Олигонуклеотиды для понижения экспрессии pd-l1

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам (олигомерам), которые являются комплементарными лиганду-1 запрограммированной смерти (PD-L1), приводящим к понижению экспрессии PD-L1 в печени. Настоящее изобретение также относится к способу облегчения исчерпания Т-клеток, вызванного инфекцией печени или раком в печени. Релевантными инфекциями являются хронические инфекции HBV (вирус гепатита В), HCV (вирус гепатита С) и HDV (вирус гепатита D) и паразитарные инфекции, подобные малярии и токсоплазмозу (например, вызванные протистами Plasmodium, в частности, видами P. vivax, P. malariae и P. falciparum).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно то, что костимулирующий путь, состоящий из рецептора запрограммированной смерти-1 (PD-1) и его лиганда - PD-L1 (или B7-H1, или CD274) - непосредственно способствует исчерпанию Т-клеток, приводящему к отсутствию контроля за вирусами во время хронических инфекций печени. Путь PD-1 также играет роль в автоиммунитете, так как у мышей с нарушениями данного пути развиваются аутоиммунные заболевания.

Было показано то, что антитела, которые блокируют взаимодействие между PD-1 и PD-L1, усиливают ответы Т-клеток, в частности, ответ цитотоксических Т-клеток CD8+ (см. Barber et al 2006 Nature Vol 439 p682 и Maier et al 2007 J. Immunol. Vol 178 p 2714).

В WO 2006/042237 описан способ диагностики рака посредством оценки экспрессии PD-L1 (B7-H1) в опухолях и предложена доставка пациенту агента, который препятствует взаимодействию PD-1/PD-L1. Препятствующими агентами могут быть антитела, фрагменты антител, миРНК (малая интерферирующая РНК) или антисмысловые олигонуклеотиды. Нет ни конкретных примеров таких препятствующих агентов, ни какого-либо упоминания хронических инфекций печени.

Опосредованное РНК-интерференцией ингибирование PD-L1 с использованием двухцепочечных молекул РНК (дцРНК, РНКи или миРНК) также было раскрыто, например, в WO 2005/007855, WO 2007/084865 и US 8507663. Ни в одной из них не описана таргетная доставка в печень.

В Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 описана доставка in vivo молекул миРНК, нацеленных на PD-L1, в клетки Купфера, усиливая, посредством этого клиренс клетками NK (природная клетка-киллер) и Т-клетками CD8+ у мышей, инфицированных MCMV (мышиный цитомегаловирус). В данной статье делается заключение о том, что молекулы миРНК, нацеленные на PD-L1, доставленные в гепатоциты, не являются эффективными в отношении усиления эффекторной функции Т-леток CD8+.

Подход с миРНК значительно отличается от подхода с одноцепочечными антисмысловыми олигонуклеотидами, так как биораспределение и механизмы действия являются совершенно разными. Как описано в Xu et al 2003 Biochem. Biophys. Res. Comm. том 306, страницы 712-717, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК имеют разные предпочтения в отношении сайтов-мишеней в мРНК.

В WO 2016/138278 описано ингибирование иммунных контрольных точек, включая PD-L1, с использованием двух или более чем двух одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов, которые связаны на их 5'-концах. В данной заявке не упоминается HBV или таргетная доставка в печень.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении идентифицированы новые олигонуклеотиды и конъюгаты олигонуклеотидов, которые очень эффективно понижают уровень мРНК PD-L1 в клетках печени - как в паренхимных (например, гепатоциты), так и в непаренхимных клетках, таких как клетки Купфера и синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSEC). Посредством понижения или сайленсинга PD-L1 олигонуклеотиды и конъюгаты олигонуклеотидов уменьшают опосредованное PD-1 ингибирование и, посредством этого, активизируют иммуностимуляцию истощенных Т-клеток. Облегчение исчерпания Т-клеток при хронической патогенной инфекции печени будет приводить к возобновленному иммунному контролю и пониженным уровням вирусных антигенов в крови во время хронической патогенной инфекции печени. Клетки природные киллеры (NK) и Т-клетки природные киллеры (NKТ) также могут активироваться олигонуклеотидами и конъюгатами олигонуклеотидов по настоящему изобретению.

Конъюгаты олигонуклеотидов обеспечивают местное снижение уровня PD-L1 в клетках печени и, следовательно, уменьшают риск аутоиммунных побочных эффектов, таких как пневмонит, невирусный гепатит и колит, ассоциированный с системным исчерпанием PD-L1.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам или их конъюгатам, нацеленным на нуклеиновую кислоту, способным модулировать экспрессию PD-L1 и лечить или предупреждать заболевания, связанные с функционированием PD-L1. Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, в частности, могут использоваться для лечения заболеваний, при которых был истощен иммунный ответ против инфекционного агента.

Соответственно, в первом аспекте изобретения предложены олигонуклеотиды, которые содержат непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью к нуклеиновой кислоте мишени PD-L1. Данный олигонуклеотид может представлять собой антисмысловой олигонуклеотид, предпочтительно с гэпмерной конструкцией. Предпочтительно данный олигонуклеотид способен ингибировать экспрессию PD-L1 посредством расщепления нуклеиновой кислоты-мишени. Расщепление предпочтительно достигается посредством рекрутирования нуклеазы.

В другом аспекте данный олигонуклеотид конъюгирован с по меньшей мере одной конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, такой как конъюгатная группировка, содержащая по меньшей мере одну N-ацетилгалактозаминную (GalNAc) группировку. Конъюгатная группировка и олигонуклеотид могут быть связаны друг с другом посредством линкера, в частности, биорасщепляемого линкера.

В другом аспекте согласно изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по изобретению и фармацевтически приемлемые разбавители, носители, соли и/или адъюванты.

В другом аспекте согласно изобретению предложены способы in vivo или in vitro для понижения экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспрессирует PD-L1, посредством введения в указанную клетку олигонуклеотида или композиции по изобретению в эффективном количестве.

В другом аспекте согласно изобретению предложены олигонуклеотиды, конъюгаты олигонуклеотидов или фармацевтические композиции для применения в восстановлении иммунитета против вируса или паразита.

В другом аспекте согласно изобретению предложены олигонуклеотиды, конъюгаты олигонуклеотидов или фармацевтические композиции для применения в качестве лекарственного средства.

В другом аспекте согласно изобретению предложены способы лечения или предупреждения заболевания, расстройства или дисфункции посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида по изобретению субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию, расстройству или дисфункции, в частности, к заболеваниям, выбранным из вирусных инфекций печени или паразитарных инфекций.

В другом аспекте олигонуклеотид, конъюгаты олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению используются для лечения или предупреждения вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV, или паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, или рака печени, или метастазов в печени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: иллюстрирует типичные конъюгаты антисмыслового олигонуклеотида, где данный олигонуклеоид либо представлен волнистой линией (А-Г), либо как «олигонуклеотид» (Д-З), либо как Т₂ (И), а конъюгатные группировки, нацеленные на рецептор асиалогликопротеина, представляют собой трехвалентные N-ацетилгалактозаминные группировки. Соединения А-Г содержат дилизиновую разветвляющую молекулу, ПЭГ3 спейсер и три концевые GalNAc углеводные группировки. В соединении А и Б олигонуклеотид непосредственно присоединен к конъюгатной группировке, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, без линкера. В соединении В и Г олигонуклеотид непосредственно присоединен к конъюгатной группировке, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, через С6 линкер. Соединения Д-И содержат утраивающую разветвляющую молекулу, спейсеры варьирующей длины и структуры, и три концевые GalNAc углеводные группировки.

Фиг. 2: график, демонстрирующий ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) (А) и нокдаун PD-L1 как % от воздействия физиологическим раствором (Б) для соединений, протестированных в Примере 2, в связи с их положением на нуклеиновой кислоте-мишени. Клеточными линиями, в которых тестировали данное соединение, были и

Фиг. 3: структурная формула трехвалентного GalNAc кластера (GN2). GN2 является полезным в настоящем изобретении в качестве конъюгатной группировки. Волнистая линия иллюстрирует сайт конъюгирования данного кластера, например, с С6 аминолинкером или непосредственно с олигонуклеотидом.

Фиг. 4: структурная формула CMP ID NO 766_2.

Фиг. 5: структурная формула CMP ID NO 767_2.

Фиг. 6: структурная формула CMP ID NO 768_2.

Фиг. 7: структурная формула CMP ID NO 769_2.

Фиг. 8: структурная формула CMP ID NO 770_2.

Фиг. 9: вестерн-блот, выявляющий экспрессию белка PD-L1 в печени от животных, индуцированных поли(IC), после обработки физиологическим раствором и указанными CMP ID NO. Каждый блот показывает голый олигонуклеотид относительно версии того же самого олигонуклеотида, конъюгированной с GalNAc, блот А) CMP ID NO 744_1 и 755_2, Б) CMP ID NO 747_1 и 758_2, В) CMP ID NO 748_1 и 759_2, Г) CMP ID NO 752_1 и 763_2, и Д) CMP ID NO 753_1 и 764_2. Верхняя полоса представляет собой контроль загрузки - винкулин, нижняя полоса представляет собой белок PD-L1. Первая дорожка в каждом блоте демонстрирует мышей, обработанных физиологическим раствором, без индукции поли(IC). Данные мыши экспрессируют очень мало белка PD-L.

Фиг. 10: популяция одноядерных клеток в печени после обработки носителем (группа 10 и 1), ДНК-вакциной (группа 11 и 2), антителом против PD-L1 (группа 12), голым АСО (антисмысловой олигонуклеотид) против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлена для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблица 18). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05; *** - Р меньше 0,001, и **** Р меньше 0,0001). А) представляет число Т-клеток в печени после обработки. Б) представляет долю Т-клеток CD4+, и В) представляет долю Т-клеток CD8+.

Фиг. 11: модуляция PD-L1-позитивных клеток в печени после обработки носителем (группа 10 и 1), ДНК-вакциной (группа 11 и 2), антителом против PD-L1 (группа 12), голым АСО против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлена для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблицу 19). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05 и **** - Р меньше 0,0001). А) представляет процентную долю Т-клеток CD8+, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки. Б) представляет процентную долю Т-клеток CD4+, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки, и В) представляет процентную долю В-клеток, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки.

Фиг. 12: специфичные в отношении антигена HBV цитокин-секретирующие клетки CD8+ после обработки носителем (группа 10 и 1), ДНК-вакциной (группа 11 и 2), антителом против PD-L1 (группа 12), голым АСО против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлены для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблицу 20). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05). А) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ (интерферон-гамма) Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении антигена PreS2+S HBV, после обработки. Б) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении корового антигена HBV, после обработки, и В) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ и TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа) Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении антигена PreS2+S HBV, после обработки.

Фиг. 13: ДНК HBV, HВsAg и HВeAg у мышей AAV/HBV после обработки антисмысловым CMP NO: 759_2 против PD-L1, конъюгированным с GalNAc , по сравнению с носителем . Вертикальная линия показывает конец обработки.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Олигонуклеотид

Термин «олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется таким образом, как обычно понятно специалисту, как молекула, содержащая два или более чем два ковалентно связанных нуклеозида. Такие ковалентно связанные нуклеозиды также могут называться молекулами нуклеиновой кислоты или олигомерами. Олигонуклеотиды обычно получают в лаборатории посредством твердофазного химического синтеза с последующей очисткой. При ссылке на последовательность олигонуклеотида, делается ссылка на последовательность или порядок группировок нуклеиновых оснований или их модификаций ковалентно связанных нуклеотидов или нуклеозидов. Олигонуклеотид по изобретению является искусственным, синтезируется химически и типично очищается или выделяется. Олигонуклеотид по изобретению может содержать один или более чем один модифицированный нуклеозид или нуклеотид.

Антисмысловые олигонуклеотиды

Термин «антисмысловой олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется как олигонуклеотид, способный модулировать экспрессию гена-мишени посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, в частности с непрерывной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды по существу не являются двухцепочечными и, следовательно, не являются миРНК. Предпочтительно антисмысловые олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются одноцепочечными.

Непрерывная нуклеотидная последовательность

Термин «непрерывная нуклеотидная последовательность» относится к области олигонуклеотида, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени. Данный термин используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «непрерывная последовательность нуклеиновых оснований» и термином «последовательность олигонуклеотидного мотива». В некоторых воплощениях все нуклеотиды данного олигонуклеотида составляют непрерывную нуклеотидную последовательность. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность и, возможно, может содержать дополнительный(ные) нуклеотид(ды), например, область нуклеотидного линкера, которая может использоваться для присоединения функциональной группы к непрерывной нуклеотидной последовательности. Область нуклеотидного линкера может быть или может не быть комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Нуклеотиды

Нуклеотиды представляют собой структурные элементы олигонуклеотидов и полинуклеотидов и для целей настоящего изобретения включают и встречающиеся в природе, и не встречающиеся в природе нуклеотиды. В природе нуклеотиды, такие как нуклеотиды ДНК и РНК, содержат группировку сахара рибозы, группировку нуклеинового основания и одну или более чем одну фосфатную группу (которая отсутствует в нуклеозидах). Нуклеозиды и нуклеотиды также могут взаимозаменяемо называться «звеньями» или «мономерами».

Модифицированный нуклеозид

Термин «модифицированный нуклеозид» или «модификация нуклеозида» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеозидам, модифицированным по сравнению с эквивалентным нуклеозидом ДНК или РНК посредством введения одной или более чем одной модификации сахарной группировки или группировки (нуклеинового) основания. В предпочтительном воплощении модифицированный нуклеозид содержит модифицированную сахарную группировку. Термин «модифицированный нуклеозид» также может использоваться в данном документе взаимозаменяемо с термином «аналог нуклеозида» или модифицированные «звенья» или модифицированные «мономеры».

Модифицированная межнуклеозидная связь

Термин «модифицированная межнуклеозидная связь» определяется так, как обычно понятно специалисту: как связи, отличные от фосфодиэфирных (РО) связей, которые ковалентно связывают вместе два нуклеозида. Нуклеотиды с модифицированными межнуклеозидными связями также называются «модифицированными нуклеотидами». В некоторых воплощениях модифицированная межнуклеозидная связь увеличивает устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе по сравнению с фосфодиэфирной связью. Для олигонуклеотидов, встречающихся в природе, межнуклеозидная связь включает фосфатные группы, создающие фосфодиэфирную связь между соседними нуклеозидами. Модифицированные межнуклеозидные связи являются особенно полезными в стабилизации олигонуклеотидов для применения in vivo, и они могут служить для защиты против нуклеазного расщепления в областях нуклеозидов ДНК или РНК в олигонуклеотиде по изобретению, например в пределах области гэпа (gap) гэпмерного олигонуклеотида, а также в областях модифицированных нуклеозидов.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит одну или более чем одну межнуклеозидную связь, модифицированную от природного фосфодиэфира до связи, которая, например, является более устойчивой к нуклеазной атаке. Устойчивость к нуклеазе можно определять посредством инкубирования олигонуклеотида в сыворотке крови или посредством применения анализа устойчивости к нуклеазе (например, фосфодиэстеразе яда змеи (SVPD)), которые оба хорошо известны в данной области. Межнуклеозидные связи, которые способны усиливать устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе, называются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. Будет понятно то, что в некоторых воплощениях нуклеозиды, которые связывают олигонуклеотид по изобретению с ненуклеотидной функциональной группой, такой как конъюгат, могут содержать фосфодиэфир. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями.

Модифицированные межнуклеозидные связи могут быть выбраны из группы, содержащей фосфоротиоат, дифосфоротиоат и боранофосфат. В некоторых воплощениях модифицированные межнуклеозидные связи, например, фосфоротиоатная, дифосфоротиоатная или боранофосфатная, являются совместимыми с рекрутированием олигосахаридом по изобретению РНКазы Н.

В некоторых воплощениях межнуклеозидная связь, такая как фосфоротиоатная межнуклеозидная связь, содержит серу (S).

Фосфоротиоатная межнуклеозидная связь является особенно полезной из-за устойчивости к нуклеазе, полезной фармакокинетики и легкости получения. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат, как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит одну или более чем одну нейтральную межнуклеозидную связь, в частности, межнуклеозидную связь, выбранную из фосфотриэфира, метилфосфоната, MMI, амида-3, формацеталя или тиоформацеталя.

