Биомаркеры, прогнозирующие способность к терапевтическому ответу на терапию химерным рецептором антигена, и их применение
Владельцы патента RU 2743657:
ДЗЕ ТРАСТИЗ ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ ПЕНСИЛЬВАНИЯ (US)
НОВАРТИС АГ (CH)
Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для оценки или мониторинга эффективности терапии у индивидуума, имеющего гематологическую злокачественную опухоль. Способ оценки эффективности терапии CAR19-экспрессирующими клетками у индивидуума, имеющего гематологическую злокачественную опухоль, включает получение величины уровня CD27+ CD45RO- иммунных эффекторных клеток в популяции CD8+ T-клеток в образце, полученном от индивидуума, или в образце продукта, содержащего популяцию CAR19-экспрессирующих клеток. Более высокий процент CD27+ CD45RO- иммунных эффекторных клеток в CD8+ популяции по сравнению с числом CD27+ CD45RO- иммунных эффекторных клеток у не отвечающего индивидуума указывает на то, что индивидуум реагирует на терапию CAR19-экспрессирующими клетками. Группа изобретений также относится к способу лечения гематологической злокачественной опухоли у индивидуума, включающему введение индивидууму продукта CAR19-экспрессирующих клеток, а также к способу оценки эффективности продукта CAR19-экспрессирующих клеток. Использование данной группы изобретений позволяет оценить эффективность терапии CAR19-экспрессирующими клетками, где полная ремиссия у пациентов с CLL при иммунотерапии CART19 ассоциирована с более высокими количествами инфузируемых CD27+PD1- CART-клеток. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 23 ил., 24 табл., 7 пр.
По настоящей заявке испрашивается приоритет заявке США с серийным номером № 62/061553, поданной 8 октября 2014 года, и заявке США с серийным номером № 62/144682, поданной 8 апреля 2015 года, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка содержит список последовательностей, который предоставлен в электронной форме в формате ASCII и, таким образом, включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 7 октября 2015 года, названа N2067-7057WO_SL.txt и имеет размер 219221 байт.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к биомаркерам злокачественной опухоли и к их применению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Многие пациенты с B-клеточными злокачественными опухолями не могут быть вылечены с использованием стандартной терапии. Кроме того, традиционные варианты лечения часто имеют серьезные побочные эффекты. Были предприняты попытки иммунотерапии злокачественной опухоли, однако некоторые препятствия делают ее клиническую эффективность труднодостижимой целью. Хотя были идентифицированы сотни так называемых опухолевых антигенов, они, как правило, являются собственными по происхождению и, таким образом, слабоиммуногенными. Более того, опухоли используют несколько механизмов, которые делают их противодействующими началу и усилению иммунной атаки.
Последние разработки с использованием терапии аутологичными модифицированными химерным рецептором антигена (CAR) T-клетками (CART), которая основана на перенацеливании T-клеток на подходящую молекулу клеточной поверхности на злокачественных клетках, таких как B-клеточные злокачественные опухоли, демонстрируют перспективные результаты в отношении приспособления сил иммунной системы к лечению B-клеточных новообразований и других злокачественных опухолей (см., например, Sadelain et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)). Например, клинические результаты для CART19, которые связываются с CD19 (т.е. "CTL019"), показали перспективность в отношении установления полных ремиссий у пациентов, страдающих хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), а также детским острым лимфоцитарным лейкозом (ALL) (см., например, Kalos et al., SCI TRANSL MED 3:95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)).
Помимо способности химерного рецептора антигена на генетически модифицированных T-клетках распознавать и разрушать клетки-мишени, успешная терапия терапевтическими T-клетками должна иметь возможность пролиферации, персистирования с течением времени и дальнейшего мониторинга ускользнувших лейкозных клеток. Изменчивое фенотипическое состояние T-клеток, представляющее собой анергию, подавление или истощение, будет оказывать эффекты на эффективность трансформированных CAR T-клеток. Чтобы быть эффективными, трансформированные CAR T-клетки пациента должны персистировать и сохранять способность к пролиферации в ответ на антиген CAR.
Таким образом, существует потребность в способе применения биомаркеров для дифференциальной диагностики и лечения злокачественной опухоли с помощью терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками). В частности, существует неудовлетворенная потребность в эффективных прогностических факторах терапевтического ответа у индивидуумов, имеющих гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL, на терапию CAR-экспрессирующими клетками, например, CTL019 или другими клетками, экспрессирующими CAR против CD19.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к идентификации и применению анализируемых соединений, профилей анализируемых соединений или маркеров (например, профили экспрессии генов, проточной цитометрии и/или экспрессии белков), обладающих клинической значимостью при злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и острый лимфоцитарный лейкоз (ALL)). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к идентификационной информации о генах, экспрессия которых на уровне транскрипции и на белковом уровне коррелирует с прогрессированием CLL и ALL, например, в качестве средства для прогнозирования ответа на терапию клетками, экспрессирующими химерный рецептор антигена (CAR) (например, терапию, включающую клетку (например, иммунную эффекторную клетку или популяцию клеток), которая экспрессирует CAR, который связывается с CD19 (также обозначаемая в настоящем описании как "CAR19" или клетка, экспрессирующая "CAR против CD19"). В определенных вариантах осуществления, оценивают один или несколько из сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркера CD27, биомаркера CD45RO, биомаркера PD-1, биомаркера LAG-3, биомаркера TIM-3, биомаркера IL2RA, биомаркера IL21, биомаркера CD4, биомаркера CD8, сигнатуры набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатуры набора генов TH2+ T-хелперных клеток, сигнатуры набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например, стволовых клеток памяти (TSCM), например, центральных T-клеток памяти (ТCM), например эффекторных T-клеток памяти (ТEM)), и их комбинации. Эти профили экспрессии генов можно использовать для диагностики и/или прогнозирования злокачественной опухоли, например, гематологической злокачественной опухоли, такой как CLL и ALL, и они являются особенно пригодными для прогнозирования того, будет ли индивидуум, у которого диагностирована злокачественная опухоль, например, гематологическая злокачественная опухоль, такая как CLL или ALL, хорошо отвечать на терапию CAR (например, терапию CAR против CD19, как описано в настоящем описании, например, на терапию CTL019). По сравнению с клиническими параметрами или биохимическими маркерами, используемыми в существующих способах прогнозирования, профили экспрессии генов, описанных в настоящем описании, обеспечивают более надежные характерные признаки прогрессирования гематологической злокачественной опухоли (например, прогрессирования CLL и ALL) и обеспечивают более надежную несубъективную основу для выбора подходящих терапевтических режимов.
Среди прочего, настоящее изобретение относится к новым генным сигнатурам, например, на уровне транскрипции и на белковом уровне, которые прогнозируют ответ индивидуума на терапию клеткой, экспрессирующей CAR, например, CAR против CD19 (например, клеткой, экспрессирующей CAR против CD19, например, T-клеткой, NK-клеткой, описанной в настоящем описании, например, такой как CTL019) при злокачественной опухоли, например, гематологической злокачественной опухоли, такой как CLL и ALL, и к способам их применения.
Настоящее изобретение демонстрирует, по меньшей мере частично, что профили экспрессии и генные сигнатуры, например, на уровне транскрипции и на белковом уровне, являются пригодными для различения отвечающего индивидуума, частично отвечающего индивидуума, неотвечающего индивидуума, индивидуума, у которого возникнет рецидив, или индивидуума, у которого не возникнет рецидива, при терапии, включающей CAR-экспрессирующую клетку (например, CAR-экспрессирующую иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку) (также обозначаемой в настоящем описании как "терапия CAR-экспрессирующими клетками"), злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как CLL и ALL). В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка представляет собой клетку, экспрессирующую CAR против CD19. В одном варианте осуществления терапия представляет собой терапию CTL019. В некоторых вариантах осуществления профили экспрессии и генные сигнатуры, описанные в настоящем описании, различают индивидуума, отвечающего на клетку, экспрессирующую CAR (или CAR против CD19), индивидуума, частично отвечающего на клетку, экспрессирующую CAR (или CAR против CD19), или индивидуума, не отвечающего на клетку, экспрессирующую CAR (или CAR против CD19) (например, индивидуума, отвечающего на CTL019, индивидуума, частично отвечающего на CTL019, и индивидуума, не отвечающего CTL019); или индивидуума, у которого возникнет рецидив при терапии клеткой, экспрессирующей CAR (или CAR против CD19), или индивидуума, у которого не возникнет рецидива при терапии клеткой, экспрессирующей CAR (или CAR против CD19) (например, индивидуума, у которого возникнет рецидив при терапии CTL019, или индивидуума, у которого не возникнет рецидива при терапии CTL019), при злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как CLL и ALL). Настоящее изобретение охватывает идентификацию новых генных сигнатур, прогнозирующих ответ у индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетки, например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, такими как CTL019.
Таким образом, в рамках настоящего изобретения описаны способы, системы, композиции и наборы для идентификации, оценки и/или лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль. Иллюстративные злокачественные опухоли включают, но не ограничиваются ими, В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (B-ALL), T-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (T-ALL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), В-клеточный промиелоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина (HL), плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток и макроглобулинемию Вальденстрема. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой ALL. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой CLL. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль ассоциирована с экспрессией CD19.
Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу оценки индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, например, гематологическую злокачественную опухоль. Способ включает получение величины статуса ответа или рецидива (например, величины статуса ответа или рецидива, как описано в настоящем описании) при терапии, включающей CAR-экспрессирующую клетку (например, множество (например, популяцию) CAR (например, CAR19)-экспрессирующих клеток), для индивидуума, где указанная величина указывает на статус способности индивидуума к ответу или рецидиву при терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В родственном аспекте изобретение относится к способу оценки или мониторинга эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, например, гематологическую злокачественную опухоль. Способ включает получение величины статуса ответа или рецидива (например, величина статуса ответа или рецидива, как описано в настоящем описании) при терапии, включающей CAR-экспрессирующую клетку (например, множество (например, популяцию) CAR(например, CAR19)-экспрессирующих клеток), для индивидуума, где указанная величина указывает на эффективность терапии CAR-экспрессирующими клетками, тем самым, осуществляя оценку эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками у индивидуума.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, например, гематологическую злокачественную опухоль. Способ включает введение индивидууму терапевтически эффективной дозы терапии CAR-экспрессирующими клетками, если индивидуум идентифицирован как отвечающий (например, идентифицирован как полностью отвечающий индивидуум, частично отвечающий индивидуум или индивидуум, у которого не возникнет рецидива) на терапию, включающую CAR-экспрессирующую клетку (например, множество (например, популяцию) CAR(например, CAR19)-экспрессирующих клеток), где указанная идентификация включает определение величины статуса ответа или рецидива (например, определение величины статуса ответа или рецидива, как описано в настоящем описании).
В родственном аспекте изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, например, гематологической злокачественной опухоли, у индивидуума. Способ включает получение величины статуса ответа или рецидива (например, величины статуса ответа или рецидива, как описано в настоящем описании) на терапию, включающую CAR-экспрессирующую клетку (например, множество (например, популяцию) CAR(например, CAR19)-экспрессирующих клеток), для индивидуума; и, после получения указанной величины, лечение злокачественной опухоли.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, величина статуса ответа или рецидива включает один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более (все) из следующих показателей:
(i) уровень или активность CD27 и/или CD45RO- (например, CD27+ CD45RO-) иммунных эффекторных клеток, например, в популяции CD4+ или CD8+ T-клеток, у индивидуума, например, в образце от индивидуума (например, образец, полученный посредством афереза, или образец продукта CAR-экспрессирующих клеток);
(ii) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) из покоящихся клеток TEFF, покоящихся клеток TREG, более молодых T-клеток (например, более молодых CD4 или CD8 клеток, или гамма/дельта T-клеток), или ранних T-клеток памяти или их комбинации, у индивидуума, например, в образце от индивидуума (например, образец, полученный посредством афереза, или образец продукта CAR-экспрессирующих клеток);
(iii) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) из активированных клеток TEFF, активированных клеток TREG, более старых T-клеток (например, более старых CD4 или CD8 клеток), или поздних T-клеток памяти или их комбинации, у индивидуума, например, в образце от индивидуума (например, образец, полученный посредством афереза, или произведенный образец продукта CAR-экспрессирующих клеток);
(iv) уровень или активность маркера истощения иммунных клеток, например, одного, двух или нескольких ингибиторов иммунной точки контроля (например, PD-1, TIM-3 и/или LAG-3) у индивидуума, например, в образце от индивидуума (например, образец, полученный посредством афереза, или произведенный образец продукта CAR-экспрессирующих клеток);
(v) уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати или более из биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 16, таблице 17, таблице 18, таблице 20, на фиг.2B, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1 или сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19;
(vi) уровень или активность цитокинов (например, качество набора цитокинов) в образце продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, в образце продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019), где цитокин выбран из одного, двух, трех, четырех, пяти или более (или всех) из цитокинов, приведенных в таблице 16;
(vii) эффективность трансдукции CAR-экспрессирующих клеток в образце продукта CAR-экспрессирующих клеток; или
(viii) количество CD27+ PD-1- клеток у индивидуума, например, в образце от индивидуума (например, образец, полученный посредством афереза, или образец продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, в образце продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019)), например, количество, превышающее или равное 1×107 клеток.
В одном аспекте изобретение относится к терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, CART-клеткой против CD19, например, клеткой CTL019) для применения для лечения индивидуума, где CAR-экспрессирующие клетки анализируют способом, описанным в настоящем описании, например, до или после трансдукции или трансфекции нуклеиновой кислотой CAR. В родственном аспекте изобретение относится к терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, CART-клеткой против CD19, например, CTL019-клеткой), для применения для лечения индивидуума, который идентифицирован как отвечающий (например, идентифицирован как полностью отвечающий, частично отвечающий индивидуум или индивидуум, у которого не возникнет рецидива) на терапию, включающую популяцию CAR-экспрессирующих клеток (например, популяцию CAR19-экспрессирующих клеток). Композиция для применения может обеспечивать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более (все) из (i)-(viii) измеренных показателей, описанных в настоящем описании.
Альтернативно или в комбинации со способами и композициями для применения, описанными в настоящем описании, после определения указанной величины проводят одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более (например, все) из:
идентификации индивидуума как полностью отвечающего, частично отвечающего или не отвечающего индивидуума, или индивидуума, у которого возникнет рецидив, или индивидуума, у которого не возникнет рецидива;
проведения, например, у отвечающего индивидуума или индивидуума, у которого не возникнет рецидива, терапии CAR-экспрессирующими клетками;
проведения измененного дозирования терапии CAR-экспрессирующими клетками;
изменения схемы или длительности терапии CAR-экспрессирующими клетками;
введения, например, не отвечающему индивидууму или частично отвечающему индивидууму, дополнительного средства в комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками, например, ингибитора точки контроля, например, ингибитора точки контроля, описанного в настоящем описании;
проведения у не отвечающего индивидуума или частично отвечающего индивидуума терапии, которая увеличивает количество более молодых T-клеток у индивидуума, перед проведением терапии CAR-экспрессирующими клетками;
модификации процесса терапии, например, процесса производства CAR-экспрессирующих клеток, например, увеличения содержания более молодых T-клеток перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, или увеличение эффективности трансдукции, например, для индивидуума, идентифицированного как не отвечающий индивидуум или частично отвечающий индивидуум;
проведения альтернативной терапии, например, для не отвечающего индивидуума, или частично отвечающего индивидуума, или индивидуума, у которого возникнет рецидив, например, стандартной терапии конкретного типа злокачественной опухоли; или
если индивидуум представляет собой или идентифицирован как не отвечающий индивидуум или индивидуум, у которого возникнет рецидив, снижения популяции клеток TREG и/или показателей генной сигнатуры TREG, например, посредством одного или нескольких из истощения CD25 или введения циклофосфамида, антитела против GITR, ингибитора mTOR или их комбинации.
В определенных вариантах осуществления индивидуума предварительно лечат антителом против GITR. В определенном варианте осуществления индивидуума лечат антителом против GITR перед инфузией или реинфузией.
В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой пациента с CLL.
В другом аспекте изобретение относится к способу или анализу для идентификации индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, как имеющего увеличенную или уменьшенную вероятность ответа на лечение, которое включает CAR-экспрессирующую клетку (например, множество (например, популяцию) CAR(например, CAR19)-экспрессирующих клеток). Способ включает:
(1) предоставление, например, получение, образца от индивидуума;
(2) определение уровня или активности одного или нескольких из биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1 в образце;
где различие, например, статистически значимое различие, между определенным уровнем по сравнению с эталонным уровнем прогнозирует способность индивидуума отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками; и
(3) (необязательно) идентификацию индивидуума как полностью отвечающего индивидуума, частично отвечающего индивидуума, не отвечающего индивидуума, индивидуума, у которого возникнет рецидив, или индивидуума, у которого не возникнет рецидива, на терапию CAR-экспрессирующими клетками.
В другом аспекте, изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, включающему:
определение того, имеет ли индивидуум увеличенную вероятность ответа или уменьшенную вероятность рецидива при терапии CAR-экспрессирующии клетками (например, терапия CAR19-экспрессирующими клетками, например, CTL019) путем определения уровня или активности одного или нескольких из биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), на фиг.2B, в таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, или сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, в образце индивидуума, например, относительно эталонного уровня; и
введение индивидууму терапевтически эффективной дозы терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, включающему:
(1) определение того, имеет ли индивидуум увеличенную вероятность рецидива при терапии CAR-экспрессирующими клетками, путем получения величины уровня или активности одного или нескольких маркеров, приведенных в таблицах настоящего описания, например, в таблице 17, в образце от индивидуума (например, образец, полученный посредством афереза, или произведенный образец CAR-экспрессирующего продукта), где отличие, например, статистически значимое отличие, уровня или активности одного или нескольких биомаркерных генов относительно эталонной величины указывает на увеличенную вероятность рецидива при терапии CAR-экспрессирующими клетками; и
(2) для индивидуума с увеличенной вероятностью рецидива, снижение популяции клеток TREG и/или показателей генной сигнатуры TREG; и
(3) введение индивидууму терапевтически эффективной дозы терапии CAR-экспрессирующими клетками.
Дополнительные признаки и варианты осуществления настоящего изобретения включают одно или несколько из следующих.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, иммунная клетка имеет фенотип истощения, например, совместно экспрессирует по меньшей мере два маркера истощения, например, совместно экспрессирует PD-1 и TIM-3. В других вариантах осуществления иммунная клетка имеет фенотип истощения, например, совместно экспрессирует по меньшей мере два маркера истощения, например, совместно экспрессирует PD-1 и LAG-3.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов, систем, композиций для применения и наборов, описанных в настоящем описании терапия CAR-экспрессирующими клетками включает множество (например, популяцию) CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток, например, множество (например, популяцию) T-клеток или NK-клеток, или их комбинацию. В одном варианте осуществления терапия CAR-экспрессирующими клетками представляет собой терапию CAR19 (например, терапию CTL019). В одном варианте осуществления терапия CAR-экспрессирующими клетками включает или состоит из CTL019. В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка представляет собой продукт CTL019. В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка представляет собой T-клетку. В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка представляет собой NK-клетку.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, один или несколько показателей из (i)-(viii) получают для образца индивидуума, полученного посредством афереза. Образец, полученный посредством афереза, можно оценивать до инфузии или реинфузии.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, один или несколько из показателей (i)-(viii) получают для образца произведенного продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, образца продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019). Произведенный продукт CAR-экспрессирующих клеток можно оценивать до инфузии или реинфузии.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, индивидуума оценивают до, в процессе или после проведения терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, гематологическая злокачественная опухоль представляет собой ALL или CLL. Индивидуум может представлять собой пациента-человека.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, клетку, например, популяцию иммунных эффекторных клеток (например, клетки, экспрессирующие молекулу CAR, описанную в настоящем описании) вводят в комбинации с ингибитором молекулы иммунной точки контроля, выбранным из одного или нескольких из PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозина, TGFR (например, TGFR-бета) или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, индивидууму проводят сопутствующее лечение средством, например, ингибитором mTOR и/или ингибитором точки контроля. В некоторых вариантах осуществления индивидууму проводят лечение средством, например, ингибитором mTOR и/или ингибитором точки контроля, после терапии CAR-эспрессирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления индивидууму проводят предварительное лечение средством, например, ингибитором mTOR и/или ингибитором точки контроля, до начала терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, популяцию клеток TREG и/или показатели генной сигнатуры TREG снижают до сбора клеток для производства. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток TREG и/или показатели генной сигнатуры TREG снижают до терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток TREG и/или показатели генной сигнатуры TREG снижают посредством введения циклофосфамида, антитела против GITR, ингибитора mTOR или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, величина статуса ответа или рецидива включает показатель комбинации генной сигнатуры и биомаркера. В некоторых вариантах осуществления величина статуса ответа или рецидива включает показатель сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, и комбинации одного или нескольких из: биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L или KLRG1.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, способ дополнительно включает идентификацию индивидуума как отвечающего (например, полностью отвечающего или частично отвечающего) индивидуума, не отвечающего индивидуума, индивидуума, у которого возникнет рецидив, или индивидуума, у которого не возникнет рецидива, на основании одного или нескольких из (i)-(viii).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, один или несколько показателей из (i)-(viii) оценивает один или несколько из профилей экспрессии генов, проточной цитометрии или экспрессии белка.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, профиль экспрессии включает одну или несколько генных сигнатур на основе уровней экспрессии мРНК выбранных генов, полученной из образца, полученного посредством афереза, или образца произведенного продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, CTL019). В одном варианте осуществления профиль экспрессии включает один, два, три, четыре, пять, десять, двадцать или более биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 16, таблице 17, таблице 18, таблице 20, на фиг.2B, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, или сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, уровень или активность CD8+ T-клеток оценивают с использованием профиля или сигнатуры, указывающих на процент CD8+ T-клеток в образце.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, уровень или активность CD27+ CD45RO- иммунных эффекторных клеток оценивают с использованием профиля или сигнатуры, указывающих на процент CD27+ CD45RO- иммунных эффекторных клеток в образце.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, уровень или активность, например, в (i), (ii) или (v), оценивают с использованием профиля или генной сигнатуры согласно одному, двум, трем, четырем, пяти, десяти, двадцати, пятидесяти, шестидесяти, семидесяти, ста или более биомаркеров или наборов генов, приведенных в таблицах 1A, 1B, 3, 4, 5, 6 или на фиг.2B.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, уровень или активность одного, двух или более ингибиторов иммунной точки контроля оценивают, например, с использованием проточной цитометрии, в качестве индикатора процента PD-1+/LAG-3+ клеток в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CAR19+ клеток).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, уровень или активность одного, двух или более ингибиторов иммунной точки контроля оценивают, например, с использованием проточной цитометрии, в качестве индикатора процента PD-1+/TIM-3+ клеток в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CAR19+ клеток).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати, пятидесяти, шестидесяти, семидесяти ста или более биомаркеров или наборов генов, приведенных в таблице 7A, таблице 7B, таблице 8 и на фиг.2B, прогнозируют ответ индивидуума на продукт CAR19+ клеток (например, CTL019).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, величина статуса ответа или рецидива включает показатель уровня или активности одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати или более (например, всех) биомаркеров, имеющих данное значение p FDR, приведенных в настоящем описании, например, в таблице настоящего описания. В некоторых вариантах осуществления значение p FDR составляет менее 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002 или 0,001. В некоторых вариантах осуществления значение p FDR составляет менее 0,1 или 0,01. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры представляют собой биомаркеры, приведенные в таблице 1A, таблице 1B, таблице 16, таблице 17, таблице 18 или таблице 20, или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель для всех биомаркеров, приведенных в таблице 1A, которые имеют значение p ниже порогового уровня 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002 или 0,001. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель для всех биомаркеров, приведенных в таблице 1B, которые имеют значение p ниже порогового уровня 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002 или 0,001. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель для всех биомаркеров, приведенных в таблице 16, которые имеют значение p ниже порогового уровня 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002 или 0,001. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель для всех биомаркеров, приведенных в таблице 17, которые имеют значение p ниже порогового уровня 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002 или 0,001. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель для всех биомаркеров, приведенных в таблице 18, которые имеют значение p ниже порогового уровня 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002 или 0,001. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель для всех биомаркеров, приведенных в таблице 20, которые имеют значение p ниже порогового уровня 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002 или 0,001. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель для всех биомаркеров, имеющих значение p ниже порогового уровня. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель для одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати, пятидесяти или ста биомаркеров, имеющих значение p ниже порогового уровня. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель по меньшей мере для одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати, пятидесяти или ста биомаркеров, имеющих значение p ниже порогового уровня. В некоторых вариантах осуществления показатель включает показатель для 1-5, 5-10, 10-20, 20-50 или 50-100 биомаркеров, имеющих значение p ниже порогового уровня.
В некоторых вариантах осуществления биомаркеры, приведенные в таблице 7B, которые обозначены как "CR" в таблице, активированы у полностью отвечающих индивидуумов по сравнению с не отвечающими индивидуумами. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры, приведенные в таблице 7B, которые обозначены как "NR" в таблице, активированы у не отвечающих индивидуумов по сравнению с полностью отвечающими индивидуумами.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, биомаркер представляет собой секретируемый биомаркер или биомаркер клеточной поверхности, приведенный в таблице 8. Например, количественное определение биомаркера можно проводить посредством проточной цитометрии.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, отвечающий индивидуум (например, полностью отвечающий индивидуум) имеет или идентифицирован как имеющий более высокий уровень или активность одного, двух или более (всех) из GZMK, PPF1BP2 или наивных T-клеток по сравнению с не отвечающим индивидуумом.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, не отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий, более высокий уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или более (например, всех) из IL22, IL-2RA, IL-21, IRF8, IL8, CCL17, CCL22, эффекторных T-клеток или регуляторных T-клеток, по сравнению с отвечающим индивидуумом.
В одном варианте осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, индивидуум, у которого возникнет рецидив, представляет собой пациента, имеющего или идентифицированного как имеющий увеличенный уровень экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4 или всех из) следующих генов по сравнению с индивидуумами, у которых не возникнет рецидива: MIR199A1, MIR1203, uc021ovp, ITM2C и HLA-DQB1, и/или сниженный уровень экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или всех) из следующих генов по сравнению с индивидуумами, у которых не возникнет рецидива: PPIAL4D, TTTY10, TXLNG2P, MIR4650-1, KDM5D, USP9Y, PRKY, RPS4Y2, RPS4Y1, NCRNA00185, SULT1E1 и EIF1AY.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, полностью отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий, например, более высокий на статистически значимом уровне, процент CD8+ T-клеток по сравнению с эталонной величиной, например, процентом CD8+ T-клеток у не отвечающих индивидуумов.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, полностью отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент (например, 5%, 6%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 27%, 30%, 35%, или 40% или более) CD27+ CD45RO- иммунных эффекторных клеток, например, в популяции CD8+, по сравнению с эталонной величиной, например, количеством CD27+ CD45RO- иммунных эффекторных клеток у не отвечающего индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, полностью отвечающий индивидуум или частично отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий, например, более высокий на статистически значимом уровне, процент CD4+ T-клеток по сравнению с эталонной величиной, например, процентом CD4+ T-клеток у не отвечающего индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, полностью отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент одного, двух, трех или более (например, всех) из покоящихся клеток TEFF, покоящихся клеток TREG, более молодых T-клеток (например, более молодых CD4 или CD8-клеток, или гамма/дельта T-клеток), или ранних T-клеток памяти или их комбинации, по сравнению с эталонной величиной, например, количеством покоящихся клеток TEFF, покоящихся клеток TREG, более молодых T-клеток (например, более молодых CD4 или CD8 клеток) или ранних T-клеток памяти, у не отвечающего индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, не отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент одного, двух, трех или более (например, всех) из активированных клеток TEFF, активированных клеток TREG, более старых T-клеток (например, более старых CD4 или CD8 клеток), или поздних T-клеток памяти или их комбинации, по сравнению с эталонной величиной, например, количеством активированных клеток TEFF, активированных клеток TREG, более старых T-клеток (например, более старых CD4 или CD8 клеток), или поздних T-клеток памяти, у отвечающего индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, не отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент маркера истощения иммунных клеток, например, одного, двух или нескольких ингибиторов иммунной точки контроля (например, PD-1, TIM-3 и/или LAG-3). В одном варианте осуществления не отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент экспрессирующих PD-1 или LAG-3 иммунных эффекторных клеток (например, CD4+ T-клеток и/или CD8+ T-клеток) (например, CAR-экспрессирующих CD4+ клеток и/или CD8+ T-клеток) по сравнению с процентом экспрессирующих PD-1 или LAG-3 иммунных эффекторных клеток у отвечающего индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, не отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент иммунных клеток, имеющих фенотип истощения, например, иммунных клеток, которые коэкспрессируют по меньшей мере два маркера истощения, например, коэкспрессируют PD-1 и TIM-3. В других вариантах осуществления не отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент иммунных клеток, имеющих фенотип истощения, например, иммунных клеток, которые совместно экспрессируют по меньшей мере два маркера истощения, например, совместно экспрессируют PD-1 и LAG-3.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, не отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент PD-1+/LAG-3+ клеток в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CAR19+ клеток) по сравнению с отвечающим индивидуумом (например, полностью отвечающим индивидуумом) при терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, частично отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент PD-1+/LAG-3+ клеток, чем отвечающий индивидуум, в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, в популяции CAR19+ клеток).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, не отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий фенотип истощения PD1+ CAR+ и коэкспрессию LAG3 в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CAR19+ клеток).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, не отвечающий индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент PD-1+/TIM-3+ клеток в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CAR19+ клеток) по сравнению с отвечающим индивидуумом (например, полностью отвечающим индивидуумом).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, частично отвечающие индивидуумы имеют или идентифицированы как имеющие более высокий процент PD-1+/TIM-3+ клеток, чем отвечающие индивидуумы, в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, в популяции CAR19+ клеток).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, присутствие CD8+ CD27+ CD45RO- T-клеток в образце, полученном посредством афереза, является положительным прогностическим фактором для ответа индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию CAR19 (например, терапию CTL019)).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, высокий процент PD1+ CAR+ и LAG3+ или TIM3+ T-клеток в образце, полученном посредством афереза, является фактором плохого прогноза для ответа индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию CAR19 (например, терапию CTL019)).
