Способ получения бензилпенициллинацилазы

Авторы патента:

изобретени Г. И. Клейнер, С. В. Лопатнев, Е. С. Былинкина , Г. И. Альбрехт

О П" И C: A--Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ пп 420660

СоюЗ т .оветских

Соцмалкстм аскитт

Ресаубпии

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 14.07.72 (21) 1811160/31-16 с присоединением заявки № (32) Приоритет

Опубликовано 25.03.74. Бюллетень ¹ 11

Дата опубликования описания 14.11.74 (51) M. Кл. С 12d 13/10 государственный комитет

Совета Министров СССР оо дедам изобретений и открытий (53) УДК 615.779.94 (088.8) (72) Авторы изобретения Г. И. Клейнер, С. В. Лопатнев, Е. С. Былинкина и Г. И. Альбрехт

Рижский завод медицинских препаратов (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ

Изобретение относится к области медицины и касается способов получения бензилпенициллинацилазы.

Известен способ получения бензилпенициллинацилазы путем глубинного культивирования

Е. coli в среде содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением целевого продукта.

Ферментацию в данном случае прекращают .при достижении определенного уровня биомассы, что не всегда совпадает с достижением культурой максимальной ацилазной активности и не всегда обеспечивает оптимальную продолжительность ферментации.

Целью изобретения является интенсификация процесса ферментации. Предложенный способ позволяет прекратить ферментацию при достижении культурой наибольшей ацилазной активности, обеспечить оптимальную продолжительность ферментации и тем самым более рационально использовать технологическое оборудование и повысить съем продукта.

Для достижения поставленной цели ферментацию прекращают при достижении относительно постоянного уровня интенсивности дыхания культуры, который наблюдается вслед за снижением максимальной интенсивности дыхания.

В таблице приведено время достижения максимальной активности культуральной жидкости при определении разными методами.

Из таблицы видно, что вне зависимости от фактичеокого времени достижения максимальной активности концентрация СО> и Ое в отходящем газе наиболее четко показывает момент окончания накопления ацилазной активности в культуре.

10 Пример 1. В ферментер загружают 100 л питательной среды, содержащей 2% кукурузного экстракта (в пересчете на сухое вещество) и 0,1% фенилуксусной кислоты, доводят рН раствором NaOH до 6,9 и стерилизуют в ферментере в течение 40 мин при 124 С.

После посева часть выходящего из ферментера газа направляют в оптико-акустический газоанализатор типа ОА 2209. По мере роста микроорганизма прибор фиксирует уве20 личение концентрации двуокиси углерода в выходящем из ферментера газе. Концентрация двуокиси углерода в выходящем из ферментера газе резко падает (с 1,96 до 1,23%) между 10 и 10,5 час роста и .продолжает дер25 жаться на том же уровне до 11,5 час роста.

На 11,5 час роста культивирование прекращают, и культуральную жидкость передают на дальнейшую обработку.

В момент слива рН культуральной жидко30 сти 8 1, концентрация биомассы 4 2 г/л и

420660

Способ определения максимальной ферментной активности культуральной жидкости

Время окончания ферментации, час

Прямой

Косвенные:

11,5

16,5

13 по изменению оптической плотности по времени достижения рН 8,2 по изменению концентрации СОя в выходящем из ферментера газе но изменению концентрации Оя в выходящем из ферментера газе

11,5

Предмет изобретения

Составитель С. Щеиева

Техред Е. Борисова

Корректор А. Васильева

Редактор Д. Пинчук

Заказ 2308/1 Изд. № 713 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, K-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 бензил пенициллинацилазная активность культуральной жидкости 14,5 ф. ед.

Пример 2. 100 л среды готовят, засевают и культивируют как в примере 1.

После посева часть выходящего из ферментера газа направляют в парамагнитный газоанализатор ти па МГК.

По мере роста микроорганизма прибор фиксирует уменьшение концентрации кислорода в выходящем из ферментера газе.

Между 12 и 12,5 час роста концентрация 0 в выходящем из ферментера газе резко повышается (с 18,8 до 19,8%) и продолжает держатся примерно на том же уровне до

13,5 час роста.

На 13,5 час роста культивирование прекращают, и культуральную жидкость передают на дальнейшую обработку.

В момент слива рН культуральной жидкости 8,0, концентрация биомассы 3,9 г/л и бензилпенициллинацилазная активность культуральной жидкости 14,8 ф. ед.

Способ получения бензилпенициллинацилазы путем глубинного культивирования Е. coli

10 в ореде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью интенсификации процесса, ферментацию прекращают при достиже15 нии относительно постоянного уровня интенсивности дыхания .культуры, который наблюдается вслед за снижением максимальной интенсивности дыхания.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть применено при ферментативной реакции синтеза, а также для фиксации ферментов на носителе

Способ синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, при использовании варианта пенициллинацилазы // 2537845

Изобретение относится к инженерной энзимологии, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к повышению эффективности биокаталитических превращений посредством применения мутантных форм ферментов с улучшенными каталитическими свойствами. В настоящем изобретении повышение эффективности ферментативного синтеза пептидной связи достигается при использовании варианта пенициллинацилазы из E.coli, содержащего замену аминокислотного остатка бета-цепи фермента в положении 484. Использование данного мутанта пенициллинацилазы позволяет увеличить выход и скорость накопления целевого продукта в реакциях синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, содержащих пептидную связь в боковой цепи с ядром. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

Мутант пенициллинацилазы из e.coli с улучшенными свойствами // 2564578

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой мутант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из E.coli, содержащий замену остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента в позиции 484 (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина. Изобретение позволяет получить пенициллинацилазу с улучшенными каталитическими свойствами. 2 табл., 2 пр.

Модифицированный ген рас бактерий escherichia coli, кодирующий предшественник фермента с активностью пенициллин g ацилазы, рекомбинантный штамм escherichia coli - продуцент пенициллин g ацилазы и способ микробиологического синтеза этого фермента // 2624022

Изобретение относится к области биохимии, генетической инженерии и биотехнологии, в частности к модифицированному гену pac бактерии Escherichia coli. Нуклеотидная последовательность указанного гена представлена в SEQ ID NO: 17. Указанный ген кодирует предшественник фермента пенициллин G ацилазы, состоящего из аминокислотной последовательности сигнального пептида L-аспарагиназы Erwinia carotovora и структурной части пенициллин G ацилазы E.coli. Настоящее изобретение относится также к рекомбинантному штамму E.coli BL21(DE3)/pMD704. Настоящий штамм является продуцентом пенициллин G ацилазы. Штамм получен путем введения указанного модифицированного гена pac в составе вектора pSVH0107 в штамм-реципиент E.coli BL21(DE3). Изобретение также относится к способу микробиологического синтеза пенициллин G ацилазы. Указанный способ предусматривает культивирование штамма E.coli BL21(DE3)/pMD704 в подходящих условиях. Настоящее изобретение позволяет получать фермент пенициллин G ацилазу E.coli с высокой активностью. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.