Дополнительные межнуклеозидные связи раскрываются в WO2009/124238 (включенной в данный документ посредством ссылки). В одном воплощении межнуклеозидная связь выбрана из линкеров, раскрытых в WO2007/031091 (включенной в данный документ посредством ссылки). В частности, межнуклеозидная связь может быть выбрана из -O-P(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -S-P(O)₂-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)₂-O-, -O-P(O)₂-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)₂-S-, -O-PO(R^H)-O-, 0-PO(OCH₃)-0-, -O-PO(NR^H)-O-, -O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-, -O-PO(BH₃)-O-, -O-PO(NHR^H)-O-, -O-P(O)₂-NR^H-, -NR^H-P(O)₂-O-, -NR^H-CO-O-, -NR^H-CO-NR^H-, и/или межнуклеозидный линкер может быть выбран из группы, состоящей: -O-CO-O-, -O-CO-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-, -O-CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -CO-NR^H-CH₂-, -CH₂-NR^HCO-, -O-CH₂-CH₂-S-, -S-CH₂-CH₂-O-, -S-CH₂-CH₂-S-, -CH₂-SO₂-CH₂-, -CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-CO -, -CH₂-NCH₃-O-CH₂-, где R^H выбран из водорода и C1-4-алкила.

Нуклеазоустойчивые связи, такие как фосфотиоатные связи, являются особенно полезными в областях олигонуклеотидов, способных рекрутировать нуклеазу, при формировании дуплекса с нуклеиновой кислотой-мишенью, таких как область G для гэпмеров или немодифицированная область нуклеозидов хэдмеров (headmer) и тэйлмеров (tailmer). Однако, фосфоротиоатные связи могут быть также полезными в областях, не рекрутирующих нуклеазу, и/или в областях, усиливающих аффинность, таких как области F и F' для гэпмеров, или в области модифицированных нуклеозидов хэдмеров и тэйлмеров.

Каждая из сконструированных областей может, однако, содержать межнуклеозидные связи, отличные от фосфоротиоатных, такие как фосфодиэфирные связи, в частности, в областях, где модифицированные нуклеозиды, такие как LNA (запертые нуклеиновые кислоты), защищают связь от нуклеазной деградации. Включение фосфодиэфирных связей, как, например, одной или двух связей, в частности между или рядом с модифицированными нуклеозидными звеньями (типично в областях, не рекрутирующих нуклеазу), может модифицировать биодоступность и/или биораспределение олигонуклеотида - см. WO2008/113832, включенную в данный документ посредством ссылки.

В одном воплощении все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. Предпочтительно все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные связи.

Нуклеиновое основание

Нуклеиновое основание включает пуриновую (например, аденин и гуанин) и пиримидиновую (например, урацил, тимин и цитозин) группировку, присутствующую в нуклеозидах и нуклеотидах, которые образуют водородные связи при гибридизации нуклеиновых кислот. В контексте настоящего изобретения термин нуклеиновое основание также охватывает модифицированные нуклеиновые основания, которые могут отличаться от встречающихся в природе нуклеиновых оснований, но являются функциональными во время гибридизации нуклеиновых кислот. В данном контексте термин «нуклеиновое основание» относится и к встречающимся в природе нуклеиновым основаниям, таким как аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин, также как и к не встречающимся в природе вариантам. Такие варианты, например, описываются в Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.

В некоторых воплощениях группировка нуклеинового основания модифицируется заменой пурина или пиримидина на модифицированный пурин или пиримидин, такой как замещенный пурин или замещенный пиримидин, как, например, нуклеиновое основание, выбранное из изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-метилцитозина, 5-тиозолоцитозина, 5-пропинилцитозина, 5-пропинилурацила, 5-бромурацил-5-тиазолоурацила, 2-тиоурацила, 2'-тиотимидина, инозина, диаминопурина, 6-аминопурина, 2-аминопурина, 2,6-диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина.

Группировки нуклеиновых оснований могут быть указаны буквенным кодом для каждого соответствующего нуклеинового основания, например, A, T, G, C или U, где каждая буква возможно может включать модифицированные нуклеиновые основания с эквивалентной функцией. Например, в проиллюстрированных в качестве примеров олигонуклеотидах группировки нуклеиновых оснований выбраны из A, T, G, C и 5-метилцитозина. Возможно для гэпмеров LNA можно использовать 5-метилцитозин нуклеозидов LNA.

Модифицированный олигонуклеотид

Термин «модифицированный олигонуклеотид» описывает олигонуклеотид, содержащий один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром и/или модифицированными межнуклеозидными связями. Термин «химерный олигонуклеотид» представляет собой термин, который использовали в литературе для описания олигонуклеотидов с модифицированными нуклеозидами.

Комплементарность

Термин «комплементарность» описывает способность нуклеозидов/нуклеотидов к образованию пар оснований по Уотсону-Крику. Парами оснований по Уотсону-Крику являются гуанин (G)-цитозин (С) и аденин (А)-тимин (Т)/урацил (U). Будет понятно то, что олигонуклеотиды могут содержать нуклеозиды с модифицированными нуклеиновыми основаниями, например, 5-метилцитозин часто используется вместо цитозина, и термин «комплементарность» как таковой охватывает образование пар оснований по Уотсону-Крику между немодифицированными и модифицированными нуклеиновыми основаниями (см., например, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).

Термин «% комплементарности» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде) в процентах, которые, в данном положении, являются комплементарными (т.е. образуют пары оснований по Уотсону-Крику) в данном положении непрерывной нуклеотидной последовательности отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается подсчетом числа выровненных оснований, которые образуют пары между двумя последовательностями (при выравнивании с использованием последовательности-мишени 5'-3' и последовательности олигонуклеотида от 3' к 5'), деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100. При таком сравнении нуклеиновое основание/нуклеотид, который не выравнивается (не образует пару оснований), называется несоответствием.

Термин «полностью комплементарный» относится к 100%-ной комплементарности.

Следующее представляет собой пример олигонуклеотида (SEQ ID NO: 5), который является полностью комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени (SEQ ID NO: 772).

5'gcagtagagccaatta3' (SEQ ID NO:772)

3'cgtcatctcggttaat5' (SEQ ID NO: 5)

Идентичность

Термин «идентичность» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов в процентах непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде), которые в данном положении являются идентичными (т.е. по их способности образовать пары оснований по Уотсону-Крику с комплементарным нуклеозидом) непрерывной нуклеотидной последовательности в данном положении отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается посредством подсчета числа выровненных оснований, которые являются идентичными между двумя последовательностями, включая пробелы, деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100.

Процент идентичности = (Соответствия × 100)/Длину выровненной области (с пробелами).

Гибридизация

Термин «осуществление гибридизации» или «гибридизуется» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как две нити нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень), образующие водородные связи между парами оснований на противоположных нитях, формируя, посредством этого, дуплекс. Аффинность связывания между двумя нитями нуклеиновой кислоты представляет собой силу гибридизации. Она часто описывается в показателях температуры плавления (T_m), определенной как температура, при которой половина олигонуклеотидов образует дуплекс с нуклеиновой кислотой-мишенью. При физиологических условиях T_m не является строго пропорциональной аффинности (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). Свободная энергия Гиббса в стандартном состоянии - ΔG° - является более точным представлением аффинности связывания и связана с константой диссоциации (K_d) реакции согласно уравнению ΔG° = -RTln(K_d), где R представляет собой газовую постоянную, и Т представляет собой абсолютную температуру. Следовательно, очень низкая ΔG° реакции между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью отражает сильную гибридизацию между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. ΔG° представляет собой энергию, связанную с реакцией, где концентрации в воде составляют 1 М, рН составляет 7, и температура составляет 37°С. Гибридизация олигонуклеотидов с нуклеиновой кислотой-мишенью представляет собой спонтанную реакцию, и для спонтанных реакций ΔG° меньше, чем ноль. ΔG° можно измерять экспериментально, например, посредством применения способа изотермической титрационной калориметрии (ITC), как описано в Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 и Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. Специалисту будет известно, что доступно имеющееся в продаже оборудование для измерений ΔG°. ΔG° также можно оценивать численно посредством применения модели ближайшего соседа, как описывается SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465, с использованием подходящим образом выведенных термодинамических параметров, описанных Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 и McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Для того чтобы иметь возможность модулирования их намеченной нуклеиновой кислоты-мишени посредством гибридизации, олигонуклеотиды по настоящему изобретению гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше -41,8 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 10-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях степень или сила гибридизации измеряется посредством свободной энергии Гиббса в стандартном состоянии - ΔG°. Олигонуклеотиды могут гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше интервала -41,8 кДж, как, например, меньше -62,8 кДж, как, например, меньше -83,7 кДж и как, например, меньше -104,6 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 8-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочным значением ΔG° от -41,8 до -251 кДж, как, например, от -50,2 до -167,4 кДж, как, например, от -62,8 до -125,5 кДж или от -66,9 до 113 кДж, как, например, от -75,3 до -104,6 кДж.

Нуклеиновая кислота-мишень

Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота-мишень представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует PD-L1 млекопитающего и может представлять собой, например, ген, РНК, мРНК и пре-мРНК, зрелую мРНК или последовательность кДНК. Следовательно, данная мишень может называться нуклеиновая кислота-мишень PD-L1. Олигонуклеотид по изобретению, например, может быть нацелен на области экзонов PD-L1 млекопитающего, или, например, может быть нацелен на область интрона пре-мРНК PD-L1 (см. Таблицу 1).

Таблица 1: экзоны и интроны человеческого PD-L1

Подходящим образом, нуклеиновая кислота-мишень кодирует белок PD-L1, в частности PD-L1 млекопитающего, такой как PD-L1 человека (см., например, Таблицы 2 и 3, в которых приводится ссылка на последовательности мРНК и пре-мРНК для человеческого, обезьяньего и мышиного PD-L1). В контексте настоящего изобретения пре-мРНК также считается нуклеиновой кислотой, которая кодирует белок.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2 и 3 или их встречающихся в природе вариантов (например, последовательностей, кодирующих белок PD-L1 млекопитающего).

При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, происходящую из ДНК или РНК.

Для применения in vivo или in vitro олигонуклеотид по изобретению типично способен ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени PD-L1 в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень PD-L1. Непрерывная последовательность нуклеиновых оснований олигонуклеотида по изобретению типично комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1 при измерении по длине олигонуклеотида, возможно, за исключением одного или двух несоответствий, и, возможно, исключая линкерные области на основе нуклеотидов, которые могут связывать олигонуклеотид с возможной функциональной группой, такой как конъюгат или другие некомплементарные концевые нуклеотиды (например, область D' или D''). Нуклеиновая кислота-мишень в некоторых воплощениях может представлять собой РНК или ДНК, такую как матричная РНК, как, например, зрелая мРНК или пре-мРНК. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК или ДНК, которая кодирует белок PD-L1 млекопитающего, такой как человеческий PD-L1, например, последовательность пре-мРНК человеческого PD-L1, такую как последовательность, раскрытая как SEQ ID NO 1, или последовательность человеческой мРНК с регистрационным номером NM_014143 NCBI (Национальный центр биотехнологической информации). Дополнительная информация по типичым нуклеиновым кислотам-мишеням приводится в Таблицах 2 и 3.

Таблица 2: информация по геному и сборке для PD-L1 между видами.

Прям. - прямая нить. Геномные координаты дают последовательность пре-мРНК (геномная последовательность). Ссылка NCBI дает последовательность мРНК (последовательность кДНК).

* База данных эталонных последовательностей Национального центра биотехнологической информации представляет собой всеохватывающий, интегрированный, неизбыточный, хорошо аннотированный набор эталонных последовательностей, включающих геномные, последовательности транскриптов и белков. Она размещается на www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq.

Таблица 3: подробности последовательностей для PD-L1 между видами.

Последовательность-мишень

Термин «последовательность-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательности нуклеотидов, присутствующей в нуклеиновой кислоте-мишени, которая содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая является комплементарной олигонуклеотиду по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень состоит из области на нуклеиновой кислоте-мишени, которая является комплементарной непрерывной нуклеотидной последовательности олигонуклеотида по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень длиннее, чем комплементарная последовательность одного олигонуклеотида, и, например, может представлять предпочтительную область нуклеиновой кислоты-мишени, на которую могут быть нацелены несколько олигонуклеотидов по изобретению.

Последовательность-мишень может представлять собой подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени.

В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из а1-а149 (см. Таблицы 4). В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из экзона мРНК PD-L1, такого как экзон человеческой мРНК PD-L1, выбранный из группы, состоящей из e1, e2, e3, e4, e5, e6 и e7 (см. Таблицу 1 выше).

В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из интрона мРНК PD-L1, такого как интрон человеческой мРНК PD-L1, выбранный из группы, состоящей из i1, i2, i3, i4, i5 и i6 (см. Таблицу 1 выше).

Олигонуклеотид по изобретению содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной или гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, такой как подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, описанная в данном документе.

Данный олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из по меньшей мере 8 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется с последовательностью-мишенью, присутствующей в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени. Непрерывная нуклеотидная последовательность (и, следовательно, последовательность-мишень) содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеотидов, как, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов, как, например, 12-25, как, например, 14-18 смежных нуклеотидов.

Клетка-мишень

Термин «клетка-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых воплощениях клетка-мишень может находиться в условиях in vivo или in vitro. В некоторых вопощениях клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка грызуна, как, например, клетка мыши или клетка крысы, или клетку примата, как, например, клетка обезьяны или клетка человека.

В предпочтительных воплощениях клетка-мишень экспрессирует мРНК PD-L1, такую как пре-мРНК PD-L1 или зрелая мРНК PD-L1. Поли А хвост мРНК PD-L1 типично не принимается во внимание для нацеливания антисмыслового олигонуклеотида.

Вариант, встречающийся в природе

Термин «вариант, встречающийся в природе» относится к вариантам гена PD-L1 или транскриптам, которые происходят из тех же самых генетических локусов, что и нуклеиновая кислота-мишень, но могут отличаться, например, за счет вырожденности генетического кода, вызывающей множественность кодонов, кодирующих ту же самую аминокислоту, или благодаря альтернативному сплайсингу пре-мРНК, или присутствию полиморфизмов, таких как однонуклеотидные полиморфизмы и аллельные варианты. На основе присутствия достаточно комплементарной последовательности к олигонуклеотиду, олигонуклеотид по изобретению, следовательно, может быть нацелен на нуклеиновую кислоту-мишень и ее встречающиеся в природе варианты.

В некоторых воплощениях встречающиеся в природе варианты имеют по меньшей мере 95%, как, например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1 млекопитающего, такой как нуклеиновая кислота-мишень, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO 1, 2 и 3.

В гене PD-L1 известны многочисленные однонуклеотидные полиморфизмы, например, однонуклеотидные полиморфизмы, раскрытые в следующей таблице (начало/эталонная последовательность человеческой пре-мРНК представляет собой SEQ ID NO 2).

Модуляция экспрессии

Термин «модуляция экспрессии» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как общий термин для способности олигонуклеотида изменять количество PD-L1 по сравнению с количеством PD-L1 до введния данного олигонуклеотида. В качестве альтернативы, модуляцию экспрессии можно определять посредством ссылки на контрольный экспермент. Обычно понятно то, что контроль представляет собой индивида или клетку-мишень, обработанную композицией физиологического раствора, или индивида или клетку-мишень, обработанную ненацеленым олигонуклеотидом (имитация). Однако он также может представлять собой индивида, которого лечили стандартом лечения.

Одним типом модуляции является способность олигонуклеотида ингибировать, осуществлять понижающую регуляцию, уменьшать, подавлять, удалять, останавливать, блокировать, предотвращать, ослаблять, снижать, устранять или прекращать экспрессию PD-L1, например, посредством деградации мРНК или блокировки транскрипции. Другим типом модуляции является способность олигонуклеотида восстанавливать, увеличивать или усиливать экспрессию PD-L1, например, посредством репарации сайтов сплайсинга или предотвращения сплайсинга, или устранения или блокировки ингибирующих механизмов, таких как репрессия микроРНК.

