Способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов

 

О П И C А Н И Е 320528

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства ¹

Заявлено 30. т/.1969 (№ 1334457/28-13) с присоединением заявки № 1334458,28-13

Приоритет

Опубликовано 04.Х1.1971. Бюллетень ¹ 34

Дата опубликования описания 31.1.1972

МПК С 12d 13/10

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 577.15.08(088.8) Авторы изобретения

К. А. Каск, Х. Я. Киппер, Т. Л. Лиеберт, К. К. Рая, A. Г. Канн и М. И. Крээн,/

Таллинский политехнический институт -" .- -"= 311, "

1.;.

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ

И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к технике получения ферментных препаратов, широко применяемых во многих отраслях легкой, пищевой и мясной промышленности.

Известен способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, заключающийся в выращивании их продуцентов Aspergillus огувае 3 — 9 — 15 на питательной среде, содержащей солевое питание, и выделении мицелия из культуральной жидкости.

Недостатками,известного способа является сложность технологической схемы при выделении ферментных препаратов из культуральных жидкостей микроорганизмов. Для очистки и концентрирования ферментных .растворов и выделения ферментных препаратов приняты такие методы как ионообмен, адсорбция, высаливание и другие.

Для ускорения процесса получения ферментных препаратов по предлагаемому способу в питательную среду вводят молочную сыворотку, при этом для увеличения протеалитической активности в качестве солевого питания используют карбонат натрия, а для увеличения амилолитической активности бикарбонат натрия.

Эти соли добавляют в количестве 1,5 — 2,5%.

Предложенный способ получения ферментчего препарата предусматривает двухступенчатое глубинное культивирование плесневых грибов Aspergillus oryzae 3 — 9 — 15.

В первой ступени глубинного культивирования микроорганизмов получают мицелии, ко5 торые используют в качестве посевного материала во второй ступени культивирования.

Посевной материал (мицелпй) получают следующим образом.

Чистую культуру плесневого гриба Asper10 gillus oryzae 3 — 9 — 15 поддерживают на сусловом arape (с 1,5 — 2,5% arapa). Посевным материалом служит водная суспензия конидий в количестве 2 — 4 лл на 100 ил среды (около

22 10 конидий).

15 Питательная среда при получении посевного материала (мицелия): 12 — 25% -ное сусло

80 — 90%, 5 — 10% -ная вытяжка из солодовых ростков 10 — 20%.

Время выращивания посевного материала

20 20 — 50 час при 28 — 30 С.

Основной питательной средой является сыворотка с содержанием 1,5 — 2,5% карбопата натрия.

Питательные среды стерилизуют прп 0,6 ати

25 в течение 30 мин.

Во второй ступени культивирования в основную питательную среду добавляют 3 — 8%,мицелия гриба от объема основной питательной среды. Культивирование ведут в течение не30 сколькпх суток при 28 — 30 С. Мицелпй от323528 фильтровывают или центрифугируют и культуральную жидкость используют без предварительной обработки в качестве ферментного препарата.

Основная питательная среда — молочная сыворотка и соль натрия.

При этом для получения препарата с усиленной протеолитической активностью в качестве соли натрия используют 1,5 — 2,0 /О карбоната натрия, а для получения препарата с повышенной амилолитической активностью

1,5 — 2,5О/О бикарбоната натрия.

Протеолитическую активность определяют по модифицированному методу Ансона, применяемому с небольшими изменениями.

Активность фермента оценивагот по колпчес1ву тирозина, содержащегося в продуктах гидролиза, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой. Тирозин определяют по интенсивности окраски, которую эта аминокислота дает с реактивом Фолина.

За единицу фермента (Е) принимают такое количество фермента, которое образует в течение одной минуты не осаждаемые трихлоруксусной кислотой продукты протеолиза, содержащие один микроэквивалент тирозина в принятых условиях опыта (время гидролиза

10 лшн при 30 С, субстрат 2 /о-ный раствор казеина в фосфатном буфере).

Протеолитическая активность (ПА) в 100лгл культуральной жидкости определяют по формуле

ПА= = Р 0442, 181.10 где ПА — протеолитическая активность (эквивалент тирозина /100 мл культ. жидк. мин), а — мкг тирозина, найденное по калибровочной кривой по разности между оптическими плотностями опытной и контрольной проб, 8 — множитель для пересчета количества тирозина на весь объем фильтрата, полученного после осаждения ТХУ, 181 — молекулярный вес тирозина (лгкг), 10 — продолжительность протеолиза (лгин), 100 — множитель для пересчета на

100мл культуральной жидкости, Р— разбавление культуральной жидкости перед определением.

Метод определения активности всего амилолитического комплекса основан на определении в продуктах ферментативного гпдролиза редуцирующих сахаров иодпым способом.

Проведение анализа.

В колбу на 100 мл вводят пипеткой 10 лгл

1 /о-ного раствора растворимого крахмала.

