3,55 г/л.

Пример 4. Культуру Vibrio tyrosinaticus

АТСС 19378 готовят в соответствии с примером 3. После выдерживания в течение 20 час объем сусла равен 400 л, рН 6,6.

Затем в сусло вводят 2,2 л водного раствора, содержащего 400 г 1-аскорбиновой кислоты, при рН 6,5 и, интенсивно перемешпвая, в течение 2 час при 30 С аэрируют стерильным воздухом в количестве 20 мз/час, Затем вновь вводят 2,2 л водного раствора (при рН 6,5), содержащего 400 г 1-аскорбиновой кислоты.

Кроме того, в питательную среду добавляют

1,720 кг L-тирозина в виде двух водных растворов концентрации 6,15О/Π— в 1 н. едком натре и в 1 н. соляной кислоте.

Затем в питательную среду последовательно с интервалом в 1 час вводят две добавки водного раствора по 1,1 л при рН 6,5, содержащие каждая по 200 г L-аскорбиновой кислоты, и добавку 2,2:I водного раствора, содержащего 400 г 1 -аскорбиновой кислоты. Культуру выдерживают 7 час, поддерживая рН сусла 66.

Окончательный объем сусла составляет

430 л, количество 1 -дигпдрокси-3,4-фенилаланина — 2,79 г/л.

Предмет изобретения

1. Способ получения 1 -дигидрокси-3,4-фенилаланина путем культивирования продуцента на питательной срс 1е, содержащей источник углерода и источник азота, в присутствии тирозина с последующим выделением 1 -днгидрокси - 3,4 - фенплаланина, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода 1-дигидрокси-3,4-фенилаланпна, в качестве продуцента используют штамм 4 ibrio tyrosinaticus

ATCC 19378.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс ведут в две фазы, на первой из которых осуществляют рост продуцента при рН 6,0 — 7,8, à»а второй — преобразование тирозина в 1 -дигидроксп-3,4-фенилалапин при рН 4,0 — 7,0.

3. Способ по пп. 1 и 2, о тл и ч а ю щи и с я тем, что тирозин в питательную среду вводят в виде двух растворов — щелочного и кислотного.

4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся тем, что на фазе преобразования добавляют глюкозу.

5. Способ по пп. 1 — 4, отл и ч а ю шийся тем, что на фазе преобразования тирозина в

1 - дигидрокси — 3,4 - фенилаланин добавляют

1-аскорбиновую кислоту и антпокисляющнй агент.

6. Способ по пп. 1 — 5, отличающийся тем, что на фазе преобразования тпрозпна в

1 -дигидрокси-3,4-фенилалашш добавляют спли меди.