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, отвечающий индивидуум (например, полностью отвечающий индивидуум) на терапию CAR19 имеет или идентифицирован как имеющий профиль биомаркеров, приведенный в таблице 9.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, не отвечающий индивидуум на терапию CAR19 имеет или идентифицирован как имеющий биомаркер, включающий один или несколько из PD-1+ иммунных эффеткорных клеток, TIM-3+ иммунных эффекторных клеток, LAG-3+ иммунных эффекторных клеток, KLRG1+ иммунных эффекторных клеток, CD27-иммунных эффекторных клеток, активированных клеток TEFF, активированных клеток TREG, активированных TH1, активированных TH2, стимулированных клеток памяти или поздних T-клеток памяти, или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, не отвечающий индивидуум на терапию CAR19 имеет или идентифицирован как имеющий профиль биомаркеров, приведенный в таблице 10.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, экспрессия одного, двух, трех, четырех или более (всех) из KLRG1, CD57, CD27, CD122 или CD62L является прогностическим фактором ответа пациента на терапию CTL019.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, индивидуум, у которого не возникнет рецидива, представляет собой пациента с B-ALL, и он имеет или идентифицирован как имеющий один или несколько профилей экспрессии (например, профилей экспрессии белков или генов) или генных сигнатур, характерных для покоящихся клеток TEFF или покоящихся клеток TREG.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, пациент, у которого возникнет рецидив, представляет собой пациента с B-ALL, и он имеет или идентифицирован как имеющий один или несколько профилей экспрессии (например, профилей экспрессии белков или генов) или генных сигнатур, характерных для активированных клеток TEFF или активированных клеток TREG.
В некоторых вариантах осуществления любых из вышеуказанных способов и композиций для применения, клетка TREG (например, активированная клетка TREG) имеет повышенную экспрессию одного или нескольких (например, по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или всех) из следующих биомаркеров: AIM2, ALAS1, BATF, C5orf32, CCL17, CD40LG, CHAC2, CSF1, CTSL1, EBNA1BP2, EDARADD, EMP1, EPAS1, FABP5, FAM40B, FKBP4, FOSL1, GCLM, GK, GPR56, HMOX1, HSPD1, HSPE1, IKBIP, IL10, IL13, IL15RA, IL1RN, IL2RA, IL3, IL4, IL5, IL9, KCNK5, LTA, MANF, MIR1182, MIR155, MIR155HG, MYOF, NDUFAF1, NLN, NME1, NME1-NME2, PANX2, PDIA6, PGAM4, PPIL1, PPPDE2, PRDX4, PRKAR1B, PSMD1, PSMD11, PUS7, RBBP8, SLC27A2, SLC39A14, SLC43A3, SRXN1, STIP1, STT3A, TBX21, TNFRSF11A, TNFRSF1B, TNFRSF8, TNFRSF9, TXN, UCK2, VDR, VTRNA1-3, WDR12, YWHAG, ZDHHC16 или ZNF282. Повышенную экспрессию можно измерять, например, через 16 часов после стимуляции. Повышенную экспрессию можно определять, например, путем измерения уровней РНК указанных генов.
В некоторых вариантах осуществления любых из вышеупомянутых способов и композиций для применения, клетка TEFF (например, активированная клетка TEFF) имеет повышенную экспрессию одного или нескольких (например, по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или всех) из следующих биомаркеров: AIM2, ALAS1, B4GALT5, BATF, C3orf26, C4orf43, CCL3, CCL4, ССТЗ, CCT7, CD40LG, CHAC2, CSF2, CTNNA1, EBNA1BP2, EDARADD, EEF1E1, EIF2B3, EIF2S1, FABP5, FAM40B, FKBP4, FOSL1, GFOD1, GLRX2, HSPD1, HSPE1, IFNG, IL15RA, IL21, IL2RA, IL3, KCNK5, KIAA0020, LARP4, LRP8, LTA, MANF, MIR1182, MIR155, MIR155HG, MTCH2, MYOF, NDUFAF1, NLN, NME1, NME1-NME2, OTUD7B, PAM, PDIA6, PEA15, PFKM, PGAM1, PGAM4, PPIL1, PRDX4, PRSS23, PSMD1, PSMD11, PSMD14, PTRH2, PUS7, RBBP8, RPF2, RPP25, SFXN1, SLC27A2, SLC39A14, SLC43A3, SORD, SPR, SRXN1, STIP1, STT3A, TBX21, TMCC2, TMEM165, TNFRSF9, TXN, TXNDC5, UCK2, VDR, WDR12, YWHAG или ZDHHC16. Повышенную экспрессию можно измерять, например, через 16 часов после стимуляции. Повышенную экспрессию можно определять, например, путем измерения уровней РНК указанных генов.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, индивидуум, у которого возникнет рецидив, представляет собой пациента с B-ALL, и он имеет или идентифицирован как имеющий один или несколько профилей экспрессии белков или генов, включающих один, два, три, четыре, пять, десять или более генов согласно таблице 7A, таблице 7B или фиг.2B или их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, индивидуум, у которого возникнет рецидив, имеет или идентифицирован как имеющий повышенный уровень одного или нескольких биомаркеров клеток TREG или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, у которого возникнет рецидив, имеет или идентифицирован как имеющий повышенную экспрессию одного или нескольких (например, по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или всех) из следующих генов: AIM2, AFAS1, BATF, C5orf32, CCL17, CD40LG, CHAC2, CSF1, CTSL1, EBNA1BP2, EDARADD, EMP1, EPAS1, FABP5, FAM40B, FKBP4, FOSL1, GCLM, GK, GPR56, HMOX1, HSPD1, HSPE1, IKBIP, IL10, IL13, IL15RA, IL1RN, IL2RA, IL3, IL4, IL5, IL9, KCNK5, LTA, MANF, MIR1182, MIR155, MIR155HG, MYOF, NDUFAF1, NLN, NME1, NME1-NME2, PANX2, PDIA6, PGAM4, PPIL1, PPPDE2, PRDX4, PRKAR1B, PSMD1, PSMD11, PUS7, RBBP8, SLC27A2, SLC39A14, SLC43A3, SRXN1, STIP1, STT3A, TBX21, TNFRSF11A, TNFRSF1B, TNFRSF8, TNFRSF9, TXN, UCK2, VDR, VTRNA1-3, WDR12, YWHAG, ZDHHC16 или ZNF282. В определенном варианте осуществления индивидуум, у которого возникнет рецидив, имеет или идентифицирован как имеющий повышенную экспрессию одного или нескольких (например, по меньшей мере 10, 20, 25 или всех) из следующих генов: C5orf32, CCL17, CSF1, CTSL1, EMP1, EPAS1, GCLM, GK, GPR56, HMOX1, IKBIP, IL10, IL13, IL1RN, IL4, IL5, IL9, MIR155, PANX2, PGAM4, PRKAR1B, TNFRSF11A, TNFRSF1B, TNFRSF8, VTRNA1-3 или ZNF282. Повышенную экспрессию можно измерять, например, через 16 часов после стимуляции. Повышенную экспрессию можно определять, например, путем измерения уровня РНК указанных генов.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий повышенный уровень одного или нескольких биомаркеров клеток TEFF или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий повышенную экспрессию одного или нескольких (например, по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или всех) из следующих генов: AIM2, ALAS1, B4GALT5, BATF, C3orf26, C4orf43, CCL3, CCL4, CCT3, CCT7, CD40LG, CHAC2, CSF2, CTNNA1, EBNA1BP2, EDARADD, EEF1E1, EIF2B3, EIF2S1, FABP5, FAM40B, FKBP4, FOSL1, GFOD1, GLRX2, HSPD1, HSPE1, IFNG, IL15RA, IL21, IL2RA, IL3, KCNK5, KIAA0020, LARP4, LRP8, LTA, MANF, MIR1182, MIR155, MIR155HG, MTCH2, MYOF, NDUFAF1, NLN, NME1, NME1-NME2, OTUD7B, PAM, PDIA6, PEA15, PFKM, PGAM1, PGAM4, PPIL1, PRDX4, PRSS23, PSMD1, PSMD11, PSMD14, PTRH2, PUS7, RBBP8, RPF2, RPP25, SFXN1, SLC27A2, SLC39A14, SLC43A3, SORD, SPR, SRXN1, STIP1, STT3A, TBX21, TMCC2, TMEM165, TNFRSF9, TXN, TXNDC5, UCK2, VDR, WDR12, YWHAG или ZDHHC16. В определенном варианте осуществления индивидуум имеет или идентифицирован как имеющий повышенную экспрессию одного или нескольких (например, по меньшей мере 10, 20, 25 или всех) из следующих генов: B4GALT5, C3orf26, C4orf43, CCL3, CCL4, ССТЗ, CCT7, CSF2, CTNNA1, EEF1E1, EIF2B3, EIF2S1, GFOD1, GLRX2, IL21, IL2RA, IL3, KIAA0020, LARP4, LRP8, OTUD7B, РАМ, PEA15, PFKM, PGAM1, PGAM4, PRSS23, PSMD1, PSMD11, PSMD14, PTRH2, RPF2, SORD, SPR, TMCC2, TMEM165 или TXNDC5. Повышенную экспрессию можно измерять, например, через 16 часов после стимуляции. Повышенную экспрессию можно определять, например, путем измерения уровней РНК указанных генов.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, отвечающий индивидуум (например, полностью или частично отвечающий индивидуум) имеет один, два, три или более (или все) из следующих профилей:
(i) имеет увеличенное количество CD27+ иммунных эффекторных клеток по сравнению с эталонной величиной, например, количеством CD27+ иммунных эффекторных клеток у не отвечающего индивидуума;
(ii) имеет большее количество CD8+ T-клеток по сравнению с эталонной величиной, например, количеством CD8+ T-клеток у не отвечающего индивидуума;
(iii) имеет более низкое количество иммунных клеток, экспрессирующих один или несколько ингибиторов точки контроля, например, ингибиторов точки контроля, выбранных из PD-1, LAG-3, TIM-3 или KLRG-1, или их комбинации, по сравнению с эталонной величиной, например, количеством клеток, экспрессирующих один или несколько ингибиторов точки контроля, у не отвечающего индивидуума; или
(iv) имеет более высокое количество одной, двух, трех, четырех или более (всех) из покоящихся клеток TEFF, покоящихся клеток TREG, более молодых клеток, наивных клеток CD4, нестимулированных клеток памяти или ранних T-клеток памяти, или их комбинации, по сравнению с эталонной величиной, например, количеством покоящихся клеток TEFF, покоящихся клеток TREG, более молодых клеток, наивных клеток CD4, нестимулированных клеток памяти или ранних T-клеток памяти, у не отвечающих индивидуумов.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, уровень или активность цитокинов, например, согласно (vi), выбраны из уровня или активности одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или более (или всех) из цитокинов CCL20/MIP3a, IL17A, IL6, GM-CSF, IFN γ, IL10, IL13, IL2, IL21, IL4, IL5, IL9 или TNFα, или их комбинации. Цитокин может быть выбран из одного, двух, трех, четырех или более (всех) из IL-17a, CCL20, IL2, IL6 или TNFα. В одном варианте осуществления увеличенный уровень или активность цитокинов, выбранных из одного или обоих из IL-17a и CCL20, указывает на увеличенную способность к ответу или сниженную способность к рецидиву. В некоторых вариантах осуществления уровень цитокинов измеряют после активации T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, эффективность трансдукции 15% или выше, например, согласно (vii), указывает на увеличенную способность к ответу или сниженную способность к рецидиву.
В некоторых вариантах осуществления любых из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, эффективность трансдукции менее 15%, например, согласно (vii), указывает на сниженную способность к ответу или увеличенную способность к рецидиву.
В другом аспекте изобретение относится к способу идентификации индивидуума, который вероятно будет отвечать (например, полностью отвечающего индивидуума или частично отвечающего индивидуума, индивидуума, у которого не возникнет рецидива) на терапию, включающую CAR-экспрессирующие клетки (например, T-клетки, NK-клетки) (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, например, описанными в настоящем описании, например, терапию CTL019). В одном варианте осуществления статус ответа (например, полностью отвечающий индивидуум, частично отвечающий индивидуум, не отвечающий индивидуум, индивидуум, у которого возникнет рецидив, или индивидуум, у которого не возникнет рецидива, на терапию, включающую CAR-экспрессирующие клетки (например, T-клетки, NK-клетки)) определяют путем измерения одного или нескольких из сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркера CD27, биомаркера CD45RO, биомаркера PD-1, биомаркера LAG-3, биомаркера TIM-3, биомаркера IL2RA, биомаркера IL21, биомаркера CD4, биомаркера CD8, сигнатуры набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатуры набора генов TH2+ T-хелперных клеток, сигнатуры набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например, стволовых клеток памяти (TSCM), например, центральных T-клеток памяти (TCM) например, эффекторных T-клеток памяти (ТEM)), и их комбинаций. В одном варианте осуществления полностью отвечающий индивидуум (CR) имеет, например, два, три, четыре или более (например, все) из CD27+, CD45RO-, PD-1-, LAG-3- и TIM-3-, как описано в таблице 9. В одном варианте осуществления не отвечающий индивидуум (NR) имеет, например, два, три или более (например, все) из CD27- CD45RO+, PD-1+, LAG-3+ и TIM-3+, как описано в таблице 10.
В одном варианте осуществления статус ответа или рецидива (например, полностью отвечающий индивидуум, частично отвечающий индивидуум, не отвечающий индивидуум, индивидуум, у которого возникнет рецидив, или индивидуум, у которого не возникнет рецидива при терапии CAR-экспрессирующими клетками) определяют путем оценки, например, измерения, двух, трех, четырех пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, пятнадцати или более из сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1.
В одном варианте осуществления любые из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, можно использовать до проведения терапии CAR-экспрессирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления описанные способы можно использовать до, одновременно или в процессе терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В одном варианте осуществления любые из способов и композиций для применения, описанных в настоящем описании, можно использовать для идентификации индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, например, гематологическую злокачественную опухоль, например, такую как CLL или ALL, как имеющего увеличенную или сниженную вероятность ответа на лечение, которое включает терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19. Способ включает: (1) получение образца от индивидуума (например, образца, полученного посредством афереза крови индивидуума; и/ или например, образца произведенного продукта, например, модифицированных способами генной инженерии T-клеток); (2) определение уровня (например, величины или активности) одного или нескольких биомаркеров (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более), приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 в образце; и (3) (необязательно) сравнение определенного уровня одного или нескольких биомаркеров с эталонным уровнем; и (4) идентификацию индивидуума как полностью отвечающего индивидуума, частично отвечающего индивидуума, не отвечающего индивидуума, индивидуума, у которого возникнет рецидив, или индивидуума, у которого не возникнет рецидива, при терапии CAR-экспрессирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления различие, например, статистически значимое различие, между определенным уровнем и эталонным уровнем является прогностическим фактором для способности индивидуумов отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками.
В одном аспекте описанные способы включают (1) получение образца (например, образца индивидуума, полученного посредством афереза; и/ или например, образца произведенного продукта, например, модифицированных способами генной инженерии T-клеток, например, образца произведенного продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19); (2) получение, например, определение генной сигнатуры образца; и (3) (необязательно) сравнение генной сигнатуры с эталонной генной сигнатурой; где отличие, например, статистически значимое отличие, в уровне экспрессии одного или нескольких биомаркеров в определенной генной сигнатуре является прогностическим фактором для способности индивидуума отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками. В одном варианте осуществления генная сигнатура включает один или несколько маркеров, выбранных из таблицы 1A, таблицы 1B, таблицы 2, таблицы 3, таблицы 4, таблицы 5, таблицы 6, таблицы 7A, таблицы 7B, таблицы 8, таблицы 9, таблицы 10, таблицы 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблицы 17, таблицы 18, таблицы 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD 122, CD62L, KLRG1 и их комбинаций. В одном варианте осуществления образец представляет собой биологический образец, выбранный из образца крови, плазмы или сыворотки. В конкретном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец крови. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец, полученный посредством афереза, например, иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки), полученные из крови индивидуума. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец произведенного продукта, например, модифицированных способами генной инженерии T-клеток, например, произведенного продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19.
В одном аспекте предусматриваются способы определения способности к ответу у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, например, гематологическую злокачественную опухоль, например, такую как CLL или ALL, на лечение, включающее терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, например, описанными в настоящем описании. Способ включает: определение уровня или активности одного или нескольких биомаркеров (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более), приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 в образце, полученном до лечения; где отличие, например, статистически значимое отличие, уровня (например, количества или активности) одного или нескольких маркеров в образце относительно заданной величины указывает на увеличенную способность к ответу на клетки, экспрессирующие CAR. В одном варианте осуществления образец представляет собой биологический образец, выбранный из образца крови, плазмы или сыворотки. В конкретном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец крови. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец, полученный посредством афереза, например, T-клетки, полученные из крови индивидуума. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец произведенного продукта, например, модифицированных способами генной инженерии T-клеток, полученных из крови индивидуума, например, произведенного продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, произведенного продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19.
В одном варианте осуществления предусматриваются способы оценки индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, например, гематологическую злокачественную опухоль, например, такую как CLL или ALL, включающие получение величины статуса ответа или рецидива для индивидуума, которая включает один или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) из следующих показателей: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), Таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркер CD27, биомаркер CD45RO, биомаркер PD-1, биомаркер LAG-3, биомаркер TIM-3, биомаркер IL2RA, биомаркер IL21, биомаркер CD4+, биомаркер CD8+, сигнатура набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов TH2+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например стволовых клеток памяти (TSCM), например центральных T-клеток памяти (TCM), например, эффекторных T-клеток памяти (TEM)), и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), тем самым, оценивая индивидуума. В одном варианте осуществления способы включают количественное определение одного или нескольких из следующих: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19. В одном варианте осуществления способы включают количественное определение одного или нескольких из следующих: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, для оценки индивидуума, имеющего CLL. В другом варианте осуществления способы включают количественное определение одного или нескольких из следующих: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, для оценки индивидуума, имеющего ALL. В одном варианте осуществления способ включает количественное определение одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) из следующих: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, или сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, в биологическом образце, выбранном из образца крови, плазмы или сыворотки. В конкретном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец крови. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец, полученный посредством афереза, например, T-клетки, полученные из крови индивидуума. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец произведенного продукта, например, модифицированных способами генной инженерии T-клеток, например, полученных из крови индивидуума, например, произведенного продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, произведенного продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19.
В одном варианте осуществления предусматриваются способы оценки или мониторинга эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, включающие получение величины статуса ответа или рецидива для индивидуума, которое включает количественное определение одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) из следующих: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркер CD27, биомаркер CD45RO, биомаркер PD-1, биомаркер LAG-3, биомаркер TIM-3, биомаркер IL2RA, биомаркер IL21, биомаркер CD4+, биомаркер CD8+, сигнатура набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов TH2+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например стволовых клеток памяти (TSCM), например центральных T-клеток памяти (TCM), например, эффекторных T-клеток памяти (TEM)), и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), тем самым, оценивая или осуществляя мониторинг эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками у индивидуума. В одном варианте осуществления способы включают количественное определение одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) из следующих: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, или сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19. В одном варианте осуществления способы включают количественное определение одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) из следующих: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, или сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, для оценки или мониторинга эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками у индивидуума, имеющего CLL. В другом варианте осуществления способы включают количественное определение одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) из следующих: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD 122, CD62L, KLRG1, или сигнатура набора генов клетки, экспрессирующей CAR против CD19, для оценки или мониторинга эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками у индивидуума, имеющего ALL. В одном варианте осуществления способ включает количественное определение одного или нескольких из следующих (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более): биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1 или сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, в биологическом образце, выбранном из образца крови, плазмы или сыворотки. В конкретном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец крови. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец, полученный посредством афереза, например, T-клетки, полученные из крови индивидуума. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец произведенного продукта, например, модифицированных способами генной инженерии T-клеток, например, полученных из крови индивидуума.
В одном варианте осуществления предусматриваются способы прогнозирования вероятности успеха терапии CAR-экспрессирующими клетками, например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, например, описанными в настоящем описании, у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, причем указанный способ включает стадии предоставления биологического образца от индивидуума; определения уровней экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6) и таблице 17, для получения профиля экспрессии генов в образце; и на основе полученного профиля экспрессии генов предоставления прогноза для индивидуума. В одном варианте осуществления биологический образец включает, но не ограничивается ими, образец крови, плазмы или сыворотки. В конкретном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец крови.
В одном варианте осуществления образец представляет собой образец, полученный посредством афереза, например, T-клетки, полученные из крови индивидуума. В одном варианте осуществления индивидуум имеет CLL. В одном варианте осуществления индивидуум имеет ALL.
В другом аспекте предусматриваются способы лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, например, гематологическую злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления предусматриваются способы лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, включающие определение того, имеет ли индивидуум отличие, например, статистически значимое отличие, в уровне экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6) и таблице 17, относительно эталонного уровня, и, если существует отличие, например, статистически значимое отличие, между определенным уровнем и эталонным уровнем, введение индивидууму терапевтически эффективной дозы CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток), тем самым, осуществляя лечение индивидуума. В одном варианте осуществления, где существует различие, например, статистически значимое различие, между определенным уровнем и эталонным уровнем, причем способ включает модификацию продукта CAR-экспрессирующих клеток перед инфузией индивидууму. В одном варианте осуществления, когда существует различие, например, статистически значимое различие, между определенным уровнем и эталонным уровнем, способ включает модификацию производства продукта CAR-экспрессирующих клеток перед инфузией индивидууму. В одном варианте осуществления если существует различие, например, статистически значимое различие, между определенным уровнем и эталонным уровнем, способ включает коррекцию инфузируемой дозы CAR-экспрессирующих клеток для достижения эффекта против злокачественной опухоли.
В одном варианте осуществления способы лечения, описанные в настоящем описании, включают определение того, имеет ли индивидуум вероятность ответа на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, путем сравнения уровня одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15 и таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6) в образце от индивидуума относительно эталонного уровня, где отличие, например, статистически значимое отличие, в уровне экспрессии одного или нескольких маркерных генов относительно эталонного уровня указывает на увеличенную вероятность ответа; и введение индивидууму терапевтически эффективной дозы CAR-экспрессирующих клеток, тем самым, осуществляя лечение индивидуума. В одном варианте осуществления образец выбран из образца крови, плазмы или сыворотки. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец, полученный посредством афереза, например, T-клетки, полученные из крови индивидуума.
В одном варианте осуществления способы лечения, описанные в настоящем описании, кроме того, включают получение образца от индивидуума; определение уровня одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1, в образце; сравнение определенного уровня одного или нескольких маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1, с эталонным уровнем; и введение терапевтически эффективной дозы CAR-экспрессирующей клетки (например, T-клетки, NK-клетки), если индивидуум идентифицирован как имеющий отличие, например, статистически значимое отличие, в определенном уровне одного или нескольких маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1, относительно эталонного уровня, в образце.
В одном варианте осуществления способы лечения, описанные в настоящем описании, включают или дополнительно включают получение величины статуса ответа или рецидива для индивидуума, которая включает один или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) из следующих показателей: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркер CD27, биомаркер CD45RO, биомаркер PD-1, биомаркер LAG-3, биомаркер TIM-3, биомаркер IL2RA, биомаркер IL21, биомаркер CD4, биомаркер CD8, сигнатура набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов TH2+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например, стволовых клеток памяти (TSCM), например, центральных T-клеток памяти (TCM), например, эффекторных T-клеток памяти (TEM)), и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, и в соответствии с определением статуса ответа или рецидива, проведение одного, двух, трех, четырех или более из: идентификации индивидуума как полностью отвечающего, частично отвечающего или не отвечающего индивидуума; проведения терапии CAR-экспрессирующими клетками; выбора или изменения дозирования терапии CAR-экспрессирующими клетками; выбора или изменения схемы или продолжительности терапии CAR-экспрессирующими клетками; введения, например, не отвечающему индивидууму или частично отвечающему индивидууму, дополнительного средства в комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками, например, ингибитором точки контроля, например, ингибитором точки контроля, описанным в настоящем описании, или ингибитором киназы, например, ингибитором киназы, описанным в настоящем описании; проведения не отвечающему индивидууму или частично отвечающему индивидууму терапии, которая увеличивает количество наивных T-клеток у индивидуума, перед проведением терапии CAR-экспрессирующими клетками; модификации процесса производства для терапии CAR-экспрессирующими клетками, например, увеличения в количестве наивных T-клеток перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, например, для индивидуума, идентифицированного как не отвечающий индивидуум или частично отвечающий индивидуум; или выбора альтернативной терапии, например, стандартной терапии конкретной злокачественной опухоли (например, как описано в настоящем описании), например, для не отвечающего индивидуума, частично отвечающего индивидуума или индивидуума, у которого возникнет рецидив; тем самым, осуществляя лечение злокачественной опухоли у индивидуума.
Системы
В другом аспекте настоящее изобретение относится к наборам для прогнозирования ответа индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанную в настоящем описании. Наборы содержат по меньшей мере один реагент, который специфически обнаруживает уровень или активность набора генов (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более генов), выбранных из таблицы 1A, таблицы 1B, таблицы 7A, таблицы 7B, таблицы 8, таблицы 9, таблицы 10, таблицы 14, таблицы 15, таблицы 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблицы 17, таблицы 18, таблицы 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и/или KLRG1; и инструкцию по применению наборов, например, для прогнозирования ответа индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления в указанных инструкциях по применению описано, что, если один или несколько обнаруженных уровней экспрессии отличаются, например превышают, от эталонного уровня, индивидуум с большей вероятностью будет положительно отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления в указанных инструкциях по применению описано, что, если один или несколько из обнаруженных уровней экспрессии является меньшим, чем эталонный уровень, индивидуум с большей вероятностью будет отвечать положительно на терапию CAR-экспрессирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления, если уровень или активность PD-1, LAG-3 или TIM-3, или любой их комбинации, являются меньшими, чем эталонная величина, индивидуум с большей вероятностью будет положительно отвечать на терапию.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один реагент, который специфически обнаруживает уровни экспрессии набора генов, содержит зонд нуклеиновой кислоты, комплементарный мРНК, экспрессируемой с генов, например, кДНК или олигонуклеотид. Зонд нуклеиновой кислоты может быть иммобилизован на поверхности подложки или может находиться в растворе. Набор реагентов может обнаруживать экспрессию полипептидов, например, поверхностных полипептидов, кодируемых указанным набором генов. В одном варианте осуществления зонд нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту размером приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100 остатков нуклеиновой кислоты, комплементарных последовательности нуклеиновой кислоты биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и/или KLRG1. Кроме того, наборы могут содержать одно или несколько из: буфер/реагенты и протокол для экстракции, буфер/реагенты и протокол для амплификации, буфер/реагенты и протокол для гибридизации и буфер/реагенты и протокол для мечения.
В определенных вариантах осуществления наборы, кроме того, содержат по меньшей мере одну сигнатуру набора генов клетки, экспрессирующей CAR против CD19 (например, T-клетки, NK-клетки). В одном варианте осуществления набор, кроме того, включает стандартный эталон.
В одном варианте осуществления индивидуум имеет CLL.
В одном варианте осуществления индивидуум имеет ALL.
В одном варианте осуществления индивидуум имеет В-клеточный ALL.