Затем ее помещают на 10 мин .в термостат с температурой 30 С. После этого в колбу вводят 1 мл раствора фермента, перемешивают и выдерживают в ультратермостате точно

l0 лгин. По истечении этого врсмени реакцию

65 приостанавливают, добавляя в реакционную смесь 5 лгл 0,3 н. раствора едкого калия. Затем в колбу добавляют еще 5 мл 0,1 н. раствора йода, закрывают ее стеклянной пробкой ,и выдерживают в течение 20 мин в темном месте.

По истечении этого времени в колбу вводят

2 лгл 1 и, раствора соляной кислоты и оттитровывают избыток йода 0,95 и. раствором гипосульфита.

Одновременно проводят контрольный опы г для определения редуцирующих сахаров в субстрате и в растворе фермента. Для этой цели в колбу вводят 10 мл субстрата, 5 лг.г

0,3 и. раствора и 5 лгл 0,1 и. раствора йода.

Ход дальнейшего анализа совпадает с вышеприведенным.

За единицу фермента (E) принимают такое количество фермента, которое расщепляет в течение 1 лгин один микроэквивалент гликозидных связей в крахмале в принятых условиях опыта.

Амилолитическая активность в 1 мл культуральной жидкости определяется по формуле (а1 — а ) 25 Р

АА=

10 где АА — амилолитическая активность (микроэквивалент гликозидных связей /1 лг.г культ. жидк. лгин.); аг — количество 0,05 и.. раствора гипосульфита, ушедшего на титрование контрольной пробы (мл); а — объем

0,05 и. раствора гипосульфита, ушедшего иа титрование опытной пробы (.мл); 25 — количество гликозидных связей, соответствующее

1 лгл 0,05 и. раствора гипосульфита (в мк эквивалентах); Р— разбавление культуральной жидкости перед определением.

За единицу амилолитической активности (АА) принято количество фермента, которое в определенных условиях (рН 4, 7, t 30 С, концентрация крахмала 1 /о) за одну минуту катализирует гидролиз 1 микроэквивалента гликозидных связей.

Пример. Питательную среду (25О/о-ное сусло 90/о, 10 /О-ная вытяжка из солодовых ростков 10/о) для получения посевного материала после стерилизации при 0,6 ати в течение 30 мин и охлаждения засевают водной суспензией конидий культуры Aspergillus

oryzae 3 — 9 — 15 в количестве 4 мл (20 10 конидий). Время выращивания посевного материала 24 час при 30 С. Культивирование ведут на качалке с 130 об/лгггн в конических колбах емкостью 500 лгл с содержанием питательной среды 100 мл. Основной питательной средой является сыворотка с добавкой 2О/о карбоната натрия. После стерилизации при

0,6 ати в течение 30 мин и охлаждения в основную питательную среду добавляют 5 /о мицелия от объема основной питательной среды.

Культивирование гриба ведут в течение

48 «ас при 30 С на качалке с 280 об/мин в конических колбах емкостью 500 мл с содержанием питательной среды 100 мл. Мицелий

320528

Предмет изобретения

Составитель В. Нижегородцева

Редактор Г. Бялобжеская Техред А. Камышникова Корректор Н. Рождественская

Заказ 3948/5 Изд. № 1755 Тираж 473 Подписное

Ц1Л1ЛИПИ Комитета по делам изобретепий п открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская паб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова 2 гриба отфильтровывают. Протеолитическая активность культуральной жидкости 20 Е/мя, Культуральную жидкость (2% от веса мяса) используют в качестве препарата для улучшения качества мяса, а именно ускорения его созревания и размягчения.

При производстве ферментного препарата с повышенной амилолитической активностью основной питательной средой является сыворотка с добавкой 2% бикарбоната натрия.

В охлажденную стерилизованную питательную среду добавляют 5% посевного материала.

Культивирование гриба ведут в течение

5 суток при 30 С на качалке с 280 об»иия в конических колоах емкостью 500 мл с содержанием питательной среды 100 ил. Мицелий гриба отфильтровывают.

Амилолитическая активность культуральной жидкости 50 Е/лл. Еультуральну1о жидкость используют в качестве препарата для улучшения качества пшеничного хлеба.

При добавлении культуральпой жидкости в тесто ускоряется процесс брожения теста, повышается пористость хлеба на 8% и удельнь1й объем на 20Я>, улучшаются вкусовые качества и аромат хлеба.

1. Способ получения комплекса амилолптнческих и протеолитических ферментов путем

10 выращивания их продуцентов Aspergil lus

oryzae 3 — 9 — 15 на питательной среде, содержащей соленое питание с последующим выделением мицелия из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью ускорения

15 процесса, в питательную среду вводят молочную сыворотку, при этом для увеличения протеолитиче=кой активности в качестве солевого питания используют карбонат натрия, а для увеличения амило Ièòè÷åñêîé активности

20 бнкар бои ат натрия.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что карбонат и бикарбонат натрия используют в количестве 1,5 — 2,5о!о.