Высокоаффинные модифицированные нуклеозиды

Высокоаффинный модифицированный нуклеозид преставляет собой модифицированный нуклеотид, который, при включении в олигонуклеотид, увеличивает аффинность олигонуклеотида в отношении его комплементарной мишени, например, при измерении по температуре плавления (T^m). Высокоаффинный модифицированный нуклеозид по настоящему изобретению предпочтительно приводит к увеличению температуры плавления от +0,5 до +12°С, более предпочтительно - от +1,5 до +10°С, и наиболее предпочтительно - от +3 до +8°С на модифицированный нуклеозид. В данной области известны многочисленные высокоаффинные модифицированные нуклеозиды, и они включают, например, многие 2'-замещенные нуклеозиды, а также запертые нуклеиновые кислоты (LNA) (см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 и Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).

Модификации сахара

Олигомер по изобретению может содержать один или более чем один нуклеозид, который имеет модифицированную сахарную группировку, т.е. модификацию сахарной группировки по сравнению с рибозной сахарной группировкой, находящейся в ДНК и РНК.

Были получены многочисленные нуклеозиды с модификацией рибозной сахарной группировки, главным образом, с целью улучшения определенных свойств олигонуклеотидов, таких как аффинность и/или нуклеазоустойчивость.

Такие модификации включают модификации, где модифицируется структура рибозного кольца, например, посредством замены на гексозное кольцо (HNA) или бициклическое кольцо, которое типично имеет бирадикальный мостик между углеродами С2 и С4 на рибозном кольце (LNA), или на несвязанное рибозное кольцо, у которого типично отсутствует связь между углеродами С2 и С3 (например, UNA). Другие нуклеозиды с модифицированным сахаром включают, например, бициклогексозные нуклеиновые кислоты (WO2011/017521) или трициклические нуклеиновые кислоты (WO 2013/154798). Модифицированные нуклеозиды также включают нуклеозиды, где сахарная группировка заменяется на несахарную группировку, например, в случае пептидных нуклеиновых кислот (PNA) или морфолинонуклеиновых кислот.

Модификации сахаров также включают модификации, сделанные посредством изменения замещающих групп на рибозном кольце на группы, отличные от водорода, или группы 2'-OH, находящейся в природе в нуклеозидах ДНК и РНК. Заместители, например, можно вводить в 2'-, 3'-, 4'- или 5'-положения. Нуклеозиды с модифицированными сахарными группировками также включают 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В самом деле, значительное внимание было потрачено на разработку 2'-замещенных нуклеозидов, и было обнаружено то, что многочисленные 2'-замещенные нуклеозиды имеют полезные свойства при включении в олигонуклеотиды, такие как повышенная устойчивость нуклеозидов и повышенная аффинность.

2'-Модифицированные нуклеозиды

Нуклеозид с 2'-модифицированным сахаром представляет собой нуклеозид, который имеет в положении 2' заместитель, отличный от Н или -ОН (2'-замещенный нуклеозид) или содержит 2'-связанный бирадикал и включает 2'-замещенные нуклеозиды и нуклеозиды LNA (связанные 2'-4' бирадикальным мостиком). Например, 2'-модифицированный сахар может обеспечивать повышенную аффинность связывания и/или повышенную нуклеазоустойчивость олигонуклеотида. Примерами 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов являются 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-фтор-ANA (F-ANA) нуклеозид. Относительно дополнительных примеров, пожалуйста, см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 и Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Ниже приводятся иллюстрации некоторых 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов.

Нуклеозиды запертых нуклеиновых кислот (LNA)

Нуклеозиды LNA представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые содержат линкерную группу (именуемую бирадикал или мостик) между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеотида. Данные нуклеозиды также называются в литературе мостиковой нуклеиновой кислотой или бициклической нуклеиновой кислотой (BNA).

В некоторых воплощениях модифицированный нуклеозид или нуклеозиды LNA олигомера по изобретению имеют общую структуру формулы I или II:

где W выбран из -O-, -S-, -N(R^a)-, -C(R^aR^b)-, таким образом, что в некоторых воплощениях -О-; В обозначает нуклеиновое основание или модифицированную группировку нуклеинового основания;

Z обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 5'-концевую группу;

Z* обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 3'-концевую группу;

Х обозначает группу, выбранную из списка, состоящего из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -O-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях Х выбран из группы, состоящей из: -O-, -S-, NH-, NR^aR^b, -CH₂-, CR^aR^b, -C(=CH₂)- и -C(=CR^aR^b)-.

В некоторых воплощениях Х представляет собой -О-.

Y обозначает группу, выбранную из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -O-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -CH₂-, -C(R^aR^b)-, -CH₂CH₂-, -C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-, -CH₂CH₂CH₂-, -C(R^aR^b)C(R^aR^b)C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)- и -C(R^a)=N-.

В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -CH₂-, -CHR^a-, -CHCH₃-, CR^aR^b-.

или -Х-Y- совместно обозначают двухвалентную линкерную группу (также именуемую радикал), состоящую из 1, 2, 3 или 4 групп/атомов, выбранных из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -O-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях -Х-Y- обозначает бирадикал, выбранный из групп, состоящих из: -X-CH₂-, -X-CR^aR^b-, -X-CHR^a-, -X-C(HCH₃)^-, -O-Y-, -O-CH₂-, -S-CH₂-, -NH-CH₂-, -O-CHCH₃-, -CH₂-O-CH₂, -O-CH(CH₃CH₃)-, -O-CH₂-CH₂-, OCH₂-CH₂-CH₂-,-O-CH₂OCH₂-, -O-NCH₂-, -C(=CH₂)-CH₂-, -NR^a-CH₂-, N-O-CH₂, -S-CR^aR^b- и -S-CHR^a-.

В некоторых воплощениях -Х-Y- обозначает -O-CH₂- или -O-CH(CH₃)-,

где Z выбран из -О-, -S- и -N(R^a)-,

и R^a, и, при наличии R^b, каждый независимо выбран из водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, возможно замещенного С_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, С_1-6-алкоксикарбонила, С_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, С_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, С_1-6-алканоилокси, сульфоно, С_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя R^a и R^b могут вместе обозначать возможно замещенный метилен (=СН₂), где для всех хиральных центров асимметрические группы могут находиться либо в R, либо в S ориентации,

где R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из группы, состоящей из: водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, С_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, С_1-6-алкоксикарбонила, С_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилокси-карбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)-амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, С_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, С_1-6-алканоилокси, сульфоно, С_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя могут вместе обозначать оксо, тиоксо, имино или возможно замещенный метилен.

В некоторых воплощениях R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из С_1-6-алкила, такого как метил, и водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³ представляют собой атомы водорода, и либо R⁵, либо R^5* также представляет собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, представляет собой С_1-6-алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях R^а представляет собой либо атом водорода, либо метил. В некоторых воплощениях R^b, при наличии, представляет собой либо атом водорода, либо метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R^а и R^b представляют собой атом водорода.

В некоторых воплощениях один из R^а и R^b представляет собой атом водорода, а другой отличается от атома водорода.

В некоторых воплощениях один из R^а и R^b представляет собой метил, а другой представляет собой атом водорода.

В некоторых воплощениях оба из R^а и R^b представляют собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН₂-, W представляет собой О, и все R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 и WO 2004/046160, которые все включены в данный документ посредством ссылки, и они включают то, что обычно известно как нуклеозиды бета-О-окси LNA и альфа-L-окси LNA.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые включены тем самым посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -NH-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды амино LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН₂-СН₂- или -О-СН₂-СН₂-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 00/047599 и Morita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76, которые тем самым включены посредством ссылки, и включают то, что обычно известно как нуклеиновые кислоты, связанные 2'-O-4'C-этиленовым мостиком (ENA).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, С_1-6алкил, такой как метил. Такие 5'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO2007/134181, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CR^aR^b, где один или оба из R^a и R^b отличаются от атома водорода, как, например, метил, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, С_1-6алкил, такой как метил. Такие бис-модифицированные нуклеозиды LNA раскрыты в WO2010/077578, которая тем самым включена в данный документ посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH₂OCH₃)- (2'O-метоксиэтилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH₂CH₃) - (2'O-этилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CНR^a, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 10036698 и WO 07090071, которые обе тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CН(СН₂ОСН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA также известны в данной области как циклические МОЕ (сМОЕ) и раскрыты в WO 07090071.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH₃)- либо в R-, либо в S-конфигурации. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH₂-O-CH₂- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CН(СН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-метилнуклеозиды LNA также известны в данной области как сЕТ нуклеозиды и могут представлять собой либо (S)cET, либо (R)cET стереоизомеры, как раскрыто в WO 07090071 (бета-D) и WO 2010/036698 (альфа-L), которые оба тем самым включены посредством ссылки).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CR^aR^b-, в котором ни один из R^a или R^b не является атомом водорода, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях и R^a, и R^b представляют собой метил. Такие 6'-двухзамещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2009006478, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CHR^a-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 11156202, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях 6'-замещенных тио LNA R^a представляет собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -C(=CH2)-C(R^aR^b)-, как, например, -C(=CH₂)-CH₂- или -C(=CH₂)-CH(CH₃)-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды винилкарбо LNA раскрыты в WO 08154401 и WO 09067647, которые обе тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(-OR^a)-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как N-замещенные LNA и раскрываются в WO 2008/150729, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-NR^a-CH₃- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(R^a)-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, и, при замещении, другой из R⁵ и R^5* представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. В таком воплощении все из R¹, R², R³ могут представлять собой атомы водорода, и бирадикал -X-Y- может быть выбран из -O-CH2- или -O-C(HCR^a)-, такого как -O-C(HCH3)-.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как CH₂-O-CH₂-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как конформационно ограниченные нуклеотиды (CRN) и раскрываются в WO 2013036868, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -O-CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как O-CH₂-O-CH₂-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как нуклеотиды СОС и раскрываются в Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238, которая тем самым включена посредством ссылки.

Будет понятно то, что, если не определено, нуклеозиды LNA могут находиться в бета-D или альфа-L стереоизоформе.

Некоторые примеры нуклеозидов LNA представлены на Схеме 1.

Схема 1

Как проиллюстрировано в Примерах, в предпочтительных воплощениях изобретения нуклеозиды LNA в олигонуклеотидах представляют собой нуклеозиды бета-D-окси-LNA.

Деградация, опосредованная нуклеазой

Термин «деградация, опосредованная нуклеазой» относится к олигонуклеотиду, способному опосредовать деградацию комплементарной нуклеотидной последовательности при образовании дуплекса с такой последовательностью.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид может функционировать посредством деградации нуклеиновой кислоты-мишени, опосредованной нуклеазой, где олигонуклеотиды по изобретению способны рекрутировать нуклеазу, в частности, эндонуклеазу, предпочтительно эндорибонуклеазу (РНКазу), такую как РНКаза Н. Примерами конструкций олигонуклеотидов, которые работают посредством механизмов, опосредованных нуклеазой, являются олигонуклеотиды, которые типично содержат область из по меньшей мере 5 или 6 нуклеозидов ДНК и фланкированы на одной стороне или на обеих сторонах нуклеозидами, увеличивающими аффинность, например, гэпмеры, хэдмеры и тэйлмеры.

Активность и рекрутирование РНКазы Н

Термин «активность РНКазы Н антисмыслового олигонуклеотида» относится к его способности при нахождении в дуплексе с комплементарной молекулой РНК рекрутировать РНКазу Н. В WO 01/23613 предложены способы in vitro для определения активности РНКазы Н, которые можно использовать для определения способности рекрутировать РНКазу Н. Типично олигонуклеотид считается способным рекрутировать РНКазу Н, если он, при предоставлении с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, имеет исходную скорость, измеренную в пмоль/л/мин, по меньшей мере 5%, как, например, по меньшей мере 10% или больше, чем 20% от исходной скорости, определенной при использовании олигонуклеотида, имеющего такую же последовательность оснований, что и тестируемый модифицированный олигонуклеотид, но содержащего только мономеры ДНК с фосфоротиоатными связями между всеми мономерами в олигонуклеотиде, и с использованием методологии, предложенной в Примерах 91-95 WO 01/23613 (включенной тем самым посредством ссылки).

Гэпмер

Термин «гэпмер» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит область олигонуклеотидов (гэп), рекрутирующую РНКазу Н, которая фланкирована 5' и 3' областями (фланги или крылья), которые содержат один или более чем один модифицированный нуклеозид, усиливающий аффинность. В данном документе описываются разные конструкции гэпмеров, и они характеризуются по их способности рекрутировать РНКазу Н. Хэдмеры и тэйлмеры представляют собой олигонуклеотиды, способные рекрутировать РНКазу Н, где отсутствует один из флангов, т.е. только один из концов олигонуклеотида содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность. Для хэдмеров отсутстует 3'-фланг (т.е. 5'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность), и для тэйлмеров отсутстует 5'-фланг (т.е. 3'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность).

Гэпмер LNA

Термин «гэпмер LNA» относится к гэпмерному олигонуклеотиду, в котором по меньшей мере один из модифицированных нуклеозидов, усиливающих аффинность, представляет собой нуклеозид LNA.

Гэпмер со смешанными крыльями

Термин «гэпмер со смешанными крыльями» или «гэпмер со смешанными флангами» относится к гэпмеру LNA, в котором по меньшей мере одна фланговая область содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, не являющийся LNA, такой как по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, такой как, например, нуклеозид(ды) 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-F-ANA. В некоторых воплощениях гэпмер со смешанными крыльями имеет один фланг, который содержит только нуклеозиды LNA (например, 5' или 3'), и другой фланг (3' или 5' соответственно) содержит 2'-замещенный(ные) модифицированный(ные) нуклеозид(ды) и возможно нуклеозиды LNA.

Олигонуклеотид с разорванным гэпом

Термин «олигонуклеотид с разорванным гэпом» используется по отношению к гэпмеру, способному поддерживать рекрутирование РНКазы Н, даже несмотря на то, что область гэпа разрывается нуклеозидом, не рекрутирующим РНКазу Н (нуклеозидом, разрывающим гэп, Е), таким образом, что область гэпа содержит меньше, чем 5 последовательных нуклеозидов ДНК. Нуклеозиды, не рекрутирующие РНКазу Н, представляют собой, например, нуклеозиды в 3'-эндоконформации, такие как LNA, где мостик между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеозида находится в бета-конформации, как, например, нуклеозид бета-D-окси LNA или ScET. Способность олигонуклеотида с разорванным гэпом рекрутировать РНКазу Н типично является специфичной в отношении последовательности или даже соединения - см. Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487, в которой раскрыты «олигонуклеотиды с разорванным гэпом», которые рекрутируют РНКазу Н, которые в некоторых случаях обеспечивает более специфичное расщеплениее РНК-мишени.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению представляет собой олигонуклеотид с разорванным гэпом. В некоторых воплощениях олигонуклеотид с разорванным гэпом содержит 5'-фланг (F), гэп (G) и 3'-фланг (F'), где гэп разорван нуклеозидом, не рекрутирующим РНКазу Н (нуклеозидом, разрывающим гэп, Е), таким образом, что гэп содержит по меньшей мере 3 или 4 последовательных нуклеозида ДНК. В некоторых воплощениях нуклеозид, разрывающий гэп (Е), представляет собой нуклеозид LNA, где мостик между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеозида находится в бета-конформации, и он размещается в пределах области гэпа таким образом, что нуклеозид LNA, разрывающий гэп, фланкирован 5' и 3' по меньшей мере 3(5') и 3(3') или по меньшей мере 3(5') и 4(3'), или по меньшей мере 4(5') и 3(3') нуклеозидами ДНК, и где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.

Олигонуклеотид с разорванным гэпом может быть представлен следующими формулами:

F-G-E-G-F'; в частности F_1-7-G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7

D'-F-G-F', в частности D'_1-3-F_1-7- G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7

F-G-F'-D'', в частности F_1-7- G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7-D''_1-3

D'-F-G-F'-D'', в частности D'_1-3-F_1-7- G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7-D''_1-3

Где области D' и D'' являются такими, как описано в разделе «Конструкция гэпмера».

В некоторых воплощениях нуклеозид, разрывающий гэп (Е), представляет собой бета-D-окси LNA или ScET, или другие нуклеозиды бета-LNA, показанные на Схеме 1).

Конъюгат

Термин «конъюгат» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к олигонуклеотиду, который ковалентно связан с ненуклеотидной группировкой (конъюгатная группировка или область С, или третья область), также именуемому конъюгатом олигонуклеотида.