В одном аспекте изобретение относится к реакционной смеси, содержащей по меньшей мере один реагент, который специфически выявляет уровни экспрессии набора генов (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более генов), выбранных из таблицы 1A, таблицы 1B, таблицы 7A, таблицы 7B, таблицы 8, таблицы 9, таблицы 10, таблицы 14, таблицы 15, таблицы 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблицы 17, таблицы 18, таблицы 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и/или KLRG1; и биологический образец. В одном варианте осуществления образец выбран из образца крови, плазмы или сыворотки. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец, полученный посредством афереза, например, T-клетки, полученные из крови индивидуума. В одном варианте осуществления образец содержит CAR-экспрессирующие клетки, например, CART-экспрессирующие клетки, например, клетки CART19.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один реагент, который специфически выявляет уровни экспрессии набора генов, содержит зонд нуклеиновой кислоты, комплементарный мРНК, экспрессируемой с генов, например, кДНК или олигонуклеотид. Зонд нуклеиновой кислоты может быть иммобилизован на поверхности подложки или может находиться в растворе. Набор реагентов может обнаруживать экспрессию полипептидов, например, поверхностных полипептидов, кодируемых указанным набором генов. В одном варианте осуществления зонд нуклеиновой кислоты включает нуклеиновую кислоту размером приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100 остатков нуклеиновой кислоты, комплементарную последовательности нуклеиновой кислоты биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и/или KLRG1. Кроме того, реакционная смесь может содержать одно или несколько из: буфер/реагенты и протокол для экстракции, буфер/реагенты и протокол для амплификации, буфер/реагенты и протокол для гибридизации и буфер/реагенты и протокол для мечения.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к системе для оценки злокачественной опухоли у индивидуума. Система содержит по меньшей мере один процессор, функционально подсоединенный к памяти, причем по меньшей мере один процессор в процессе работы настроен на проведение одной или нескольких стадий, описанных в настоящем описании.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к системе для оценки злокачественной опухоли у индивидуума. Система включает по меньшей мере один процессор, функционально подсоединенный к памяти, причем по меньшей мере один процессор в процессе работы настроен на:
получение величины статуса ответа или рецидива, которая включает один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более (все) из следующих показателей:
(i) уровень или активность CD27 и/или CD45RO- (например, CD27+ CD45RO-) иммунных эффекторных клеток, например, в популяции CD4+ или CD8+ T-клеток, в образце (например, образец, полученный посредством афереза, или образец продукта CAR-экспрессирующих клеток);
(ii) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) из покоящихся клеток TEFF, покоящихся клеток TREG, более молодых T-клеток (например, более молодых CD4 или CD8 клеток, или гамма/дельта T-клеток), или ранних T-клеток памяти или их комбинации, в образце (например, образец, полученный посредством афереза, или образец продукта CAR-экспрессирующих клеток);
(iii) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) из активированных клеток TEFF, активированных клеток TREG, более старых T-клеток (например, более старых CD4 или CD8 клеток), или поздних T-клеток памяти или их комбинации, в образце (например, образец, полученный посредством афереза, или произведенный образец продукта CAR-экспрессирующих клеток);
(iv) уровень или активность маркера истощения иммунных клеток, например, одного, двух или нескольких ингибиторов иммунной точки контроля (например, PD-1, TIM-3 и/или LAG-3) в образце (например, образец, полученный посредством афереза, или произведенный образец продукта CAR-экспрессирующих клеток);
(v) уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати или более из биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 16, таблице 17, таблице 18, таблице 20, на фиг.2B, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1 или сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19;
(vi) уровень или активность цитокинов (например, качество набора цитокинов) в образце продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, в образце продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019), где цитокин выбран из одного, двух, трех, четырех, пяти или более (или всех) из цитокинов, приведенных в таблице 16;
(vii) эффективность трансдукции CAR-экспрессирующих клеток в образце продукта CAR-экспрессирующих клеток; или
(viii) количество CD27+ PD-1- клеток у индивидуума, например, в образце от индивидуума (например, образец, полученный посредством афереза, или образец продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, в образце продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019)), например, количество, превышающее или равное 1×107 клеток.
после определения величины статуса ответа проведение одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или более (например, всех) из:
идентификации индивидуума как полностью отвечающего индивидуума, частично отвечающего индивидуума, не отвечающего индивидуума, индивидуума, у которого возникнет рецидив, или индивидуума, у которого не возникнет рецидива;
рекомендации проведения терапии CAR-экспрессирующими клетками;
рекомендации выбора или изменения дозирования терапии CAR-экспрессирующими клетками;
рекомендации выбора или изменения схемы или продолжительности терапии CAR-экспрессирующими клетками;
рекомендации введения, например, не отвечающему или частично отвечающему индивидууму, дополнительного средства в комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками, например, ингибитора точки контроля, например, ингибитора точки контроля, описанного в настоящем описании;
рекомендации проведения у не отвечающего или частично отвечающего индивидуума терапии, которая повышает количество наивных T-клеток у индивидуума перед проведением терапии CAR-экспрессирующими клетками;
рекомендации модифицировать процесс производства для терапии CAR-экспрессирующими клетками, например, увеличения в количестве наивных T-клеток перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, например, для индивидуума, идентифицированного как не отвечающий или частично отвечающий индивидуум;
рекомендации модифицировать продукт CAR-экспрессирующих клеток перед инфузией пациенту;
рекомендации скорректировать инфузируемую дозу CAR-экспрессирующих клеток для достижения клинической эффективности;
рекомендации проведения альтернативной терапии, например, для не отвечающего или частично отвечающего индивидуума или для индивидуума, у которого возникнет рецидив;
рекомендации выбрать альтернативную терапию, например, для не отвечающего индивидуума или частично отвечающего индивидуума, например, стандартную терапию для конкретного типа злокачественной опухоли, или
если индивидуум является или идентифицирован как не отвечающий индивидуум или индивидуум, у которого возникнет рецидив, рекомендации снизить популяцию клеток TREG и/или показатели сигнатуры клеток TREG, например, путем истощения CD25, введения циклофосфамида, антитела против GITR, ингибитора mTOR или их комбинации.
В одном варианте осуществления величина включает показатель сигнатуры наборы генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, и комбинацию одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) из: биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркера CD27, биомаркера CD45RO, биомаркера PD-1, биомаркера LAG-3, биомаркера TIM-3, биомаркера IL2RA, биомаркера IL21, биомаркера CD4, биомаркера CD8, сигнатуры набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатуры набора генов TH2+ T-хелперных клеток и сигнатуры набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например, стволовых клеток памяти (TSCM), например, центральных T-клеток памяти (ТCM), например эффекторных T-клеток памяти (ТEM)); и после определения величины статуса ответа, проведение одного, двух, трех, четырех или более из: идентификации индивидуума как полностью отвечающего, частично отвечающего или не отвечающего индивидуума; рекомендации терапии CAR-экспрессирующими клетками; рекомендации выбора или изменения дозирования терапии CAR-экспрессирующими клетками; рекомендации альтернативной терапии, рекомендации комбинированной терапии, например, комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками, рекомендации изменить процесс производства для терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один процессор во время работы настроен на: получение величины статуса ответа, которая включает показатель сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, и комбинации одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) из: биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1; и после определения величины статуса ответа проведение одного, двух, трех, четырех или более из: идентификации индивидуума как полностью отвечающего, частично отвечающего или не отвечающего индивидуума; рекомендации терапии CAR-экспрессирующими клетками; рекомендации выбора или изменения дозирования терапии CAR-экспрессирующими клетками; рекомендации альтернативной терапии, например, стандартной терапии для конкретной злокачественной опухоли (например, как описано в настоящем описании); рекомендации комбинированной терапии, например, комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками, рекомендации изменить процесс производства для терапии CAR-экспрессирующими клетками, например, как описано в настоящем описании.
Способы производства
В другом аспекте изобретение относится к способу оценки эффективности продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, образца продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019). Способ включает получение одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или более (например, всех) из величин:
(i) уровень или активность CD27 и/или CD45RO- (например, CD27+ CD45RO-) иммунных эффекторных клеток, например, в популяции CD4+ или CD8+ T-клеток, в продукте CAR-экспрессирующих клеток;
(ii) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) из покоящихся клеток TEFF, покоящихся клеток TREG, более молодых T-клеток (например, более молодых CD4 или CD8 клеток, или гамма/дельта T-клеток), или ранних T-клеток памяти или их комбинации в продукте CAR-экспрессирующих клеток;
(iii) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) из активированных клеток TEFF, активированных клеток TREG, более старых T-клеток (например, более старых CD4 или CD8 клеток), или поздних T-клеток памяти или их комбинации в продукте CAR-экспрессирующих клеток;
(iv) уровень или активность маркера истощения иммунных клеток, например, одного, двух или нескольких ингибиторов иммунной точки контроля (например, PD-1, TIM-3 и/или LAG-3) в продукте CAR-экспрессирующих клеток;
(v) уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати или более из биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 16, таблице 17, таблице 18, таблице 20, на фиг.2B, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1 или сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19;
(vi) уровень или активность цитокинов в образце продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, в образце продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019), где цитокин выбран из одного, двух, трех, четырех, пяти или более (или всех) из цитокинов, приведенных в таблице 16;
(vii) эффективность трансдукции CAR-экспрессирующих клеток в продукте;
(viii) количество CD27+ PD-1- клеток у индивидуума, например, в образце от индивидуума (например, образец, полученный посредством афереза, или образец продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, в образце продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019)), например, количество, превышающее или равное 1×107 клеток; или
(ix) уровень или активность клеток TREG или клеточной популяции,
где увеличение (i), (ii), (vi), (vii), (viii) или любой их комбинации указывает на увеличенную эффективность продукта CAR-экспрессирующих клеток, и
где увеличение (iii), (iv), (ix) или любой их комбинации указывает на снижение эффективности продукта CAR-экспрессирующих клеток.
В родственном аспекте изобретение относится к способу оптимизации производства продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, образца продукта клеток, экспрессирующих CAR19 (например, CTL019). Способ включает:
(1) получение образца, содержащего CAR-экспрессирующую клетку (например, популяцию CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток);
(2) активацию CAR-экспрессирующей клетки in vitro;
(3) оценку эффективности активированных CAR-экспрессирующих клеток посредством определения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или более (например, всех) из:
(i) уровень или активность CD27 и/или CD45RO- (например, CD27+ CD45RO-) иммунных эффекторных клеток, например, в популяции CD4+ или CD8+ T-клеток, в продукте CAR-экспрессирующих клеток;
(ii) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) из покоящихся клеток TEFF, покоящихся клеток TREG, более молодых T-клеток (например, более молодых CD4 или CD8 клеток, или гамма/дельта T-клеток), или ранних T-клеток памяти или их комбинации в продукте CAR-экспрессирующих клеток;
(iii) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) из активированных клеток TEFF, активированных клеток TREG, более старых T-клеток (например, более старых CD4 или CD8 клеток), или поздних T-клеток памяти или их комбинации в продукте CAR-экспрессирующих клеток;
(iv) уровень или активность маркера истощения иммунных клеток, например, одного, двух или нескольких ингибиторов иммунной точки контроля (например, PD-1, TIM-3 и/или LAG-3) в продукте CAR-экспрессирующих клеток;
(v) уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати или более из биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 16, таблице 17, таблице 18, таблице 20, на фиг.2B, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1 или сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19;
(vi) уровень или активность цитокинов в образце продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, в образце продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019), где цитокин выбран из одного, двух, трех, четырех, пяти или более (или всех) из цитокинов, приведенных в таблице 16;
(vii) эффективность трансдукции CAR-экспрессирующих клеток в продукте;
(viii) количество CD27+ PD-1- клеток у индивидуума, например, в образце от индивидуума (например, образец, полученный посредством афереза, или образец продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, в образце продукта CAR19-экспрессирующих клеток (например, CTL019)), например, количество, превышающее или равное 1×107 клеток; или
(ix) уровень или активность клеток TREG или клеточной популяции,
где увеличение (i), (ii), (vi), (vii), (viii) или любой их комбинации указывает на увеличенную эффективность продукта CAR-экспрессирующих клеток, и
где увеличение (iii), (iv), (ix) или любой их комбинации указывает на снижение эффективности продукта CAR-экспрессирующих клеток.
В родственном аспекте в настоящем описании описан процесс производства продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, клеток, экспрессирующих CAR против CD19, например, клеток, экспрессирующих CAR против CD19, описанных в настоящем описании, например, CTL019) для определения действенности или эффективности продукта. В одном варианте осуществления предусматриваемые способы включают стадии предоставления биологического образца от индивидуума, например, образца крови, сыворотки или плазмы; определения уровней экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или более) генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1, с получением профиля экспрессии генов в образце; (необязательно) сравнения полученного профиля экспрессии генов с заданной величиной; и определения отличий между полученной и заданной величиной. В одном варианте осуществления определенное отличие регистрируют в протоколе по контролю качества.
В некоторых вариантах осуществления любые из способов, описанных в настоящем описании, кроме того, включают стадию увеличения в количестве, например, выделения клеток согласно любому из (i), (ii), (vi), (vii), (viii), или любой их комбинации, или снижения любого из (iii), (iv), (ix), или любой их комбинации.
В другом аспекте изобретение относится к способу производства образца продукта, например, модифицированных способами инженерии T-клеток, например, полученных из крови индивидуума, например, произведенного продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток), например, продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19, например, продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19, описанных в настоящем описании (например, CTL019). В одном варианте осуществления способ включает:
предоставление произведенного образца продукта, например, модифицированных способами инженерии T-клеток, например, полученных из крови индивидуума, например, произведенного продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19, например, продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19, описанных в настоящем описании (например, CTL019);
(i) получение профиля экспрессии цитокинов (например, приведенных в таблице 14, таблице 15 или таблице 16 (например, CCL20, IL-6 и/или IL-17a)), секретируемых в продукте CAR-экспрессирующих клеток; и/или
(ii) получение показателя эффективности трансдукции CAR-экспрессирующих клеток в продукте;
идентификацию продукта CAR-экспрессирующих клеток в качестве пригодного для введения на основе определенного уровня цитокинов или эффективности трансдукции (или обоих из них); и
необязательно, выбор продукта CAR-экспрессирующих клеток для введения индивидууму,
тем самым, изготавливая продукт CAR-экспрессирующих клеток.
В определенных вариантах осуществления вышеупомянутых способов производства цитокин выбран из одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или более (или всех) из CCL20/MIP3a, IL17A, IL6, GM-CSL, IFNγ, IL10, IL13, IL2, IL21, IL4, IL5, IL9 или TNFα, или их комбинации. В одном варианте осуществления цитокин выбран из одного, двух, трех, четырех или более (всех из) IL-17a, CCL20, IL2, IL6 или TNFα. Например, цитокин может быть выбран из: одного или обоих из IL-17a и CCL20; одного или обоих из CCL20/MIP3a и IL17A; или одного, двух или всех из CCL20/MIP3a, IL17A и IL6. В одном варианте осуществления цитокин представляет собой CCL20/MIP3a. В другом варианте осуществления цитокин представляет собой IL17A. В другом варианте осуществления цитокин представляет собой IL6.
В определенных вариантах осуществления вышеупомянутых способов производства эффективность трансдукции 15% или выше указывает на увеличенную эффективность. В других вариантах осуществления эффективность трансдукции менее 15% указывает на сниженную эффективность.
В определенных вариантах осуществления любого из вышеупомянутых способов производства способы, кроме того, включают уменьшение количества (например, истощение) клеток Treg, например, посредством истощения CD25, истощения GITR или ингибирования mTOR. Альтернативно или в комбинации, способы производства, кроме того, включают приведение в контакт образца, например, образца, полученного посредством афереза, с антителом против GITR.
В определенных вариантах осуществления любого из вышеупомянутых способов производства каждый из (i), (ii) или (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (ix), или любую их комбинацию (например, все) оценивают после активации in vitro.
В одном варианте осуществления профиль цитокинов включает один или несколько (например, один, два, три, четыре, пять, шесть или более) из CCL20 (также обозначаемого как MIP3a), IL-17a, IL-6, GM-CSF, IFNγ, IL-10, IL-13, IL-2, IL-21, IL-4, IL-5, IL-9 и TNFα. В одном варианте осуществления профиль цитокинов включает CCL20. В одном варианте осуществления профиль цитокинов включает IL-17a. В одном варианте осуществления профиль цитокинов включает IL-6. В одном варианте осуществления профиль цитокинов включает два или более (например, все три) из CCL20, IL-17a и IL-6.
В одном варианте осуществления способ, кроме того, включает определение уровня экспрессии одного или нескольких цитокинов, приведенных в таблице 14, таблице 15 или таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), секретируемых продуктом CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток). В одном варианте осуществления секреция одного или нескольких цитокинов, приведенных в таблице 14, таблице 15 или таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6) осуществляется в ответ на стимуляцию продукта CAR-экспрессирующих клеток одним или несколькими антигеном(ами) опухоли-мишени.
В одном варианте осуществления сигнатура или уровень цитокинов, описанные в настоящем описании, указывают на эффективность продукта CAR-экспрессирующих клеток. В одном варианте осуществления сигнатуры цитокинов, описанные в настоящем описании, являются маркерами ответа на продукт CAR-экспрессирующих клеток при гематологической злокачественной опухоли (например, CLL и ALL).
В одном варианте осуществления сигнатура или уровень цитокинов, описанные в настоящем описании, прогнозируют ответ индивидуума на продукт CAR-экспрессирующих клеток.
В одном варианте осуществления сигнатура или уровень цитокинов, описанные в таблице 16, прогнозируют ответ индивидуума на продукт CAR-экспрессирующих клеток.
В одном варианте осуществления уровень экспрессии IL-17a и CCL-20 прогнозирует ответ индивидуума на продукт CAR-экспрессирующих клеток.
В одном варианте осуществления способ, кроме того, включает одно или несколько (например, одно, два, три или все) из: получения образца крови, например, популяции T-клеток, полученных из крови индивидуума; активации популяции T-клеток, например, способом, описанным в настоящем описании; модификации способами генной инженерии клеток из популяции T-клеток, например, трансдукции клеток из популяции T-клеток, вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании, например, CAR против CD19, описанный в настоящем описании, например, CTL019; увеличения в количестве популяции T-клеток, которая содержит модифицированные способами инженерии T-клетки, например, клетки, трансдуцированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании, например, CAR против CD19, описанный в настоящем описании, например, способом, описанным в настоящем описании.
В одном варианте осуществления эффективность трансдукции CAR, описанная в настоящем описании, указывает на ответ индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетками при гематологической злокачественной опухоли (например, CLL и ALL).
В одном варианте осуществления эффективность трансдукции CAR, описанная в настоящем описании, прогнозирует ответ индивидуума на терапию CAR-эксрессирующими клетками при гематологическом заболевании (например, CLL и ALL).
В одном варианте осуществления сигнатуру или уровень цитокинов, описанные в настоящем описании, используют для улучшения и/или модификации продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19, например, такого как CTL019) перед инфузией пациентам.
В одном варианте осуществления сигнатуру или уровень цитокинов, описанные в настоящем описании, используют для оценки произведенных продуктов CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток). В одном варианте осуществления сигнатура или уровень цитокинов, описанные в настоящем описании, обеспечивают конечную точку оптимизации процесса производства.
В одном варианте осуществления любой из вышеупомянутых способов производства включает стадию регистрации результата сравнения протоколов по контролю качества для препарата CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, препарата клеток, экспрессирующих CAR против CD19, как описано в настоящем описании, например, таких как CTL019). В одном варианте осуществления способ дополнительно включает получение препарата T-клеток от индивидуума, идентифицированного как частично отвечающий или не отвечающий индивидуум, и увеличение количества наивных T-клеток в препарате. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в препарат T-клеток.
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает получение препарата иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток) от индивидуума, идентифицированного как частично отвечающий или не отвечающий индивидуумом, которого впоследствии лечили средством, которое повышает количество наивных T-клеток у индивидуума, например, от индивидуума, которого лечили ингибитором киназы, например, ингибитором mTOR, например, как описано в настоящем описании, и/или ингибитором точки контроля, например, как описано в настоящем описании. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в множество иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток) в препарате.
В одном варианте осуществления продукт CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) представляет собой клетку, экспрессирующую CAR против CD19, например, клетку, экспрессирующую CAR против CD19, описанную в настоящем описании, например, CTL019.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к одной или нескольким генным сигнатурам или профилям экспрессии, которые отличают индивидуумов, у которых возникнет рецидив при терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) от индивидуумов, у которого не возникнет рецидива при терапии CAR-экспрессирующими клетками при злокачественной опухоли, например, гематологической злокачественной опухоли (например, ALL и CLL).
В одном варианте осуществления одна или несколько генных сигнатур или профилей экспрессии, описанных в настоящем описании, обеспечивают улучшение произведенных продуктов, тем самым, снижая вероятность рецидива у пациентов. В одном варианте осуществления генные сигнатуры, описанные в настоящем описании, используют для модификации терапевтического применения произведенного продукта, тем самым, снижая вероятность рецидива у пациента.
В одном варианте осуществления у индивидуума перед лечением CAR-экспрессирующими клетками (например, лечение клетками, экспрессирующими CAR против CD19, например, терапия CTL019) идентифицируют одну или несколько генных сигнатур или профилей экспрессии, описанных в настоящем описании, которые прогнозируют рецидив при лечении CAR-экспрессирующими клетками. В одном варианте осуществления одну или несколько генных сигнатур или профилей экспрессии, описанных в настоящем описании, идентифицируют в образце, полученном посредством афереза. В одном варианте осуществления одну или несколько генных сигнатур или профилей экспрессии, описанных в настоящем описании, идентифицируют в образце костного мозга. В одном варианте осуществления одну или несколько генных сигнатур или профилей экспрессии, описанных в настоящем описании, идентифицируют в произведенном продукте CAR-экспрессирующих клеток (например, продукт клеток, экспрессирующих CAR против CD19, например, CTL019) перед инфузией.
В одном варианте осуществления снижение уровня или показателя генной сигнатуры TREG у индивидуума перед аферезом или в процессе производства продукта CAR-экспрессирующих клеток значительно снижает риск рецидива у индивидуума.
В одном варианте осуществления индивидуума предварительно лечат одним или несколькими способами терапии, которые снижают уровень клеток TREG, перед сбором клеток для производства продукта CAR-экспрессирующих клеток, тем самым, снижая риск рецидива у индивидуума при лечении CAR-экспрессирующими клетками (например, лечении CTL019).
В одном варианте осуществления способы снижения уровня клеток TREG включают, но не ограничиваются ими, введение индивидууму одного или нескольких из циклофосфамида, антитела против GITR, средства для истощения CD25, ингибитора mTOR или их комбинации. Введение одного или нескольких из циклофосфамида, антитела против GITR, средства для истощения CD25, ингибитора mTOR или их комбинации можно осуществлять до, в процессе или после инфузии продукта CAR-экспрессирующих клеток.
В одном варианте осуществления индивидуума предварительно лечат циклофосфамидом перед сбором клеток для производства продукта CAR-экспрессирующих клеток, тем самым, снижая риск рецидива индивидуума при лечении CAR-экспрессирующими клетками (например, лечении CTL019).
В одном варианте осуществления индивидуума предварительно лечат антителом против GITR перед сбором клеток для производства продукта CAR-экспрессирующих клеток, тем самым, снижая риск рецидива у индивидуума при лечении CAR-экспрессирующими клетками (например, лечение CTL019).
В одном варианте осуществления процесс производства CAR-экспрессирующих клеток модифицируют для истощения клеток TREG перед производством продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, продукта CTL019). В одном варианте осуществления истощение CD25 используют для истощения клеток TREG перед производством продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, продукта CTL019). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает:
a. предоставление популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток); и
b. удаление T-регуляторных клеток из популяции, тем самым, обеспечивая популяцию клеток с истощением T-регуляторных клеток;
где стадии a) и b) проводят перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в популяцию.
В некоторых вариантах осуществления способов T-регуляторные клетки включают CD25+ T-клетки, и их удаляют из клеточной популяции с использованием антитела против CD25 или его фрагмента. Антитело против CD25 или его фрагмент могут быть конъюгированы с подложкой, например, гранулами.
В других вариантах осуществления популяция клеток с истощением T-регуляторных клеток, предоставленная на стадии (b), содержит менее 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток.
В других вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление из популяции клеток, которые экспрессируют опухолевый антиген, которые не содержат CD25, для получения популяции клеток с истощением T-регуляторных клеток и истощением опухолевого антигена перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в популяцию. Опухолевый антиген может быть выбран из CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 или CD11b, или их комбинации.
В других вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление из популяции клеток, которые экспрессируют ингибитор точки контроля, с получением популяции клеток с истощением T-регуляторных клеток и истощением ингибиторной молекулы перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в популяцию. Ингибиторная молекула, например, ингибитор точки контроля, может быть выбрана из PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозина и TGFR (например, TGFR-бета), например, как описано в настоящем описании.
Следующие варианты осуществления, описанные в настоящем описании, охватывают предоставление популяции иммунных эффекторных клеток. Предоставленная популяция иммунных эффекторных клеток может быть выбрана, исходя из экспрессии одного или нескольких из CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA и/или CD45RO. В определенных вариантах осуществления предоставленная популяция иммунных эффекторных клеток представляет собой CD3+ и/или CD28+ клетки.
В определенных вариантах осуществления способа, способ дополнительно включает увеличение в количестве популяции клеток после введения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR.
В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток увеличивают в количестве в течение 8 суток или менее.
В определенных вариантах осуществления популяцию клеток увеличивают в количестве в культуре в течение 5 суток и полученные клетки являются более эффективными, чем те же клетки, которые увеличивали в количестве в культуре в течение 9 суток, в тех же условиях культивирования.
В других вариантах осуществления популяцию клеток увеличивают в количестве в культуре в течение 5 суток, и она демонстрирует по меньшей мере однократное, двукратное, трехкратное или четырехкратное увеличение удвоений клеток при стимуляции антигеном по сравнению с теми же клетками, которые увеличивали в количестве в культуре в течение 9 суток в тех же условиях культивирования.
В других вариантах осуществления популяцию клеток увеличивают в количестве в культуре в течение 5 суток и полученные клетки демонстрируют более высокие уровни провоспалительного IFN-γ и/или GM-CSF по сравнению с теми же клетками, которые увеличивали в количестве в культуре в течение 9 суток в тех же условиях культивирования.
В других вариантах осуществления популяцию клеток увеличивают в количестве путем культивирования клеток в присутствии средства, которое стимулирует ассоциированный с комплексом CD3/TCR сигнал, и/или лиганда, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток. Средство можно конъюгировать на гранулах с антителом против CD3 или его фрагментом и/или антителом против CD28 или его фрагментом.
В других вариантах осуществления популяцию клеток увеличивают в количестве в подходящей среде, которая включает один или несколько интерлейкинов, которые приводят к увеличению количества клеток по меньшей мере в 200 раз, 250 раз, 300 раз или 350 раз в ходе периода увеличения в количестве в течение 14 суток при измерении посредством проточной цитометрии.
В других вариантах осуществления популяцию клеток увеличивают в количестве в присутствии IL-15 и/или IL-7.
В определенных вариантах осуществления способ, кроме того, включает криоконсервацию популяции клеток после соответствующего периода увеличения в количестве.
В других вариантах осуществления способ получения, описанный в настоящем описании, кроме того, включает приведение в контакт популяции иммунных эффекторных клеток с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, hTERT. Нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицу теломеразы, может представлять собой ДНК.
В других вариантах осуществления способ получения, описанный в настоящем описании, кроме того, включает культивирование популяции иммунных эффекторных клеток в сыворотке, включающей 2% сыворотку hAB.
В любых из способов, систем и наборов, описанных в настоящем описании, CAR против CD19 может содержать связывающий CD19 домен, описанный в таблице 12, или CDR, например, одну или несколько (например, все) из CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC связывающего CD19 домена, описанного в таблице 12. В одном варианте осуществления CAR может содержать одно или несколько из: лидерной последовательности, например, лидерной последовательности, описанной в настоящем описании, например, в таблице 11; связывающего CD19 домена, например, связывающего CD19 домена, описанного в настоящем описании, например, в таблице 12; шарнирной области, например, шарнирной области, описанной в настоящем описании, например, шарнирной области, описанной в таблице 11; трансмембранного домена, например, трансмембранного домена, описанного в настоящем описании, например, в таблице 11; и внутриклеточного сигнального домена (например, костимулирующего домена /или первичного сигнального домена, например, костимулирующего домена, описанного в настоящем описании, например, в таблице 11 и/или первичного сигнального домена, описанного в настоящем описании, например, в таблице 11). В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая CAR против CD19 (например, T-клетка, NK-клетка) представляет собой CTL019 или клетку с CAR против CD19, описанные в таблице 13.
Хотя при применении на практике или исследовании настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем описании, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки (например, ссылочные номера в базе данных последовательностей), упоминаемые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Например, все последовательности GenBank, Unigene и Entrez, упоминаемые в настоящем описании, например, в любой из таблиц настоящего описания, например, в любой из таблицы 1A, таблицы 1B, таблицы 7A, таблицы 7B, таблицы 8, таблицы 14, таблицы 17, таблицы 18 и таблицы 20, включены в настоящее описание в качестве ссылок. Если нет иных указаний, номера доступа последовательностей, упоминаемые в настоящем описании, в том числе в любой из таблиц настоящего описания, например, в любой из таблицы 1A, таблицы 1B, таблицы 7A, таблицы 7B, таблицы 8, таблицы 14, таблицы 17, таблицы 18 и таблицы 20, относятся к записям в базе данных на 8 октября 2014 года. Когда ген или белок имеет ссылку на множество номеров доступа последовательностей, то все варианты последовательностей охватываются.
Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Заголовки, подзаголовки или пронумерованные или обозначенные буквами элементы, например, (a), (b), (i) и т.д., предоставлены только для простоты прочтения. Использование заголовков или пронумерованных или обозначаемых буквами элементов в настоящем документе не требует, чтобы выполнение стадий или элементы следовали в алфавитном порядке, или что стадии или элементы необходимо отделять друг от друга. Другие признаки, задачи и преимущества изобретения станут очевидными из описания и чертежей, и из формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 представлена иллюстративная модель, иллюстрирующая данные полногеномного анализа RNAseq CTL019, проведенного для T-клеток при аферезе и после производства CTL019, для 21 образца CLL и 7 образцов ALL. Эта модель демонстрирует, что профили экспрессии у полностью отвечающих индивидуумов (CR) имеют более молодой фенотип T-клеток, чем профили экспрессии у не отвечающих индивидуумов (NR). Содержание подгрупп T-клеток памяти различается между CR и NR, причем у CR они демонстрируют сходство с T-клетками памяти.
