О- - ,1кчрд'l/trt«рихтер гедеон ведьешети дьяр р.т.»^ -'^-- ^-^-^i^a):(венгерская народная реснублика)>&,-«,> &.?*;??}1?1ека f/i&a

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социглистических

Республик

" Ё

Зависимый от патента ¹

Заявлено 07.1Х.1970 (№ 1476146/31-16) М. Кл. С 12d 13,„, ОО

А 611с 17 00

Приоритет

Опубликовано 13.1Х.1972. Бюллетень ¹ 27

Комитет по делом изоеретеиий и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 615.45:615.351 (088.8) Дата опубликования описания 26.IX.1972

Лвторы пзобрс гения

Иностранцы

Габор Хантош, Иштван Удварди, Диула Хруби, Денеш Жекели и Иозеф Жолноки (Венгерская Народная Республика) ВСЕСОЮЗНАЯ

11ностраниая фирма

ЛАТ"

«Рихтер Гедеон Ведьешети Дьяр Р.T.» . „ " - - - - --"Лт (Венгерская Народная Р спублнка) "o " r@Ha 14Ыi

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

Изобретение относится к области медицины и касается получения кортикостероидов.

Известен способ получения кортикостероидов при помощи культур Arthrobacter или

Corynebacter, обладающих индуктивной стероид-1,2-дегидрогеназой, индукцию которой вызывают стероидами типа андростана или прегнана. Однако при использовании этого способа выход продукта низкий, а чистота его не удовлетворяет требованиям фармакопеи, Целью предлагаемого способа является ускорение процесса и повышение выхода целевого продукта.

Для достижения поставленной цели индукцию фермента стероид-1,2-дегидрогсназы проводят в период стационарной фазы культуры прибавлением 0,02 — 0,2 иг/лет стероида нндуктора с одновременным провоцированием вторичного размножения бактерий путем введения в культуральную среду 0,01 — 0,1% источника углерода или азота, после втори шого исчерпания питательных ресурсов среды <обавляют 1,2-насыщенный кортикостероид и осуществляют дегидрирование, а конечный продукты выделяют известными приемами.

Стероид прибавляют в форме грубых кристаллических зерен, в виде водной суспензии или кристаллов, осажденных из органического растворителя небольшим количеством воды.

К культуре в качестве индукционного периода прибавляют моно- или дисахарнды. В качестве источника азота добавляют аминокислоту или питательное вещество, содержащее аминокислоту, например, кукурузный экстракт. В начале штдукционного периода прибавляют аммоцисвую соlb органической кислоты, например, сукиионат аммония.

П р и м с р 1. 5 л стсрильпой питательной среды, рГ1 6,8 — 7,0, содержащей 0,5% глюкозы, 10 0,3 /о сукционата аммония, 0,1% экстракта дрожжей и 0,1% дегидрофосфата калия, инокулируют суспензией Corynebacterium ciem», и ку,чьтуру ннкубируют при 35 С при перемешиваннн и аэрации со скоростью 80 л.Ч кис15 лорода на 1 л среды в час. Культивирование ведут до полного израсходования сукционата аммония (около 14 час). К культуре прибавляют 0,5 л стерильного раствора, содержащего 0,8,р сукционата аммония. В этом стериль20 ном растворе предварительно суспендируют

0,5 г гидрокортизона. К1 льт :р . инкубируют

5 «ас. Количество клеток возрастает на 20%.

Пример 2. 250 .чл питательной среды, содержащей 0,4% глюкозы, 0,4% пептона, 0,4%

25 экстракта дрожжей, стернлизуют в коническои колбе Эрленмейера, объемом 750 лтл. Среду пнокулируют жидкой культурой Arthrobacte>

simplex, и культуру инкубируют при встряхивании при 35 С до начала периода покоя клезо ток. Эта стадия наступает примерно на 18—

351374

55 б0

20 час культивирования. 0,2 г глюкозы растворяют в 10 м.г воды, а 10 м.г предпизолона (ипдуктор — стероид) растворяют в 2 мл метанола.