Конъюгирование олигонуклеотида по изобретению с одной или более чем одной ненуклеотидной группировкой может улучшать фармакологию данного олигонуклеотида, например, посредством влияния на активность, клеточное распределение, клеточное поглощение или стабильность олигонуклеотида. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка нацеливает олигонуклеотид в печень. В то же самое время конъюгат служит для уменьшения активности олигонуклеотида в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями, например, активность вне мишени или активность в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями. В одном воплощении изобретения конъюгат олигонуклеотида по изобретению демонстрирует улучшенное ингибирование PD-L1 в клетке-мишени по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. В другом воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретнию имеет улучшенное клеточное распределение между печенью и другими органами, такими как селезенка или почки (т.е. больше конъюгированного олигонуклеотида поступает в печень, чем в селезенку или в почки), по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. В другом воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретнию демонстрирует улучшенное клеточное поглощение в печень конъюгата олигонуклеотида по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом.

В WO 93/07883 и WO 2013/033230 предложены подходящие конъюгатные группировки, которые тем самым являются включенными посредством ссылки. Дополнительными подходящими конъюгатными группировками являются группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr). В частности, подходящими для связывания с ASGPr являются трехвалентные N-ацетилгалактозаминные конъюгатные группировки, см., например, WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620 (включенные тем самым посредством ссылки). Конъюгатная группировка является по существу частью конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов, которая не состоит из нуклеиновых кислот.

Конъюгаты олигонуклеотидов и их синтез также были описаны во всеохватывающих обзорах Manoharan в Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 и Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

В одном воплощении ненуклеотидная группировка (конъюгатная группировка) выбрана из группы, состоящей из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов (например, бактериальных токсинов), витаминов, вирусных белков (например, капсидов) или их комбинаций.

Линкеры

Связка или линкер представляет собой соединение между двумя атомами, которое связывает одну химическую группу или интересующий сегмент с другой химической группой или интересующим сегментом посредством одной или более чем одной ковалентной связи. Конъюгатные группировки могут присоединяться к олигонуклеотиду непосредственно или через связывающую группировку (например, линкер или связку). Линкеры служат для ковалентного присоединения третьей области, например, конъюгатной группировки (области С), к первой области, например, олигонуклеотиду или непрерывной нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (область А).

В некоторых воплощениях изобретения конъюгат или конъюгат олигонуклеотида по изобретению возможно может содержать линкерную область (вторая область или область В, и/или область Y), которая располагается между олигонуклеотидом или непрерывной нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (область А или первая область), и конъюгатной группировкой (область С или третья область).

Область В относится к биорасщепляемым линкерам, содержащим или состоящим из физиологически лабильной связи, которая является расщепляемой при условиях, которые обычно встречаются или являются аналогичными условиям, которые встречаются в организме млекопитающего. Условия, при которых физиологически лабильные линкеры подвергаются химическому превращению (например, расщеплению), включают такие химические условия, как рН, температура, окислительные или восстановительные условия или агенты и концентрация соли, обнаруженные или аналогичные условиям, встречающимся в клетках млекопитающих. Внутриклеточные условия у млекопитающих также включают присутствие ферментативной активности, обычно присутствующей в клетке млекопитающего, как, например, от протеолитических ферментов или гидролитических ферментов, или нуклеаз. В одном воплощении биорасщепляемый линкер чувствителен к расщеплению нуклеазой S1. В предпочтительном воплощении нуклеазочувствительный линкер содержит от 1 до 10 нуклеозидов, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов, более предпочтительно - от 2 до 6 нуклеозидов, и наиболее предпочтительно - от 2 до 4 связанных нуклеозидов, содержащих по меньшей мере две последовательные фосфодиэфирные связи, как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных фосфодиэфирных связей. Предпочтительно нуклеозидами являются ДНК или РНК. Биорасщепляемые линкеры, содержащие фосфодиэфир, более подробно описываются в WO 2014/076195 (включенной тем самым посредством ссылки).

Область Y относится к линкерам, которые не обязательно являются биорасщепляемыми, но, главным образом, служат для ковалентного присоединения конъюгатной группировки (области С или третьей области) к олигонуклеотиду или непрерывной нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (области А или первой области). Линкеры области Y могут содержать структуру цепи или олигомер из повторяющихся звеньев, такой как этиленгликоль, аминокислотные звенья или аминоалкильные группы. Конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению могут быть сконструированы из следующих элементов областей: A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C или A-Y-C. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С2-С36 аминоалкильную группу, включающую, например, С6-С12 аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер (область Y) представляет собой С6 аминоалкильную группу.

Лечение

Термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится как к лечению существующего заболевания (например, заболевания или расстройства, на которые дается ссылка в данном документе), так и к предупреждению заболевания, т.е. профилактике. Следовательно, будет понятно, что лечение в том виде, в котором на него дается ссылка в данном документе, в некоторых воплощениях может быть профилактическим.

Восстановление иммунного ответа против патогенов

Иммунный ответ подразделяется на врожденный и адаптивный иммунный ответ. Врожденная иммунная система обеспечивает немедленный, но неспецифичный ответ. Адаптивный иммунный ответ активируется врожденным иммунным ответом и является высокоспецифичным по отношению к конкретному патогену. При презентации антигена, происходящего из патогена, на поверхности антигенпрезентирующих клеток иммунные клетки адаптивного иммунного ответа (т.е. Т- и В-лимфоциты) активируются посредством их антигенспецифичных рецепторов, приводя к патогенспецифичному иммунному ответу и развитию иммунологической памяти. Хронические вирусные инфекции, такие как HBV и HCV, ассоциированы с исчерпанием Т-клеток, характеризуемым неотвечаемостью вирусоспецифичных Т-клеток. Исчерпание Т-клеток хорошо изучено, относительно обзора см., например, Yi et al 2010 Immunology 129, 474-481. Хронические вирусные инфекции также ассоциированы с пониженной функцией NK-клеток, которые являются врождеными иммунными клетками. Усиление иммунного ответа против вирусов является важным для клиренса хронической инфекции. Восстановление иммунного ответа против патогенов, опосредованного Т-клетками и NK-клетками, можно оценивать посредством измерения пролиферации, секреции цитокинов и цитолитической функции (Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 и Пример 6 в данном документе).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению антисмысловых олигонуклеотидов, их конъюгатов и содержащих их фармацевтических композиций для восстановления иммунного ответа против патогенов, которые инфицировали животное, в частности человека. Конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов по настоящему изобретению являются особенно полезными против патогенов, которые инфицировали печень, в частности, против хронических инфекций печени, подобных HBV. Данные конъюгаты обеспечивают таргетное распределение олигонуклеотидов и предотвращают системный нокдаун нуклеиновой кислоты-мишени.

Олигонуклеотиды по изобретению

Данное изобретение относится к олигонуклеотидам, способным модулировать экспрессию PD-L1. Модуляция может достигаться гибридизацией с нуклеиновой кислотой-мишенью, кодирующей PD-L1, или с той, которая участвует в регуляции PD-L1. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой последовательность PD-L1 млекопитающего, такую как последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой пре-мРНК, мРНК или любую последовательность РНК, экспрессируемую из клетки млекопитающего, которая поддерживает экспрессию или регуляцию PD-L1.

Олигонуклеотид по изобретению представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который нацелен на PD-L1.

В одном аспекте изобретения олигонуклеотиды по изобретению конъюгированы с конъюгатной группировкой, в частности, с конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен модулировать экспрессию мишени посредством осуществления ее ингибирования или понижающей регуляции. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере 20% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени, более предпочтительно по меньшей мере 30%-ное, 40%-ное, 50%-ное, 60%-ное, 70%-ное, 80%-ное или 90%-ное ингибирование по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере 20% по сравнению с уровнем экспрессии при заражении клетки или организма инфекционным агентом, или при обработке агентом, имитирующим заражение инфекционным агентом (например, поли I:C или LPS (липополисахарид)), более предпочтительно по меньшей мере 30%-ное, 40%-ное, 50%-ное, 60%-ное, 70%-ное, 80%-ное или 90%-ное ингибирование по сравнению с с уровнем экспрессии при заражении клетки или организма инфекционным агентом, или при обработке агентом, имитирующим заражение инфекционным агентом (например, поли I:C или LPS). В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии мРНК PD-L1 по меньшей мере на 60% или 70% in vitro с использованием клеток KARPAS-299 или ТНР1. В некоторых воплощениях соединения по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии белка PD-L1 по меньшей мере на 50% in vitro с использованием клеток KARPAS-299 или ТНР1. Подходящим образом в примерах предложены анализы, которые можно использовать для измерения РНК PD-L1 (например, Пример 1). Модуляция мишени запускается гибридизацией между непрерывной нуклеотидной последовательностью олигонуклеотида и нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит несоответствия между данным олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. Несмотря на несоответствия гибридизация с нуклеиновой кислотой-мишенью все еще может быть достаточной для демонстрации желательной модуляции экспрессии PD-L1. Пониженная аффинность связывания, происходящая из-за несоответствий, преимущественно может компенсироваться большим числом нуклеотидов в олигонуклеотиде и/или большим числом модифицированных нуклеозидов, способных увеличивать аффинность связывания с мишенью, таких как 2'-модифицированные нуклеозиды, включая LNA, присутствующих в пределах последовательности олигонуклеотида.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен восстанавливать патогенспецифичные Т-клетки. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению способны увеличивать число патогенспецифичных Т-клеток по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70% по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. В одном воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HBV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. Подходящим образом, в данных примерах предложены анализы, которые можно использовать для измерения HBV-специфичных Т-клеток (например, пролиферация Т-клеток, секреция цитокинов и цитолитическая активность). В другом воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HСV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. В другом воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HDV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен уменьшать уровни HBsAg у животного или человека. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению способны уменьшать уровни HВsAg по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, 90% или 95% по сравнению с уровнем до обработки. Наиболее предпочтительно олигонуклеотиды по изобретению способны достигать сероконверсии HВsAg у животного или человека, иницированного HBV.

Один аспект настоящего изобретения относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1.

В некоторых воплощениях данный олигонуклеотид содержит непрерывную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, по меньшей мере на 91%, как, например, по меньшей мере на 92%, как, например, по меньшей мере на 93%, как, например, по меньшей мере на 94%, как, например, по меньшей мере на 95%, как, например, по меньшей мере на 96%, как, например, по меньшей мере на 97%, как, например, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени.

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению или его непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарным (на 100% комплементарным) области нуклеиновой кислоты-мишени, или в некоторых воплощениях может содержать одно или два несоответствия между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, с полной (или 100%-ной) комплементарностью с областью нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, 100%-ной комплементарностью с соответствующей областью нуклеиновой кислоты-мишени, где непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, выбранной из группы, состоящей из положения 371-3068, 5467-12107 и 15317-19511 на SEQ ID NO: 1. В другом воплощении подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из положения 371-510, 822-1090, 1992-3068, 5467-5606, 6470-12107, 15317-15720, 15317-18083, 18881-19494 и 1881-19494 на SEQ ID NO: 1. В предпочтительном воплощении подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из положения 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 и 15690-15735 на SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, 100%-ной комплементарностью с соответствующей областью нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1, где область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из областей от а1 до а449 в Таблице 4.

Таблица 4: области SEQ ID NO 1, на которые может осуществляться нацеливание с использованием олигонуклеотида по изобретению

В некотором воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последователность является комплементарным области нуклеиновой кислоты-мишени, где данная область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из a7, a26, a43, a119, a142, a159, a160, a163, a169, a178, a179, a180, a189, a201, a202, a204, a214, a221, a224, a226, a243, a254, a258, 269, a274, a350, a360, a364, a365, a370, a372, a381, a383, a386, a389, a400, a427, a435 и a438.

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени, где область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из a160, a180, a221, a269 и a360.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из 8-35 нуклеотидов в длину, как, например, от 9 до 30, как, например, от 10 до 22, как, например, от 11 до 20, как, например, от 12 до 18, как, например, от 13 до 17 или от 14 до 16 смежных нуклеотидов в длину. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид содержит или состоит из 16-20 нуклеотидов в длину. Следует понимать то, что любой интервал, приведенный в данном документе, включает конечные точки интервала. Соответственно, если говорится то, что олигонуклеотид включает от 10 до 30 нуклеотидов, включены и 10, и 30 нуклеотидов.

В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов в длину. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид содержит или состоит из 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов в длину.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в Таблице 5.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-743 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 5).

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-743 и 771.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 и 735.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 287.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 342.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 640.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 466.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 566.

В воплощениях, где олигонуклеотид длиннее, чем непрерывная нуклеотидная последовательность (которая комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени), мотивы последоваельностей в Таблице 5 образуют часть непрерывной нуклеотидной последовательности антисмысловых олигонуклеотидов по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является эквивалентной непрерывной нуклеотидной последовательности (например, если не добавляются биорасщепляемые линкеры).

Понятно то, что непрерывные последовательности из нуклеиновых оснований (мотив последовательности) могут быть модифицированы, например, для увеличения устойчивости к нуклеазе и/или аффинности связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Модификации описываются в определениях и в разделе «Конструкция олигонуклеотидов». В Таблице 5 перечислены предпочтительные конструкции каждого мотива последовательности.

Конструкция олигонуклеотида

Термин «конструкция олигонуклеотида» относится к картине модификаций сахара нуклеозидов в последовательности олигонуклеотида. Олигонуклеотиды по изобретению содержат нуклеозиды с модифицированным сахаром и также могут содержать нуклеозиды ДНК или РНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит нуклеозиды с модифицированным сахаром и нуклеозиды ДНК. Включение модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотид по изобретению может увеличивать аффинность олигонуклеотида в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. В данном случае модифицированные нуклеозиды можно называть модифицированными нуклеотидами, увеличивающими аффинность, модифицированные нуклеозиды также можно называть звеньями.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере 1 модифицированный нуклеозид, как, например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении олигонуклеотид содержит от 1 до 10 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 2 до 8 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 3 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 4 до 6 модифицированных нуклеозидов, как, например, 3, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром, как, например, нуклеозиды, модифицированные 2' сахаром. Предпочтительно олигонуклеотид по изобретению содержит один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и нуклеозидов LNA. Даже более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой запертую нуклеиновую кислоту (LNA).

В другом воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные или боранофосфатные межнуклеозидные связи. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи в непрерывной последовательности олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеозидов LNA, как, например, от 2 до 6 нуклеозидов LNA, как, например, от 3 до 7 нуклеозидов LNA, от 4 до 6 нуклеозидов LNA или 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеозидов LNA. В некоторых воплощениях по меньшей мере 75% модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотиде представляют собой нуклеозиды LNA, как, например, 80%, как, например, 85%, как, например, 90% модифицированных нуклеозидов представляют собой нуклеозиды LNA В еще одном другом воплощении все модифицированные нуклеозиды в олигонуклеотиде представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении олигонуклеотид может содержать и бета-D-окси-LNA, и один или более чем один из следующих нуклеозидов LNA: тио-LNA, амино-LNA, окси-LNA и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В другом воплощении все цитозиновые звенья LNA представляют собой 5-метилцитозин. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 1 нуклеозид LNA на 5'-конце и по меньшей мере 2 нуклеозида LNA на 3'-конце нуклеотидной последовательности.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, который представляет собой нуклеозид 2'-MOE-РНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов 2'-MOE-РНК. В некоторых воплощениях по меньшей мере один из указанных модифицированных нуклеозидов представляет собой 2'-фтор-ДНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов 2'-фтор-ДНК.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид содержит и нуклеозиды, модифицированные 2'-сахаром, и звенья ДНК. Предпочтительно олигонуклеотид содержит и нуклеотиды (звенья) LNA, и ДНК. Предпочтительно объединенное общее число звеньев LNA и ДНК составляет 8-30, как, например, 10-25, предпочтительно 12-22, как, например, 12-18, даже более предпочтительно 11-16. В некоторых воплощениях изобретения нуклеотидная последовательность олигонуклеотида, такая как непрерывная нуклеотидная последовательность, состоит из по меньшей мере из одного или двух нуклеотидов LNA, и остальные нуклеозилы представляют собой звенья ДНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит только нуклеозиды LNA и встречающиеся в природе нуклеозиды (такие как нуклеозиды РНК или ДНК, наиболее предпочтительно нуклеозиды ДНК), возможно с модифицированными межнуклеозидными связями, такими как фосфоротиоатная.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид по изобретению способен рекрутировать РНКазу Н.