На фиг.2A представлена иллюстративная гистограмма количества образцов, проанализированных в полногеномном анализе RNAseq CTL019, описанном в настоящем описании. p=продукт; a=аферез. На фиг.2B представлена иллюстративная схема, иллюстрирующая обзор анализа. В кратком изложении, для каждого набора генов использовали статистическую модель для 3 групп для определения наличия статистически значимых отличий метагенов между продуктами CR, PR и NR при CLL. CR в большей мере имеют покоящиеся клетки TEFF, в то время как NR в большей мере имеют активированные клетки TEFF. Образцы CTL019 NR имеют более активированное состояние, чем образцы CR.
На фиг.3 представлена иллюстративная схема предшественников и подгрупп T-клеток памяти. Без связи с конкретной теорией. состояние T-клеток памяти в образцах CTL019, вероятно, является основным компонентом ответа.
На фиг.4 представлен иллюстративный результат, иллюстрирующий показатели метагенов для набора активированных генов в TSCM против TCM. На оси x представлены образцы по группе ответа, где a=аферез и p=продукт. На оси у представлены нормализованные показатели экспрессии метагенов. Наборы генов, перепредставленные у CR при CLL (например, CR в случае CTL019), также перепредставлены при остром лимфобластном лейкозе (ALL). ALL и CLL у CR имеют перепредставленные гены, специфичные для подгруппы стволовых T-клеток (TSCM), в то время как CLL у PR и NR имеют перепредставленные гены подгруппы центральных T-клеток памяти (TCM). При аферезе наблюдают тот же профиль, что и в образцах продуктов. Профили экспрессии ALL являются наиболее сходными с профилями экспрессии CLL у CR и являются еще более значительными для покоящихся/нестимулированных/ранних T-клеток памяти.
На фиг.5A представлен иллюстративный результат анализа основных компонентов (PCA) для образцов CTL019. Этот иллюстративный результат PCA показывает, что образцы CR, ALL и нормальные образцы кластеризуются отдельно от PR и NR. На фиг.5B представлен иллюстративный результат PCA для CTL019 и образцов, полученных посредством афереза. Этот иллюстративный результат PCA иллюстрируют, что образцы CR, ALL и нормальные образцы кластеризуются отдельно от PR и NR и от кластера, полученного посредством афереза.
На фиг.6 представлена иллюстративная схема, изображающая иммунофенотипирование образцов, полученных посредством афереза, и образцов продукта.
На фиг.7A и фиг.7B представлены иллюстративные результаты многоцветного проточно-цитометрического анализа, идентифицирующие корреляцию ответа в образцах продукта. Анализировали 36 образцов произведенных CTL019 от пациентов с CLL. Образцы включали 5 CR, 8 PR, 19 NR и 3 неопределенных. На фиг.7A представлен иллюстративный результат, иллюстрирующий процент CD4+ клеток и ответ пациента. На фиг.7B представлен иллюстративный результат, иллюстрирующий процент CD8+ клеток и ответ пациента.
На фиг.8A, фиг.8B, фиг.8C и фиг.8D представлен иллюстративный проточно-цитометрический анализ экспрессии PD1 и CAR19 на T-клетках. На фиг.8A и фиг.8B представлены репрезентативные профили проточной цитометрии, демонстрирующие распределение экспрессии PD-1 и CAR19 на CD4+ T-клетках от индивидуумов, которые являются полностью отвечающими (CR) или не отвечающими (NR) на терапию клетками, экспрессирующими CAR. На фиг.8C представлен график, демонстрирующий процент клеток PD1 в популяции CD4+ T-клеток в группах индивидуумов с различными ответами на терапию CAR-экспрессирующими клетками. На фиг.8D представлен график, демонстрирующий процент PD1-клеток в популяции CD8+ T-клеток в группах индивидуумов с различными ответами на терапию CAR-экспрессирующими клетками.
На фиг.9A и фиг.9B представлены иллюстративные результаты проточно-цитометрического анализа экспрессии PD1, CAR19 и LAG-3 на T-клетках индивидуумов, которые являются полностью отвечающими (CR) или не отвечающими (NR) на терапию CAR-экспрессирующими клетками. на фиг.9C представлены иллюстративные результаты, которые демонстрируют распределение экспрессии PD1 и LAG-3 в группах индивидуумов с различными ответами на терапию CAR-экспрессирующими клетками. Продукты не отвечающих индивидуумов (NR) имеют более высокий процент PD1+ CAR19+ LAG3+ T-клеток, чем CR. Эти данные показывают, что продукты NR демонстрируют фенотип истощения PD1+ CAR+ и коэкспрессию LAG3.
На фиг.10A и фиг.10B представлены иллюстративные результаты проточно-цитометрического анализа экспрессии PD1, CAR 9 и TIM-3 на T-клетках индивидуумов, которые являются полностью отвечающими (CR) или не отвечающими (NR) на терапию CAR-экспрессирующими клетками. На фиг.1C представлены иллюстративные результаты, которые демонстрируют распределение экспрессии PD1 и TIM-3 в группах индивидуумов с различными ответами на терапию CAR-экспрессирующими клетками. Продукты не отвечающих индивидуумов (NR) имеют более высокий процент CAR19+ PD1+ TIM3+ клеток, чем продукты CR. Эти данные показывают, что продукты NR демонстрируют фенотип истощения PD1+ CAR+ и коэкспрессию TIM3.
На фиг.11 показан иллюстративный результат, показывающий, что уровни CD27 в продукте CAR коррелируют с ответом пациента. CD8+ клетки CR демонстрировали более высокий процент CD27+ клеток по сравнению с PR и NR.
На фиг.12 показан иллюстративный результат многоцветного проточно-цитометрического анализа, идентифицирующий корреляцию ответа в образцах, полученных посредством афереза. Анализировали 26 образцов, полученных посредством афереза, от пациентов с CLL. Образцы включали 4 CR, 6 PR, 14 NR и 1 пациента, которому инфузию не проводили.
На фиг.13 представлен результат иллюстративного многоцветного проточно-цитометрического анализа, иллюстрирующий корреляцию между фенотипом более молодых T-клеток и ответом на терапию CTL019. Эти данные демонстрируют, что процент CD27+ CD45RO- среди CD8+ T-клеток прогнозирует, какие пациенты с CLL будут иметь полный ответ на CTL019.
На фиг.14 представлен иллюстративный анализ образцов, полученных посредством афереза, у пациента-человека перед терапией CTL019. Иллюстративные результаты показывают, что, хотя пациент 1000-00045 имел очень мало T-клеток, 27% T-клеток были CD8+ CD27+ CD45RO-.
На фиг.15 представлен иллюстративный результат ответа пациента (пациент 1000-00045) на терапию CTL019. CD8+ CD27+ CD45RO- T-клетки были положительным прогностическим фактором ответа пациента на терапию CTL019. Эти иллюстративные результаты показывают, что хороший прогностический фенотип при аферезе представляет собой высокий процент CD8+ CD27+ CD45RO- T-клеток (наивных или фенотипа TSCM). Плохим прогностическим фенотипом в продукте CTL019 является высокий процент PD1+ CAR+ и LAG3+ или TIM3+ T-клеток (фенотип истощения).
На фиг.16 представлена иллюстративная блок-схема компьютерной системы, на которой можно практиковать различные аспекты и варианты осуществления.
На фиг.17 представлена иллюстративная тепловая карта, демонстрирующая бикластеризацию экспрессии цитокинов в стимулированных продуктах CTL019 и у пациентов с CLL. Два кластера (кластер 1 и кластер 3) практически исключительно состояли из CR и PR, в то время как другие два кластера (кластер 2 и кластер 4) содержали в основном NR. В среднем, уровни экспрессии цитокинов были более высокими у CR/PR против NR. На верхней панели показан красный канал изображения тепловой карты, на центральной панели показан синий канал, а на нижней панели показан зеленый канал.
На фиг.18 представлены иллюстративные результаты логарифмически нормализованной экспрессии статистически значимых цитокинов (например, CCL20/MIP3a, IL2, TNFα, IL17a и IL6) для различения пациентов CR, PR и NR при CLL.
На фиг.19A представлена иллюстративная диаграмма рассеяния, демонстрирующая логарифмически нормализованную корреляцию экспрессии IL17A (ось у) и CCL20 (ось x). Пунктирные линии соответствуют границе классификации для отделения NR от CR/PR. Каждая точка соответствует пациенту с CLL, и заштрихованная (NR), черная (PR) и белая (CR) области соответствуют клиническому ответу. Коэффициент корреляции обозначен как "r" (например, коэффициент корреляции 0,928) и соответствующее значение p для корреляции обозначено как "значение p" (например, соответствующее значению p 1,36e-09). На фиг.19B представлен иллюстративный график рассеяния, демонстрирующий корреляцию CCL20 с процентом CAR+ клеток, с коэффициентом корреляции 0,395 и соответствующим значением p 0,0761. Каждая точка соответствует пациенту CLL, и заштрихованная (NR), черная (PR) и белая (CR) области соответствуют клиническому ответу. Коэффициент корреляции обозначен как "r" (например, коэффициент корреляции 0,928) и соответствующее значение p для корреляции обозначено как "значение p". На. фиг.19C представлена иллюстративная диаграмма рассеяния, демонстрирующая корреляцию IL17a с процентом CAR+ клеток, с коэффициентом корреляции 0,278 и соответствующим значением p 0,222. Каждая точка соответствует пациенту CLL, и заштрихованная (NR), черная (PR) и белая (CR) области соответствуют клиническому ответу. Коэффициент корреляции обозначен как "r" (например, коэффициент корреляции 0,928) и соответствующее значение p для корреляции обозначено как "значение p".
На фиг.20 представлены иллюстративные результаты (p=0,000215), иллюстрирующие, что гены TREG имеют высокие уровни экспрессии у пациентов с рецидивом (R) по сравнению с полностью отвечающими индивидуумами (CR) без рецидива. На оси x представлены образцы по группе ответа, где CR=полностью отвечающий индивидуум и R=индивидуум, у которого возник рецидив. На оси у представлены нормализованные показатели экспрессии метагенов.
На фиг.21 представлен иллюстративный график рассеяния, демонстрирующий процент CAR+ клеток (т.е. частоту трансдукции) до сбора клеток у полностью отвечающих индивидуумов (CR) белым цветом, частично отвечающих индивидуумов (PR) черным цветом и не отвечающих индивидуумов (NR) заштрихованной областью. Эффективность трансдукции определяли до сбора и сопоставляли с ответом индивидуума (например, CR, PR или NR). Сплошная линия соответствует эффективности трансдукции 15%, которая отделяет большинство не отвечающих индивидуумов от отвечающих индивидуумов. Без связи с конкретной теорией, эти данные указывают на то, что частота трансдукции CAR до сбора клеток является маркером ответа на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) при CLL.
На фиг.22 представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая взаимосвязь между инфузируемым количеством CD27+ PD1- CART-клеток и ответом на терапию.
На фиг.23 представлен график рассеяния, демонстрирующий взаимосвязь между инфузируемым количеством CD27+ PD1- CART-клеток и ответом на терапию.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой относится изобретение.
Форма единственного числа относится к одному или более чем к одному (т.е. по меньшей мере к одному) грамматическому объекту в форме единственного числа. В качестве примера "элемент" означает один элемент или более одного элемента.
Термин "приблизительно", когда он относится к поддающейся измерению величине, такой как количество, период времени и т.п., охватывает отклонения ±20%, или в некоторых случаях ±10%, или в некоторых случаях ±5%, или в некоторых случаях ±1%, или в некоторых случаях ±0,1% от указанной величины, поскольку такие отклонения являются пригодными для выполнения описанных способов.
Термины "получать" или "получение", как используют в настоящем описании, относятся к получению во владение физического объекта (например, образца, полипептида, нуклеиновой кислоты или последовательности), или величины, например, числовой величины, путем "прямого получения" или "непрямого получения" физического объекта или величины. "Прямое получение" означает проведение процесса (например, проведение способа синтеза или анализа) для получения физического объекта или величины. "Непрямое получение" относится к получению физического объекта или величины из другого объекта или источника (например, сторонней лаборатории, которая прямо получает физический объект или величину). Прямое получение физического объекта включает проведение процесса, который включает физическое изменение физического вещества, например, исходного материала. Иллюстративные изменение включают получение физического объекта из двух или более исходных материалов, измельчение или фрагментацию вещества, разделение или очистку вещества, комбинирование двух или более отдельных объектов в смесь, проведение химической реакции, которая включает разрушение или формирование ковалентной или нековалентной связи. Прямое получение величины включает проведение процесса, который включает физическое изменение образца или другого вещества, например, проведение аналитического процесса, который включает физическое изменение вещества, например, образца, анализируемого соединения или реагента (иногда называемого в настоящем описании "физическим анализом"), проведение аналитического способа, например, способа, который включает одно или несколько из следующих: отделение или очистку вещества, например, анализируемого соединения, или его фрагмента или другого производного, от другого вещества; комбинирование анализируемого соединения, или его фрагмента или другого производного, с другим веществом, например, буфером, растворителем или реагентом; или изменение структуры анализируемого соединения, или его фрагмента или другого производного, например, путем разрушения или образования ковалентной или нековалентной связи между первым и вторым атомами анализируемого соединения; или изменение структуры реагента, или его фрагмента или другого производного, например, путем разрушения и образования ковалентной или нековалентной связи между первым и вторым атомами реагента.
Термин "антитело", как используют в рамках изобретения, относится к белку, или полипептидной последовательности, происходящим из молекулы иммуноглобулина, который специфически связываются с антигеном. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными, имеющими множество цепей или одноцепочечными, или интактными иммуноглобулинами, и они могут происходить из природных источников или из рекомбинантных источников. Антитела могут представлять собой тетрамеры молекул иммуноглобулинов.
Термин "измененный уровень экспрессии" биомаркера, как описано в настоящем описании (например, биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1 и генной сигнатуры клетки, экспрессирующей CAR против CD19 (например, T-клетки, NK-клетки)) относится к увеличению (или снижению) уровня экспрессии маркера в исследуемом образце, таком как образец, полученный от пациента, страдающего злокачественной опухолью (например, гематологической злокачественной опухолью, такой как ALL и CLL), который превышает или является меньшим, чем стандартная ошибка анализа, используемого для оценки экспрессии. В некоторых вариантах осуществления изменение может превышать или может быть меньше по меньшей мере в два раза, по меньшей мере в три раза, по меньшей мере в четыре раза, по меньшей мере в пять раз или по меньшей мере в двадцать раз или более, чем уровень экспрессии биомаркеров в контрольном образце (например, образце от здорового индивидуума, не имеющего ассоциированного с ними заболевания), или средний уровень экспрессии в нескольких контрольных образцах. "Измененный уровень экспрессии" можно определять на уровне белка или нуклеиновой кислоты (например, мРНК).
Термин "фрагмент антитела" относится по меньшей мере к одной части антитела, которая сохраняет способность специфически взаимодействовать (например, путем связывания, пространственного препятствования, стабилизации/дестабилизации, пространственного распределения) с эпитопом антигена. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fab, Fab', F(ab')2, Fv-фрагменты, фрагменты антител scFv, связанные дисульфидной связью Fv (sdFv), Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (либо VL, либо VH), домены VHH животных семейства верблюжьих, мультиспецифические антитела, образованные фрагментами антител, такими как двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области, и выделенные CDR или другие связывающие эпитоп фрагменты антитела. Антигенсвязывающий фрагмент также может быть включен в однодоменные антитела, максиантитела, миниантитела, наноантитела, интраантитела, диантитела, триантитела, тетраантитела, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть пересажены в каркасы на основе полипептидов, таких как фибронектин типа III (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описаны миниантитела на основе полипептида фибронектина).
Термин "scFv" относится к слитому белку, содержащему по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи, и по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельные области легкой и тяжелой цепей связаны друг с другом, например через короткий гибкий полипептидный линкер, и способному экспрессироваться в качестве одноцепочечного полипептида, и где scFv сохраняет специфичность интактного антитела, из которого он происходит. Если не указано, как используют в рамках изобретения, scFv может иметь вариабельные области VL и VH в любом порядке, например, относительно N-конца и C-конца полипептида scFv может содержать VL-линкер-VH или может содержать VH-линкер-VL.
Термин "тяжелая цепь антитела" относится к более крупной из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антитела в их встречающихся в природе конформациях, и обычно определяющему класс, к которому относится антитело.
Термин "легкая цепь антитела" относится к меньшей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях. Легкие цепи каппа (κ) и лямбда (λ) относятся к двум основным изотипам легких цепей антител.
Термины "определяющая комплементарность область" и "CDR", как используют в рамках изобретения относятся к последовательностям аминокислот в вариабельных областях антитела, которые сообщают ему специфичность к антигену и аффинность связывания. Как правило, существует три CDR в каждой вариабельной области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три CDR в каждой вариабельной области легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3). Точные границы аминокислотной последовательности данной CDR можно определять с использованием любой из ряда хорошо известных схем, включая схемы, описанные Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (схема нумерации "Chothia") или их комбинацию.
Согласно схеме нумерации Kabat, в некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки CDR вариабельного домена тяжелой цепи (VH) нумеруются как 31-35 (HCDR1), 50-66 (HCDR2) и 99-109 (HCDR3); и аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене легкой цепи (VL) нумеруются как 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3). Согласно схеме нумерации Chothia, в некоторых вариантах осуществления аминокислоты CDR в VH нумеруются как 26-32 (HCDR1), 52-57 (HCDR2) и 99-109 (HCDR3); и аминокислотные остатки в VL нумеруются как 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). При комбинировании схем нумерации Kabat и Chothia, в некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют аминокислотным остаткам, которые являются частью CDR по Kabat, CDR по Chothia, или и тех, и других. Например, в некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют аминокислотным остаткам 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в VH, например, VH млекопитающих, например, VH человека; и аминокислотным остаткам 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в VL, например, VL млекопитающих, например, VL человека.
Термин "противораковый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными путями, включая, но не ограничиваясь ими, например, снижение объема опухоли, уменьшение количества злокачественных клеток, уменьшение количества метастазов, увеличение продолжительности жизни, снижение пролиферации злокачественных клеток, снижение выживаемости злокачественных клеток или смягчение различных физиологических симптомов, ассоциированных со злокачественным состоянием. "Противораковый эффект" также может проявляться способностью пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител к предупреждению возникновения злокачественной опухоли изначально. Термин "противоопухолевый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными путями, включая, но не ограничиваясь ими, например, снижение объема опухоли, уменьшение количества опухолевых клеток, снижение пролиферации опухолевых клеток или снижение выживаемости опухолевых клеток.
Термин "аллогенный" относится к любому материалу, происходящему из другого животного того же вида относительно индивидуума, которому материал вводят. Два или более индивидуумов называют аллогенными друг другу, когда гены в одном или нескольких локусов не являются идентичными. В некоторых аспектах аллогенный материал от индивидуумов того же вида может быть достаточно генетически отличающимся, чтобы происходило антигенное взаимодействие.
Термин "аферез", как используют в рамках изобретения, относится к экстракорпоральному процессу, посредством которого кровь донора или пациента извлекают из донора или пациента и пропускают через устройство, которое отделяет конкретный компонент(ы) и возвращает остальную часть в кровоток донора или пациента, например, посредством ретрансфузии. Таким образом, в этом контексте "образец, полученный посредством афереза," относится к образцу, полученному с использованием афереза.
Термин "аутологичный" относится к любому материалу, происходящему из того же индивидуума, которому его впоследствии обратно вводят.
"Биомаркер" или "маркер" представляет собой ген, мРНК или белок, которые претерпевают изменение экспрессии, ассоциированное с прогрессированием злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) или способностью отвечать на лечение. Изменение может представлять собой изменение количества и/или активности в биологическом образце (например, образце крови, плазмы или сыворотки), полученном от индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, по сравнению с количеством и/или активностью в образце, полученном на исходном уровне, или предшествующей величиной у индивидуума, у индивидуума в другой период времени, средней или срединной величиной для популяции пациентов со злокачественной опухолью, здорового контроля, или популяции здоровых индивидуумов (например, контрольной); такие изменения экспрессии и/или активности ассоциированы со способностью индивидуума, имеющего злокачественное состояние (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL), отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, CAR-экспрессирующими иммунными эффекторными клетками (например, CAR-экспрессирующими T-клетками, NK-клетками)), например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19. Например, маркер по изобретению, который прогнозирует способность отвечать на терапевтические средства, может иметь измененный уровень экспрессии, уровень белка или активность белка в биологическом образце, полученном от индивидуума, имеющего или предположительно имеющего злокачественную опухоль, по сравнению с биологическим образцом, полученным от контрольного индивидуума.
Термин "злокачественная опухоль" относится к заболеванию, характеризующемуся неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Злокачественные клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части организма. Примеры различных злокачественных опухолей описаны в настоящем описании и включают, но не ограничиваются ими, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак почки, рак печени, злокачественную опухоль головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легкого и т.п. Злокачественные опухоли включают, но не ограничиваются ими, В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (B-ALL), T-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (T-ALL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), В-клеточный промиелоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток и макроглобулинемию Вальденстрема. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль ассоциирована с экспрессией CD19. Термины "новообразование" и "злокачественная опухоль" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, например, оба термина охватывают солидные и жидкостные опухоли. Как используют в рамках изобретения, термин "злокачественная опухоль" или "новообразование" включают предзлокачественные, а также злокачественные опухоли и новообразования.
Термины "ассоциированный со злокачественной опухолью антиген" или "опухолевый антиген" взаимозаменяемо относятся к молекуле (как правило, белок, углевод или липид), которая преимущественно экспрессируется на поверхности злокачественной клетки, либо полностью, либо в качестве фрагмента (например, MHC/пептид) по сравнению с нормальной клеткой, и которая является пригодной для предпочтительного нацеливания фармакологического средства на злокачественную клетку. В некоторых вариантах осуществления ассоциированный со злокачественной опухолью антиген представляет собой маркер, экспрессируемый как нормальными клетками, так и злокачественными клетками, например, маркер линии дифференцировки, например, CD19 на B-клетках. В некоторых вариантах осуществления ассоциированный со злокачественной опухолью антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая сверхэкспрессируется в злокачественной клетке по сравнению с нормальной клеткой, например, сверхэкспрессируется в 1 раз, сверхэкспрессируется в 2 раза, сверхэкспрессируется в 3 раза или более по сравнению с нормальной клеткой. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая ненадлежащим образом синтезируется в злокачественной клетке, например, молекулу, которая содержит делеции, вставки или мутации по сравнению с молекулой, экспрессируемой на нормальной клетке. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген экспрессируется исключительно на клеточной поверхности злокачественной клетки, полностью или в качестве фрагмента (например, MHC/пептида), и не синтезируется или не экспрессируется на поверхности нормальной клетки. В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению включают CAR, содержащие антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела), который связывается с пептидом, презентируемым MHC. Обычно, пептиды, происходящие из эндогенных белков, занимают карманы молекул основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и распознаются T-клеточными рецепторами (TCR) CD8+ T-лимфоцитах. Комплексы MHC класса I конститутивно экпрессируются всеми ядросодержащими клетками. При злокачественной опухоли вирусоспецифические и/или опухолеспецифические комплексы пептид/MHC представляют собой уникальный класс мишеней клеточной поверхности для иммунотерапии. Описаны пептиды, нацеливающие TCR-подобные антитела, происходящие из вирусных или опухолевых антигенов, в контексте лейкоцитарного антигена человека (HLA)-A1 или HLA-A2 (см., например, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21): 1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176): 176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Например, TCR-подобное антитело может быть идентифицировано при скрининге библиотеки, такой как библиотека фагового дисплея scFv человека.
Как используют в рамках изобретения, термин "CD19" относится к белку кластера дифференцировки 19, который является антигенной детерминантой, поддающейся обнаружению на лейкозных клетках-предшественниках. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот человека и мыши могут быть найдены в общественной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотная последовательность CD19 человека может быть найдена в качестве номера доступа UniProt/Swiss-Prot № P15391, и нуклеотидная последовательность, кодирующая CD19 человека, может быть найдена под номером доступа № NM_001178098. Как используют в рамках изобретения, "CD19" включает белки, содержащие мутации, например, точковые мутации, фрагменты, инсерции, делеции и варианты по сплайсингу полноразмерного CD19 дикого типа. CD19 экспрессируется большинством злокачественных опухолей B-ростка, включая, например, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз и неходжкинскую лимфому. Другие клетки, которые экспрессируют CD19, представлены ниже в определении "заболевания, ассоциированного с экспрессией CD19". Также он является ранним маркером предшественников B-клеток. См., например, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). В одном аспекте антигенсвязывающая часть CART распознает и связывает антиген во внеклеточном домене белка CD19. В одном аспекте белок CD19 экспрессируется на злокачественной клетке. В одном варианте осуществления CD19 имеет последовательность дикого типа, например, последовательность дикого типа человека. В другом варианте осуществления CD19 имеет мутантную последовательность, например, мутантную последовательность человека.
Термин "химерный рецептор антигена" или альтернативно "CAR" относится к набору полипептидов, как правило, двум в наиболее простых вариантах осуществления, который, когда находится в иммунной эффекторной клетке, обеспечивает специфичность клетки к клетке-мишени, как правило, злокачественной клетке, и индукцию внутриклеточного сигнала. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит по меньшей мере внутриклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также обозначаемый в настоящем описании как "внутриклеточный сигнальный домен"), содержащий функциональный сигнальный домен, происходящий из стимулирующей молекулы и/или костимулирующей молекулы, как определено ниже. В некоторых вариантах осуществления набор полипептидов находится в одной полипептидной цепи (например, включает химерный слитый белок). В некоторых вариантах осуществления полипептиды в наборе не являются соседними друг с другом, например, находятся на различных полипептидных цепях. В некоторых вариантах осуществления набор полипептидов включает переключатель димеризации, который в присутствии молекулы димеризации может связывать полипептиды друг с другом, например, может связывать антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В одном аспекте стимулирующая молекула представляет собой зета-цепь, связанную с T-клеточным рецепторным комплексом. В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен включает первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен CD3-зета). В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен дополнительно содержит один или несколько функциональных сигнальных доменов, происходящих из по меньшей мере одной костимулирующей молекулы, как определено ниже. В одном аспекте костимулирующая молекула выбрана из 4-1BB (т.е. CD137), CD27, ICOS и/или CD28. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, происходящий из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, происходящий из костимулирующей молекулы, и функциональный сигнальный домен, происходящий из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий два функциональных сигнальных домена, происходящих из одной или нескольких костсимулирующей молекулы(молекул), и функциональный сигнальный домен, происходящий из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий по меньшей мере два функциональных сигнальных домена, происходящих из одной или нескольких костимулирующей молекулы(молекул), и функциональный сигнальный домен, происходящий из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит необязательную лидерную последовательность на N-конце (N-ter) слитого белка CAR. В одном аспекте CAR дополнительно содержит лидерную последовательность на N-конце внеклеточного антигенраспознающего домена, где лидерная последовательность необязательно отщепляется от антигенраспознающего домена (например, scFv) в ходе клеточного процессинга и локализации CAR на клеточной мембране. В одном варианте осуществления CAR представляет собой CTL019.
Часть CAR по изобретению, содержащая антитело или фрагмент антитела, может существовать в различных формах, где антигенсвязывающий домен экспрессируется в качестве части непрерывной полипептидной цепи, включая, например, однодоменный фрагмент антитела (sdAb), одноцепочечное антитело (scFv) и гуманизированное антитело (Harlow et al., 1999: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В одном аспекте антигенсвязывающий домен композиции CAR по изобретению содержит фрагмент антитела. В следующем аспекте CAR содержит фрагмент антитела, который содержит scFv.
Как используют в рамках изобретения, термин "связывающий домен" или "молекула антитела" относится к белку, например, цепи иммуноглобулина или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Термины "связывающий домен" или "молекула антитела" охватывают антитела и фрагменты антитела. В одном варианте осуществления молекула антитела представляет собой мультиспецифическую молекулу антитела, например, она содержит множество последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулинов, где первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества обладает специфичностью связывания в отношении первого эпитопа, а вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества обладает специфичностью связывания в отношении второго эпитопа. В одном варианте осуществления мультиспецифическая молекула антитела представляет собой биспецифическую молекулу антитела. Биспецифическое антитело обладает специфичностью в отношении не более чем двух антигенов. Биспецифическая молекула антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая обладает специфичностью связывания в отношении первого эпитопа, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая обладает специфичностью связывания в отношении второго эпитопа.
Часть CAR по изобретению, содержащая антитело или фрагмент антитела, может существовать в различных формах, где антигенсвязывающий домен экспрессируется в качестве части непрерывной полипептидной цепи, включая, например, однодоменный фрагмент антитела (sdAb), одноцепочечное антитело (scFv) и гуманизированное антитело (Harlow et al., 1999: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В одном аспекте антигенсвязывающий домен композиции CAR по изобретению содержит фрагмент антитела. В следующем аспекте CAR содержит фрагмент антитела, который содержит scFv.