Оба раствора объединяют и прибавляют к культуре, после чего инкубироваппе ведут

4 час. По окончании этого периода активность культуры составляет 180 ед мл. Полученную культуру прибавляют к 4750 м.г стерильной воды и 1,6,г/г, т. е. 8 г гидрокортизона, дегпдрируют полученной разбавленной культурой в

5 л. Гидрокортизон вводят в аппарат для ферментацпи v.фор.ме раствора в метаноле, содержащего 10О/О хлористого кальция. Раствор прибаьляют четырьмя равными порциями через каждые 2 час. Инкубирование ведут при

35 С при перемешивании и аэрации со скоростью 80 мМ кислорода на 1 л среды в час.

Через 8 час инкубации проводят хроматографию, среда не содержит гидрокортизона.

Культуральную жидкость экстрагируют тремя порциями этилацетата, сушат и выпаривают.

Получают 7,1 г кристаллического преднизолона, содержащего 1,0 /о остаточной примеси гидрокортпзона.

Пример 3. 200 л питательной среды, рН 6,8 — 7,0, содержащей 0,5 "/о глюкозы, 0,1 /о аспарагина и 0,2 /о кукурузного экстракта стерилизуют, инокулируют 10 л культуры Arthrobacter simplex и инкубируют при 35 С при перемешивании и аэрации со скоростью 120 мМ кислорода на 1 л среды в час. 1ерез 14 час содержание аминокислот в культуре составляет меньше 0,02 /о.

25 г гистидина растворяют в 1000 мл воды, а 25 г гидрокортизона (индуктор — стероид) растворяют в 300 м.г метанола, содержащего

10 /о хлористого кальция. Растворы объединяют и прибавляют к культуре. Индукцию ведут

3 час. Активность культуры составляет

420 ед/мл. Скорость превращения гидрокортизона равна 58у мл/мин.

Культуру, содержащую стероид — 1,2 — дегндрогеназу, разбавлпот водой в соотношении 1:20 и к 4000 л полученного бульона прибавляют 3,2 кг гидрокортизона, через 2 час добавляют еще 1,6 кг гидрокортизона. Общее количество прибавленного гидрокортизопа еоставляет 1,2 г/л. Продолжают инкубировапие, через три часа отбирают пробу и исследуют методом хроматографии. Гидрокортизон отсутствует. Культуру экстрагируют тремя порциями по 0,5 объема хлороформа, экстракты обецвечивают обычным способом, выпаривают в вакууме; продукт кристаллизу от, фильтруют и сушат. Получают 4,2 кг пред»«золона.

Пример 4. 4 кг гидрокортизопа суспепдпруют в 16 л воды, содержащей 100 г эмульгатора «Твин — 80». К суспензии прибавляют

4 л метанола, суспензию переносят в аппарат для гомогепизации и прибавляют к культуре, содержащей стероид-1,2-дегидрогеназу, получение которой описано в примере 3. 20 г/л гпдрокортизона подвергают превращен по. Во втором и шестом часу превращения прибавле5

1О

40 пне прерывают на 1 час для исследований. Пре вращение ведут при 35 С при перемешпвании и аэрации со скоростью 80 мМ кислорода па 1 .г среды в час. Когда зерна гидрокортпзона исчезают и начинают преобладать игольчатые кристаллы преднизолона, исследуют культуральную жидкость методом хроматографии.

Ферментацию прекращают, когда количество остаточного гидрокортизона составляет не более 2 о/о (приблизительно через 10 — 12 час) .

Кристаллический преднизолон отделяют, растворпот в смеси хлороформа с метанолом, раствор фильтруют, обесцвечивают 100 г активированного угля, выпаривают в вакууме, продукт кристаллизуют. Получают 3,45 г преднизолона, который содержит 1,8 /о остаточного гидрокортизона.