Структурная конструкция олигонуклеотида по изобретению может быть выбрана из гэпмеров, олигонуклеотидов с разорванным гэпом, хэдмеров и тэйлмеров.

Конструкция гэпмера

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению имеет конструкцию или структуру гэпмера, также именуемую в данном документе просто «гэпмер». В структуре гэпмера олигонуклеотид содержит по меньшей мере три отличные структурные области: 5'-фланг, гэп и 3'-фланг, F-G-F' в ориентации '5 -> 3'. В данной конструкции фланкирующие области F и F' (также именуемые области крыльев) содержат непрерывный отрезок модифицированных нуклеозидов, которые являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1, тогда как область гэпа - G - содержит непрерывный отрезок нуклеотидов, который способен рекрутировать нуклеазу, предпочтительно эндонуклеазу, такую как РНКаза, например, РНКаза Н, когда олигонуклеотид находится в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью. Нуклеозиды, которые способны рекрутировать нуклеазу, в частности РНКазу Н, могут быть выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-окси-LNA, 2'-фтор-ANA и UNA. Области F и F', фланкирующие 5'- и 3'-концы области G, предпочительно содержат нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу (нуклеозиды с 3'-эндоструктурой), более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид, увеличивающий аффинность. В некоторых воплощениях 3'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, предпочтительно по меньшей мере 2 нуклеозида LNA. В некоторых воплощениях 5'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях обе 5'- и 3'-фланкирующие области содержат нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды в данных фланкирующих областях представляют собой нуклеозиды LNA. В других воплощениях фланкирующие области могут содержать и нуклеозиды LNA, и другие нуклеозиды (смешанные фланги), такие как нуклеозиды ДНК и/или модифицированные нуклеозиды, не являющиеся нуклеозидами LNA, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В данном случае гэп определяется как непрерывная последовательность из по меньшей мере 5 нуклеозидов, рекрутирующих РНКазу Н (нуклеозиды с 2'-эндоструктурой, предпочтительно ДНК), фланкированная на 5'- и 3'-конце модифицированным нуклеозидом, увеличивающим аффинность, предпочтительно LNA, таким как бета-D-окси-LNA. Следовательно, нуклеозиды 5'-фланкирующей области и 3'- фланкирующей области, которые являются смежными с областью гэпа, представляют собой модифицированные нуклеозиды, предпочтительно нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу.

Область F

Область F (5'-фланг или 5'-крыло), присоединенная к '5-концу области G, включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F содержит или состоит из от 1 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-5 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце данной области.

В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F имеют 3'-эндоструктуру.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F представляет собой 2'-модифицированные нуклеозиды.

В другом воплощении область F содержит ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце (рядом с областью G) области F. В одном воплощении область F содержит нуклеозиды ДНК, как, например, от 1 до 3 смежных нуклеозидов ДНК, как, например, от 1 до 3 или от 1 до 2 смежных нуклеозидов ДНК. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. В некоторых воплощениях 2'-модифицированные нуклеозиды и нуклеозиды ДНК и/или РНК в области F чередуются с 1-3 2'-модифицированными нуклеозидами и 1-3 нуклеозидами ДНК и/или РНК. Такие фланги также могут называться флангами с чередованием. Длина 5'-фланга (области F) в олигонуклеотидах с флангами с чередованием может составлять от 4 до 10 нуклеозидов, как, например, от 4 до 8, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов, как, например, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов. В некоторых воплощениях только 5'-фланг олигонуклеотида является флангом с чередованием. Конкретными примерами области F с чередующимися нуклеозидами являются:

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2- N'_1-2-2'_1-2,

где 2' показывает модифицированный нуклеозид, и N' представляет собой РНК или ДНК. В некоторых воплощениях все модифицированные нуклеозиды во флангах с чередованием представляют собой LNA, а N' представляет собой ДНК. В другом воплощении один или более чем один 2'-модифицированный нуклеозид в области F выбран из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.

В некоторых воплощениях область F содержит и нуклеозид LNA, и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.

В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, cET и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F содержит по меньшей мере 1 звено бета-D-окси LNA на 5'-конце непрерывной последовательности.

Область G

Область G (область гэпа) предпочтительно включает, содержит или состоит из по меньшей мере 4, как, например, из по меньшей мере 5, как, например, из по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 последовательных нуклеозидов, способных рекрутировать вышеупомянутую нуклеазу, в частности РНКазу Н. В другом воплощении область G включает, содержит или состоит из от 5 до 12 или от 6 до 10, или от 7 до 9, как, например, из 8 последовательных нуклеотидных звеньев, способных рекрутировать вышеупомянутую нуклеазу.

Нуклеозидные звенья в области G, которые способны рекрутировать нуклеазу, в одном воплощении выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-LNA, C4'-алкилированой ДНК (как описано в PCT/EP2009/050349 и Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300, которые обе включены в данный документ посредством ссылки), нуклеозидов, происходящих из арабинозы, подобных ANA и 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (незапертая нуклеиновая кислота) (как описано в Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, включенной в данный документе посредством ссылки). UNA представляет собой незапертую нуклеиновую кислоту, типично где связь между С2 и С3 рибозы была удалена, образуя незапертый «сахарный» остаток.

В еще одном другом воплощении по меньшей мере одно нуклеозидное звено в области G представляет собой нуклеозидное звено ДНК, как, например, от 1 до 18 звеньев ДНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 звеньев ДНК, предпочтительно от 2 до 17 звеньев ДНК, как, например, от 3 до 16 звеньев ДНК, как, например, от 4 до 15 звеньев ДНК, как, например, от 5 до 14 звеньев ДНК, как, например, от 6 до 13 звеньев ДНК, как, например, от 7 до 12 звеньев ДНК, как, например, от 8 до 11 звеньев ДНК, более предпочтительно от 8 до 17 звеньев ДНК или от 9 до 16 звеньев ДНК, от 10 до 15 звеньев ДНК или от 11 до 13 звеньев ДНК, как, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 звеньев ДНК. В некоторых воплощениях область G состоит из 100% звеньев ДНК.

В других воплощениях область G может состоять из смеси ДНК и других нуклеозидов, способных опосредовать расщепление РНКазой Н. Область G может состоять из по меньшей мере 50% ДНК, более предпочтительно - из 60%, 70% или 80% ДНК, и даже более предпочтительно из 90% или 95% ДНК.

В еще одном другом воплощении по меньшей мере одно нуклеозидное звено в области G представляет собой нуклеозидное звено альфа-L-LNA, как, например, по меньшей мере одно звено альфа-L-LNA, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 звеньев альфа-L-LNA. В другом воплощении область G содержит по меньшей мере одно звено альфа-L-LNA, которое представляет собой звено альфа-L-окси-LNA. В другом воплощении область G содержит комбинацию нуклеозидных звеньев ДНК и альфа-L-LNA.

В некоторых воплощениях нуклеозиды в области G имеют 2'-эндоструктуру.

В некоторых воплощениях область G может содержать нуклеозид, разрывающий гэп, приводящий к олигонуклеотиду с разорванным гэпом, который способен рекрутировать РНКазу Н.

Область F'

Область F' (3'-фланг или 3'-крыло), присоединенная к '3-концу области G, включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F' содержит или состоит из от 1 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F' определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и на 3'-конце данной области.

В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F' имеют 3'-эндоструктуру.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой 2'-модифицированные нуклеозиды.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид.

В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляет собой 2'-модифицированные нуклеозиды. В другом воплощении область F' содержит ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце (смежном с областью G) и 3'-конце области F'. В одном воплощении область F' содержит нуклеозиды ДНК, как, например, от 1 до 4 смежных нуклеозидов ДНК, как, например, от 1 до 3 или от 1 до 2 смежных нуклеозидов ДНК. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. В некоторых воплощениях 2'-модифицированные нуклеозиды и нуклеозиды ДНК и/или РНК в области F' чередуются с 1-3 2'-модифицированными нуклеозидами и 1-3 нуклеозидами ДНК и/или РНК, причем такие фланги также могут называться флангами с чередованием. Длина 3'-фланга (области F') в олигонуклеотидах с флангами с чередованием может составлять от 4 до 10 нуклеозидов, как, например, от 4 до 8, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов, как, например, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов. В некоторых воплощениях только 3'-фланг олигонуклеотида является флангом с чередованием. Конкретными примерами области F' с чередующимися нуклеозидами являются:

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2- N'_1-2-2'_1-2,

где 2' показывает модифицированный нуклеозид, и N' представляет собой РНК или ДНК. В некоторых воплощениях все модифицированные нуклеозиды во флангах с чередованием представляют собой LNA, а N' представляет собой ДНК. В другом воплощении модифицированные нуклеозиды в области F' выбраны из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.

В некоторых воплощениях область F' содержит и LNA и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.

В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F' независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, cET и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F' имеет по меньшей мере 2 звена бета-D-окси LNA на 3'-конце непрерывной последовательности.

Область D' и D''

Область D' и D'' может быть присоединена к 5'-концу области F или к 3'-концу области F' соответственно. Область D' или D'' является опцией.

Область D' и D'' может независимо содержать от 0 до 5, как, например, от 1 до 5, как, например, от 2 до 4, как, например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов, которые могут быть комплементарными или некомплементарными нуклеиновой кислоте-мишени. В данном отношении олигонуклеотид по изобретению может в некоторых воплощениях содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, способную модулировать мишень, которая фланкирована на 5'- и/или 3'-конце дополнительными нуклеотидами. Такие дополнительные нуклеотиды могут служить в качестве нуклеазочувствительного биорасщепляемого линкера (см. определение линкеров). В некоторых воплощениях дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеозиды связаны фосфодиэфирными связями и могут представлять собой ДНК или РНК. В другом воплощении дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеозиды представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые могут быть включены, например, для увеличения нуклеазоустойчивости или для легкости синтеза. В одном воплощении олигонуклеотид по изобретению содержит область D' и/или D'' на 5'- или 3'-конце непрерывной нуклеотидной последовательности. В другом воплощении область D' и/или D'' состоит из 1-5 нуклеозидов ДНК или РНК, связанных фосфодиэфирными связями, которые не являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени.

Гэпмерный олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть представлен следующими формулами:

3'-F-G-F'-3'; в частности, F_1-7-G_4-12-F'_1-7

5'-D'-F-G-F'-3', в частности, D'_1-3-F_1-7-G_4-12-F'_1-7

5'-F-G-F'-D''-3', в частности, F_1-7-G_4-12-F'_1-7-D''_1-3

5'-D'-F-G-F'-D'-3'', в частности, D'_1-3-F_1-7-G_4-12-F'_1-7-D''_1-3

Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях F, G и F', D' и D'' были описаны выше. Конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению имеют область С, ковалентно присоединенную либо к 5'-, либо к 3'-концу олигонуклеотида, в частности гэпмерных олигонуклеотидов, представленных выше.

В одном воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретению содержит олигонуклеотид с формулой 5'-D'-F-G-F'-3' или 5'-F-G-F'-D''-3', где области F и F' независимо содержат 1-7 модифицированных нуклеозидов, G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н, и область D' или D'' содержит 1-5 нуклеозидов, связанных фосфодиэфирными связями. Предпочтительно область D' или D'' присутствует в конце олигонуклеотида, где рассматривается конъюгирование с конъюгатной группировкой.

Примеры олигонуклеотидов с флангами с чередованием могут быть представлены следующими формулами:

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3-G_6-12-2'_1-2-N'_1-4-2'_1-4

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-G_6-12-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2- N'_1-2-2'_1-2

F-G_6-12-2'_1-2-N'_1-4-2'_1-4

F-G_6-12-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3-G_6-12-F'

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-N_1-2-2'_1-2-G_6-12-F'

где фланг указан F или F', если он содержит только 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как нуклеозиды LNA. Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях с чередованием и области F, G и F', D' и D'' были описаны выше.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, состоящий из 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 нуклеотидов в длину, где каждая из областей F и F' независимо состоит из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозных звеньев, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 нуклеозидных звеньев, способных рекрутировать нуклеазу при нахождении в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1, и область D' состоит из 2 ДНК, связанных фосфодиэфирной связью.

В других воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' независимо состоит из 3, 4, 5 или 6 модифицированных нуклеозных звеньев, таких как нуклеозидные звенья, содержащие сахар 2'-O-метоксиэтил-рибозу (2'-MOE), или нуклеозидные звенья, содержащие сахар 2'-фтор-дезоксирибозу, и/или звенья LNA, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеозидных звеньев, таких как звенья ДНК или другие нуклеозиды, рекрутирующие нуклеазу, такие как L-LNA или смесь нуклеозидов ДНК и нуклеозидов, рекрутирующих нуклеазу.

В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' состоит из двух звеньев LNA, и область G состоит из 12, 13, 14 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 2-12-2, 2-13-2 и 2-14-2.

В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' независимо состоит из трех звеньев LNA, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 3-8-3, 3-9-3 3-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3 и 3-14-3.

В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' состоит из четырех звеньев LNA, и область G состоит из 8 или 9, 10, 11 или 12 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 4-8-4, 4-9-4, 4-10-4, 4-11-4 и 4-12-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 6 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-6-1, 1-6-2, 2-6-1, 1-6-3, 3-6-1, 1-6-4, 4-6-1, 2-6-2, 2-6-3, 3-6-2 2-6-4, 4-6-2, 3-6-3, 3-6-4 и 4-6-3.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 7 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-7-1, 2-7-1, 1-7-2, 1-7-3, 3-7-1, 1-7-4, 4-7-1, 2-7-2, 2-7-3, 3-7-2, 2-7-4, 4-7-2, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 и 4-7-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 8 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-8-1, 1-8-2, 1-8-3, 3-8-1, 1-8-4, 4-8-1,2-8-1, 2-8-2, 2-8-3, 3-8-2, 2-8-4, , 4-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3 и 4-8-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 9 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-9-1, 2-9-1, 1-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 1-9-4, 4-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 2-9-4, 4-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3 и 4-9-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 10 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 и 4-10-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 11 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 и 4-11-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 12 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4-12-1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 и 4-12-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 13 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-13-1, 2-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1-13-4, 4-13-1, 2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13-4, 4-13-3 и 4-13-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 14 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-14-1, 2-14-1, 1-14-2, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14-1, 2-14-2, 2-14-3, 3-14-2, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14-4, 4-14-3 и 4-14-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 15 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-15-1, 2-15-1, 1-15-2, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-2, 2-15-3, 3-15-2, 2-15-4, 4-15-2 и 3-15-3.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 16 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-16-1, 2-16-1, 1-16-2, 1-16-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16-1, 2-16-2, 2-16-3, 3-16-2, 2-16-4, 4-16-2 и 3-16-3.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 17 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-17-1, 2-17-1, 1-17-2, 1-17-3, 3-17-1, 1-17-4, 4-17-1, 2-17-2, 2-17-3 и 3-17-2.

Во всех случаях конструкция F-G-F' может дополнительно включать область D' и/или D'', которая может иметь 1, 2 или 3 нуклеозидных звена, таких как звенья ДНК, таких как 2 звена ДНК, связанных 2-фосфодиэфиром. Предпочтительно нуклеозиды в области F и F' представляют собой модифицированные нуклеозиды, тогда как нуклеотиды в области G предпочтительно представляют собой немодифицированные нуклеозиды.

При каждой конструкции предпочтительным модифицированным нуклеозидом является LNA.

В другом воплощении все межнуклеозидные связи в гэпе в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом воплощении все межнуклеозидные связи во флангах (области F и F') в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в области D' и D'' в гэпмере представляют собой фосфодиэфирные связи.

Для конкретных гэпмеров, как раскрыто в данном документе, при аннотации остатков цитозина (С) как 5-метил-цитозин в разных воплощениях один или более чем один С, присутствующий в олигонуклеотиде, может представлять собой немодифицированный остаток С.

В конкретном воплощении гэпмер представляет собой так называемый шортмер, как описано в WO2008/113832, включенной в данный документ посредством ссылки.

Дополнительные конструкции гэпмеров раскрыты в WO2004/046160, WO2007/146511 и включены посредством ссылки.

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO от 5_1 до 743_1 и 771_1.

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1, and 735_1.