Выражение "заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19," включает, но не ограничивается ими, заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19 (например, CD19 дикого типа или мутантного CD19), или состояние, ассоциированное с клетками, которые экспрессируют или в какой-либо момент времени экспрессировали CD19, включая, например, пролиферативные заболевания, такие как злокачественная опухоль или новообразование, или предзлокачественное состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз; или не связанные со злокачественной опухолью состояния, ассоциированные с клетками, которые экспрессируют CD19. Во избежание неопределенности, заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, может включать состояние, ассоциированное с клетками, которые в настоящее время не экспрессируют CD19, например, поскольку экспрессия CD19 подавлена, например, вследствие лечения молекулой, нацеленной на CD19, например, CAR против CD19, но которая когда-то экспрессировала CD19. В одном аспекте злокачественная опухоль, ассоциированная с экспрессией CD19, представляет собой гематологическую злокачественную опухоль. В одном аспекте гематологическая злокачественная опухоль представляет собой лейкоз или лимфому. В одном аспекте злокачественная опухоль, ассоциированная с экспрессией CD19, включает злокачественные опухоли и новообразования, включающие, но не ограничивающиеся ими, например, один или несколько из острых лейкозов, включая, но не ограничиваясь ими, например, острый миелоидный лейкоз (AML), B-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз ("B-ALL"), T-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз ("T-ALL"), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL); один или несколько хронических лейкозов, включая, но не ограничиваясь ими, например, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). Дополнительные злокачественные опухоли или гематологические состояния, ассоциированные с экспрессией CD19, включают, но не ограничиваются ими, например, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема, миелопролиферативное новообразование; гистиоцитарное нарушение (например, нарушение тучных клеток или новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток); нарушение тучных клеток, например, системный мастоцитоз или лейкоз тучных клеток; В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, плазмацитарную миелому и "предлейкоз", который представляет собой многообразную совокупность гематологических состояний, объединенных неэффективной продукцией (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и т.п. Кроме того, заболевания, ассоциированные с экспрессией CD19, включают, но не ограничиваясь ими, например, атипичные и/или неклассические злокачественные опухоли, новообразования, предзлокачественные состояния или пролиферативные заболевания, ассоциированные с экспрессией CD19. Не связанные со злокачественной опухолью состояния, ассоциированные с экспрессией CD19, включают, но не ограничиваются ими, например, аутоиммунное заболевание (например, волчанка), воспалительные нарушения (аллергия и астма) и трансплантацию. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, экспрессируют или в какой-либо момент экспрессировали мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, продуцируют белок опухолевого антигена (например, дикого типа или мутантный), и белок опухолевого антигена может присутствовать на нормальных уровнях или сниженных уровнях. В одном варианте осуществления экспрессирующие опухолевый антиген клетки продуцируют поддающиеся обнаружению уровни белка опухолевого антигена в один момент времени, а затем по существу не продуцируют поддающийся обнаружению белок опухолевого антигена. В других вариантах осуществления заболевание представляет собой отрицательную по CD19 злокачественную опухоль, например, отрицательную по CD19 рецидивирующую злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген (например, CD19), экспрессирует или в какой-либо момент времени экспрессировала мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген (например, CD19), продуцирует опухолевый антигенный белок (например, дикого типа или мутантный), и белок опухолевого антигена может присутствовать на нормальных уровнях или на сниженных уровнях. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген (например, CD19), продуцирует поддающиеся обнаружению уровни белка опухолевого антигена в один момент времени, а затем по существу не продуцирует белок опухолевого антигена.
Термин "костимулирующая молекула" относится к распознающему связывающему партнеру на T-клетке, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, тем самым, опосредуя костимулирующий ответ T-клеткой, такой как, но не ограничиваясь ими, пролиферация. Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности, отличные от рецепторов антигенов или их лигандов, которые требуются для эффективного иммунного ответа. Костимулирующие молекулы включают, но не ограничиваются ими, молекулу MHC класса I, белки рецепторов TNF, иммуноглобулин-подобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTFA, рецептор Toll-подобного лиганда, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KFRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VFA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKF, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM 1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, и лиганд, который специфически связывается с CD83.
Костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части костимулирующей молекулы. Внутриклеточный сигнальный домен может содержать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которой он происходит, или их функциональный фрагмент.
Как используют в рамках изобретения, "величина статуса ответа или рецидива" включает показатель (например, уровень), прогнозирующий способность индивидуума к ответу или рецидиву при лечении (например, лечении, которое включает или состоит из терапии CAR-экспрессирующими клетками, как описано в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления показатель является качественным или количественным. В некоторых вариантах осуществления величина статуса ответа или рецидива соответствует полностью отвечающему индивидууму, частично отвечающему индивидууму, не отвечающему индивидууму, индивидууму, у которого возникнет рецидив, или индивидууму, у которого не возникнет рецидива. В некоторых вариантах осуществления величина статуса ответа или рецидива представляет собой вероятность быть полностью отвечающим индивидуумом, частично отвечающим индивидуумом, не отвечающими индивидуумом, индивидуумом, у которого возникнет рецидив, или индивидуумом, у которого не возникнет рецидива. В некоторых вариантах осуществления величину статуса ответа или рецидива можно определять на основе любого из показателей (i)-(viii), как описано в настоящем описании.
Что касается способности к ответу, индивидуум отвечает на лечение, если параметр злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, например, рост, пролиферация и/или выживаемость злокачественных клеток) замедляется или снижается на поддающуюся обнаружению величину, например, приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более при определении с помощью любого подходящего показателя, например, массы, количества клеток или объема. В одном примере индивидуум отвечает на лечение, если индивидуум имеет увеличение продолжительности жизни приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или более по сравнению с прогнозируемой продолжительностью жизни без проведения лечения. В другом примере индивидуум отвечает на лечение, если индивидуум имеет увеличенную выживаемость без заболевания, общую выживаемость или увеличенное время до прогрессирования.
Для определения того, отвечает ли пациент на лечение, можно использовать несколько способов, включая, например, критерии, предоставляемые Clinical Practice Guidelines in Oncology NCCN (NCCN Guidelines®). Например, в контексте B-ALL, полный ответ или полностью отвечающий индивидуум могут вовлекать одно или несколько из: < 5% бластов BM, >1000 нейтрофилов/ANC (/мкл), >100000 тромбоцитов (/мкл) без циркулирующих бластов или экстрамедулярного заболевания (нет лимфоаденопатии, спленомегалии, инфильтрации кожи/десны/тестикулярной массы/вовлечения ЦНС), гемопоэз трех ростков и отсутствие рецидива в течение 4 недель. Частично отвечающий индивидуум может вовлекать одно или несколько из >50% снижения бластов BM, >1000 нейтрофилов/ANC (/мкл), >100000 тромбоцитов (/мкл). Не отвечающий индивидуум может демонстрировать прогрессирование заболевания, например, > 25% бластов BM.
"Полностью отвечающий", как используют в рамках изобретения, относится к индивидууму, имеющему заболевание, например, злокачественную опухоль, который проявляет полный ответ на лечение, например полную ремиссию. Полный ответ можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines® или критериев Cheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999) и Cheson et al., "Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma", J Clin Oncol 25:579-586 (2007) (оба из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме), как описано в настоящем описании.
"Частично отвечающий", как используют в рамках изобретения, относится к индивидууму, имеющему заболевание, например, злокачественную опухоль, который проявляет частичный ответ на лечение, например, частичную ремиссию. Частичный ответ можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines® или критериев Cheson, как описано в настоящем описании.
"Не отвечающий", как используют в рамках изобретения, относится к индивидууму, имеющему заболевание, например, злокачественную опухоль, который не проявляет ответ на лечение, например, пациент имеет стабильное заболевание или прогрессирующее заболевание. Не отвечающего индивидуума можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines® или критериев Cheson, как описано в настоящем описании.
Термин "рецидив", как используют в рамках изобретения, относится к повторному возникновению заболевания (например, злокачественной опухоли) после первоначального периода ответа, например, после предшествующей терапии, например, терапии злокачественной опухоли (например, полного ответа или частичного ответа). Первоначальный период ответа может вовлекать уровень злокачественных клеток, падающий ниже определенного порога, например, ниже 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Повторное возникновение может вовлекать уровень злокачественных клеток, достигающий величины выше определенного порогового уровня, например, выше 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Например, в контексте B-ALL, повторное возникновение может вовлекать, например, повторное возникновение бластов в крови, костном мозге (> 5%) или любой экстрамедуллярной области после полного ответа. В этом контексте полный ответ может вовлекать <5% бластов BM. Более часто, в одном варианте осуществления ответ (например, полный ответ или частичный ответ) может вовлекать отсутствие поддающейся обнаружению MRD (минимальная резидуальная болезнь). В одном варианте осуществления первоначальный период ответа длится по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 суток; по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 недели; по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, или 12 месяцев; или по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 лет.
В некоторых вариантах осуществления при терапии, которая включает ингибитор CD19, например, терапии CAR против CD19, может возникнуть рецидив или рефрактерность к лечению. Рецидив или резистентность могут быть вызваны утратой CD19 (например, мутацией с утратой антигена) или другим изменением CD19, которое снижает уровень CD19 (например, вызванным клональной селекцией CD19-отрицательных клонов). Злокачественную опухоль, которая имеет такую утрату или изменение CD19, называют в настоящем описании "CD19-отрицательной злокачественной опухолью" или "CD19-отрицательной рецидивирующей злокачественной опухолью"). Должно быть понятно, что CD19-отрицательная злокачественная опухоль не должна иметь 100% утрату CD19, а должна иметь достаточное снижение для уменьшения эффективности терапии против CD19, так что происходит рецидив злокачественной опухоли или она становится рефрактерной. В некоторых вариантах осуществления CD19-отрицательная злокачественная опухоль является результатом терапии CAR против CD19. В некоторых вариантах осуществления CD19-отрицательную множественную миелому можно лечить с помощью терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, например, как описано в PCT/US2015/024671, поданной 7 апреля 2015 года (например, абзацы 9 и 90, и пример 6 в ней), которая включена в качестве ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления CD19-отрицательную злокачественную опухоль можно лечить с помощью терапии CAR-экспрессирующими клетками, например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD123, например, как описано в PCT/US2015/045898, поданной 19 августа 2015 года (например, стр.26, стр.30, и пример 7 в ней), которая включена в качестве ссылки в полном объеме.
Термин "эндогенный" относится к любому материалу из или продуцируемому внутри организма, клетки, ткани или системы.
Термины "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к количеству соединения, состава, материала или композиции, как описано в настоящем описании, эффективному для достижения конкретного биологического результата.
Термин "экзогенный" относится к любому материалу, внесенному извне или продуцированному вне организма, клетки, ткани или системы.
Термин "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемой промотором.
Термины "гибкий полипептидный линкер" или "линкер", как используют в контексте scFv, относится к пептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как остатки глицина и/или серина, используемых отдельно или в комбинации, для связывания вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи вместе. В одном варианте осуществления гибкий полипептидный линкер представляет собой линкер Gly/Ser, и он содержит аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, равное или превышающее 1. Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 и n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10 (SEQ ID NO: 28). В одном варианте осуществления гибкие полипептидные линкеры включают, но не ограничиваются ими, (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 29) или (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 30). В другом варианте осуществления линкеры включают множество повторов (Gly2Ser), (GlySer) или (Gly3Ser) (SEQ ID NO: 31). Также в объем изобретения входят линкеры, описанные в WO2012/138475, включенной в настоящее описание в качестве ссылки).
Термины "гомология" или "идентичность", используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к сходству двух полинуклеотидных последовательностей или двух полипептидных последовательностей, причем идентичность является более строгим сравнением. Выражения "процентная идентичность или гомология" и "% идентичность или гомология" относятся к проценту сходства последовательностей при сравнении двух или более полинуклеотидных последовательностей или двух или более полипептидных последовательностей. "Сходство последовательностей" относится к процентному сходству последовательностей пар оснований (при определении любым подходящим способом) между двумя или более полинуклеотидными последовательностями. Две или более последовательности могут обладать любым сходством в пределах 0-100%, или любого целого числа между ними. Идентичность или сходство можно определять путем сравнения положения в каждой последовательности, которое может быть выровнено для целей сравнения. Когда положение в сравниваемых последовательностях занято одним и тем же нуклеотидным основанием или аминокислотой, тогда молекулы являются идентичными в этом положении. Степень сходства или идентичность полинуклеотидных последовательностей является функцией количества идентичных или совпадающих нуклеотидов в общих положениях полинуклеотидных последовательностей. Степень идентичности полипептидных последовательностей является функцией идентичных аминокислот в общих положениях полипептидных последовательностей. Степень гомологии или сходства полипептидных последовательностей является функцией количества аминокислот в общих положениях полипептидных последовательностях. Термин "существенная гомология", как используют в рамках изобретения, относится к гомологии по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или более.
"Гуманизированные" формы не являющихся человеческими антител (например, мыши) представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие связывающие антиген подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из не являющегося человеческим иммуноглобулина. В основном гуманизированные антитела и их фрагменты представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело или фрагмент антитела), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены остатками из CDR не являющегося человеком вида (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющими желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими не являющимися человеческими остатками. Более того, гуманизированное антитело/фрагмент антитела может содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентном антителе, ни в импортированных последовательностях CDR или каркасной области. Эти модификации могут далее усовершенствовать и оптимизировать эффективность антитела или фрагмента антитела. Как правило, гуманизированное антитело или его фрагмент содержат значительную часть по меньшей мере одного, и, как правило, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все из областей CDR соответствуют областям CDR не являющегося человеческим иммуноглобулина и все или по существу все из областей FR представляют собой области FR из последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или фрагмент антитела также могут содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Для более подробного описания, см. Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.
"Иммунная эффекторная клетка", как этот термин используют в настоящем описании, относится к клетке, которая вовлечена в иммунный ответ, например, стимуляцию иммунного эффекторного ответа. Примеры иммунных эффекторных клеток включают T-клетки, например, альфа/бета T-клетки и гамма/дельта T-клетки, В-клетки, натуральные киллеры (NK), натуральные киллерные T-клетки (NK-T), тучные клетки и фагоциты миелоидного происхождения.
"Иммунная эффекторная функция или иммунный эффекторный ответ", как эти термины используют в настоящем описании, относятся к функции или ответу, например, иммунной эффекторной клетки, которая усиливает или стимулирует иммунную атаку клетки-мишени. Например, иммунная эффекторная функция или ответ относятся к свойству T-клеток или NK-клеток, которое стимулирует уничтожение или ингибирование роста или пролиферации клетки-мишени. В случае T-клетки, примерами иммунной эффекторной функции или ответа являются первичная стимуляция и костимуляция.
Термин "эффекторная функция" относится к специализированной функции клетки. Эффекторная функция T-клетки, например, может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов.
Термин "4-1BB" относится к представителю суперсемейства TNFR с аминокислотной последовательностью, представленной в качестве последовательности с номером доступа GenBank № AAA62478.2, или эквивалентными остатками из не являющегося человеком вида, например, мыши, грызуна, мартышки, человекообразной обезьяны и т.п. В одном аспекте "костимулирующий домен 4-1BB" определяют как аминокислотные остатки 214-255 последовательности с номером доступа GenBank № AAA62478.2, или эквивалентные остатки из не являющегося человеком вида, например, мыши, грызуна, мартышки, человекообразной обезьяны и т.п. В одном аспекте "костимулирующий домен 4-1BB" представляет собой последовательность, представленную в качестве SEQ ID NO: 7, или эквивалентные остатки из не являющегося человеком вида, например, мыши, грызуна, мартышки, человекообразной обезьяны и т.п.
"Внутриклеточный сигнальный домен", как используют в настоящем описании, относится к внутриклеточной части молекулы. Внутриклеточный сигнальный домен генерирует сигнал, который стимулирует иммунную эффекторную функцию содержащей CAR клетки, например, CAR-экспрессирующей клетки, например, T-клетки или NK-клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например, в CAR-экспрессирующей клетке, включают цитолитическую активность и хелперную активность, включая секрецию цитокинов. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен передает сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Хотя можно использовать целый внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях не является необходимым использование целой цепи. В случаях когда используют укороченную часть внутриклеточного сигнального домена такую укороченную часть можно использовать вместо интактной цепи при условии, что она передает сигнал эффекторной функции. Таким образом, подразумевают, что термин "внутриклеточный сигнальный домен включает любую укороченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для передачи сигнала эффекторной функции.
В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Иллюстративные первичные внутриклеточные сигнальные домены включают домены, происходящие из молекул, ответственных за первичную стимуляцию или антигензависимую стимуляцию. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать костисмулирующий внутриклеточный домен. Иллюстративные костимулирующие внутриклеточные сигнальные домены включают домены, происходящие из молекул, ответственных за костисмулирующие сигналы или антиген-независимую стимуляцию. Например, в случае CAR-экспрессирующей клетки (например, T-клетки, NK-клетки) первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность T-клеточного рецептора, и костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность из корецептора или костимулирующей молекулы.
Первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры содержащих ITAM первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают, но не ограничиваются ими, последовательности, происходящие из CD3-зета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"), FcεRI, CD66d, CD32, DAP10 и DAP12.
Как используют в рамках изобретения, "транскрибированная in vitro РНК" относится к РНК, предпочтительно мРНК, синтезированной in vitro. Как правило, транскрибированную in vitro РНК получают из вектора для транскрипции in vitro. Вектор для транскрипции in vitro содержит матрицу, которую используют для получения транскрибированной in vitro РНК.
Термин "выделенный" означает измененный или извлеченный относительно природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, естественным образом присутствующие в живом животном, не являются "выделенными", но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сосуществующих с ними материалов природного состояния, являются "выделенными". Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать в по существу очищенной форме или могут существовать в ненативной среде, например, такой как клетка-хозяин.
Термин "лентивирус" относится к роду семейства Retroviridae. Лентивирусы являются уникальными среди ретровирусов, поскольку они способны инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-хозяина, так что они являются одним из наиболее эффективных способов доставки вектора с геном. Примерами лентивирусов являются ВИЧ, SIV и FIV.
Термин "лентивирусный вектор" относится к вектору, происходящему по меньшей мере из части генома лентивируса, включая, а частности, самоинактивирующийся лентивирусный вектор, представленный в Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Другие примеры лентивирусных векторов, которые можно использовать в клинике, включают, но не ограничиваются ими, например, технологию доставки генов LENTIVECTOR® от Oxford BioMedica, векторную систему LENTIMAXTM от Lentigen и т.п. Также доступны неклинические типы лентивирусных векторов, и они известны специалисту в данной области.
Термин "низкая усиливающая иммунитет доза", когда его используют применительно к ингибитору mTOR, например, аллостерическому ингибитору mTOR, например RAD001 или рапамицину, или каталитическому ингибитору mTOR, относится к дозе ингибитора mTOR, которая частично, но не полностью ингибирует активность mTOR, например, при измерении по ингибированию активности киназы P70 S6. Способы оценки активности mTOR, например, по ингибированию киназы P70 S6, описаны в настоящем описании. Доза является недостаточной для обеспечения полного подавления иммунного ответа, но является достаточной для усиления иммунного ответа. В одном варианте осуществления низкая усиливающая иммунитет доза ингибитора mTOR приводит к уменьшению количества положительных по PD-1 иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, и/или увеличению количества отрицательных по PD-1 иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, или к увеличению соотношения отрицательные по PD-1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки/положительные по PD-1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки.
Как правило, термин "наивная T-клетка" относится к иммунным клеткам, которые включают клетки, не подвергавшиеся воздействию антигена, например, иммунные клетки, которые являются предшественниками клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления наивные T-клетки могут быть дифференцированными, но еще не встретившими распознаваемый ими антиген, и, таким образом, они являются активированными T-клетками или T-клетками памяти. В некоторых вариантах осуществления наивные T-клетки могут характеризоваться экспрессией CD62L, CD27, CCR7, CD45RA, CD28 и CD127, и отсутствием изоформы CD95 или CD45RO. В определенных вариантах осуществления наивные T-клетки представляют собой тип более молодых T-клеток, как описано в настоящем описании.
Термин "менее истощенный" или "менее истощенный фенотип" относится к иммунным эффекторным клеткам, которые имеют сниженную (например, отсутствие) экспрессию маркеров истощения иммунных клеток, например, PD1, TIM3 и LAG3. В некоторых вариантах осуществления менее истощенная клетка может представлять собой более молодую T-клетку, как описано в настоящем описании.
Термины "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" относятся к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК), или комбинации ДНК или РНК, и их полимерам либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме. Термин "нуклеиновая кислота" включает ген, кДНК или мРНК. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты является синтетической (например, химически синтезированной) или рекомбинантной. Если конкретно не ограничено, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют сходные свойства связывания с эталонной нуклеиновой кислотой и метаболизируются аналогично встречающимся в природе нуклеотидам. Если нет иных указаний, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также косвенно охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, вырожденные замены кодонов), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также последовательность, прямо указанную. В частности, вырожденные замены кодонов можно осуществлять путем получения последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов замещено смешанными остатками и/или остатками дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). В контексте настоящего изобретения используют следующие сокращения часто встречающихся оснований нуклеиновых кислот. "A" относится к аденозину, "C" относится к цитозину, "G" относится к гуанозину, "T" относится к тимидину и "U" относится к уридину.
"Маркер" или "биомаркер" "нуклеиновой кислоты" представляет собой нуклеиновую кислоту (например, ДНК, мРНК, кДНК), кодируемую маркером или соответствующую маркеру, как описано в настоящем описании. Например, такие маркерные молекулы нуклеиновой кислоты включают ДНК (например, геномную ДНК и кДНК), содержащую целую или частичную последовательность любой из указанных последовательностей нуклеиновых кислот, или комплементарную последовательность или гибридизующийся фрагмент такой последовательности. Маркерные молекулы нуклеиновых кислот также включают РНК, содержащую целую или частичную последовательность любой из последовательностей нуклеиновых кислот, указанных в настоящем описании, или комплементарную последовательность для такой последовательности, где все остатки тимидина заменены остатками уридина. "Маркерный белок" представляет собой белок, кодируемый маркером или соответствующий маркеру по изобретению. Маркерный белок содержит целую или неполную последовательность белка, кодируемого любыми из последовательностей, указанных в настоящем описании, или их фрагментами. Термины "белок" и "полипептид" используют в настоящем описании взаимозаменяемо.
"Сверхэкспрессия" или "значительно более высокий уровень экспрессии" генных продуктов относится к уровню экспрессии или количеству копий в исследуемом образце, которые превышают стандартную ошибку анализа, используемого для оценки уровня экспрессии. В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия может по меньшей мере в два, по меньшей мере в три, по меньшей мере в четыре, по меньшей мере в пять или по меньшей мере в десять или более раз превышать уровень экспрессии гена в контрольном образце или средний уровень экспрессии генных продуктов в нескольких контрольных образцах.
Термины "пептид," "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должны содержать по меньшей мере две аминокислоты, и отсутствует ограничение на максимальное количество аминокислот, которые могут содержаться в последовательности белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащие две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Как используют в рамках изобретения, термин относится к как коротким цепям, которые также обычно называют в данной области, например, пептидами, олигопептидами и олигомерами, так и к более длинным цепям, которые обычно называют в данной области белками, для которых существует множество типов. "Полипептиды" включают, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки, среди прочих. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.
Как используют в рамках изобретения, "поли(A)" представляет собой серию остатков аденозина, присоединяемых к мРНК посредством полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления конструкции для временной экспрессии длина поли-A составляет от 50 до 5000 (SEQ ID NO: 34) (например, 2000; SEQ ID NO: 32), например, 64 (SEQ ID NO: 37), например, более 100 (например, 150, SEQ ID NO: 33), например, более 400 (SEQ ID NO: 38). Последовательности поли(A) могут быть химически или ферментативно модифицированы для модулирования функциональности мРНК, такой как локализация, стабильность или эффективность трансляции.
Термин "зонд" относится к любой молекуле, которая способна селективно связываться с конкретной молекулой-мишенью, например, маркером по изобретению. Зонды могут быть либо синтезированы специалистом в данной области, либо происходят из соответствующих биологических препаратов. Для обнаружения молекулы-мишени зонды могут быть специально сконструированы так, чтобы быть мечеными, как описано в настоящем описании. Примеры молекул, которые можно использовать в качестве зондов, включают, но не ограничиваются ими, РНК, ДНК, белки, антитела и органические мономеры.
Термин "промотор" относится к последовательности ДНК, распознаваемой синтетическим аппаратом клетки или введенным синтетическим аппаратом, которая требуется для инициации транскрипции полинуклеотидной последовательности.
Термин "промоторная/регуляторная последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая требуется для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промоторной/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях эта последовательность может представлять собой основную промоторную последовательность и в других случаях эта последовательность также может включать энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, которые требуются для экспрессии продукта гена. Промоторная/регуляторная последовательность, например, может представлять собой последовательность, которая экспрессирует продукт гена тканеспецифическим образом.
Термин "профилактика", как используют в рамках изобретения, означает предупреждение или защитное лечение заболевания или болезненного состояния.
Диапазоны: на протяжении настоящего описания различные аспекты изобретения могут быть представлены в формате диапазонов. Следует понимать, что описание в формате диапазонов предоставлено только для удобства и краткости, и его не следует истолковывать как строгое ограничение объема изобретения. Таким образом, описание диапазона следует считать имеющим конкретно описанные все возможные числовые поддиапазоны, а также индивидуальные числовые величины в этом диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует истолковывать как диапазон, имеющий конкретно описанные поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также индивидуальные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. В качестве другого примера диапазон, такой как идентичность 95-99%, включает что-либо с 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью и включает поддиапазоны, такие как идентичность 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% и 98-99%. Это применимо независимо от ширины диапазона.
Термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, которое получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК, например, такому как антитело, экспрессируемое бактериофагом или дрожжевой экспрессирующей системой. Термин также следует истолковывать как антитело, полученное посредством синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, причем эта молекула ДНК экспрессирует белок антитела или аминокислотную последовательность, характеризующую антитело, где ДНК или аминокислотная последовательность получены с использованием технологии рекомбинантных ДНК или аминокислотных последовательностей, которая доступна и хорошо известна в данной области.
"Рефрактерный", как используют в рамках изобретения, относится к заболеванию, например, злокачественной опухоли, которое не отвечает на лечение. В некоторых вариантах осуществления рефрактерная злокачественная опухоль может быть устойчивой к лечению до или в начале лечения. В других вариантах осуществления рефрактерная злокачественная опухоль может стать рефрактерной в процессе лечения. Рефрактерную злокачественную опухоль также называют резистентной злокачественной опухолью.
В некоторых вариантах осуществления эталонный или контрольный уровень или активность представляет собой уровень и/или активность у индивидуума, например, в образце, полученном из одного или нескольких из: исходного уровня или предшествующей величины для индивидуума (например, до лечения CAR-экспрессирующей клеткой); индивидуума в другой период времени; средней или срединной величины для популяции пациентов со злокачественной опухолью; здорового контроля или здоровой популяции индивидуумов (например, контроля).
"Образец", "образец ткани", "образец от пациента", "образец клеток или ткани пациента" или "проба" относятся к биологическому образцу, полученному из ткани или жидкости организма индивидуума или пациента. Источником образца ткани может быть солидная ткань, такая как из свежего, замороженного и/или сохраненного органа, образец ткани, биоптат или аспират; кровь или компоненты крови (например, сыворотка, плазма); жидкости организма, такие как моча, спинномозговая жидкость, цельная кровь, плазма и сыворотка. Образец может включать неклеточную фракцию (например, моча, плазма, сыворотка или другая неклеточная жидкость организма). В одном варианте осуществления образец представляет собой образец мочи. В других вариантах осуществления жидкость организма, из которой получают образец индивидуума, включает кровь (например, цельную кровь). В одном варианте осуществления образец представляет собой образец цельной крови, полученный от индивидуума. В определенных вариантах осуществления кровь можно далее обрабатывать для получения плазмы или сыворотки. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец, полученный посредством афереза крови индивидуума. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец произведенного продукта, например, модифицированных способам инженерии T-клеток, полученных из крови индивидуума, например, произведенного продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток), например, произведенного продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19. В другом варианте осуществления образец содержит ткань, клетки (например, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC)). Например, образец может представлять собой образец, полученный посредством тонкоигольной пункционной биопсии, архивный образец (например, архивный образец с известным диагнозом и/или анамнезом лечения), гистологический срез (например, замороженный или фиксированный формалином срез, например, после длительного хранения), среди прочих. Термин "образец" включает любой материал, полученный и/или происходящий из биологического образца. включая полипептид и нуклеиновую кислоту (например, геномную ДНК, кДНК, РНК), очищенные или переработанные из образца. Очистка и/или переработка образца могут вовлекать одно или несколько из экстрагирования, концентрирования, выделения антитела, сортировки, концентрирования, фиксации, добавления реагентов и т.п. Образец может содержать соединения, которые в природе не смешаны с тканью, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксажи, питательные вещества, антибиотики и т.п.