Пример 5. штамм Curvularia prasadii культивируют 24 час в питательной среде, содержащей 1,5 /о глюкозы и 2,5 /о экстракта кукурузы. К культуре прибавляют раствор

6 г соединения Рейхштейна-S (RS) в 60 мл метанола, содержащего 10О/О хлористого кальция. Культуру инкубируют при 26 С при перемешивании и аэрации со скоростью 80 мМ кислорода па 1 л среды в час. Исследуют методом хроматографии через каждые 1 час.

Через 28 «ас, когда соединение RS полпостью превратилось, пробу исследуют методом хроматографии на бумаге. Фильтруют, к фильтрату, после индукции описанной в примере 3, прибавляют 300 мл культуры Arthrobacter

simplex. По данным хроматографии основным компонентом фильтрата является гидрокортизон. Культуру инкубируют, как описано в примере 3, и процесс превращения контролируют методом хроматографии. Продукт выделяют как в примере 3 и получают 3,1 г преднизолона.

Пример 6. 500 мл стерильной питательной среды, содержащей 0,3 /оглюкозы и 0,3 /о пептона инокулируют культурой Arthrobacter

simplex, культуру инкубируют при 35 С при встряхивании до наступления периода покоя (примерно 20 час). К культуре прибавляют

0,25 г глюкозы и 0,15 г глицина и индукцию провоцируют прибавлением 100 мг 17-о.-метилтестостерппа, растворенного в 10 м;г метанола.

Культуру инкубируют при 35 С при встряхивании. Активность стсроид-1,2-дегидрогеназы через пять часов инкубации составляет

220 ед/м.г.

500 м.г культу ральной жидкости разбавляют

4500 мл воды и прибавляют раствор 4 г сое. дипения RS в 50 л л мстанола, содержащего

100 г хлористого кальция. Дегидрирование проводят при перемешивании и аэрации до потребления субстрата (примерно 16 час). Процесс превращения контролируют методом хроматографии. Культуральную жидкость экстрагируют тремя порциями по 0,3 объема этилацетатом и выделяют продукт известными приемами. Выход 3,28 г 1-2-дегидросоединения ЯЬ.

351374

Предмет изобретения

Составитель В. Муравьева

Техред 3. Тараненко

Редактор Д. Пинчук

Корректор О. Тюрина

Заказ 3036/14 Изд. ¹ 1292 Тираж 406 Подписное

Ц1гИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете министров СССР

Москва,, К-35, Раушская иаб., д. 4,5

Типография, пр. Сапунова. 2

1. Способ получения кортикостероидов при

I-o IoUjII культуры Лг11ггоЬас1ег или CorynebacteI обладагощих индуктивной стероид-1,2дегидрогеназой, индукцию которой вызывают стероидами типа андростана и прегпана, отлигаюигийс,г тем, что, с целью ускорения процесса и повышения выхода целевого продукта, индукцию фермента стероид-1,2-дегидрогеназы проводят в период стационарной фазы культуры прибавлением 0,02 — 0,2 тгг/1гл стероида индуктора с одновременным провоцированием вторичного размножения бактерий путем введения в культуральную среду 0,01—

0,1ого источника углерода или азота, после вторичного исчерпания питательных ресурсов среды добавлягот 1,2-насыщегlный 1 .ортикостсроид и осуществляют дегидрироваипс, а конечный продукт выделяют известными приемами.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стероид прибавляют в форме грубых кристал5 лических зерен, в виде водной суспензии или кристаллов, осажденных из органического растворителя небольшим количеством воды.

3. Способ по п. 1, от.гичагощийся тем, что к культуре в начале индукционного периода

10 прибавляют моно- или дисахариды.

4. Способ по п. 1, от.ги гающггйгся тем, что к культуре в начале индукционного периода добавляют аминокислоту или питательное вещество, содержащее аминокислоту, например, 15 кукурузный экстракт.

5. Способ по п. 1, от.гггчающийся тем, что к культуре в начале индукционного периода прибавляют аммониевую соль органической кислоты, например, сукционат аммония.