В одном предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 287_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 342_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 640_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 466_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 566_1.

В другом воплощении изобретения непрерывная нуклеотидная последовательность олигонуклеотидных мотивов и олигонуклеотидных соединений по изобретению содержит от двух до четырех дополнительных нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью, на 5'-конце непрерывной нуклеотидной последовательности (например, области D'). В одном воплощении нуклеозиды служат в качестве биорасщепляемого линкера (см. раздел «Биорасщепляемые линкеры»). В предпочтительном воплощении динуклеотид са (цитидин-аденозин) связан с 5'-концом непрерывной нуклеотидной последовательности (т.е. с любым из мотивов последовательностей или олигонуклеотидных соединений, перечисленных в Таблице 5) посредством фосфодиэфирной связи. В предпочтительном воплощении динуклеотид са не является комплементарным последовательности-мишени в положении, где остальная часть непрерывного нуклеотида является комплементарной.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей нуклеотидных мотивов с SEQ ID NO: 766, 767, 768, 769 и 770.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 и 770_1.

Углеводные конъюгатные группировки

Углеводные конъюгатные группировки включают галактозу, лактозу, N-ацетилгалактозамин, маннозу и моннозо-6-фосфат, но не ограничиваются ими. Углеводные конъюгаты могут использоваться для увеличения доставки или активности в целом ряде тканей, таких как печень и/или мышцы. См., например, EP1495769, WO99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21. Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17.

В некоторых воплощениях углеводные конъюгатные группировки являются многовалентными, таким образом, что, например, 2, 3 или 4 идентичные или неидентичные углеводные группировки могут быть ковалентно связаны с олигонуклеотидом, возможно через линкер или линкеры. В некоторых воплощениях согласно изобретению предложен конъюгат, содержащий олигонуклеотид по изобретению и углеводную конъюгатную группировку. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка представляет собой или может содержать маннозу или маннозо-6-фосфат. Это особенно полезно для нацеливания в мышечные клетки, см., например, US 2012/122801.

Конъюгатные группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr) являются особенно полезными для нацеливания в гепатоциты в печени. В некоторых воплощениях согласно изобретению предложен конъюгат олигонуклеотида, содержащий олигонуклеотид по изобретению и конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина. Конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит одну или более чем одну углеводную группировку, способную к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (углеводные группировки, связывающиеся с ASGPr) с аффинностью, равной или большей, чем аффинность галактозы. Аффинности многочисленных производных галактозы в отношении рецептора асиалогликопротеина были исследованы (см., например, Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686) или легко определяются с использованием способов, типичных в данной области.

Одним аспектом настоящего изобретения является конъюгат антисмыслового олигонуклеотида, содержащий а) олигонуклеотид (область А), содержащий непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью к нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1; и б) по меньшей мере одну конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина (область С), ковалентно присоединенную к олигонуклеотиду в а). Олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность может быть такой, как описано в любом из разделов «Олигонуклеотиды по изобретению», «Конструкция олигонуклеотидов» и «Конструкция гэпмеров».

В некоторых воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит по меньшей мере одну углеводную группировку, связывающуюся с ASPGr, выбранную из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина и N-изобутаноилгалактозамина. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является одновалентной, двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной (т.е. содержащей 1, 2, 3 или 4 концевые углеводные группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина). Предпочтительно конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является двухвалентной, даже более предпочтительно она является трехвалентной. В предпочтительном воплощении конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит 1-3 группировки N-ацетилгалактозамина (GalNAc) (также именуемая GalNAc конъюгат). В некоторых воплощениях конъюгат олигонуклеотида содержит конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, которая является трехвалентной N-ацетилгалактозаминной (GalNAc) группировкой. GalNAc конъюгаты использовали с фосфодиэфирными, метилфосфонатными и PNA антисмысловыми олигонуклеотидами (например, US 5994517 и Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701, Biessen et al 1999 Biochem J. 340, 783-792, и Maier et al 2003 Bioconjug Chem 14, 18-29 ) и миРНК (например, WO 2009/126933, WO 2012/089352 и WO 2012/083046) и с модифицированными нуклеозидами LNA и 2'-MOE (WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620, включенные тем самым посредством ссылки).

Для получения конъюгатной группировки, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr (предпочтительно GalNAc), присоединяются к разветвляющей молекуле через C-1 углероды сахаридов. Углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, предпочтительно связываются с разветвляющей молекулой через спейсеры. Предпочтительным спейсером является гибкий гидрофильный спейсер (патент США 5885968; Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). Предпочтительным гибким гидрофильным спейсером является ПЭГ (полиэтиленгликоль) спейсер. Предпочтительным ПЭГ спейсером является ПЭГ3 спейсер (три этиленовых звена). Разветвляющей молекулой может быть любая маленькая молекула, которая допускает присоединение двух или трех концевых углеводных группировок, связывающихся с ASPGr, и дополнительно обеспечивает присоединение точки разветвления к олигонуклеотиду. Типичной разветвляющей молекулой является дилизин. Молекула дилизина содержит три аминогруппы, посредством которых три углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, могут быть присоединены к карбоксильной реакционноспособной группе, через которую дилизин может быть присоединен к олигонуклеотиду. Альтернативными разветвляющими молекулами могут быть удвоитель или утроитель, такие как поставляемые Glen Research. В некоторых воплощениях разветвляющая молекула может быть выбрана из группы, состоящей из 1,3-бис-[5-(4,4'-диметокситритилокси)пентиламидо]пропил-2-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)] фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1920-xx), три-2,2,2-[3-(4,4'-диметокситритилокси)пропилоксиметил]этил-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1922-xx), трис-2,2,2-[3-(4,4'- диметокситритилокси)пропилоксиметил]метиленоксипропил-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита и 1-[5-(4,4'-диметокси-тритилокси)пентиламидо]-3-[5-флюоренометокси-карбонил-окси-пентиламидо]-пропил-2-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1925-xx). В WO 2014/179620 и заявке PCT № PCT/EP2015/073331 описано получение разных конъюгатных группировок GalNAc (включенных тем самым посредством ссылки). Между разветвляющей молекулой и олигонуклеотидом может быть вставлен один или более чем один линкер. В предпочтительном воплощении линкер представляет собой биорасщепляемый линкер. Линкер может быть выбран из линкеров, описанных в разделе «Линкеры» и его подразделах.

Конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, в частности, конъюгатная группировка GalNAc, может быть присоединена к 3'- или 5'-концу олигонуклеотида с использованием способов, известных в данной области. В предпочтительных воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, связывается с 5'-концом олигонуклеотида.

Модуляторы фармакокинетики в отношении доставки миРНК были описаны в WO 2012/083046 (включенной тем самым посредством ссылки). В некоторых воплощениях углеводная конъюгатная группировка содержит модулятор фармакокинетики, выбранный из группы, состоящей из гидрофобной группы, имеющей 16 или более атомов углерода, гидрофобной группы, имеющей 16-20 атомов углерода, пальмитоила, гексадек-8-еноила, олеила, (9Е,12Е)-октадека-9,12-диеноила, диоктаноила, С16-С20-ацила и холестерина. В предпочтительном воплощении углеводная конъюгатная группировка, содержащая модулятор фармакокинетики, представляет собой GalNAc конъюгат.

Предпочтительные углеводные конъюгатные группировки содержат от одной до трех концевых углеводных группировок, связывающихся с ASPGr, предпочтительно группировку(ки) N-ацетилгалактозамина. В некоторых воплощениях углеводная конъюгатная группировка содержит три углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, предпочтительно N-ацетилгалактозаминные группировки, связанные через спейсер с разветвляющей молекулой. Спейсерная молекула может иметь длину от 8 до 30 атомов. Предпочтительная углеводная конъюгатная группировка содержит три концевые GalNAc группировки, связанные через ПЭГ спейсер с разветвляющей молекулой дилизином. Предпочтительно ПЭГ спейсер представляет собой 3ПЭГ. Подходящие конъюгатные группировки, нацеленные на рецептор асиалогликопротеина, показаны на Фиг. 1. Предпочтительная конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, показана на Фиг. 3.

Другие GalNAc конъюгатные группировки могут включать, например, маленькие пептиды с присоединенными GalNAc группировками, такие как Tyr-Glu-Glu-(аминогексил-GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3; гликотрипептид, который связывается с рецептором асиалогликопротеина на гепатоцитах, см., например, Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297); галактозные кластеры на основе лизина (например, L3G4; Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214); и галактозные кластеры на основе холана (например, мотив распознавания углевода для рецептора асиалогликопротеина).

В некоторых воплощениях изобретения конъюгат антисмыслового олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из следующих CPM ID NO: 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 и 770_2.

В предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 4.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 5.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 6.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 7.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 8.

Линкеры

Биорасщепляемые линкеры (область В)

Применение конъюгата часто ассоциировано с улучшенными фармакокинетическими или фармакодинамическими свойствами. Однако присутствие конъюгатной группировки может препятствовать активности олигонуклеотида против намеченной мишени, например посредством стерического препятствия, предотвращающего гибридизацию или рекрутирование нуклеазы (например, РНКазы Н). Применение физиологически лабильной связи (биорасщепляемого линкера) между олигонуклеотидом (область А или первая область) и конъюгатной группировкой (область С или третья область) обеспечивает улучшенне свойства из-за присутствия конъюгатной группировки при обеспечении того, что при нахождении в ткани-мишени конъюгатная группа не предотвращает эффективную активность олигонуклеотида.

Расщепление физиологически лабильной связи происходит спонтанно при достижении молекулой, содержащей лабильную связь, подходящей внутри- и/или внеклеточной среды. Например, рН-лабильная связь может расщепляться при поступлении молекулы в подкисленную эндосому. Таким образом, рН-лабильная связь может рассматриваться как связь, расщепляемая в эндосоме. Связи, расщепляемые ферментом, могут расщепляться при воздействии ферментов, таких как ферметы, присутствующие в эндосоме или в лизосоме, или в цитоплазме. Дисульфидная связь может расщепляться при поступлении молекулы в более восстанавливающую среду цитоплазмы клетки. Таким образом, дисульфид может рассматриваться как связь, расщепляемая в цитоплазме. рН-лабильная связь в том виде, в котором данный термин используется в данном документе, представляет собой лабильную связь, которая селективно расщепляется при кислотных условиях (рН меньше 7). Такие связи также могут называться эндосомно-лабильными связыми, так как клеточные эндосомы и лизосомы имеют рН меньше, чем 7.

Для биорасщепляемых линкеров, ассоциированных с конъюгатной группировкой для таргетной доставки, предпочтительным является то, что скорость расщепления, наблюдаемая в ткани-мишени (например, в мышце, печени, почке или опухоли), была больше, чем наблюдающаяся в сыворотке крови. Подходящие способы для определения уровня (%) расщепления в ткани-мишени относительно сыворотки или расщепления нуклеазой S1 описываются в разделе «Материаы и методы». В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер (также именуемый физиологически лабильный линкер или нуклеазочувствительный линкер, или область В) в конъюгате по изобретению расщепляется по меньшей мере примерно на 20%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 30%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 40%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 50%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 60%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 70%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 75% по сравнению со стандартом.

В некоторых воплощениях конъюгат олигонуклеотида по изобретению содержит три области: i) первую область (область А), которая содержит 10-25 смежных нуклеотидов, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени; ii) вторую область (область В), которая содержит биорасщепляемый линкер, и iii) третью область (область С), которая содержит конъюгатную группировку, такую как конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, где третья область ковалентно связана со второй областью, которая ковалентно связана с первой областью.

В одном воплощении настоящего изобретения конъюгат олигонуклеотида содержит биорасщепляемый линкер (область В) между непрерывной нуклеотидной последовательностью (область А) и конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина (область С).

В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер может находиться или на 5'-конце и/или на 3'-конце смежных нуклеотидов, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени (область А). В предпочтительном воплощении биорасщепляемый линкер находится на 5'-конце.

В некоторых воплощениях расщепляемый линкер является чувствительным к нуклеазе(зам), которые, например, могут экспрессироваться в клетке-мишени. В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер состоит из 2-5 последовательных фосфодиэфирных связей. Данный линкер может представлять собой короткую область (например, из 1-10, как подробно описано в определении линкеров) нуклеозидов, связанных фосфодиэфирными связями. В некоторых воплощениях нуклеозиды в области В биорасщепляемого линкера (возможно независимо) выбраны из группы, состоящей из нуклеозидов ДНК и РНК или их модификаций, которые не препятствуют нуклеазному расщеплению. Модификации нуклеозидов ДНК и РНК, которые не препятствуют нуклеазному расщеплению, могут представлять собой не встречающиеся в природе нуклеиновые основания. Некоторые нуклеозиды с модифицированным сахаром также могут обеспечивать нуклеазное расщепление, как, например, альфа-L-окси-LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды области В содержат (возможно независимо) либо сахар 2'-OH-рибозу (РНК), либо 2'-H сахар - т.е. РНК или ДНК. В предпочтительном воплощении по меньшей мере два последовательных нуклеозида области В представляют собой нуклеозиды ДНК или РНК (как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных нуклеозидов ДНК или РНК). В даже более предпочтительном воплощении нуклеозиды области В представляют собой нуклеозиды ДНК. Предпочтительно область В состоит из от 1 до 5 или от 1 до 4, как, например, из 2, 3, 4 последовательных нуклеозидов ДНК, связанных фосфодиэфирной связью. В предпочтительных воплощениях область В является такой короткой, что она не рекрутирует РНКазуН. В некоторых воплощениях область В содержит не больше, чем 3 или больше, чем 4 последовательных нуклеозида ДНК и/или РНК, связанных фосфодиэфирной связью (таких как нуклеозиды ДНК).

Когда область В состоит из нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью, область А и В могут вместе образовать олигонуклеотид, который связан с областью С. В данном контексте область А может отличаться от области В тем, что область А начинается с по меньшей мере одного, предпочтительно по меньшей мере двух модифицированных нуклеозидов с повышенной аффинностью связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, LNA или нуклеозиды с 2'-замещенной сахарной группировкой), и область А сама по себе способна к модуляции экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени в релевантной линии клеток. Кроме того, если область А содержит нуклеозиды ДНК или РНК, они связаны нуклеазоустойчивой межнуклеозидной связью, такой как фосфоротиоатная или боранофосфатная. Область В, с другой стороны, содержит фосфодиэфирные связи между нуклеозидами ДНК или РНК. В некоторых воплощениях область В не является комплементарной или содержит по меньшей мере 50% несоответствий с нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых воплощениях область В не является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или смежным нуклеотидам, комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени в области А.

В некоторых воплощениях область В является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В данном отношении области А и В вместе могут образовать одну непрерывную последовательность, которая является комплементарной последовательности-мишени.

В некоторых аспектах изобретения межнуклеозидная связь между первой (область А) и второй областью (область В) может рассматриваться как часть второй области.

В некоторых воплощениях последовательность оснований в области В выбрана для обеспечения оптимального сайта расщепления эндонуклеазой на основе преобладающих эндонуклеазных расщепляющих ферментов, присутствующих в ткани-мишени или в клетке-мишени, или в субклеточном компартменте-мишени. В данном отношении посредством выделения клеточных экстрактов из тканей-мишеней и тканей, не являющихся мишенями, могут быть выбраны последовательности расщепления эндонуклеазой для применения в области В на основе предпочтительной расщепляющей активности в желательной клетке-мишени (например, печени/гепатоцитах) по сравнению с клеткой, не являющейся мишенью (например, почки). В данном отношении эффективность соединения в отношении понижающей регуляции мишени может быть оптимизирована для желательной ткани/клетки.

В некоторых воплощениях область В содержит динуклеотид последовательности AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC, или GG, в которм С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидная связь представляет собой фосфодиэфирную связь. В некоторых воплощениях область В содержит тринуклеотид последовательности AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC и GGG, в которм С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодиэфирные связи. В некоторых воплощениях область В содержит тетрануклеотид последовательности AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX и GGGX, где Х может быть выбран из группы, состоящей из A, T, U, G, C и их аналогов, где С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодиэфирные связи. Будет понятно то, что при ссылке на (встречающиеся в природе) нуклеиновые основания A, T, U, G, C они могут быть заменены аналогами нуклеиновых оснований, которые функционируют как эквивалент природных нуклеиновых оснований (например, пара оснований с комплементарным нуклеозидом).