Термин "продукт" или "произведенный продукт", как используют в рамках изобретения, относится к произведенной композиции, содержащей модифицированную способами генной инженерии клетку (например, иммунную эффекторную клетку), например, популяцию клеток, в которой множество клеток модифицированы способами инженерии для экспрессии CAR, например, CAR, описанного в настоящем описании. Произведенный продукт может представлять собой любую модифицированную способами генной инженерии эффекторную клетку (например, T-клетку, NK-клетку), например, модифицированные способами генной инженерии иммунные эффекторные клетки, полученные из крови индивидуума, например, произведенный продукт CAR-экспрессирующих клеток, например, произведенный продукт клеток, экспрессирующих CAR против CD19. В одном варианте осуществления клетку (например, иммунную эффекторную клетку), модифицированную способами инженерии для экспрессии CAR, можно получать из активированной криоконсервированной увеличенной в количестве клеточной популяции (например, увеличенной в количестве популяции иммунных эффекторных клеток).
Термин "сигнальный домен" относится к функциональной части белка, которая действует, передавая информацию в клетке для регуляции клеточной активности через определенные пути передачи сигнала путем образования вторичных посредников или функционирования в качестве эффекторов посредством ответа на таких посредников.
Количество биомаркера, например, продукта экспрессии гена (например, одного или нескольких биомаркеров, описанных в настоящем описании) у индивидуума является "значимо" более высоким или более низким, чем нормальное количество маркера, если количество маркера превышает или является более низким, соответственно, чем нормальный уровень на количество, превышающее стандартную ошибку анализа, используемого для оценки количества, или по меньшей мере в два, три, четыре, пять, десять или более превышающее это количество. Альтернативно количество маркера у индивидуума можно считать "значимо" более высоким или более низким, чем нормальное количество, если количество по меньшей мере приблизительно в 1,5, два, по меньшей мере приблизительно три, по меньшей мере приблизительно четыре, или по меньшей мере приблизительно пять раз превышает или является более низким, соответственно, чем нормальное количество маркера.
Термин "специфически связывается" относится к антителу или лиганду, которые распознают и связываются с белком-партнером по связыванию, присутствующем в образце, но при этом эти антитело или лиганд по существу не распознают или не связывают другие молекулы в образце.
Термин "стимуляция" относится к первичному ответу, индуцированному посредством связывания стимулирующей молекулы (например, комплекс TCR/CD3) с ее собственным лигандом, что, тем самым, опосредует событие передачи сигнала, такое как, но не ограничиваясь ими, передача сигнала через комплекс TCR/CD3 или передача сигнала через соответствующий рецептор NK или сигнальные домены CAR. Стимуляция может опосредовать измененную экспрессию определенных молекул, такую как подавление регуляции TGF-β и/или реорганизация структур цитоскелета и т.п.
Термин "стимулирующая молекула" относится к молекуле, экспрессируемой T-клеткой, которая предоставляет первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность(и), которая регулирует первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом для по меньшей мере некоторого аспекта каскада передачи сигнала T-клетками. В одном аспекте первичный сигнал инициируется, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой MHC, нагруженной пептидом, и который приводит к опосредованию T-клеточного ответа, включая, но не ограничиваясь ими, пролиферацию, активацию, дифференцировку и т.п. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также обозначаемая как "первичный сигнальный домен"), которая действует стимулирующим образом, может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры содержащей ITAM цитоплазматической сигнальной последовательности, которая является особенно пригодной в рамках изобретения, включают, но не ограничиваются ими, последовательности, происходящие из CD3-зета, общего FcR-гамма (FCER1G), Fc-гамма RIIa, FcR-бета (Fc-эпсилон R1b), CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD79a, CD79b, DAP10 и DAP12. В конкретном CAR по изобретению внутриклеточный сигнальный домен в любом одном или нескольких CAR по изобретению содержит внутриклеточную сигнальную последовательность, например, первичную сигнальную последовательность CD3-зета. В конкретном CAR по изобретению первичная сигнальная последовательность CD3-зета представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18 (мутантный CD3-зета), или эквивалентные остатки из не являющегося человеком вида, например, мыши, грызуна, мартышки, человекообразной обезьяны и т.п. В конкретном CAR по изобретению первичная сигнальная последовательность CD3-зета представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20 (CD3-зета человека дикого типа), или эквивалентные остатки из не являющегося человеком вида, например, мыши, грызуна, мартышки, человекообразной обезьяны и т.п.
Термин "индивидуум" включает живые организмы, у которых может быть индуцирован иммунный ответ (например, млекопитающие, человек). В одном варианте осуществления индивидуумом является млекопитающее. В одном варианте осуществления индивидуумом является человек. В одном варианте осуществления индивидуумом является пациент.
Термин "терапевтический", как используют в рамках изобретения, означает лечение. Терапевтический эффект достигают путем снижения, подавления, обеспечения ремиссии или устранения болезненного состояния.
Термины "трансфицированный", или "трансформированный", или "трансдуцированный" относятся к процессу, посредством которого экзогенная нуклеиновая кислота переносится или вводится в клетку-хозяина. "Трансфицированная", или "трансформированная", или "трансдуцированная" клетка представляет собой клетку, которая трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована экзогенной нуклеиновой кислотой. Клетка включает первичную клетку индивидуума и ее потомство.
Как используют в рамках изобретения, "временный" относится к экспрессии невстроенного трансгена в течение периода, составляющего несколько часов, суток или недель, где период экспрессии является меньшим, чем период экспрессии гена, если он встроен в геном или содержится в стабильном плазмидном репликоне в клетке-хозяине.
Термин "трансмембранный домен" относится к полипептиду, который проходит через плазматическую мембрану. В одном варианте осуществления он связывает внеклеточную последовательность, например, домен переключения, внеклеточный распознающий элемент, например, антигенсвязывающий домен, ингибиторный противодействующий лигандсвязывающий домен или костимулирующий домен ECD, с внутриклеточной последовательностью, например, с доменом переключения или внутриклеточным сигнальным доменом. Трансмембранный домен может включать одну или несколько дополнительных аминокислот, соседних с трансмембранной областью, например, одну или несколько аминокислот, ассоциированных с внеклеточной областью белка, из которого происходит трансмембранный домен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и вплоть до 15 аминокислот внеклеточной области) и/или одну или несколько дополнительных аминокислот, ассоциированных с внутриклеточной областью белка, из которого происходит трансмембранный белок (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и вплоть до 15 аминокислот внутриклеточной области). Примеры трансмембранных доменов описаны в настоящем описании.
Термины "лечить", "лечение" и "проведение лечения" относятся к снижению или смягчению прогрессирования, тяжести и/или длительности пролиферативного нарушения, или к смягчению одного или нескольких симптомов (предпочтительно, одного или нескольких различимых симптомов) пролиферативного нарушения вследствие проведения одной или нескольких терапий (например, введения одного или нескольких лекарственных средств, таких как CAR по изобретению). В конкретных вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "проведение лечения" относятся к смягчению по меньшей мере одного поддающегося измерению физического параметра пролиферативного нарушения, такого как рост опухоли, не обязательно заметного для пациента. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "проведение лечения" относятся к ингибированию прогрессирования пролиферативного нарушения, либо физически, например, путем стабилизации различимого симптома, либо физиологически, например, путем стабилизации физического параметра, или обоими путями. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "проведение лечения" относятся к снижению или стабилизации размера опухоли или количества злокачественных клеток.
"Недостаточная экспрессия" или "значительно сниженный уровень экспрессии" продуктов (например, маркеров, описанных в настоящем описании) относится к уровню экспрессии в исследуемом образце, который превышает стандартную ошибку анализа, используемого для оценки экспрессии, например, по меньшей мере в 1,5 раза, в два раза, по меньшей мере в три раза, по меньшей мере в четыре раза, по меньшей мере в пять раз или по меньшей мере в десять или более раз меньше, чем уровень экспрессии гена в контрольном образце или средний уровень экспрессии генных продуктов в нескольких контрольных образцах.
Термин "ксеногенный" относится к трансплантату, происходящему из животного другого вида.
Как используют в рамках изобретения, термин "молодая T-клетка" или "более молодая T-клетка", относится к иммунной эффекторной клетке, которая имеет менее дифференцированный фенотип, например, более молодой клетке, например, молодой T-клетке. В некоторых вариантах осуществления более молодая T-клетка может представлять собой наивную T-клетку (TN). В некоторых вариантах осуществления молодая T-клетка может характеризоваться экспрессией CD62L и отсутствием изоформ CD25, CD44 или CD45RO. В некоторых вариантах осуществления более молодая T-клетка может представлять собой стволовую клетку памяти (TSCM). В некоторых вариантах осуществления более молодые T-клетки могут представлять собой центральную T-клетку памяти (ТCM). Фенотипические маркеры, ассоциированные с TN, TSCM и ТCM, описаны, например, в Maus, M. et al. (2014) Annu. Rev. Immunol. 32:189-225 (см., например, фиг.3), включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Иллюстративные фенотипы TN включают один или несколько (или все) из следующих: CD45RA+, CD45RO-, CD62Fhigh, CCR7high, CD95-, CD122-, CD27high, CD28+, CD57-, KFRG-1- или длинную теломеру (или любую комбинацию из двух, трех, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или всех из указанных выше маркеров TN). Иллюстративные фенотипы TSCM включают один или несколько (или все) из следующих: CD45RA+, CD45RO-, CD62Fhigh, CCR7high, CD95+, CD122+, CD27high, CD28high, CD57-, KFRG-1- или длинную теломеру (или любую комбинацию двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или всех из вышеупомянутых маркеров TSCM). Иллюстративные фенотипы ТCM включают один или несколько (или все) из следующих: CD45RA-, CD45ROhigh, CD62Fhigh, CCR7+, CD95+, CD122high, CD27+, CD28high, CD57-, KFRG-1-/+, или длинную/промежуточную теломеру (или любую комбинацию из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или всех из вышеупомянутых маркеров TCM).
Как используют в рамках изобретения, термин "более старая T-клетка" относится к иммунной эффекторной клетке, которая содержит более истощенный фенотип. В некоторых вариантах осуществления более старая T-клетка может представлять собой эффекторную T-клетку памяти (ТEM). В других вариантах осуществления более старая T-клетка может представлять собой эффекторную T-клетку (TEFF). В других вариантах осуществления более старая T-клетка имеет фенотип истощения. Фенотипические маркеры, ассоциированные с ТEM, TEFF и истощенными T-клетками, описаны, например, в Maus, M. et al. (2014) Annu. Rev. Immunol. 32:189-225 (см., например, фиг.3), включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Иллюстративные фенотипы TEM включают один или несколько (или все) из следующих: CD45RA-/+, CD45ROhigh, CD62F-, CCR7-, CD95-, CD122high, CD27-/+, CD28-/+, CD57low, KFRG-1+ или промежуточную длину теломеры (или любую комбинацию из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или всех из вышеупомянутых маркеров ТEM). Иллюстративные фенотипы TEFF включают один или несколько (или все) из следующих: CD45RA-/+, CD45RO+, CD62F-, CCR7-, CD95 high, CD122 -/+, CD27-, CD28-, CD57+, KFRG-1high, или короткую/промежуточную теломеру (или любую комбинацию из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или всех из вышеупомянутых маркеров TEFF). Иллюстративные фенотипы фенотипа истощенных T-клеток включают один или несколько (или все) из следующих: CD45RA-/+, CD45RO+, CD62L-, CCR7-, CD95high, CD122low, CD27-, CD28-, CD57high, KFRG-1high, или короткую теломеру (или любую комбинацию из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или всех из вышеупомянутых маркеров).
Термин "зета" или альтернативно "зета-цепь", "CD3-зета" или "TCR-зета" определяют как белок, представленный под номером доступа GenBank № BAG36664.1, или эквивалентные остатки из не являющегося человеком вида, например, мыши, грызуна, обезьяны, и т.п., и "зета-стимулирующий домен" или альтернативно "стимулирующий домен CD3-зета" или "стимулирующий домен TCR-зета" определяют как аминокислотные остатки из цитоплазматического домена зета-цепи, которые являются достаточными для функциональной передачи первоначального сигнала, необходимого для активации T-клеток. В одном аспекте цитоплазматический домен зета-цепи содержит остатки с 52 по 164 последовательности с номером доступа GenBank № BAG36664.1 или эквивалентные остатки из не являющегося человеком вида, например, мыши, грызуна, мартышки, человекообразной обезьяны и т.п., которые являются их функциональными ортологами. В одном аспекте "зета-стимулирующий домен" или "стимулирующий домен CD3-зета" представляет собой последовательность, предоставленную в качестве SEQ ID NO: 18. В одном аспекте "зета-стимулирующий домен" или "стимулирующий домен CD3-зета" представляет собой последовательность, предоставленную в качестве SEQ ID NO: 20.
Различные аспекты изобретения более подробно описаны ниже. На протяжении описания приводятся дополнительные определения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ОПРЕДЕЛЕННЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
В рамках настоящего изобретения предусматриваются биомаркеры, прогнозирующие ответ на терапию у индивидуумов, имеющих злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и острый лимфобластный лейкоз (ALL)).
В одном аспекте в рамках настоящего изобретения предусматриваются биомаркеры, прогнозирующие ответ на клетку, экспрессирующую CAR, например, клетку, экспрессирующую CAR против CD19 (например, T-клетку, NK-клетку) (например, клетку, экспрессирующую CAR против CD19, описанную в настоящем описании, например, такую как CTL019) у индивидуумов, имеющих CLL и ALL.
Предусматриваются способы диагностики и мониторинга лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) на основе обнаружения определенных биомаркеров в образцах пациентов, которые имеют или предположительно имеют злокачественную опухоль. Кроме того, экспрессию одного или нескольких таких биомаркеров можно использовать для отличения индивидуумов, которые будут благоприятно отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, "полностью отвечающие индивидуумы" или "CR") от индивидуумов, которые не будут отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, "не отвечающие индивидуумы" или "NR") и от индивидуумов, которые будут иметь частичный ответ на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, "частично отвечающие индивидуумы" или "PR").
Применение биомаркеров для оценки прогрессирования заболевания и прогнозирования ответа индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетками
В одном варианте осуществления в способах по настоящему изобретению можно использовать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1 и/или генную сигнатуру клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток) для получения величины прогрессирования заболевания. Величину прогрессирования заболевания можно использовать, например, для оценки эффективности терапии при лечении злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL). В одном варианте осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более генов в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и/или KLRG1 и/или генную сигнатуру клеток, эксрессирующих CAR против CD19, используют для классификации индивидуума как полностью отвечающего, частично отвечающего или не отвечающего индивидуума на терапию CAR-экспресирующими клетками (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, CTL019). В одном варианте осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, и/или KLRG1, и/или генную сигнатуру клеток, экспрессирующих CAR против CD19, используют для прогнозирования способности индивидуума отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, CTL019).
Индивидуумы
Для любых способов и наборов, описанных в настоящем описании, индивидуум, которого лечат, или индивидуум, для которого получают величину, представляет собой индивидуума, имеющего злокачественную опухоль на любой стадии лечения, или имеющего риск ее наличия. Иллюстративные злокачественные опухоли включают, но не ограничиваются ими, В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (B-ALL), T-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (T-ALL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), В-клеточный помиелоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток и макроглобулинемию Вальденстрема. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой гематологическую злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой ALL. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой CLL. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль ассоциирована с экспрессией CD19.
В одном варианте осуществления индивидууму проводили предварительное лечение дополнительной терапией, например, индивидууму, которого идентифицировали как частично отвечающего или не отвечающего индивидуума, а затем предварительно лечили дополнительной терапией. В одном варианте осуществления индивидууму проводят предварительное лечение ингибитором mTOR. В одном варианте осуществления ингибитор mTOR вводят в дозе или по схеме дозирования, описанной в настоящем описании. В одном варианте осуществления низкую усиливающую иммунитет дозу ингибитора mTOR вводят до лечения индивидуума CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками). В одном варианте осуществления введение низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора, например, RAD001, или каталитического ингибитора, начинают до введения CAR-экспрессирующих клеток, описанных в настоящем описании, например, T-клеток. В одном варианте осуществления CAR-клетки вводят после достаточного периода времени или достаточного дозирования ингибитора mTOR, так что уровень отрицательных по PD1 иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток, или соотношение отрицательные по PD1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки/положительные по PD1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки, по меньшей мере временно увеличивается. В одном варианте осуществления клетку, например, T-клетку, подлежащую модификации способами инженерии для экспрессии CAR, собирают после достаточного периода времени или после достаточного дозирования низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, так чтобы уровень отрицательных по PD1 иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток, или соотношение отрицательные по PD1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки/положительные по PD1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки, у индивидуума или собранных от индивидуума, по меньшей мере временно увеличивался.
В одном варианте осуществления индивидууму проводят предварительное лечение ингибитором точки контроля, например, ингибитором точки контроля, описанным в настоящем описании. Примеры ингибиторных молекул, например, молекул точки контроля, включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAF9, аденозин и TGFR (например, TGFR-бета). В некоторых вариантах осуществления ингибиторную нуклеиновую кислоту, например, ингибиторную нуклеиновую кислоту, например, дцРНК, например, миРНК или кшРНК; или например, ингибиторный белок или систему, например, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами (CRISPR), нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TAFEN), или эндонуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), например, как описано в настоящем описании, можно использовать для ингибирования экспрессии молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, T-клеточную функцию в CAR-экспрессирующей клетке. В одном варианте осуществления средство представляет собой кшРНК, например, кшРНК, описанную в настоящем описании. В одном варианте осуществления ингибитор молекулы точки контроля может представлять собой, например, антитело или фрагмент антитела, которые связываются с молекулой точки контроля. Например, средство может представлять собой антитело или фрагмент антитела, которые связываются с PD1, PD-F1, PD-F2 (например, как описано в настоящем описании) или CTFA4 (например, ипилимумаб (также обозначаемый как MDX-010 и MDX-101, и выпускаемый в продажу Yervoy®; Bristol-Myers Squibb; тремелимумаб (моноклональное IgG2-антитело, доступное от Pfizer, ранее известное как тицилимумаб, CP- 675,206)). В одном варианте осуществления средство представляет собой антитело или фрагмент антитела, которые связываются с TIM3, например, как описано в настоящем описании. В одном варианте осуществления средство представляет собой антитело или фрагмент антитела, которые связываются с LAG3, например, как описано в настоящем описании. В одном варианте осуществления средство представляет собой антитело или фрагмент антитела, которые связываются с CEACAM, например, как описано в настоящем описании.
В одном варианте осуществления индивидууму проводят дополнительную терапию в комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапией клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTF019). В одном варианте осуществления индивидууму вводят ингибитор mTOR, например, ингибитор mTOR, описанный в настоящем описании, в комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками. В одном варианте осуществления ингибитор mTOR вводят в дозе и/или по схеме дозирования, описанной в настоящем описании. В одном варианте осуществления индивидууму вводят ингибитор точки контроля, например, ингибитор точки контроля, описанный в настоящем описании, в комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками. В одном варианте осуществления ингибитор точки контроля вводят в дозе и/или по схеме дозирования, описанной в настоящем описании. В одном варианте осуществления индивидууму вводят ингибитор киназы, например, ингибитор киназы, описанный в настоящем описании. В одном варианте осуществления ингибитор киназы вводят в дозе и/или по схеме дозирования, описанной в настоящем описании.
В одном варианте осуществления индивидуум идентифицирован как не отвечающий индивидуум и индивидууму проводят терапию, отличную от терапии CAR-экспрессирующими клетками, например, стандартную терапию для конкретного типа злокачественной опухоли. В одном варианте осуществления индивидууму вводят одно или несколько из антитела против CD20 или его функционального фрагмента (например, офатумумаб, ритуксимаб, обинутузумаб), антитела против CD52 или его функционального фрагмента (например, алемтузумаб), алкилирующего средства (например, алкилирующее средство на основе азотистого иприта, например, такое как бендамустин HCl, хлорамбуцил, циклофосфамид), ингибитора киназы (например, ингибитор киназы, описанный в настоящем описании, например, такой как ингибитор ВТК, описанный в настоящем описании, или ингибитор фосфонозитид-3-киназы, описанный в настоящем описании). В одном варианте осуществления индивидууму вводят трансплантат стволовых клеток.
Оценка биомаркеров
Анализ биомаркеров CTL019
Анализ уровней экспрессии и/или активности продуктов генов, коррелирующих с ответом индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019) и прогрессированием онкологического заболевания (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как CLL и ALL) привел к идентификации новых генных сигнатур клеток, экспрессирующих CAR против CD19. Например, настоящее изобретение относится к способам оценки уровня экспрессии одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, пятнадцати, двадцати, двадцати пяти, тридцати, тридцати пяти, сорока, сорока пяти, пятидесяти, ста или более генов из таблицы 1A, таблицы 1B, таблицы 7A, таблицы 7B, таблицы 8, таблицы 9, таблицы 10, таблицы 14, таблицы 15, таблицы 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблицы 17, таблицы 18, таблицы 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD 122, CD62L и KLRG1, которые составляют генную сигнатуру клеток, экспрессирующих CAR против CD19.
В таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, приводятся гены (например, белковые биомаркеры) и PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и/или KLRG1 являются генами (например, белковыми биомаркерами), которые иначе экспрессируются у полностью отвечающих индивидуумов по сравнению с частично отвечающими и не отвечающими индивидуумами.
В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению можно использовать для определения способности индивидуума отвечать на лечение терапией CAR-экспрессирующими клетками (например, клетками, экспрессирующими CAR против CD19 (например, T-клетками, NK-клетками), описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019), где статистически значимое отличие в количестве, например, экспрессии и/или активности, маркера, описанного в настоящем описании, относительно эталона, например, срединной величины для популяции пациентов со злокачественной опухолью (например, гематологической злокачественной опухолью, такой как CLL и ALL), срединной величины для популяции здоровых не имеющих злокачественной опухоли индивидуумов, срединной величины для популяции не отвечающих или частично отвечающих индивидуумов, в выборке индивидуумов указывает на более высокую вероятность ответа заболевания на терапию CAR-экспрессирующими клетками.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу или анализу для идентификации индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL), как имеющего увеличенную или сниженную вероятность ответа на лечение, которое включает терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019), причем способ включает:
(1) получение образца от индивидуума;
(2) определение уровня одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или более) маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 в образце; и
(3) сравнение определенного уровня одного или нескольких маркеров с эталонным уровнем; где отличие, например, статистически значимое отличие, в определенном уровне относительно эталонного уровня прогнозирует способность индивидуума отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками; и
(4) идентификацию индивидуума как полностью отвечающего, частично отвечающего или не отвечающего индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетками.
В одном варианте осуществления образец представляет собой образец крови, плазмы или сыворотки. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец, полученный посредством афереза, например, T-клетки, полученные из крови индивидуума. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец произведенного продукта, например, модифицированные способами генной инженерии T-клетки, полученные из крови индивидуума, например, произведенный продукт CAR-экспрессирующих клеток, например, произведенный продукт клеток, экспрессирующих CAR против CD19.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу или анализу для идентификации индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, включая, но не ограничиваясь ими, В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (B-ALL), T-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (T-ALL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), В-клеточный промиелоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток и макроглобулинемию Вальденстрема. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой гематологическую злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой ALL. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой CLL. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль ассоциирована с экспрессией CD19.
В одном варианте осуществления терапия CAR-экспрессирующими клетками включает терапию CAR-экспрессирующими клетками, описанными в настоящем описании, например, CTL019.
В одном варианте осуществления терапия CAR-экспрессирующими клетками состоит из терапии CAR-экспрессирующими клетками, описанными в настоящем описании, например, CTL019.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу или анализу для идентификации индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL) как имеющего увеличенную или сниженную вероятность ответа на лечение, которое включает терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019), причем способ включает:
(1) получение образца от индивидуума;
(2) определение генной сигнатуры в образце; и
(3) сравнение определенной генной сигнатуры с эталонной генной сигнатурой; где отличие, например, статистически значимое отличие, в уровне экспрессии одного или нескольких маркеров в определенной генной сигнатуре, например, по сравнению с заданной величиной, прогнозирует способность индивидуума отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу или анализу для определения способности индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL) отвечать на лечение, включающее клетку, экспрессирующую CAR (например, клетка, экспрессирующая CAR против CD19, например, клетка, экспрессирующая CAR против CD19 (например, T-клетка, NK-клетка), описанная в настоящем описании, например, такая как CTL019), причем способ включает:
определение уровня одного или нескольких маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 в образце, полученном до лечения;
где статистически значимое отличие в уровне экспрессии одного или нескольких маркеров в образце относительно заданной величины указывает на увеличенную способность отвечать на CAR-экспрессирующую клетку.
Способы, описанные в настоящем описании, являются особенно пригодными для идентификации индивидуумов, которые вероятно будут отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019) до начала такого лечения (например, до терапии) или на раннем этапе терапевтического режима. В некоторых вариантах осуществления экспрессию или активность биомаркеров определяют у индивидуума по меньшей мере за 2 недели, по меньшей мере за 1 месяц, по меньшей мере за 3 месяца, по меньшей мере за 6 месяцев или по меньшей мере за 1 год до начала терапии. В некоторых вариантах осуществления экспрессию или активность биомаркеров количественно определяют менее чем за 6 месяцев до начала терапии. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления экспрессию или активность биомаркеров измеряют в пределах 6 месяцев, 5 месяцев, 4 месяцев, 3 месяцев, 2 месяцев, 1 месяца, 2 недель, 1 недели, 6 суток, 5 суток, 4 суток, 3 суток, 2 суток или 1 суток до начала терапии. В других вариантах осуществления экспрессию или активность биомаркеров определяют после начала терапии (например, через 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 3,5 месяца, 4 месяца, 4,5 месяца, 5 месяцев, 5,5 месяца, 6 месяцев).
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL), включающему:
получение величины статуса ответа для индивидуума, которая включает один или несколько из следующих показателей:
один или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более) биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркер CD27, биомаркер CD45RO, биомаркер PD-1, биомаркер LAG-3, биомаркер TIM-3, биомаркер IL2RA, биомаркер IL21, биомаркер CD4, биомаркер CD8, сигнатура набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов TH2+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например стволовых клеток памяти (TSCM), например, центральных T-клеток памяти (ТСМ), например, эффекторных T-клеток памяти (ТEM)) и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19,
тем самым оценивая индивидуума.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL), включающему получение величины статуса ответа для индивидуума, которая включает один или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более) из следующих показателей: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, тем самым оценивая индивидуума.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки или мониторинга эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, включающему:
получение величины статуса ответа для индивидуума, которая включает один или несколько из следующих показателей:
биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркер CD27, биомаркер CD45RO, биомаркер PD-1, биомаркер LAG-3, биомаркер TIM-3, биомаркер IL2RA, биомаркер IL21, биомаркер CD4, биомаркер CD8, сигнатура набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов TH2+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например стволовых клеток памяти (TSCM), например, центральных T-клеток памяти (ТCM), например, эффекторных T-клеток памяти (ТEM)) и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19,
тем самым оценивая или осуществляя мониторинг эффективность терапии CAR у индивидуума.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки или мониторинга эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапии клетками, эксрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019) у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL), включающему: получение величины статуса ответа у индивидуума, которая включает один или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более) из следующих показателей: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1 и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), тем самым, осуществляя оценку или мониторинг эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) у индивидуума.
В одном варианте осуществления величина статуса ответа включает показатель комбинации генной сигнатуры и биомаркера.
В одном варианте осуществления величина статуса ответа включает показатель сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, и комбинацию одного или нескольких из: биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркера CD27, биомаркера CD45RO, биомаркера PD-1, биомаркера LAG-3, биомаркера TIM-3, биомаркера IL2RA, биомаркера IL21, биомаркера CD4, биомаркера CD8, сигнатуры набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатуры набора генов TH2+ T-хелперных клеток и сигнатуры набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например стволовых клеток памяти (TSCM), например, центральных T-клеток памяти (ТCM), например, эффекторных T-клеток памяти (ТEM)).
В одном варианте осуществления величина статуса ответа включает показатель сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, и комбинацию одного или нескольких из: биомаркера, приведенного в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1.
В одном варианте осуществления величина статуса ответа включает показатель одного или нескольких биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, и комбинацию одного или нескольких из: биомаркера CD27, биомаркера CD45RO, биомаркера PD-1, биомаркера LAG-3, биомаркера TIM-3, биомаркера IL2RA, биомаркера IL21, биомаркера CD4, биомаркера CD8, сигнатуры набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатуры набора генов TH2+ T-хелперных клеток, сигнатуры набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например стволовых клеток памяти (TSCM), например, центральных T-клеток памяти (ТCM), например, эффекторных T-клеток памяти (ТEM)) и сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19.
В одном варианте осуществления величина статуса ответа включает показатель одного или нескольких биомаркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, и комбинацию одного или нескольких из: CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1.
В одном варианте осуществления сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, включает величину экспрессии по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9 или 10 генов, включающую генную сигнатуру клеток, экспрессирующих CAR против CD19.
В одном варианте осуществления величина экспрессии гена включает величину параметра транскрипции, например, уровень мРНК, кодируемой геном.
В одном варианте осуществления величина экспрессии белка включает величину параметра трансляции, например, уровень белка.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы, кроме того, включают получение образца от индивидуума, где образец включает фракцию клеток или тканей. В одном варианте осуществления клеточная фракция включает кровь.
В одном варианте осуществления показатель биомаркера и/или генной сигнатуры получают до, одновременно или в процессе терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019).
