Способ получения конидий гриба beauveria bassiana (bals.) vuill.всесоюзнаяпатентно-т?хн^"е:кдньиблмотека

 

СGQ> 6

30II42

ОПИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оюз Советских оциалистикеских

Республик

Зависимое от авт. свидетельства Хо

МПК А 01п 15/00

Заявлено 06.X.1969 (№ 1369820/30-15) с присоединением заявки М

Приоритет

Опубликовано 21.!Ч.1971. Бюллетень М 14

Дата опубликования описания 16.VI.1971

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете йииистров

СССР

УДК 632.937.14:576.8. .093.1 (088.8) Автор изобретения

В. М. Гораль

Заявитель Украинский научно-исследовательский институт защиты растений

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНИДИЙ ГРИБА

BEAUVERIA BASSIANA (BALS.) VUILL.

Известно несколько способов получения патогена для насекомых на основе гриба В. basяапа.

Использование в качестве патогена гонидий (бластоспор), образуемых этим грибом в глубинной культуре, несмотря на простоту способа их получения, не нашло практического применения, поскольку гонидии, являясь вегетативной формой размножения гриба, очень чувствительны к воздействию неблагоприятных внешних условий и менее патогенны, чем конидии, Поэтому в качестве патогена для насекомых, как правило, используют конидии, которые получают поверхностным:способом.

Известен также способ получения конидий гриба B. bassiana на поверхности жидкого питательного субстрата в стационарной культуре.

Суть известного способа заключается в следующем.

Некоторое количество зерна, например кукурузы, в течение 1 час кипятят в утроенном количестве воды, К отолученному отвару добавляют 1 сахара, 0,2 азотнокислого натрия (калия) или пептона и антибиотик (стрептомицин). Готовую среду слоем 5 — 7 см разливают в чистую посуду, которую закрывают бумагой, Среду обильно засевают конидиями гриба. Культивирование ведут при температуре 22 — 26 С. Через 14 — 20 дней на поверхности .питательной среды получают конидиальные пленки гриба, которые используют для приготовления препарата.

s Основными недостатками известного способа.получения конидий гриба В. bassiarIa я вляются низкая продуктивность, длительность процесса получения конидий, потребность в больших площадях для массового культиви10 рования гриба, высокая стоимость питательной среды, вероятносгь частых загрязнений последней посторонними микроорганизмами, обусловленная медленным ростом гриба и оказывающая отрицательное влияние на про1б дуктивность и вирулентность конидий, значительные затраты посевного .материала, большие затраты тепловой энергии на llpHIQTQBление среды, возможность возникновения аллергических явлений среди обслуживающего

20 персонала, связанная с поверхностным ростом гриба.

Перечисленные недостатки делают известный способ трудоемким и мало рентабельным.

Несовершенство известного способа получе25 ния конидий гриба В. bassiarIa препятствует организации промышленного производства препарата боверина.

Целью предлагаемого изобретения является повышение производительности и рентабель30 ности способа, улучшение санитарно-гигиенических условий труда.

301142

Эта цель достигается тем, что в отличие от известного способа конидии гриба получают непосредственно в жидкой питательной среде в глубинной культуре. Культивирование гриба до массового образования конидий ведут в стерильных условиях в течение 60 — 70 час при температуре 28 — 29 С и непрерывной аэрации, интенсивность которой в период массового конидиеобразования понижают, в оргапосинтетической среде с нейтральным или слабощелочным исходным рН, содержащей 2 /О сахара, 0,2 — 0,5 /О азотнокислого натрия, 0,2—

0,5 /О фосфорнокислого калия, 0,05 — 0,2 /О сернокислого иагния и не более 30 мг /О аминного азота, источником которого могут служить, B час IIOcTlI, К кУРУзный экстРакт IIvIII IIHBlloP. сусло. Густота засева конидиями питательной среды 0,5 — 1,5 млрд/л, рН среды около 8.