Другие линкеры (область Y)

Линкер может иметь по меньшей мере две функциональные группы: одну для присоединения олигонуклеотида и другую - для присоединения конъюгатной группировки. Типичные функциональные группы линкера могут быть электрофильными для осуществления реакции с нуклеофильными группами на олигонуклеотиде или конъюгатной группировке или нуклеофильными для осуществления реакции с электрофильными группами. В некоторых воплощениях функциональные группы линкера включают амино, гидроксил, карбоновую кислоту, тиол, фосфорамидат, фосфоротиоат, фосфат, фосфит, ненасыщенные группы (например, с двойными или тройными связями) и тому подобное. Некоторые типичные линкеры (область Y) включают 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (ADO), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-l-карбоксилат (SMCC), 6- аминогексановую кислоту (AHEX или AHA), 6-аминогексилокси, 4-аминомасляную кислоту, 4-аминоциклогексилкарбоновую кислоту, сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-l-карбокси-(6-амидо-капроат) (LCSMCC), сукцинимидил-м-малеимидо-бензоилат (MBS), сукцинимидил-N-e-малеимидо-капроилат (EMCS), сукцинимидил-6-(бета-малеимидо-пропионамидо)гексаноат (SMPH), сукцинимидил-N-(a-малеимидоацетат) (AMAS), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (SMPB), бета-аланин (бета-ALA), фенилглицин (PHG), 4-аминоциклогексановую кислоту (ACHC), бета-(циклопропил)аланин (бета-CYPR), аминододекановую кислоту (ADC), алилендиолы, полиэтиленгликоли, аминокислоты и тому подобное. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С2-С36 аминоалкильную группу, включающую, например, С6-С12 аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер (область Y) представляет собой С6 аминоалкильную группу. Аминоалкильная группа может быть добавлена к олигонуклеотиду (область А или область А-В) в качестве части стандартного синтеза олигонуклеотида, например, с использованием (например, защищенного) аминоалкилфосфорамидита. Связывающая группа между аминоалкилом и олигонуклеотдом может представлять собой, например, фосфоротиоат или фосфодиэфир, или одну из других нуклеозидных связывающих групп, на которые дается ссылка в данном документе. Аминоалкильная группа квалентно связывается с 5' или 3'-концом олигонуклеотида. Имеющиеся в продаже аминоалкильные линкеры представляют собой, например, 3'-аминомодифицирующий реактив для связывания на 3'-конце олигонуклеотида, и для связывания на 5'-конце олигонуклеотида доступен 5'-аминомодификатор С6. Данные реактивы доступны у Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Данные соединения или аналогичные соединения были использованы Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161 для связывания флюоресцеина с 5'-концом олигонуклеотида. В данной области известен широкий спектр других линкерных групп, и они могут быть полезными при присоединении конъюгатных группировок к олигонуклеотидам. Обзор многих полезных линкерных групп можно найти, например, в Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350. Другие соединения, такие как акридин, присоединяли к 3'-концевой фосфатной группе олигонуклеотида посредством полиметиленовой связи (Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297). Любую из приведенных выше групп можно использовать в качестве одиночного линкера (область Y) или в комбинации с одним или более чем одним другим линкером (область Y-Y' или область Y-B, или B-Y).

Линкеры и их применение в получении конъюгатов олигонуклеотидов приводятся во всей данной области, как, например, в WO 96/11205 и WO 98/52614 и в патентах США № 4948882; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5580731; 5486603; 5608046; 4587044; 4667025; 5254469; 5245022; 5112963; 5391723; 5510475; 5512667; 5574142; 5684142; 5770716; 6096875; 6335432 и 6335437, WO 2012/083046, каждая из которых включена посредством ссылки во всей ее полноте.

Способ изготовления

В другом аспекте согласно изобретению предложены способы изготовления олигонуклеотидов по изобретению, включающие проведение взаимодействия нуклеотидных звеньев и, посредством этого, образование ковалентно связанных смежных нуклеотидных звеньев, содержащихся в олигонуклеотиде. Предпочтительно в данном способе используется фосфорамидитная химия (см., например, Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology том 154, страницы 287-313). В другом воплощении данный способ дополнительно включает проведение взаимодействия непрерывной нуклеотидной последовательности с конъюгируемой группировкой (лигандом). В другом аспекте предложен способ изготовления композиции по изобретению, включающий смешивание олигонуклеотида или конъюгированного олигонуклеотида по изобретению с фармацевтически приемлемым разбавителем, растворителем, носителем, солью и/или адъювантом.

Фармацевтическая композиция

В другом аспекте согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая любой из вышеупомянутых олигонуклеотидов и/или конъюгатов олигонуклеотидов и фармацевтически приемлемый разбавитель, растворитель, носитель, соль и/или адъювант. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), а фармацевтически приемлемые соли включают натриевые и калиевые соли, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой стерильный фосфатно-солевой буферный раствор. В некоторых воплощениях олигонуклеотид используется в фармацевтически приемлемом разбавителе в виде раствора в концентрации 50-300 мкМ.

Подходящие препараты для применения в настоящем изобретении находятся в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985. Относительно краткого обзора способов доставки лекарственного средства, см., например, Langer (Science 249:1527-1533, 1990). В WO 2007/031091 предложены дполнительные подходящие и предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей и адъювантов (включенные тем самым посредством ссылки). Подходящие дозировки, препараты, пути введения, композиции, лекарственные формы, комбинации с другими терапевтическими агентами, препараты пролекарств также приводятся в WO 2007/031091.

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по изобретению могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами для приготовления фармацевтических композиций или препаратов. Композиции и способы для приготовления фармацевтических композиций зависят от целого ряда критериев, включающих путь введения, степень заболевания или дозу, подлежащую введению, но не ограничивающихся ими.

Данные композиции можно стерилизовать традиционными методиками стерилизации, или они могут подвергаться стерилизующему фильтрованию. Образующиеся водные растворы могут быть упакованы для применения в том виде, в котором они находятся, или лиофилизируются, причем лиофилизированный препарат объединяется со стерильным водным раствором перед введением. рН препаратов типично будет составлять от 3 до 11, более предпочтительно - от 5 до 9 или от 6 до 8, и наиболее предпочтительно - от 7 до 8, как, например, от 7 до 7,5. Образующиеся композиции в твердой форме можно упаковывать в многочисленные единичные стандартные дозы, причем каждая из них содержит фиксированное количество вышеупомянутого агента или агентов, как, например, в запечатанной упаковке или таблетках, или капсулах. Композицию в твердой форме также можно упаковывать в контейнер для гибкого количества, такой как поддающийся выдавливанию тюбик, разработанный для местно наносимого крема или мази.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида по изобретению представляет собой пролекарство. В частности, в отношении конъюгатов олигонуклеотидов конъюгатная группировка отщепляется от олигонуклеотида, как только пролекарство доставляется к месту действия, например, в клетку-мишень.

Применения

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению могут использоваться в качестве исследовательских реактивов, например, для диагностики, терапии и профилактики.

В исследовании такие олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов можно использовать для специфичной модуляции синтеза белка PD-L1 в клетках (например, в культурах клеток in vitro) и в экспериментальных животных, облегчая, посредством этого, функциональный анализ мишени или оценку ее полезности в качестве мишени для терапевтического вмешательства. Типично модуляция мишени достигается посредством осуществления деградации или ингибирования мРНК, продуцирующей белок, предотвращая, посредством этого, образование белка, или посредством осуществления деградации или ингибирования модулятора гена или мРНК, продуцирующей белок.

При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, полученную из ДНК или РНК.

Согласно настоящему изобретению предложен способ in vivo или in vitro модуляции экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспрессирует PD-L1, причем указанный способ включает введение в указанную клетку олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида по изобретению в эффективном количестве.

В некоторых воплощениях клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, в частности, человеческую клетку. Клетка-мишень может представлять собой культуру клеток in vitro или клетку in vivo, образующую часть ткани млекопитающего. В предпочтительных воплощениях клетка-мишень присутствует в печени. Клетка-мишень печени может быть выбрана из паренхимных клеток (например, гепатоцитов) и непаренхимных клеток, таких как клетки Купфера, LSEC, звездчатые клетки (или клетки Ито), холангиоциты и лейкоциты, ассоциированные с печенью (включающие Т-клетки и NK-клетки). В некоторых воплощениях клетка-мишень представляет собой антигенпрезентирующую клетку. Антигенпрезентирующие клетки подвергают дисплею чужеродные антигены, образующие комплекс с главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I или класса II на их поверхностях. В некоторых воплощениях антигенпрезентирующие клетки экспрессируют МНС класса II (т.е. профессиональные антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги и В-клетки).

При диагностике данные олигонуклеотиды могут быть использованы для выявления и количественного измерения экспрессии PD-L1 в клетке и тканях посредством норзерн-блоттинга, гибридизации in situ или аналогичных методик.

Для терапии олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению или их фармацевтические копозиции могут вводиться животному или человеку, у которого подозревается наличие заболевания или расстройства, которое может быть облегчено или вылечено посредством уменьшения экспрессии PD-L1, в частности, посредством уменьшения экспрессии PD-L1 в клетках-мишенях печени.

Согласно изобретению предложены способы лечения или предупреждения заболевания, включающие введение терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида, конъюгата олигонуклеотида или фармацевтической композиции по изобретению субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.

Данное изобретение также относится к олигонуклеотиду, конъюгату олигонуклеотида или фармацевтической композиции согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическую композицию согласно изобретению типично вводят в эффективном количестве.

Согласно изобретению также предложено применение олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида, или фармацевтической композиции по изобретению, как описано, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, на которые дается ссылка в данном документе. В одном воплощении данное заболевание выбрано из: а) вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV; б) паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, и в) рака печени или метастазов в печени.

В одном воплощении данное изобретение относится к олигонуклеотидам, конъюгатам олигонуклеотидов или фармацевтическим композициям для применения в лечении заболеваний или расстройств, выбранных из вирусных или паразитарных инфекций. В другом воплощении данное заболевание выбрано из: а) вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV; б) паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, и в) рака печени или метастазов в печени.

Заболевание или расстройство, на которые дается ссылка в данном документе, ассоциировано с истощением иммунной системы. В частности, данное заболевание или расстройство ассоциировано с истощением вирусоспецифичных ответов Т-клеток. В некоторых воплощениях заболевание или расстройство может быть облегчено или вылечено посредством уменьшения экспрессии PD-L1.

Способы по изобретению предпочтительно используют для лечения или профилактики против заболеваний, ассоциированных с истощением иммунной системы.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтические композиции по изобретению используются в восстановлении иммунного ответа против рака печени или метастазов в печени.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтические композиции по изобретению используются в восстановлении иммунного ответа против патогена. В некоторых воплощениях патоген может находиться в печени. Данными патогенами могут быть вирус или паразит, в частности, вирусы или паразиты, описанные в данном документе. В предпочтительном воплощении патоген представляет собой HBV.

Данное изобретение дополнительно относится к применению олигонуклеотида, конъюгата олигонуклеотида или фармацевтической композиции, как определено в данном документе, для изготовления лекарственного средства для восстановления иммунитета против вирусной или паразитарной инфекции, как упомянуто в данном документе.

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать в лечении вирусных инфекций, в частности, вирусных инфекций в печени, где подвержен влиянию путь PD-1 (см., например, Kapoor and Kottilil 2014 Future Virol Vol. 9 pp. 565-585 и Salem and El-Badawy 2015 World J Hepatol Vol. 7 pp. 2449-2458). Вирусные инфекции печени могут быть выбраны из группы, состоящей из вирусов гепатита, в частности HBV, HCV и HDV, в частности, хронических форм данных инфекций. В одном воплощении олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению используются для лечения HBV, в частности, хронического HBV. Показателями хронических инфекций HBV являются высокие уровни вирусной нагрузки (ДНК HBV) и даже более высокие уровни пустых частиц HВsAg (более чем 100-кратный избыток относительно вирионов) в системе кровообращения.

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению также можно использовать для лечения вирусных инфекций печени, которые наблюдаются в качестве сопутствующих инфекций ВИЧ (вирус иммунодефицита человека). Другими вирусными инфекциями, которые можно лечить олигонуклеотидами или конъюгатами олигонуклеотидов, или фармацевтическими композициями по настоящему изобретению, являются lcmv (вирус лимфоцитарного хориоменингита) и ВИЧ в качестве моноинфекции, HSV-1 и -2, и другие герпесвирусы. Данные вирусы не являются гепатотрофическими, однако, они могут быть чувствительными к понижающей регуляции PD-L1.

В некоторых воплощениях восстановление иммунитета или иммунного ответа включает улучшение ответа Т-клеток и/или NK-клеток, и/или ослабление исчерпания Т-клеток, в частности, восстанавливается HBV-специфичный Т-клеточный ответ, HСV-специфичный Т-клеточный ответ и HDV-специфичный Т-клеточный ответ. Улучшение Т-клеточного ответа, например, можно оценивать как увеличение уровня Т-клеток в печени, в частности, увеличение уровня Т-клеток CD8+ и/или CD4+ по сравнению с контролем (т.е. уровнем до обработки или уровнем у субъекта, обработанного носителем). В другом воплощении восстанавливается или возрастает именно уровень вирусоспецифичных Т-клеток CD8+ по сравнению с контролем, в частности, восстанавливается или возрастает уровень HBV-специфичных Т-клеток CD8+ или HСV-специфичных Т-клеток CD8+, или HDV-специфичных Т-клеток CD8+ по сравнению с контролем. В предпочтительном воплощении возрастает уровень Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена s HBV (HВsAg) и/или Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена e HBV (HBeAg), и/или Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена кора HBV (HBсAg), у субъектов, обработанных олигонуклеотидом, конъюгатом олигонуклеотида или фармацевтической композицией по настоящему изобретению по сравнению с контролем. Предпочтительно Т-клетки CD8+, специфичные в отношении антигена HBV, продуцируют один или более чем один цитокин, такой как интерферон-гамма (IFN-γ) или фактор некроза опухолей альфа (TNF-α). Увеличение уровня Т-клеток CD8+, описанных выше, в частности, наблюдается в печени. Описанное в данном документе увеличение должно быть статистически значимым по сравнению с контролем. Предпочтительно данное увеличение составляет по меньшей мере 20%, как, например, 25%, как, например, 50%, как, например, 75% по сравнению с контролем. В другом воплощении олигонуклеотидами или конъюгатами олигонуклеотидов по настоящему изобретению активируются природные клетки-киллеры (NK) и/или природные Т-клетки-киллеры (NKТ).

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать в лечении паразитарных инфекций, в частности, паразитарных инфекций, где подвергается влиянию путь PD-1 (см., например, Bhadra et al. 2012 J Infect Dis vol 206 pp. 125-134; Bhadra et al. 2011 Proc Natl Acad Sci U S A Vol. 108 pp. 9196-9201; Esch et al. J Immunol vol 191 pp 5542-5550; Freeman and Sharpe 2012 Nat Immunol Vol 13 pp. 113-115; Gutierrez et al. 2011 Infect Immun Vol 79 pp. 1873-1881; Joshi et al. 2009 PLoS Pathog Vol 5 e1000431; Liang et al. 2006 Eur J Immunol Vol. 36 pp 58-64; Wykes et al. 2014 Front Microbiol Vol 5 pp 249). Паразитарные инфекции могут быть выбраны из группы, состоящей из малярии, токсоплазмоза, лейшманиоза и трипаносомоза. Малярийная инфекция вызвана протистом рода Plasmodium, в частности вида P. vivax, P. malariae и P. falciparum. Токсоплазмоз представляет собой паразитарное заболевание, вызванное Toxoplasma gondii. Лейшманиоз представляет собой заболевание, вызванное протозойными паразитами рода Leishmania. Трипаносомоз вызван простейшим рода Trypanosoma. Болезнь Чагаса, которая является тропической формой, вызывается видом Trypanosoma cruzi, а расстройство сна вызывается видом Trypanosoma brucei.