В одном варианте осуществления показатель биомаркера и/или генной сигнатуры получают менее чем за 6 месяцев, 5 месяцев, 4 месяца, 3 месяца, 2 месяца, 1 месяц, 2 недели, 1 неделю, 6 суток, 5 суток, 4 суток, 3 суток, 2 суток до начала терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019).
Способы, описанные в настоящем описании, также можно использовать для мониторинга положительного ответа индивидуума на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019). Такие способы являются пригодными для раннего обнаружения толерантности к терапии или для прогнозирования прогрессирования заболевания у индивидуума. В таких вариантах осуществления экспрессию или активность биомаркера определяют, например, по меньшей мере каждую неделю, по меньшей мере каждые 2 недели, по меньшей мере каждый месяц, по меньшей мере каждые 2 месяца, по меньшей мере каждые 3 месяца, по меньшей мере каждые 4 месяца, по меньшей мере каждые 5 месяцев, по меньшей мере каждые 6 месяцев, по меньшей мере каждые 7 месяцев, по меньшей мере каждые 8 месяцев, по меньшей мере каждые 9 месяцев, по меньшей мере каждые 10 месяцев, по меньшей мере каждые 11 месяцев, по меньшей мере каждый год, по меньшей мере каждые 18 месяцев, по меньшей мере каждые 2 года, по меньшей мере каждые 3 года, по меньшей мере каждые 5 лет или более. Также предусматривается, что экспрессию или активность биомаркеров определяют с нерегулярными интервалами, например, определение биомаркеров у индивидуума можно проводить после 3 месяцев лечения, после 6 месяцев лечения и после 7 месяцев лечения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления экспрессию или активность биомаркеров определяют тогда, когда это сочтет необходимым квалифицированный врач, осуществляющий мониторинг лечения индивидуума.
Способы, описанные в настоящем описании, можно использовать для лечения любого индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL). В одном аспекте изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как CLL и ALL) у индивидуума.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли, включающей, но не ограничивающейся ими, В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (B-ALL), T-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (T- ALL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), В-клеточный промиелоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток и макроглобулинемию Вальденстрема. В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения ALL. В другом варианте осуществления изобретение относится к способам лечения CLL. В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли, ассоциированной с экспрессией CD19.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы включают введение индивидууму клетки, экспрессирующей CAR, например, CAR T-клетки, например, CAR T-клетки против CD19, например, продукта CTL019, если у индивидуума идентифицировано отличие, например, статистически значимое отличие, уровня экспрессии одного или нескольких маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 относительно эталонного уровня, так что осуществляется лечение злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) у индивидуума.
Как описано выше, злокачественная опухоль, которую можно лечить описанными способами, представляет собой злокачественную опухоль, ассоциированную с экспрессией CD19. В одном аспекте злокачественная опухоль, ассоциированная с экспрессией CD19, представляет собой гематологическую злокачественную опухоль. В одном аспекте гематологическая злокачественная опухоль представляет собой лейкоз или лимфому. В одном аспекте злокачественная опухоль, ассоциированная с экспрессией CD19, включает злокачественные опухоли и новообразования, включающие, но не ограничивающиеся ими, например, один или несколько острых лейкозов, включая, но не ограничиваясь ими, например, В-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("B-ALL"), T-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("T-ALL"), острый лимфоидный лейкоз (ALL); один или несколько хронических лейкозов, включая, но не ограничиваясь ими, например, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). Дополнительные злокачественные опухоли или гематологические состояния, ассоциированные с экспрессией CD19, включают, но не ограничиваются ими, например, В-клеточный промиелоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую. лимфому, лимфому Ходжкина, плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема, и "предлейкоз", который представляет собой многообразную совокупность гематологических состояний, объединенных неээфективной продукцией (или дисплазией) миелоидных клеток крови и т.п. Кроме того, заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, включает, но не ограничивается ими, например, атипичные и/или неклассические злокачественные опухоли, новообразования, предзлокачественные состояния и пролиферативные заболевания, ассоциированные с экспрессией CD19.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL), включающему:
определение того, имеет ли индивидуум увеличенную вероятность ответа на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019) путем сравнения уровня одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более) маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1, в образце от индивидуума относительно эталонного уровня, где статистически значимое отличие в уровне экспрессии одного или нескольких маркерных генов относительно эталонного уровня указывает на увеличенную вероятность ответа; и
введение индивидууму терапевтически эффективной дозы терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL), включающему:
получение образца от индивидуума;
определение уровня одного или нескольких маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 в образце;
сравнение определенного уровня одного или нескольких маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1, с эталонным уровнем; и
ведение терапевтически эффективной дозы терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019), если индивидуум идентифицирован как имеющий статистически значимое отличие определенного уровня одного или нескольких маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1, от эталонного уровня, в образце.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) у индивидуума, включающему:
получение величины статуса ответа для индивидуума, которая включает один или несколько из следующих показателей:
биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, биомаркер CD27, биомаркер CD45RO, биомаркер PD-1, биомаркер LAG-3, биомаркер TIM-3, биомаркер IL2RA, биомаркер IL21, биомаркер CD4, биомаркер CD8, сигнатура набора генов TH1+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов TH2+ T-хелперных клеток, сигнатура набора генов T-клеток памяти (например, CD8+ T-клеток памяти, например, наивных T-клеток (TN), например стволовых клеток памяти (TSCM), например, центральных T-клеток памяти (ТCM), например, эффекторных T-клеток памяти (ТEM)) и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, и
после определения статуса ответа проведение одного, двух, трех, четырех или более из:
идентификации индивидуума как полностью отвечающего, частично отвечающего или не отвечающего;
проведения терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019);
выбора или изменения дозирования терапии CAR-экспрессирующими клетками;
выбора или изменения схемы и длительности терапии CAR-экспрессирующими клетками;
введения, например, не отвечающему или частично отвечающему индивидууму, дополнительного средства в комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками, например, ингибитора точки контроля, например, ингибитора точки контроля, описанного в настоящем описании;
проведения у не отвечающего индивидуума или частично отвечающего индивидуума терапии, которая увеличивает количество наивных T-клеток у индивидуума, перед лечением терапией CAR-экспрессирующими клетками;
модификации процесса производства для терапии CAR-экспрессирующими клетками, например, увеличение в количестве наивных T-клеток перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, например, для индивидуума, идентифицированного как не отвечающий или частично отвечающий индивидуум; или
выбора альтернативной терапии, например, для не отвечающего индивидуума или частично отвечающего индивидуума; или
выбора альтернативной терапии, например, альтернативной терапии, описанной в настоящем описании, например, стандартной терапии злокачественной опухоли, тем самым, осуществляя лечение злокачественной опухоли у индивидуума.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) у индивидуума, включающему: получение величины статуса ответа для индивидуума, которая включает один или несколько из следующих показателей: биомаркер, приведенный в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1, и сигнатура набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19, и после определения статуса ответа, проведение одного, двух, трех, четырех или более из: идентификации индивидуума как полностью отвечающего индивидуума, частично отвечающего индивидуума или не отвечающего индивидуума; проведения терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019); выбора или изменения дозирования терапии CAR-экспрессирующими клетками; выбора или изменения схемы и длительности терапии CAR-экспрессирующими клетками; введения, например, не отвечающему или частично отвечающему индивидууму, дополнительного средства в комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками, например, ингибитора точки контроля, например, ингибитора точки контроля, описанного в настоящем описании; проведения у не отвечающего индивидуума или частично отвечающего индивидуума терапии, которая увеличивает количество наивных T-клеток у индивидуума, перед лечением терапией CAR-экспрессирующими клетками; модификации процесса производства для терапии CAR-экспрессирующими клетками, например, увеличение в количестве наивных T-клеток перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в T-клетки, например, для индивидуума, идентифицированного как не отвечающий или частично отвечающий индивидуум; выбора альтернативной терапии, например, стандартной терапии злокачественной опухоли, например, для не отвечающего или частично отвечающего индивидуума; или выбора альтернативной терапии CAR-экспрессирующими клетками; тем самым, осуществляя лечение злокачественной опухоли у индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления количество биомаркера, определенное в образце индивидуума, количественно определяют в качестве абсолютной величины (например, нг/мл). Абсолютные величины можно без труда сравнивать с эталонной величиной или пороговой величиной. Например, можно определять пороговую величину, которая отражает статус прогрессирования заболевания; любые абсолютные величины, находящиеся либо выше (т.е. биомаркеры, экспрессия которых увеличивается при прогрессировании злокачественной опухоли, например, гематологических злокачественных опухолей, таких как ALL и CLL), либо ниже (т.е. биомаркеры со сниженной экспрессией при прогрессировании злокачественной опухоли, например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) пороговой величины, вероятно, определяют прогрессирование заболевания.
Альтернативно определяют относительное количество биомаркера. В одном варианте осуществления относительное количество определяют путем сравнения экспрессии и/или активности одного или нескольких биомаркеров у индивидуума со злокачественной опухолью с эталонным параметром экспрессии биомаркеров. В некоторых вариантах осуществления эталонный параметр получают из одного или нескольких из: исходного уровня или предшествующей величины для индивидуума, величины для индивидуума в другой момент времени, средней или срединной величины для популяции индивидуумов со злокачественной опухолью (например, пациентов), здорового контроля или популяции здоровых индивидуумов.
Настоящее изобретение также относится к области предсказательной медицины, в которой диагностические анализы, фармакогеномику и клинические испытания по мониторингу используют для целей прогнозирования, чтобы тем самым лечить индивидуума профилактически. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к способам анализа для определения количества, структуры и/или активности полипептидов или нуклеиновых кислот, соответствующих одному или нескольким биомаркерам, описанным в настоящем описании, для определения того, будет ли индивидуум, имеющий злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL) или имеющий риск развития злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как CLL и ALL) с большей вероятностью отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019).
Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу определения того, вероятно ли, что индивидуум со злокачественной опухолью (например, гематологической злокачественной опухолью, такой как CLL и ALL) будет отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками, например, клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, такими как CTL019. В другом аспекте изобретение относится к способу прогнозирования продолжительности заболевания. В другом аспекте, способ относится к прогнозированию вероятности значительного явления в процессе заболевания (например, повторного возникновения или ремиссии). В определенных вариантах осуществления способ включает обнаружение комбинации биомаркеров, ассоциированных со способностью отвечать на лечение, как описано в настоящем описании, и определение вероятности того, что индивидуум будет отвечать на лечение.
В одном аспекте изобретение относится к способу предоставления прогноза вероятности успеха терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанной в настоящем описании, например, такими как CTL019) у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL), причем указанный способ включает стадии:
предоставления биологического образца от индивидуума;
определения уровней экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более) генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1, с получением профиля экспрессии генов для образца; и
на основе полученного профиля экспрессии генов предоставление прогноза индивидууму.
В одном варианте осуществления стадия определения уровней экспрессии набора генов, кроме того, включает обнаружение экспрессии мРНК, экспрессируемой с указанных генов. В одном варианте осуществления предусматриваемые способы, кроме того, включают стадию, где определение экспрессии мРНК включает воздействие на указанную мРНК зонда нуклеиновой кислоты, комплементарного указанной мРНК.
В одном варианте осуществления стадия определения уровней экспрессии набора генов, кроме того, включает обнаружение экспрессии полипептида, кодируемого указанными генами.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы включают выбор терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, описанными в настоящем описании, например, такими как CTL019) для индивидуума на основе предоставленного прогноза.
В некоторых вариантах осуществления способы вовлекают оценку биологического образца, например, образца от индивидуума, например, пациента, у которого диагностировано или предполагается наличие злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как CLL или ALL, например, присутствуют симптомы CLL или ALL) для обнаружения изменений экспрессии и/или активности 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или более генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 и генной сигнатуры клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток).
Результаты способа скрининга и их интерпретация прогнозируют прогрессирование заболевания у пациента (например, прогрессирование злокачественной опухоли, например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL или CLL). В соответствии с настоящим изобретением, изменения экспрессии или активности 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или более генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 и генной сигнатуры клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток) относительно средней или срединной величины для популяции пациентов со злокачественной опухолью или относительно срединной величины для популяции здоровых не имеющих злокачественной опухоли индивидуумов указывают на прогрессирование злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL).
В другом варианте осуществления одно или несколько изменений, например, изменений экспрессии биомаркеров, оценивают с заданными интервалами, например, в первый момент времени и по меньшей мере в последующий момент времени. В одном варианте осуществления продолжительность определяют путем определения времени между значимыми явлениями в ходе заболевания индивидуума, где измерение прогнозирует, будет ли заболевание индивидуума иметь длительное течение. В другом варианте осуществления значительное явление представляет собой прогрессирование от постановки диагноза до смерти. В другом варианте осуществления значительное явление представляет собой прогрессирование от постановки диагноза до ухудшения заболевания.
Способы обнаружения экспрессии генов
Также можно оценивать уровень экспрессии биомаркера. Экспрессию маркера, описанного в настоящем описании, можно оценивать с помощью любого из широкого множества известных способов обнаружения экспрессии транскрибируемой молекулы или белка. Неограничивающие примеры таких способов включают иммунологические способы обнаружения секретируемых, находящихся на клеточной поверхности, цитоплазматических или ядерных белков, способы очистки белков, способы анализа функции или активности белков, способы гибридизации нуклеиновых кислот, способы обратной транскрипции нуклеиновых кислот и способы амплификации нуклеиновых кислот.
В определенных вариантах осуществления активность конкретного гена охарактеризовывают путем количественного определения транскрипта гена (например, мРНК), путем измерения количества транслируемого белка или путем измерения активности продукта гена. Мониторинг экспрессии маркера можно осуществлять различными способами, в том числе, путем обнаружения уровней мРНК, уровней белка или активности белка, любой из которых можно определять с использованием стандартных способов. Обнаружение может вовлекать количественное определение уровня экспрессии гена (например, геномной ДНК, кДНК, мРНК, белка или активности фермента), или альтернативно оно может представлять собой качественную оценку уровня экспрессии гена, в частности, по сравнению с контрольным уровнем. Тип определяемого уровня будет очевиден из контекста.
Способы обнаружения и/или количественного определения транскрипта гена (мРНК или кДНК, полученной на ее основе) с использованием способов гибридизации нуклеиновых кислот известны специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., выше). Например, один способ оценки присутствия, отсутствия или количества кДНК вовлекает саузерн-перенос, как описано выше. В кратком изложении мРНК выделяют (например, с использованием способа экстракции с использованием кислотного гуанидиния-фенола-хлороформа, Sambrook et al. выше) и подвергают обратной транскрипции для получения кДНК. Затем кДНК необязательно расщепляют и разделяют на геле в буфере и переносят на мембраны. Затем проводят гибридизацию с использованием зондов нуклеиновой кислоты, специфичных к кДНК-мишени.
Общий принцип таких диагностических и прогностических способов анализа вовлекает подготовку образца или реакционной смеси, которые могут содержать маркер и зонд, в соответствующих условиях в течение времени, достаточного для того, чтобы позволить маркеру и зонду взаимодействовать и связываться, таким образом, формируя комплекс, который может быть извлечен из реакционной смеси и/или обнаружен. Эти способы анализа можно проводить различными способами.
Например, один способ проведения такого анализа вовлекает заякоривание маркера или зонда на твердофазной подложке, также называемой субстратом, и обнаружение комплексов маркер-мишень/зонд, заякоренных на твердой подложке, в конце реакции. В одном варианте осуществления такого способа образец от индивидуума, который подлежит анализу в отношении присутствия и/или концентрации маркера, можно заякоривать на носителе или твердой подложке. В другом варианте осуществления является возможной обратная ситуация, когда зонд можно заякоривать на твердой фазе и образцу от индивидуума можно позволять реагировать в качестве не заякоренного компонента анализа.
Для проведения анализа с использованием вышеупомянутых подходов не иммобилизованный компонент добавляют к твердой подложке, на которой заякорен второй компонент. После завершения реакции компоненты, не находящиеся в комплексе, можно удалять (например, путем промывания) в условиях, при которых любые образовавшиеся комплексы остаются иммобилизованными на твердой подложке. Обнаружение комплексов маркер/зонд, заякоренных на твердой подложке, можно проводить рядом способов, описанных в настоящем описании.
В другом варианте осуществления зонд, когда он представляет собой не заякоренный компонент анализа, можно метить для обнаружения и считывания данных анализа, либо прямо, либо непрямо, поддающимися обнаружению метками, описанными в настоящем описании и хорошо известными специалисту в данной области.
Также является возможным прямое обнаружение образования комплекса маркер/зонд без дальнейшего манипулирования или мечения любого из компонентов (маркер или зонд), например, с использованием способа переноса энергии флуоресценции (см., например, Lakowicz et al., патент США № 5631169; Stavrianopoulos, et al., патент США № 4868103). Метку-флуорофор на первой, "донорной", молекуле выбирают таким образом, чтобы при возбуждении падающим светом подходящей длины волны испускаемая ей энергия флуоресценции поглощалась флуоресцентной меткой на второй, "акцепторной", молекуле, которая в свою очередь способна к флуоресценции вследствие поглощенной энергии. Альтернативно, в молекуле "донорного" белка можно просто использовать природную энергию флуоресценции остатков триптофана. Выбирают метки, которые испускают свет различной длины волны, так чтобы "акцепторную" молекулу можно было отличить от "донорной". Поскольку эффективность переноса энергии между метками связана с расстоянием, разделяющим молекулы, можно оценивать пространственные взаимоотношения между молекулами. В ситуации, когда между молекулами происходит связывание, испускание флуоресценции метки "акцепторной" молекулы должно быть максимальным. Событие связывания FET можно удобным способом измерять посредством стандартных способов флуориметрического обнаружения, хорошо известных в данной области (например, с использованием флуориметра).
В другом варианте осуществления определение способности зонда распознавать маркер можно проводить без мечения какого-либо компонента анализа (зонд или маркер) с использованием технологии, такой как анализ биомолекулярного взаимодействия в реальном времени (BIA) (см., например, Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 и Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Как используют в рамках изобретения, "BIA" или "поверхностный плазмонный резонанс" представляет собой технологию для исследования биоспецифических взаимодействий в реальном времени без мечения каких-либо участников взаимодействия (например, BIAcore). Изменения массы на связывающей поверхности (указывающее на событие связывания) приводят к изменениям индекса рефракции света вблизи поверхности (оптическое явление поверхностного плазмонного резонанса (SPR)), что приводит к поддающемуся обнаружению сигналу, который можно использовать в качестве показателя взаимодействий между биологическими молекулами в реальном времени.
Альтернативно в другом варианте осуществления аналогичные диагностические и прогностические способы анализа можно проводить с использованием маркера и зонда в качестве растворенных соединений в жидкой фазе. В таком анализе комплекс маркера и зонда отделяют от не образовавших комплекс компонентов любым из ряда стандартных способов, включая, но не ограничиваясь ими: дифференциальное центрифугирование, хроматографию, электрофорез и иммунопреципитацию. При дифференциальном центрифугировании комплексы маркер/зонд можно отделять от не образовавших комплекс компонентов анализа посредством серии стадий центрифугирования вследствие различающегося равновесия седиментации комплексов, исходя из их различных размеров и плотностей (см., например, Rivas, G., и Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7). Также для отделения молекул в комплексе от молекул, не образовавших комплекс, можно использовать стандартные способы хроматографии. Например, гель-фильтрация разделяет молекулы на основе размера, и с использованием соответствующей смолы для гель-фильтрации в формате колонки, например, относительно более крупный комплекс может быть отделен от относительно меньших не образовавших комплекс компонентов. Аналогично, относительно различающиеся зарядовые свойства комплекса маркер/зонд по сравнению с не образовавшими комплекс компонентами можно использовать для отличения комплекса от не образовавших комплекс компонентов, например, с использованием смол ионообменной хроматографии. Такие смолы и способы хроматографии хорошо известны специалисту в данной области (см., например, Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., и Tweed, S.A. J Chromatogr В Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525). Также для отделения образовавших комплекс компонентов анализа от не связанных компонентов можно использовать гель-электрофорез (см., например, Ausubel et al, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999). В этом способе комплексы белков или нуклеиновых кислот разделяют на основе, например, размера или заряда. Для поддержания связывающего взаимодействия в процессе электрофореза обычно используют неденатурирующие материалы матрикса геля и условия в отсутствие восстановителя. Соответствующие условия конкретного анализа и его компоненты хорошо известны специалисту в данной области.
В конкретном варианте осуществления уровень мРНК, соответствующей маркеру, можно определять в формате как in situ, и так и in vitro, в биологическом образце с использованием способов, известных в данной области. Термин "биологический образец" включает ткани, клетки, биологические жидкости и их изоляты, полученные от индивидуума, а также ткани, клетки и жидкости, находящиеся в индивидууме. Во многих способах обнаружения экспрессии используют выделенную РНК. Для способов in vitro любой способ выделения РНК, который не осуществляет селекцию, направленную против выделения мРНК, можно использовать для очистки РНК из клеток (см., например, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999). Кроме того, большое количество образцов тканей можно без труда обрабатывать с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, например, таких как одностадийный способ выделения РНК Chomczynski (1989, патент США № 4843155).
Выделенную нуклеиновую кислоту можно использовать в способах с использованием гибридизации или амплификации, которые включают, но не ограничиваются ими, способы саузерн-анализа или нозерн-анализа, анализа с использованием полимеразной цепной реакции или матрицы с зондами. Один из диагностических способов определения уровней мРНК вовлекает приведение в контакт выделенной мРНК с молекулой нуклеиновой кислоты (зондом), которая может гибридизоваться с мРНК, кодируемой подвергаемым обнаружению геном. Зонд на основе нуклеиновой кислоты может представлять собой, например, полноразмерную кДНК или ее часть, такую как олигонуклеотид длиной по меньшей мере 7, 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов, и достаточную для специфической гибридизации в жестких условиях с мРНК или геномной ДНК, кодирующей маркер по настоящему изобретению. Другие подходящие зонды для применения в диагностических способах анализа описаны в настоящем описании. Гибридизация мРНК с зондом указывает на то, что рассматриваемый маркер экспрессируется.
В одном формате мРНК иммобилизуют на твердой подложке и приводят в контакт с зондом, например, путем разделения выделенной мРНК на агарозном геле и переноса мРНК с геля на мембрану, такую как нитроцеллюлозная мембрана. В альтернативном формате зонд(ы) иммобилизуют на твердой поверхности и мРНК приводят в контакт с зондом(ами), например, на генном чипе Affymetrix. Квалифицированный специалист без труда адаптирует известные способы обнаружения мРНК для применения для определения уровня мРНК, кодируемой маркерами, описанными в настоящем описании.
Зонды могут быть полноразмерными или могут быть меньшими, чем полноразмерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок. Более короткие зонды эмпирически исследуют в отношении специфичности. Иллюстративные зонды нуклеиновой кислоты имеют длину 20 оснований или более (см., например, Sambrook et al. для способов селекции последовательностей зондов нуклеиновой кислоты для применения в гибридизации нуклеиновых кислот). Визуализация гибридизованных участков позволяет качественное определение присутствия или отсутствия кДНК.
Альтернативный способ определения уровня транскрипта, соответствующего маркеру по настоящему изобретению, в образце вовлекает процесс амплификации нуклеиновых кислот, например, посредством ОТ-ПЦР (экспериментальный вариант осуществления, указанный в Mullis, 1987, патент США № 4683202), лигазной цепной реакции (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), самоограниченной репликации последовательностей (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), транскрипционной системы амплификации (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), способа с Q-бета репликазой (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), репликации по принципу катящегося кольца (Lizardi et al., патент США № 5854033) или любого другого способа амплификации нуклеиновых кислот с последующим обнаружением амплифицированных молекул с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области. В способах по изобретению также можно использовать флуорогенную ОТ-ПЦР. Во флуорогенной ОТ-ПЦР количественное определение основано на величине флуоресцентных сигналов, например, TaqMan и sybr green. Эти схемы обнаружения являются особенно пригодными для обнаружения молекул нуклеиновых кислот, если такие молекулы присутствуют в очень низких количествах. Как используют в рамках изобретения, праймеры для амплификации определяют как пару молекул нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с 5ʹ- или 3ʹ-областями гена (плюс- и минус-цепи, соответственно, или наоборот) и содержат короткую область между ними. Как правило, праймеры для амплификации имеют длину приблизительно от 10 до 30 нуклеотидов и фланкируют область длиной приблизительно от 50 до 200 нуклеотидов. В соответствующих условиях и с использованием соответствующих реагентов такие праймеры позволяют амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, фланкированную праймерами.
Для способов in situ нет необходимости в выделении мРНК перед обнаружением. В таких способах образец клеток или ткани получают/обрабатывают с использованием известных гистологических способов. Затем образец иммобилизуют на подложке, как правило, предметном стекле, а затем приводят в контакт с зондом, с которым может гибридизоваться с мРНК, которая кодирует маркер.
В качестве альтернативы определению на основе абсолютного уровня экспрессии маркера определение может быть основано на нормализованном уровне экспрессии маркера. Уровень экспрессии нормализуют путем внесения поправки в абсолютный уровень экспрессии посредством его сравнения с экспрессией гена, который не является маркером, например, гена домашнего хозяйства, который конститутивно экспрессируется. Подходящие гены для нормализации включают гены домашнего хозяйства, такие как ген актина или специфические гены эпителиальных клеток. Эта нормализация позволяет сравнение уровня экспрессии в одном образце, например, образце от индивидуума, с уровнем экспрессии в другом образце, например, от здорового индивидуума, или между образцами из различных источников.
Альтернативно уровень экспрессии может быть предоставлен в качестве относительного уровня экспрессии. Для определения относительного уровня экспрессии маркера уровень экспрессии маркера можно определять для 10 или более образцов нормальных изолятов против изолятов злокачественной опухоли, или даже для 50 или более образцов, перед определением уровня экспрессии в рассматриваемом образце. Можно определять средний уровень экспрессии каждого из генов, анализируемых в большом количестве образцов, и его можно использовать в качестве исходного уровня экспрессии для маркера. Затем уровень экспрессии маркера, определенный для исследуемого образца (абсолютный уровень экспрессии) можно делить на среднюю величину экспрессии, полученную для этого маркера. Это обеспечивает относительный уровень экспрессии.
В определенных вариантах осуществления образцы, используемые для определения исходного уровня, представляют собой образцы, происходящие от индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL) против образцов того же типа ткани от здорового индивидуума. Выбор источника клеток зависит от использования относительного уровня экспрессии. Использование экспрессии, обнаруживаемой в нормальных тканях, в качестве среднего показателя экспрессии, способствует подтверждению того, что анализируемый маркер является специфическим для ткани, из которой происходит клетка (против нормальных клеток). Кроме того, по мере накопления данных, среднюю величину экспрессии можно пересматривать, предоставляя улучшенные величины относительной экспрессии на основе накопленных данных. Данные об экспрессии в нормальных клетках обеспечивают средние значения для определения тяжести онкологического заболевания.
В другом варианте осуществления экспрессию маркера оценивают путем получения геномной ДНК или мРНК/кДНК (т.е., транскрибированного полинуклеотида) из клеток в образце индивидуума и гибридизации геномной ДНК или мРНК/кДНК с эталонным полинуклеотидом, который комплементарен полинуклеотиду, содержащему маркер, и его фрагментами. Необязательно перед гибридизацией с эталонным полинуклеотидом кДНК можно амплифицировать с использованием любого из множества способов полимеразной цепной реакции. Аналогично, экспрессию одного или нескольких маркеров можно обнаруживать с использованием количественной ПЦР (Q-ПЦР) для оценки уровня экспрессии маркера(ов). Альтернативно любой из известных способов обнаружения мутаций или вариантов (например, однонуклеотидные полиморфизмы, делеции и т.д.) маркера по изобретению можно использовать для обнаружения встречаемости мутантного маркера у индивидуума.
В родственном варианте осуществления смесь транскрибированных полинуклеотидов, полученных из образца, приводят в контакт с подложкой, на которой фиксирован полинуклеотид, комплементарный или гомологичный по меньшей мере части (например, по меньшей мере 7, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 500 или более нуклеотидным остаткам) маркера, описанного в настоящем описании. Если полинуклеотиды, комплементарные или гомологичные маркеру, описанному в настоящем описании, по-разному обнаруживаются на подложке (например, обнаруживаются с использованием различных хромофоров или флуорофоров, или фиксированы к различным выбранным положениям), тогда уровни экспрессии множества маркеров можно оценивать одновременно с использованием одной подложки (например, микроматрицы "генный чип" с полинуклеотидами, фиксированными в определенных положениях). Когда используют способ оценки экспрессии маркеров, который вовлекает гибридизацию одной нуклеиновой кислоты с другой, гибридизацию можно проводить в жестких условиях гибридизации.
В другом варианте осуществления используют комбинацию способов для оценки экспрессии маркера.
Поскольку композиции, наборы и способы основаны на обнаружении отличий в уровнях экспрессии одного или нескольких маркеров, описанных в настоящем описании, в определенных вариантах осуществления уровень экспрессии маркера значимо превышает минимальный предел обнаружения способа, используемого для оценки экспрессии по меньшей мере в одном биологическом образце от индивидуума со злокачественной опухолью (например, гематологической злокачественной опухолью, такой как ALL и CLL) или эталоне (например, биологическом образце от здорового индивидуума, например, индивидуума без злокачественной опухоли).