Содержание аминного азота в питательной среде является одним из факторов, влияющих на репродуктивное размножение гриба В. basяапа (образование конидий) в глубинной культуре.

Отсутствие в синтетической питательной среде аминного азота приводит к слабому разрастанию мицелия и незначительному конидиеобразованию (количество конидий не превышает 30 млн/мл).

Чрезмерное содержание аминного азота в питательной среде (более 30 мг /О) способствует вегетативному размножению гриба-образованию гонидий. На среде, содержащей

55 — 60 мгой амийного азота кукурузного экстракта (20/О), отмечается только образование гонидий. На среде с пивным суслом (35—

40 мг аминного азота) параллельно происходит образование конидий и гонидий.

Оптимальным содержанием в среде аминного азота, способствующим хорошему конидиеобразованию;при слабом образовании гоиндий, является 10 — 15 мг /О для пивного сусла и 4 — 10 мго/О для кукурузного экстракта.

В качестве пеногасителя применяют растительное масло. Масло в питательную среду вводят частями, по мере вспенивания питательной среды и потребления масла грибом, при этом общий расход масла не должен превышать 0,2 /О, в противном случае развитие гриба идет в сторону образования гонидий.

Питательную среду стер илизуют в ферментере при температуре 120 С в течение 30—

40 мин.

Для засева питательной среды готовят конидиальную суспензию, при этом в колбу с конидиями наливают стерильную воду и шуттелируют на качалке в течение 1 — 2 час для получения равномерной суапензии. Затем определяют титр суспензии и производят расчет посевного материала.

После охлаждения питательной среды ее засевают конидиальной суспензией гриба из расчета 0,5 — 1,5 млрд/л.

Культивирование гриба ведут при постоянной температуре 28 — 29 С и непрерывной при5

65 нудительной аэрации, интенсивность которой в период разрастания мицелия (Π— 20—

30 час) устанавливают равной 0,75 — 0,8 об.ьема воздуха на 1 объем аэрируемой среды в

1 мин при механическом перемешивании среды. В период образования конидий интенси.вность аэрации понижают до 0,3 — 0,4 объема воздуха на 1 объем аэрируемой среды в 1 мин без механического перемешивания среды. Такой режим аэрации благоприятствует образованию конидий.

При культивировании гриба ведут обычный микроскопический контроль чистоты культуры и степени развития гриба.

В начальный период культивирования происходит прорастание конидий и разрастание мицелия, количество которото через 20 — 30 час достигает 6 — 8 г на 1 л среды. Затем на мицелии образуются бутылевидные конидиеносцы, расширенные у основания и вытянутые к вершине в виде тонкого волокна. Конидии вначале образуются на дистальном конце конидиеносца, а затем на небольших боковых стеригмах.

Форма конидий округлая, размер 2,8х, )(4,0 мкм. Характер образования конидий в глубинной культуре не отличается от образования их на поверхности питательного субстрата. Форма и размер конидий такие же, как и при образовании их на поверхности.

В отличие от конидий гонидии образуются путем отчленения от мицелия боковых отростков или расчленения мицелия. Форма гонидий цилиндрическая, размеры (5 — 7) Q (7— — 14) мкм.

Культивирование заканчивают, когда количество конидий в культуральной жидкости достигнет максимума, т. е. когда дальнейшее продуцирование их прекращается. При этом отмечается частичный автолиз мицелиальных клеток, количество которых постепенно уменьшается.

Предлагаемый способ получения конидий гриба В. bassiaIIa апробирован в лабораторных условиях. Ниже приведены результаты этих испытаний.

Пример 1. Культивирование гриба вели в среде, содержащей 25 пивного сусла, 0,2% фосфорнокислого калия, 0,05 /О сернокислого магния и более 30 мг аминного азота (последнее определяли формольным титрованием). Исходное рН среды было 6,0. Культивирование вели при температуре 28 С и постоянной аэрации. Через 90 час культивирования титр конидий составлял 46 млн/мл, гонидий—

128,75 млн/мл.