В некоторых воплощениях восстановление иммунитета включает восстановление ответа паразитоспецифичных Т-клеток и NK-клеток, в частности, ответа Plasmodium-специфичных Т-клеток, ответа Toxoplasma gondii-специфичных Т-клеток и NK-клеток, ответа Leishmania-специфичных Т-клеток и NK-клеток, ответа Trypanosoma cruzi-специфичных Т-клеток и NK-клеток или ответа Trypanosoma brucei-специфичных Т-клеток и NK-клеток. В другом воплощении восстанавливается именно ответ паразитоспецифичных Т-клеток CD8+ и NK-клеток.

Введение

Олигонуклеотиды или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить местно (как, например, на кожу, посредством ингаляции, в глаз или в ухо), энтерально (как, например, перорально или через желудочно-кишечный тракт) или парентерально (как, например, внутривенно, подкожно, внутримышечно, интрацеребрально, интрацеребровентрикулярно или подоболочечно).

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводятся посредством парентрального пути, включающего внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию, внутриоболочечное или внутричерепное, например, интрацеребральное или интравентрикулярное, интравитреальное введение. В одном воплощении активный олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида вводится внутривенно. В другом воплощении активный олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида вводится подкожно.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению вводится в дозе 0,1-15 мг/кг, как, например, 0,1-10 мг/кг, как, например, 0,2-10 мг/кг, как, например, 0,25-10 мг/кг, как, например, 0,1-5 мг/кг, как, например, 0,2-5 мг/кг, как, например, 0,25-5 мг/кг. Введение может осуществляться один раз в неделю, каждую 2-ую неделю, каждую третью неделю или даже один раз в месяц.

Комбинированные терапии

В некоторых воплощениях олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению предназначены для применения в комбинированном лечении с другим терапевтическим агентом. Данный терапевтический агент может представлять собой, например, стандарт лечения для описанных выше заболеваний или расстройств.

Для лечения хронических инфекций HBV в качестве стандарта лечения рекомендуется комбинация противовирусных лекарственных средств и модуляторов иммунной системы. Эффективными противовирусными лекарственными средствами против HBV являются, например, аналоги нуклеоз(т)идов. Имеется пять аналогов нуклеоз(т)идов, лицензированных для терапии HBV, а именно: ламивудин (эпивир), адефовир (гепсера), тенофовир (виреад), телбивудин (тизека), энтекавир (бараклуд). Они являются эффективными в подавлении вирусной репликации (ДНК HBV), но не имеют влияния на уровни HВsAg. Другие антивирусные лекарственные средства включают рибавирин и терапию антителом против HBV (моноклональным или поликлональным). Модуляторами иммунной системы могут быть, например, интерферон-альфа-2а и ПЭГилированный интерферон-альфа-2а (пегасис) или агонисты TLR7 (например, GS-9620), или терапевтические вакцины. Лечение IFN-α демонстрирует лишь очень умеренный эффект в уменьшении вирусной нагрузки, но приводит к некоторому снижению уровня HВsAg, хотя и очень не эффективно (меньше 10% после 48 недель терапии).

Олигонуклеотид или конъюгаты олигонуклеотида по настоящему изобретению также могут быть объединены с другими противовирусными лекарственными средствами, эффективными против HBV, такими как антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в WO2012/145697 и WO 2014/179629, или молекулы миРНК, описанные в WO 2005/014806, WO 2012/024170, WO 2012/2055362, WO 2013/003520 и WO 2013/159109.

При введении олигонуклеотидов или конъюгатов олигонуклеотидов по данному изобретению в комбинированных терапиях с другими агентами, они могут вводиться индивиду последовательно или сопутствующе. В качестве альтернативы, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать комбинацию олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида по настоящему изобретению в ассоциации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, как описано в данном документе, и с другим терапевтическим или профилактическим агентом, известным в данной области.

ВОПЛОЩЕНИЯ

Следующие воплощения настоящего изобретения можно использовать в комбинации с любыми другими воплощениями, описанными в данном документе.

1. Антисмысловой олигонуклеотид, который содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, способный уменьшать экспрессию PD-L1.

2. Олигонуклеотид по воплощению 1, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1.

3. Олигонуклеотид по воплощению 1 или 2, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3.

4. Олигонуклеотид по воплощениям 1-3, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна области в пределах положения 1 и 15720 на SEQ ID NO: 1.

5. Олигонуклеотид по воплощениям 1-4, где данный олигонуклеотид способен гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3, с ΔG° меньше -41,8 кДж.

6. Олигонуклеотид по воплощениям 1-5, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, где данная подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из положения 371-3068, 5467-12107, 15317-15720, 15317-18083, 15317-19511 и 18881-19494 на SEQ ID NO: 1.

7. Олигонуклеотид по воплощению 6, в котором подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из положения 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 и 15690-15735 на SEQ ID NO: 1.

8. Олигонуклеотид по воплощениям 2-7, в котором нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК.

9. Олигонуклеотид по воплощению 8, где РНК представляет собой мРНК.

10. Олигонуклеотид по воплощению 9, где мРНК представляет собой пре-мРНК или зрелую мРНК.

11. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из по меньшей мере 14 непрерывных нуклеотидов, в частности, из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 непрерывных нуклеотидов.

12. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 16-20 нуклеотидов.

13. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, где данный олигонуклеотид содержит или состоит из 14-35 нуклеотидов в длину.

14. Олигонуклеотид по воплощению 13, где данный олигонуклеотид содержит или состоит из 18-22 нуклеотидов в длину.

15. Олигонуклеотид по воплощениям 1-14, где данный олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является одноцепочечной.

16. Олигонуклеотид по воплощениям 1-15, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, где данная подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из A7, A26, A43, A119, A142, A159, A160, A163, A169, A178, A179, A180, A189, A201, A202, A204, A214, A221, A224, A226, A243, A254, A258, 269, A274, A350, A360, A364, A365, A370, A372, A381, A383, A386, A389, A400, A427, A435 и A438.

17. Олигонуклеотид по воплощению 16, в котором подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из A221, A360, A180, A160 и A269.

18. Олигонуклеотид по воплощениям 1-17, где данный олигонуклеотид не является миРНК и не является комплементарным самому себе.

19. Олигонуклеотид по воплощениям 1-18, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5-743 или 771.

20. Олигонуклеотид по воплощениям 1-19, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 и 735.

21. Олигонуклеотид по воплощениям 1-20, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 466, 640, 342, 287 и 566.

22. Олигонуклеотид по воплощениям 1-21, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет от нуля до трех несоответствий по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью, которой она комплементарна.

23. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет одно несоответствие по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.

24. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет два несоответствия по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.

25. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.

26. Олигонуклеотид по воплощениям 1-25, содержащий один или более чем один модифицированный нуклеозид.

27. Олигонуклеотид по воплощению 26, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой высокоаффинные модифицированные нуклеозиды.

28. Олигонуклеотид по воплощению 26 или 27, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром.

29. Олигонуклеотид по воплощению 28, в котором один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбран из группы, состоящей из нуклеозидов 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, 2'-фтор-ANA и LNA.

30. Олигонуклеотид по воплощению 28, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид LNA.

31. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид LNA представляет собой окси-LNA.

32. Олигонуклеотид по воплощению 31, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой бета-D-окси-LNA.

33. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой тио-LNA.

34. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой амино-LNA.

35. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой сЕТ.

36. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой ENA.

37. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид LNA выбран из бета-D-окси-LNA, альфа-L-окси-LNA, бета-D-амино-LNA, альфа-L-амино-LNA, бета-D-тио-LNA, альфа-L-тио-LNA, (S)cET, (R)cET, бета-D-ENA и альфа-L-ENA.

38. Олигонуклеотид по воплощениям 30-37, в котором, помимо модифицированного нуклеозида LNA, имеется по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.

39. Олигонуклеотид по воплощению 38, в котором 2'-замещенный модифицированный нуклеозид выбран из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, 2'-фтор-ANA.

40. Олигонуклеотид по любому из воплощений 1-39, где данный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.

41. Олигонуклеотид по воплощению 40, в котором модифицированная межнуклеозидная связь является устойчивой к нуклеазе.

42. Олигонуклеотид по воплощению 40 или 41, в котором по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи или боранофосфатные межнуклеозидные связи.

43. Олигонуклеотид по воплощению 40 или 41, в котором все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

44. Олигонуклеотид по воплощениям 1-43, где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.

45. Олигонуклеотид по воплощению 44, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер.

46. Олигонуклеотид по воплощению 44 или 45, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер формулы 5'-F-G-F'-3', где области F и F' независимо содержат или состоят из 1-7 модифицированных нуклеозидов, и G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н.

47. Олигонуклеотид по воплощению 44 или 45, где гэпмер имеет формулу 5'-D'-F-G-F'-3' или 5'-F-G-F'-D''-3', где области F и F' независимо содержат 1-7 модифицированных нуклеозидов, G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н, и области D' или D'' содержат 1-5 нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью.

48. Олигонуклеотид по воплощению 47, в котором D' или D'' являются опционными.

49. Олигонуклеотид по воплощению 47, в котором область D' состоит из двух нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью.

50. Олигонуклеотид по воплощению 49, в котором нуклеозиды, связанные фосфодиэфирной связью, представляют собой са (цитидин-аденозин).

51. Олигонуклеотид по воплощению 46 или 47, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из нуклеозидов 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и LNA.

52. Олигонуклеотид по воплощениям 46-51, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F и F' представляет собой нуклеозид LNA.

53. Олигонуклеотид по воплощению 52, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды LNA.

54. Олигонуклеотид по воплощению 53, в котором область F и F' состоит из нуклеозидов LNA.

55. Олигонуклеотид по воплощениям 52-54, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды окси-LNA.

56. Олигонуклеотид по воплощению 52, в котором по меньшей мере одна из областей F и F' дополнительно содержит по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК и 2'-фтор-ДНК.

57. Олигонуклеотид по воплощениям 46-56, в котором нуклеозиды, рекрутирующие РНКазу Н, в области G независимо выбраны из ДНК, альфа-L-LNA, C4'-алкилированной ДНК, ANA, 2'-F-ANA и UNA.

58. Олигонуклеотид по воплощению 57, в котором нуклеозиды в области G представляют собой нуклеозиды ДНК и/или альфа-L-LNA.

59. Олигонуклеотид по воплощению 57 или 58, в котором область G состоит из по меньшей мере 75% нуклеозидов ДНК.

60. Олигонуклеотид по воплощениям 1-59, где данный олигонуклеотид выбран из любого олигонуклеотида CMP ID NO: от 5_1 до 743_1 и 771_1 (Таблица 5).

61. Олигонуклеотид по воплощениям 1-60, где данный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из CMP ID NO: 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1 и 735_1.

62. Олигонуклеотид по воплощениям 1-61, где данный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из CMP ID NO: 287_1, 342_1, 466_1, 640_1, 566_1, 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 и 770_1.

63. Конъюгат антисмыслового олигонуклеотида, содержащий:

а. олигонуклеотид по любому из воплощений 1-62 (область А); и

б. по меньшей мере одну конъюгатную группировку (область С), ковалентно присоединенную к указанному олигонуклеотиду.

64. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63, в котором конъюгатная группировка выбрана из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов, витаминов, вирусных белков или их комбинаций.

65. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63 или 64, в котором конъюгатная группировка представляет собой углеводсодержащую группировку.

66. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 65, в котором углеводная конъюгатная группировка содержит по меньшей мере одну группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, ковалентно присоединенную к олигонуклеотиду по любому из пп. 1-62.

67. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 66, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит по меньшей мере одну углеводную группировку, выбранную из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина и N-изобутаноилгалактозамина.

68. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 66 или 67, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является одновалентной, двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной.

69. Конъюгат олигомера по воплощению 68, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, состоит из двух-четырех концевых GalNAc группировок, ПЭГ спейсера, связывающего каждую GalNAc группировку с разветвляющей молекулой.

70. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 66-69, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, представляет собой трехвалентную N-ацетилгалактозаминную (GalNAc) группировку.

71. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 66-70, в котором конъюгатная группировка выбрана из одной из трехвалентных GalNAc группировок на Фиг. 1.

72. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 71, в котором конъюгатная группировка представляет собой трехвалентную GalNAc группировку на Фиг. 3.

73. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63-72, в котором присутствует линкер между олигонуклеотидом или непрерывной олигонуклеотидной последовательностью и конъюгатной группировкой.

74. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 73, в котором линкер представляет собой физиологически лабильный линкер (область В).

75. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 74, в котором физиологически лабильный линкер представляет собой нуклеазочувствительный линкер.

76. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 74 или 75, в котором физиологически лабильный линкер состоит из 2-5 последовательных фосфодиэфирных связей.

77. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 76, в котором физиологически лабильный линкер является эквивалентным области D' или D'', присутствующей в воплощении 47-50.

78. Конъюгат олигонуклеотида по любому из воплощений 63-77, где данный конъюгат олигонуклеотида выбран из CMP ID NO: 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 и 770_2.

79. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 78, где данный конъюгат олигонуклеотида выбран из конъюгата олигонуклеотида, представленного на Фиг. 4, 5, 6, 7 и 8.

80. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 63-76, который демонстрирует улучшенное ингибирование PD-L1 в клетке-мишени или улучшенное клеточное распределение между печенью и селезенкой, или улучшенное клеточное поглощение в печени конъюгата олигонуклеотида по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом.

81. Фармацевтическая композиция, содержащая олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль и/или адъювант.

82. Способ изготовления олигонуклеотида по воплощению 1-62, включающий проведение взаимодействия нуклеотидных звеньев, образуя, посредством этого, ковалентно связанные смежные нуклеотидные звенья, содержащиеся в олигонуклеотиде.

83. Способ по воплощению 82, дополнительно включающий проведение взаимодействия непрерывной нуклеотидной последовательности с ненуклеотидной конъюгатной группировкой.

84. Способ изготовления композиции по воплощению 81, включающий смешивание олигонуклеотида с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солью и/или адъювантом.

85. Способ in vivo или in vitro модулирования экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспресирует PD-L1, причем указанный способ включает введение олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80, или фармацевтической композиции по воплощению 81 в эффективном количестве в указанную клетку.

86. Способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80, или фармацевтической композиции по воплощению 81 субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.

87. Способ восстановления иммунитета против вируса или паразита, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества конъюгата олигонуклеотида по воплощениям 63-80 или олигонуклеотида по воплощениям 1-62, или фармацевтической композиции по воплощению 81 субъекту, инфицированному вирусом или паразитом.

88. Способ по воплощению 87, причем восстановление иммунитета представляет собой увеличение в печени Т-клеток CD8+, специфичных в отношении одного или более чем одного антигена HBV по сравнению с контролем.

89. Олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80, или фармацевтическая композиции по воплощению 81 для применения в качестве лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.

90. Применение олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.

91. Олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80, или фармацевтическая композиции по воплощению 81 для применения в восстановлении иммунитета против вируса или паразита.

92. Применение по воплощению 91, где восстановление иммунитета представляет собой увеличение в печени Т-клеток CD8+, специфичных в отношении одного или более чем одного антигена HBV по сравнению с контролем.

93. Применение по воплощению 92, где антиген HBV представляет собой HBsAg.

94. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-93, где заболевание ассоциировано с активностью PD-L1 in vivo.

95. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-94, где заболевание ассоциировано с повышенной экспрессией PD-L1 в антигенпрезентирующей клетке.

96. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 95, где экспрессия PD-L1 снижается по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% по сравнению с экспрессией без обработки или до обработки олигонуклеотидом по воплощениям 1-62 или конъюгатом по воплощениям 63-80, или фармацевтической композицией по воплощению 81.

97. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-95, где заболевание выбрано из вирусной инфекции печени или паразитарных инфекций.

98. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 98, где вирусная инфекция представляет собой HBV, HCV или HDV.

99. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-95, где заболевание представляет собой хроническую инфекцию HBV.

100. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 98, где паразитарная инфекция представляет собой малярию, токсоплазмоз, лейшманиоз или трипаносомоз.

101. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-100, где субъект представляет собой млекопитающее.

102. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 101, где млекопитающее представляет собой человека.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Мотивы последовательностей и олигонуклеотидные соединения

Таблица 5: список последовательностей олигонуклеотидных мотивов (указанных по SEQ ID NO), нацеленных на транскрипт человеческого PD-L1 (SEQ ID NO: 1), их конструкции, а также специфичные антисмысловые олигонуклеотидные соединения (указанные по CMP ID NO), разработанные на основе мотива последовательности.