Бнйлиотека ^л. в. воробьев
О П И С А Н И Е 336904
ИЗОЫЕТ ЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВМДЕТЕЛЬСТВУ
Соез Советских
Социалистических
Республик
Зависимое от авт. свидетельства ¹
М. Кл. А 61k 23/00
Заявлено 30.Х1.1970 (№ 1602518/31-16) с присоединением заявки №
Приоритет
Опубликовано 26.1.1973. Бюллетень № 9
Дата опубликования описания 9.IV.1973
Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров
СССР
УДК 576.8.097.2 (088.8) Автор изобретения
Л. В. Воробьев
- Заявитель
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА
Изобретение относится к области медицины, а именно к области иммунологических методов исследования.
Известен способ определения антигена путем обработки его иммунной сывороткой, меченой флуорохромом. Результат реакции оценивают путем просмотра препарата в люминисцентном микроскопе, в ультрафиолетовых лучах.
Однако известный способ определения антигена не обеспечивает высокой чувствительности реакции и может быть использован только для определения корпускулярных антигенов.
Цель изобретения — увеличение чувствительности реакции и определение корпускулярных и растворимых антигенов. Это достигается тем, что к сыворотке добавляют меченый флуорохромом гомологичный антиген, комплекс антитело — меченный антиген отделяют от свободного меченого антигена диск-электрофорезом в акриламидном геле, и результат учитывают по интенсивности свечения меченого антигена при облучении геля ультрафиолетовыми лучами.
Пример. Для испытания чувствительности предлагаемого способа в качестве неизвестного антигена используют традиционный объект иммунологии — альбумин человеческой сыворотки. Это определяет выбор специфической индикаторной системы. Она состоит из человеческого сывороточного альбумина, меченого изотиоцианатом флуоресцеина и сыворотки, преципитирующей белок человека. Окрашен5 ный известным способом альбумин фильтруют через колонку с сефадексом G-25, предварительно ур авновешенную электродным буфером. Таким образом, одновременно с освобождением альбумина от избытка флуорохрома
10 (флуоресцеинизотиоцианата натрия) происходит замена физраствора электродным буфером. Элюат собирают в отдельные пробирки порциями по 1,0 — 1,5 мл. Наиболее ярко окрашенную порцию элюата обозначают как раст15 вор меченого альбумина. Содержание белка в растворе определяемое по Лоури, составляет
4 — 5 мг/мл.
Затем приготавливают столбики 7%-ного акриламидного геля, используя для мелкопо20 ристого геля трис-буфер с рН 7,5, для крупнопористого геля трис-буфер с рН 5,5. Б качестве электродного буфера используют трис-верональный буфер с рН 7,0.
Приготовив гели и раствор меченого альбу25 мина, приступают к определению его рабочей дозы. Для этого последовательно приготавливают разведения меченого альбумина. 0,05 или
0,1 мл каждого разведения наносят на столбики геля и проводят электрофорез. После
30 окончания электрофореза гели просматривают
336904
Предмет изобретения
Составитель С, Щенева
Техред Г. Дворина
Корректоры: Л, Царькова и H. Лук
Редактор Н. Цалихина
Заказ 669/1 Изд. К 210 Тираж 467 Подписное
ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР
Москва, 7К-36, Раушская наб., д. 4/3
Типография, пр. Сапунова, 2 в ультрафиолетовом свете.и отмечают последнее разведение антигена, еще дающее четкую светящуюся полосу в нижней части геля. Это разведение принимают за рабочую дозу меченого антигена.
Затем определяют рабочую дозу гомологичной меченому антигену сыворотки, преципитирующей человеческий альбумин. Смешивают
0,05 мл каждого разведения сыворотки с рабочей дозой меченого альбумина. По 0,1—
0,15 мл смеси наносят на гели и проводят электрофорез.
Комплекс антитело — меченый альбумин в силу большой величины и маленького заряда остается в верхней части геля, в то время как свободный меченый антигвн перемещается в его нижнюю часть.
После окончания фореза гели просматривают в ультрафиолетовом свете и отмечают последний гель, где светящаяся полоса находится в верхней части геля. Это и есть рабочая доза сыворотки, т. е. минимальное количество сыворотки, полностью связывающее рабочую дозу меченого антигена.
Далее 0,05 мл раствора определяемого альбумина на электродном буфере смешивают сначала с рабочей дозой преципитирующей сыворотки, затем добавляют рабочую дозу меченого альбумина. 0,15 мл смеси наносят на гели и после электрофореза учитывают ре5 зультат реакции по интенсивности свечения свободного и связанного меченого альбумина при облучении геля ультрафиолетовым светом.
Способ определения антигвна, основанный на его взаимодействии со специфической го15 мологичной сывороткой в реакции иммунофлуоресценции, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности реакции и определения корпускулярных и растворимых антигенов, к сыворотке добавляют меченый флу20 орохромом гомологичный антигон, комплекс антитело — меченый антиген отделяют от свободного меченого антигена дискэлектрофорезом в акриламидном геле, и результат учитывают по и нтенсивности свечения связанного и
25 свободного меченого антигена при облучении геля ультрафиолетовыми лучами.