В данном случае гриб одновременно продуцировал два типа клеток, что объясняется большим содержанием аминного азота в среде.

Полученные клетки (кон идии и гонидии) отделяли от культуральной жидкости и определяли вирулентность их по смертности гусениц яблонной плодожорки V возраста. Смертность насекомых при дозе 100 тыс. клеток на одну

301142 особь составляла на 15-й день 13 /о, на 30-й день — 250, в варианте с заражением гусениц поверхностными конидиями — соответственно 65 и 88 /о.

Приведенные данные показывают, что в среде с большим содержанием пивного сусла происходит одновременно образование конидий и гонидий, вирулентность полученного на такой среде материала была ниже вирулентности поверхностных конидий.

Пример 2. Культивирование гриба вели на среде, содержащей 0,5 /о азотнокислого натрия, 0,5 /о фосфорнокислого калия, 0,2 /О сернокислого магния, 2 /о сахара, 0,4 /о кукурузного экстракта и 8 мг /о аминного азота.

Культивирование вели в течение 80 час при тех же условиях, что и в предыдущем примере. Образование конидий в этом случае было преобладающим, и к концу культивирования количество их достигло 2040 млн/мл, гонидий при этом было 184 млн/мл.

При мер 3. Культивирование вели на среде, содержащей 0,5 /о азотнокислого натрия, 0,5 /о фосфорнокислого калия, 0,2 /о сернокислого магния, 2 сахара, 2 /о пивного сусла и

12,5 мг /о аминното азота (последнее определяли формольным титрованием). Исходное рН среды 8,1, густота засева конидиями

0,75 млрд/л, температура культивирования

28 С. В течение первых 30 час культивирования интенсивность аэрации была 0,8 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин с механическим перемешиванием среды, затем ее понизили до 0,4 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин без механического перемешивания среды. Через 68 час культивирования количество конидий достигло 456 млн/мл, количество гонидий было 0,5 млн/мл. При дальнейшем культивировании титр конидий не увеличивался.

Выход стандартного препарата с 50 л ферментера составил 15,2 кг.

Полученные предлагаемым способом конидии хранили и испытывали на жизнеспособность и вирулентность в двух формах — жидкой и сухой.

Жидкая форума представляла собой конидии в культуральной жидкости, сухая форма— конидии, отделенные от культуральной жидкости путем сепарирования и высушенные при температуре 30 С.

Сопоставление в процессе хранения жизнеспособности конидий, полученных предлагаемым и известным способами, показало, что через пять месяцев хранения в обоих случаях процент жизнеспособных конидий был одинаков.

Токсикологическая оценка ко индий, полученных в глубинной культуре, приведена в таблице.

Из данных таблицы видно, что при дозированном заражении насекомых конидии, полученные предлагаемым способом, по вирулентности не уступали конидиям, полученным известным способом, в отношении гусениц яб5

60 65 лонной плодожорки и имаго клопа — вредной черепашки; в отношении личинок колорадского жука глубинные конидии уступали по,вирулентности поверхностным. Однако при обработке корма глубинными конидиями, сохранявшимися в жидкой форме в течение четырех месяцев, отмечена высокая смертность личинок колорадского жука III † возраста (93,3 / ).

Изменение вирулентности конидий в процессе хранения показано в таблице.

Из таблицы видно, что конидии, полученные как поверхностным, так и глубинным способом, через пять месяцев хранения в равной степени патогенны для насекомых.

Сухие гонидии,,высушенные при температуре 30" С, практически не обладали патогенными свойствами — смертность имаго клопа— вредной черепашки при дозировке 16,6 млн на одну особь на 18-й день опыта составила 18% и не отличалась от естественной смертности в контроле.

Хранение гонидий в жидкой форме в лабораторных условиях (температура 15 — 22" C) не представлялось возможным, поскольку происходило образование грибной конидиальной пленки на поверхности культуральнои жидкости, что исключало, возможность инфицирования насекомых гонидиями.

Проведенные опьгты показали, что конидии, полученные предлагаемым способом, по показателям вирулентности и продолжительности хранения не отличались от конидии, полученных известным способом; гонидии по этим показателям значительно уступали конидиям.

Предлагаемый способ прост в осуществлении и не требует специального оборудования.

Он может быть осуществлен на люоом предприятии, выпускающем микробные препараты.

Сравнительные технико-экономические показатели известного и предлагаемого способов получения конидий гриба В. Ьазыапа приведены ниже.

Основными достоинствами предлагаемого способа в сравнении с известным являются получение конидий непосредственно в глубинной культуре, уменьшение вероятности загрязнения питательной среды посторонними микроорганизмами, улучшение санитарно-гигиенических условий труда, поскольку культивирование гриба проводят в закрытых ферментерах.

Использование предлагаемого спо:оба позволяет сократить продолжительность получения конидий в 5 — 8 раз, повысить продуктивность в 6 — 46 раз, повысить производительность способа в 26 — 300 раз, понизить стоимость питательной среды в 2 — 4 раза, понизить расход посевного материала в 18 раз, снизить затраты тепловой энергии в 5—

44 раза.

Все это дает возможность использовать предлагаемый способ в промышленных масштабах.

301142

Способ известный предлагаемый

60 — 70

500 — 2000

336 — 480

43 — 90

Продолжительность способа, час

Выход конидий (продуктивность), млрд/л

Выход стандартного препарата, содержагцего 1,5млрд конидий в 1 г, кг/л

Густота засева, млрд/и

Стоимость 1 л среды, кои.

Производительность, млрд/л. час

Коэффициент воспроизведения (отношение продуктивности к густоте засева)

Часовой коэффициент воспроизведения (отношение производительности к густоте засева), час

Затраты тепловой энергии на приготовление 1 л среды (без учета теплопотерь), ккал

Расход тепловой энергии на получение 1 млрд конидий, ккал

0 03 — 0 06

5 — 8

5 — 7

0,09 — 0,27

0,33 — 1,33

0,5 — 1 5

1,5 — 3,0

7 — 27

5,4 — 18,0

0,011 — 0,054

333 — 4000

4,6 — 66,5

95,7

2,22 — 1,06

0,2 — 0,05

Сравнительные показатели вирулентности конидий гриба В. bassiana.

Смертность насекомых, ой

Х v о О.

Cg о,s@

yC K

Р м

O ао

Для образца, полученного глубинным способом и сохраняемого в

Ю о о. ж о

Дни

Инфицированное насекомое

Для образца, полученного известным способом, при дозе сухой форме при дозе жидкой форме при дозе учета

10 | 10 10 (10

104 (106 I 1Pe f 107

10 I 10 I 10s I 10

Гусеницы яблон ной плодожорки Ъ возраста после зимовки

0,5

12

34

7

13

7

13

27

3

7

37

Личинки колорадского жука IV возраста

После раскопки

100

100

20 60

20

30

40

Имаго клопа — вредной черепашки перед зимовкой

19

0

0

37

42

63

63

13

13

0

8

П р и м е ч а н и е. Образцы, полученные предлагаемым и известным способами, хранились в лабораторных условиях при температуре 15 — 22 С.

Предмет изобретения

ЦНИИПИ Заказ 1531;2 Изд. № 660 Тираж 473 Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

1. Способ получения конидий гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. путем его культивирования на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей в аэробных условиях, отличающийся тем, что, с целью повышения продуктивности культуры и снижения затрат труда, культивирование гриба ведут глубинным методом при нейтральной или слабощелочной реакции среды, причем питательная среда содержит 0,2 — 0,5% азотнокислого натрия, 0,2—

0,5% фосфорнокислого калия, 0,05 — 0,2% сернокислого магния, 2,0% сахара и не более

55 30 мг% аминного азота.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что н качестве аминного азота берут пивное сусло и/или кукурузный экстракт.

60 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование ведут при температуре 28—

29 С.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аэрацию среды снижают в период массового

65 образования конидий.