Молекулы нуклеиновых кислот и зонды
Один аспект изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, которые соответствуют одному или нескольким маркерам, описанным в настоящем описании, включая нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептид, соответствующий одному или нескольким маркерам, описанным в настоящем описании, или часть такого полипептида. Молекулы нуклеиновых кислот включают молекулы нуклеиновых кислот, которые находятся в геномных областях, указанных в настоящем описании. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот также включают молекулы нуклеиновых кислот, достаточные для применения в качестве зондов для гибридизации для идентификации молекул нуклеиновых кислот, которые соответствуют маркеру, описанному в настоящем описании, включая молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, соответствующий маркеру, описанному в настоящем описании, и фрагменты таких молекул нуклеиновых кислот, например, фрагменты, пригодные для применения в качестве ПЦР-праймеров для амплификации или мутации молекул нуклеиновых кислот. Молекулы нуклеиновых кислот могут представлять собой молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой двухцепочечную ДНК.
"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в природном источнике молекулы нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах осуществления "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты свободна от последовательностей (таких как кодирующие белок последовательности), которые естественным образом фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательности, расположенные на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого нуклеиновая кислота происходит.
Формулировка "по существу свободный от другого клеточного материала или культуральной среды" включает препараты молекулы нуклеиновой кислоты, в котрых молекула отделена от компонентов клеток, из которых она выделена или продуцирована рекомбинантными способами. Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты, которая по существу свободна от клеточного материала, включает препараты молекул нуклеиновой кислоты, имеющие менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 10% или менее чем приблизительно 5% (в расчете на сухую массу) другого клеточного материала или культуральной среды.
Если желательно, молекулу нуклеиновой кислоты, например, продукты маркерных генов, идентифицированные в настоящем описании, можно выделять с использованием стандартных способов молекулярной биологии и информации о последовательностях в записях баз данных, описанных в настоящем описании. С использованием всех или части таких последовательностей нуклеиновых кислот молекулы нуклеиновых кислот можно выделять стандартными способами гибридизации и клонирования (например, как описано в Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Молекулу нуклеиновой кислоты можно амплифицировать с использованием кДНК, мРНК или геномной ДНК в качестве матрицы и соответствующих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными способами амплификации с использованием ПЦР. Молекулы нуклеиновых кислот, амплифицированные таким образом, можно клонировать в соответствующий вектор и охарактеризовывать посредством анализа последовательности ДНК. Более того, олигонуклеотиды, соответствующие всей молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению или ее части можно получать стандартными способами синтеза, например, с использованиме автоматизированного устройства для синтеза ДНК.
Зонды на основе молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно использовать для обнаружения транскриптов (например, мРНК) или геномных последовательностей, соответствующих одному или нескольким маркерам, описанным в настоящем описании. Зонд содержит группу метки, связанную с ним, например, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Такие зонды можно использовать в качестве части набора для диагностического тестирования для идентификации клеток или тканей, которые ошибочно экспрессируют белок, например, путем измерения уровней молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, в образце клеток индивидуума, например, обнаружения уровней мРНК или определения того, является ли ген, кодирующий белок, мутантным или делетированным.
Обнаружение полипептидов
Способы количественного определения биомаркеров, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими: вестерн-блоттинг, иммуноблоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA), иммунопреципитацию, поверхностный плазмонный резонанс, хемилюминесценцию, флуоресцентную поляризацию, фосфоресценцию, иммуногистохимичский анализ, жидкостную хроматографию масс-спектрометрию (LC-MS), времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOL), микроцитометрию, микрочипы, микроскопию, активированную флуоресценцией сортировку клеток (FACS), магнитную сортировку активированных клеток (MACS), проточную цитометрию, лазерную сканирующую цитометрию, гематологический анализатор и способы анализа на основе свойства белка, включая, но не ограничиваясь ими, связывание ДНК, связывание лиганда или взаимодействие с другими белковыми партнерами.
Активность или уровень маркерного белка также можно обнаруживать и/или количественно определять путем обнаружения или количественного определения экспрессируемого полипептида. Полипептид можно обнаруживать и количественно определять любым из ряда способов, хорошо известных специалистам в данной области. Они могут включать аналитические биохимические способы, такие как электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (TLC), гипердиффузионная хроматография и т.п., или различные иммунологические способы, такие как реакции преципитина в жидкости или геле, иммунодиффузия (одинарная или двойная), иммуноэлектрофорез, радиоиммунный анализ (RIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммунофлуоресцентный анализ, вестерн-блоттинг, иммуногистохимия и т.п. Квалифицированный специалист может без труда адаптировать известные способы обнаружения белка/антитела для применения для определения уровня одного или нескольких биомаркеров в образце сыворотки.
Другое средством для обнаружения полипептида представляет собой антитело, способное связываться с полипептидом, соответствующим маркеру, описанному в настоящем описании, например, антитело с поддающейся обнаружению меткой. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Можно использовать интактное антитело или его фрагмент (например, Fab или F(ab')2). Термин "меченый" в отношении зонда или антитела охватывает прямое мечение зонда или антитела путем присоединения (т.е. физического связывания) поддающегося обнаружению вещества к зонду или антителу, а также непрямое мечение зонда или антитела посредством реактивности с другим реагентом, который является прямо меченным. Примеры непрямого мечения включают обнаружение первичного антитела с использованием флуоресцентно меченного вторичного антитела и концевое мечение ДНК-зонда биотином, так чтобы его можно было обнаружить с помощью флуоресцентно меченного стрептавидина.
В другом варианте осуществления антитело представляет собой меченое антитело, например, меченное радиоактивной меткой, меченное хромофором, меченной флуорофором или ферментативно меченное антитело. В другом варианте осуществления используют производное антитела (например, антитело, конъюгированное с субстратом или с белком или лигандом из пары белок-лиганд (например, биотин-стрептавидин)), или фрагмент антитела (например, одноцепочечное антитело, выделенный гипервариабельный домен антитела и т.д.), которые специфически связываются с белком, соответствующим маркеру, таким как белок, кодируемый открытой рамкой считывания, соответствующей маркеру, или такой как белок, который претерпел всю или часть его нормальной посттрансляционной модификации.
Белки из клеток можно выделять с использованием способов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Способы выделения белков могут представлять собой, например, способы, описанные в Harlow and Lane (Harlow и Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
В одном формате в способах можно использовать антитела или фрагменты антител, такие как вестерн-блоттинг или иммунофлуоресцентные способы, для обнаружения экспрессируемых белков. В таких применениях либо антитело, либо белки, можно иммобилизовывать на твердой подложке. Подходящие твердофазные подложки или носители включают любую подложку, способную связывать антиген или антитело. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит.
В другом варианте осуществления полипептид обнаруживают с использованием иммуноанализа. Как используют в рамках изобретения, иммуноанализ представляет собой анализ, в котором используется антитело для специфического связывания с анализируемым соединением. Таким образом, иммуноанализ характеризуется обнаружением специфического связывания полипептида с антителом в противоположность применению других физических или химических свойств для выделения анализируемого соединения, нацеливания на него и количественного определения.
Полипептид обнаруживают и/или количественно определяют с использованием любого из ряда хорошо известных иммунологических анализов связывания (см., например, патенты США № 4366241; 4376110; 4517288 и 4837168). Для обзора основных способов иммуноанализа также см. Asai (1993) Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. New York; Stites & Terr (1991) Basic and Clinical Immunology 7th Edition.
В другом варианте осуществления полипептид обнаруживают и/или количественно определяют с использованием технологии анализа Luminex®. Анализ Luminex® разделяет мельчайшие кодируемые цветом гранулы, например, различные наборы, каждый из которых покрыт реагентом для конкретного биоанализа, что позволяет улавливание и обнаружение конкретных анализируемых соединений из образца мультиплексным образом. Технологию анализа Luminex® можно сравнить с мультиплексным анализом ELISA с использованием флуоресцентной цитометрии на основе гранул для обнаружения анализируемых соединений, таких как биомаркеры.
Также изобретение относится к наборам для обнаружения присутствия полипептида или нуклеиновой кислоты, соответствующей маркеру, описанному в настоящем описании, в биологическом образце, например, образце, содержащем ткань, цельную кровь, сыворотку, плазму, щечный соскоб, слюну, цереброспинальную жидкость, мочу, стул и костный мозг. Такие наборы можно использовать для определения того, страдает ли индивидуум или имеет ли индивидуум увеличенный риск развития злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как CLL и ALL). Например, набор может содержать меченое соединение или агент, способные обнаруживать полипептид или мРНК, кодирующую полипептид, соответствующий маркеру, описанному в настоящем описании, в биологическом образце, и средства для определения количества полипептида или мРНК в образце (например, антитело, которое связывает полипептид, или олигонуклеотидный зонд, который связывается с ДНК или мРНК, кодирующей полипептид). Наборы также могут включать инструкции для интерпретации результатов, полученных с использованием набора.
Таким образом, изобретение включает набор для оценки прогрессирования заболевания у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL).
В одном варианте осуществления набор можно использовать для оценки прогрессирования злокачественной опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (B-ALL), T-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (T-ALL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), В-клеточный промиелоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток и макроглобулинемию Вальденстрема. В одном варианте осуществления изобретение относится к набору для оценки прогрессирования заболевания у индивидуума, имеющего гематологическую злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления изобретение относится к набору для оценки прогрессирования заболевания у индивидуума, имеющего ALL. В другом варианте осуществления изобретение относится к набору для оценки прогрессирования заболевания у индивидуума, имеющего CLL. В одном варианте осуществления изобретение относится к набору для оценки прогрессирования заболевания у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, которая ассоциирована с экспрессией CD19.
В одном варианте осуществления изобретение относится к набору для оценки и охарактеризации статуса ответа (например, полностью отвечающий индивидуум, частично отвечающий индивидуум или не отвечающий индивидуум) индивидуума, имеющего гематологическую злокачественную опухоль, на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, как описано в настоящем описании, например, такими как CTL019). В одном варианте осуществления изобретение относится к набору для оценки и охарактеризации статуса ответа (например, полностью отвечающий индивидуум, частично отвечающий индивидуум или не отвечающий индивидуум) у индивидуума, имеющего ALL, на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, как описано в настоящем описании, например, такими как CTL019). В одном варианте осуществления изобретение относится к набору для оценки и охарактеризации статуса ответа (например, полностью отвечающий индивидуум, частично отвечающий индивидуум или не отвечающий индивидуум) индивидуума, имеющего CLL, на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию клетками, экспрессирующими CAR против CD19, как описано в настоящем описании, например, такую как CTL019).
Подходящие реагенты для связывания с полипептидом, соответствующим маркеру, описанному в настоящем описании, включают антитела, производные антител, фрагменты антител и т.п. Подходящие реагенты для связывания с нуклеиновой кислотой (например, геномной ДНК, мРНК, сплайсированной мРНК, кДНК и т.п.) включают комплементарные нуклеиновые кислоты. Например, реагенты на основе нуклеиновых кислот включают олигонуклеотиды (меченые или немеченые), фиксированные на подложке, меченые олигонуклеотиды, не связанные с подложкой, пару праймеров для ПЦР, зонды молекулярных маяков и т.п.
Набор необязательно может содержать дополнительные компоненты, пригодные для проведения способов, описанных в настоящем описании. В качестве примера набор может содержать жидкости (например, буфер SSC), пригодные для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот или для связывания антитела с белком, с которым оно специфически связывается, одно или несколько отделений для образца и инструкции, в которых описаны характеристики способа по изобретению, эталонный образец для сравнения уровней экспрессии биомаркеров, описанных в настоящем описании, и т.п.
Набор по изобретению может содержать реагент, пригодный для определения уровня белка или белковой активности маркера.
В одном варианте осуществления предусматривается набор для обеспечения прогнозирования вероятности успеха терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, терапии клетками, экспрессирующими CAR против CD19, как описано в настоящем описании, например, такими как CTL019) у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как CLL и ALL), причем указанный набор содержит:
набор реагентов, которые специфически определяют уровни экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 или более) генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 и сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19; и
инструкции по применению указанного набора;
где в указанных инструкциях по применению описано, что, если один или несколько из обнаруженных уровней экспрессии превышает эталонный уровень, индивидуум с большей вероятностью будет положительно отвечать на терапию CAR-экспрессирующими клетками.
В одном варианте осуществления набор реагентов обнаруживает экспрессию мРНК, экспрессируемой с указанного набора генов.
В одном варианте осуществления набор реагентов содержит зонды нуклеиновой кислоты, комплементарные мРНК, экспрессируемой с указанного набора генов.
В одном варианте осуществления зонды нуклеиновой кислоты, комплементарные мРНК, представляют собой кДНК или олигонуклеотиды.
В одном варианте осуществления зонды нуклеиновой кислоты, комплементарные мРНК, иммобилизованы на поверхности подложки.
В одном варианте осуществления набор реагентов обнаруживает экспрессию полипептидов, кодируемых указанным набором генов.
Терапевтические средства, композиции и введение
Способы, описанные в настоящем описании, можно использовать для оценки статуса ответа на клетку, эксрессирующую CAR. В одном варианте осуществления клетка экспрессирует молекулу CAR, содержащую антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, которые специфически связываются с опухолевым антигеном), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен включает любое антитело или его фрагмент, например, scFv, известные в данной области, которые нацелены или специфически связаны с любым из опухолевых антигенов, описанных в настоящем описании. Например, опухолевый антиген представляет собой BCMA (также известный как TNFRSF17, представитель 17 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли или антиген созревания В-клеток), CD33, CLL-1 (также известен как представитель 1 семейства домена, подобного лектину С-типа, или CLECL1) или клаудин-6 (CLDN6). Антитело или его фрагмент могут представлять собой антитело мыши, гуманизированное или полностью человеческое антитело или их фрагмент, например, scFv.
В одном варианте осуществления CAR содержит антитело или фрагмент антитела, которые включают связывающий CD19 домен, описанный в настоящем описании (например, антитело мыши или гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которые специфически связываются с CD19, как описано в настоящем описании), трансмембранный домен, описанный в настоящем описании, и внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен, описанный в настоящем описании).
Антигенсвязывающий домен
В одном аспекте CAR по изобретению содержит специфичный к мишени связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающим доменом. Выбор части зависит от типа и количества лигандов, которые определяют поверхность клетки-мишени. Например, антигенсвязывающий домен можно выбирать так, чтобы он распознавал лиганд, который выступает в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированного с конкретным болезненным состоянием. Таким образом, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут выступать в качестве лигандов для антигенсвязывающего домена в CAR по изобретению, включают маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунными заболеваниями и злокачественными клетками.
В одном аспекте модифицированный посредством CAR ответ T-клеток может быть направлен на представляющий интерес антиген посредством встраивания способами инженерии антигенсвязывающего домена, который специфически связывает желаемый антиген, в CAR.
В одном аспекте часть CAR, содержащая антигенсвязывающий домен, содержит антигенсвязывающий домен, который нацелен на опухолевый антиген, например, опухолевый антиген, описанный в настоящем описании.
Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном, включая, но не ограничиваясь ими, моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело и их функциональный фрагмент, включая, но не ограничиваясь ими, однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) наноантитела, происходящего из животного семейства верблюжьих, и альтернативный каркас, известный в данной области, выполняющий функцию антигенсвязывающего домена, такой как рекомбинантный фибронектиновый домен, T-клеточный рецептор (TCR) или их фрагмент, например, одноцепочечный TCR и т.п. В некоторых случаях является полезным, чтобы антигенсвязывающий домен происходил из того же вида, в котором в конечном итоге будут использовать CAR. Например, для применения у человека может быть полезным, чтобы антигенсвязывающий домен CAR содержал остатки человека или гуманизированные остатки для антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела.
В соответствии с настоящим изобретением в данной области можно использовать любой известный CAR против CD19, например, антигенсвязывающий домен любого известного CAR против CD19. Например, можно использовать LG-740; CAR против CD19, описанный в патенте США № 8399645; патенте США № 7446190; Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); и 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10.
Иллюстративные антигены-мишени, на которые можно осуществлять нацеливание с использованием CAR-экспрессирующих клеток, включают, но не ограничиваются ими, CD19, CD123, EGFRvIII, мезотелин, среди прочих, как описано, например, в WO 2014/130635, WO 2014/130657, и WO 2015/090230, все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
В одном варианте осуществления T-клетка с CAR, которая специфически связывается с CD19, имеет обозначение USAN TISAGENLECLEUCEL-T. CTL019 получают посредством генной модификации T-клеток, опосредуемой стабильным встраиванием посредством трансдукции самоинактивирующимся лентивирусным (LV) вектором с дефектом репликации, содержащим трансген CTL019 под контролем промотора EF-1-альфа. CTL019 может представлять собой смесь положительных и отрицательных по трансгену T-клеток, которые доставляют индивидууму, исходя из процента положительных по трансгену T-клеток.
В других вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки могут специфически связываться с CD19 человека, например, могут включать молекулу CAR или антигенсвязывающий домен (например, гуманизированный антигенсвязывающий домен) согласно таблице 3 WO2014/153270, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
В других вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки могут специфически связываться с CD123, например, могут включать молекулу CAR (например, любую из CAR1-CAR8) или антигенсвязывающий домен согласно таблицам 1-2 WO 2014/130635, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
В других вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки могут специфически связываться с EGFRvIII, например, могут включать молекулу CAR или антигенсвязывающий домен согласно таблице 2 или SEQ ID NO:11 WO 2014/130657, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
В других вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки могут специфически связываться с мезотелином, например, могут включать молекулу CAR или антигенсвязывающий домен согласно таблицам 2-3 WO 2015/090230, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, из антитела, приведенного выше, и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи, CDR1 EC, CDR2 LC и CDR3 LC, из антитела, приведенного выше. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, приведенного или описанного выше.
В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой опухолевый антиген, описанный в международной заявке WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген выбран из одного или нескольких из: CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (также обозначаемых как CD2 подгруппы 1, CRACC, SLAMF7, CD319 и 19A24); подобной лектину С-типа молекулы 1 (CLL-1 или CLECL1); CD33; варианта III рецептора эпидермального фактора роста (EGFRvIII); ганглиозид G2 (GD2); ганглиозид GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); антигена созревания B-клеток, являющегося представителем семейства рецептора TNF (BCMA); антигена Tn ((Tn Ag) или (GalNAca-Ser/Thr)); мембранного антигена, специфичного к про-состоянию (PSMA); сиротского рецептора 1, подобного рецепторной тирозинкиназе (ROR1); Fms-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3); опухолеассоциированного гликопротеина 72 (TAG72); CD38; CD44v6; карциноэмбрионального антигена (CEA); молекулы адгезии эпителиальных клеток (ЕРСАМ); B7H3 (CD276); KIT (CD117); субъединицы альфа-2 рецептора интерлейкина-13 (IL-13Ra2 или CD213A2); мезотелина; рецептора-альфа интерлейкина 11 (IL-11Ra); антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA); сериновой протеазы 21 (тестисин или PRSS21); рецептора 2 сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGFR2); антигена Льюиса (Y); CD24; рецептора-бета тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-бета); стадиеспецифического эмбрионального антигена 4 (SSEA-4); CD20; рецептора-альфа фолатов; рецепторной тирозинпротеинкиназы ERBB2 (Her2/neu); муцина 1, ассоциированного с клеточной поверхностью (MUC1); рецептора эпидермального фактора роста (EGFR); молекулы адгезии нервных клеток (NCAM); простазы; кислой фосфатазы предстательной железы (PAP); мутантного фактора элонгации 2 (ELF2M); эфрина B2; белка-альфа активации фибробластов (FAP); рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (рецептора IGF-1), карбоангидразы IX (CAIX); субъединицы 9 протеасомы (просома, макропаин) бета-типа (LMP2); гликопротеина 100 (gp100); онкогенного слитого белка, состоящего из области локализации сайта инициации реаранжировки (BCR) и гомолога 1 вирусного онкогена лейкоза мышей Абельсона (Abl) (bcr-abl); тирозиназы; рецептора 2 эфрина типа-A (EphA2); фукозил-GM1; молекулы адгезии сиалил Льюиса (sLe); ганглиозида GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); трансглутаминазы 5 (TGS5); высокомолекулярного ассоциированного с меланомой антигена (HMWMAA); o-ацетил-GD2 ганглиозида (OAcGD2); рецептора-бета фолатов; эндотелиального опухолевого маркера 1 (TEM1/CD248); белка, родственного эндотелиальному опухолевому маркеру 7 (TEM7R); клаудина 6 (CLDN6); рецептора тиреостимулирующего гормона (TSHR); сопряженного с G-белком рецептора класса С группы 5, представителя D (GPRC5D); открытой рамки считывания 61 хромосомы X (CXORF61); CD97; CD179a; киназы анапластической лимфомы (ALK); полисиаловой кислоты; специфического белка 1 плаценты (PLAC1); гексасахаридной части гликоцерамида globoH (GloboH); антигена дифференцировки молочной железы (NY-BR-1); уроплакина 2 (UPK2); клеточного рецептора 1 вируса гепатита A (HAVCR1); адренорецептора-бета 3 (ADRB3); паннексина 3 (PANX3); сопряженного с G-белком рецептора 20 (GPR20); комплекса лимфоцитарного антигена 6 локуса К9 (LY6K); ольфакторного рецептора 51E2 (OR51E2); белка альтернативной рамки считывания TCR-гамма (TARP); белка опухоли Вильмса (WT1); антигена 1 злокачественной опухоли/яичка (NY-ESO-1); антигена 2 злокачественной опухоли/яичка (LAGE-1a); ассоциированного с меланомой антигена 1 (MAGE-A1); варианта гена 6 с транслокацией ETS, расположенного на хромосоме 12p (ETV6-AML); белка 17 спермы (SPA17); представителя 1A семейства антигенов X (XAGE1); рецептора 2 поверхности ангиопоэтин-связывающих клеток (Tie 2); антигена-1 меланомы/яичка (MAD-CT-1); антигена-2 меланомы/яичка (MAD-CT-2); Fos-родственного антигена 1; опухолевого белка p53 (p53); мутанта p53; простеина; сурвивина; теломеразы; опухолевого антигена 1 карциномы предстательной железы (PCTA-1 или галектин 8), антигена 1 меланомы, распознаваемого T-клетками (MelanA или MARTI); мутанта саркомы крыс (Ras); обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT); точек разрыва транслокации саркомы; меланомного ингибитора апоптоза (МL-IAP); ERG (слитый ген трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2) и ETS); N-ацетилглюкозаминилтрансферазы V (NA17); белка парного бокса Pax-3 (PAX3); рецептора андрогенов; циклина B1; гомолога, происходящего из нейробластомы вирусного онкогена миелоцитоматоза птиц v-myc (MYCN); представителя семейства С гомологов Ras (RhoC); родственного тирозиназе белка 2 (TRP-2); цитохрома P450 1B1 (CYP1B1); белка, подобного CCCTC-связывающему фактору (белок с цинковыми пальцами) (BORIS или Brother of the Regulator of Imprinted Sites), антигена 3 плоскоклеточной карциномы, распознаваемого T-клетками (SART3); белка парного бокса Pax-5 (PAX5); проакрозин-связывающего белка sp32 (OY-TES1); лимфоцитспецифической протеинтирозинкиназы (LCK); якорного белка 4 A-киназы (AKAP-4); точки разрыва 2 X синовиальной саркомы (SSX2); рецептора конечных продуктов гликирования (RAGE-1); почечного убиквитарного белка 1 (RU1); почечного убиквитарного белка 2 (RU2); легумаина; вируса папилломы человека E6 (HPV E6); вируса папилломы человека E7 (HPV E7); кишечной карбоксилэстеразы; мутантного белка теплового шока 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; рецептора 1, подобного ассоциированному с лейкоцитами иммуноглобулину (LAIR1); Fc-фрагмента рецептора IgA (FCAR или CD89); представителя 2 подсемейства A иммуноглобулин-подобных рецепторов лейкоцитов (LILRA2); представителя F семейства белков, подобных молекуле CD300 (CD300LF); представителя A семейства 12 домена лектинов С-типа (CLEC12A); антигена 2 стромальных клеток костного мозга (BST2); белка 2, подобного рецептору муцин-подобного гормона, содержащего EGF-подобный модуль (EMR2); лимфоцитарного антигена 75 (LY75); глипикана-3 (GPC3); белка 5, подобного Fc-рецептору (FCRL5); и полипептида 1, подобного иммуноглобулину лямбда (IGLL1).
Конструкции CAR против CD19
Конструкции CAR против CD19 мыши описаны в публикации PCT WO 2012/079000, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, и аминокислотная последовательность CAR против CD19 мыши и конструкции scFv представлены в таблице 2 ниже.
Таблица 2: Конструкции CAR против CD19 мыши
CTL019, полная - а.к. | SEQ ID NO: 81 | |
CTL019, scFv-домен | SEQ ID NO: 52 |
|
mCAR1, scFv | SEQ ID NO: 84 | |
mCAR1, полный - а.к. | SEQ ID NO: 85 | |
mCAR2, scFv | SEQ ID NO: 86 | |
mCAR2, CAR - а.к. | SEQ ID NO: 87 | |
mCAR2, полный - а.к. | SEQ ID NO: 88 |
|
mCAR3, scFv | SEQ ID NO: 89 | |
mCAR3, полный - а.к. | SEQ ID NO: 90 |
Конструкции CAR против CD19, содержащие гуманизированные домены scFv против CD19, описаны в публикации PCT WO 2014/153270, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен включает антитело против CD19 или его фрагмент, например, scFv. Например, антигенсвязывающий домен включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, приведенную в таблице 12. Линкерная последовательность, связывающая вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, может представлять собой, например, любую из линкерных последовательностей, описанных в настоящем описании, или альтернативно она может представлять собой GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 45).
Таблица 12: Связывающие домены антитела против CD19
CD19 | huscFv1 | |
CD19 | huscFv2 | |
CD19 | huscFv3 | |
CD19 | huscFv4 | |
CD19 | huscFv5 | |
CD19 | huscFv6 | |
CD19 | huscFv7 | |
CD19 | huscFv8 | |
CD19 | huscFv9 | |
CD19 | HuscFv10 | |
CD19 | HuscFv11 | |
CD19 | HuscFv12 | |
CD19 | muCTLO19 | |
CD19 | После-дова-тель-ность VH SSJ25-C1 | |
CD19 | После-дова-тель-ность VL SSJ25-C1 |
|
В соответствии с настоящим изобретением в данной области можно использовать любой известный CAR против CD19, например, антигенсвязывающий домен любого известного CAR против CD19. Например, можно использовать LG-740; CAR против CD19, описанный в патенте США № 8399645; патенте США № 7446190; Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2): 255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17): 2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18): 4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20): 4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25): 4129-39(2013); и 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, из антитела, приведенного выше, и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, из антитела, приведенного выше. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, приведенного или описанного выше.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен против CD22 представляет собой антигенсвязывающую часть, например, CDR, антитела, описанного, например, в Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174 (2013); Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903 (2010); Kato et al., Leuk Res 37(1): 83-88 (2013); Creative BioMart (creativebiomart.net): MOM-18047-S(P).
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен против CD20 представляет собой антигенсвязывающую часть, например CDR, антитела ритуксимаба, офатумумаба, окрелизумаба, велтузумаба или GA101.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен против ROR1 представляет собой антигенсвязывающую часть, например CDR, антитела, описанного в настоящем описании, например, Hudecek et al., Clin Cancer Res 19(12): 3153-3164 (2013); WO 2011159847 и US20130101607.
Биспецифические CAR
В одном варианте осуществления мультиспецифическая молекула антитела представляет собой биспецифичнскую молекулу антитела. Биспецифическое антитело обладает специфичностью в отношении более чем двух антигенов. Биспецифическая молекула антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая обладает специфичностью связывания в отношении первого эпитопа, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая обладает специфичностью связывания в отношении второго эпитопа. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на одном и том же антигене, например, на одном и том же белке (или субъединице мультимерного белка). В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы перекрываются. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы не перекрываются. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на различных антигенах, например, различных белках (или различных субъединицах мультимерного белка). В одном варианте осуществления биспецифическая молекула антитела содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые обладают специфичностью связывания с первым эпитопом, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые обладают специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления биспецифическая молекула антитела содержит половинное антитело, обладающее специфичностью связывания с первым эпитопом, и половинное антитело, обладающее специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления биспецифическая молекула антитела содержит половинное антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с первым эпитопом, и половинное антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления биспецифическая молекула антитела содержит scFv или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с первым эпитопом, и scFv или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания со вторым эпитопом.
В определенных вариантах осуществления молекула антитела представляет собой мультиспецифическую (например, биспецифическую или триспецифическую) молекулу антитела. Протоколы получения биспецифических или гетеродимерных молекул антител и различных конфигураций биспецифических молекул антител описаны, например, в абзацах 455-458 WO2015/142675, поданной 13 марта 2015, которая включена в качестве ссылки в полном объеме.
В одном аспекте биспецифическая молекула антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, например scFv, которая обладает специфичностью связывания с CD19, например, содержит scFv, как описано в настоящем описании, или содержит CDR легкой цепи и/или CDR тяжелой цепи из scFv, описанного в настоящем описании, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая обладает специфичностью связывания со вторым эпитопом на другом антигене.
Химерный TCR
В одном аспекте антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению (например, антитела против CD19 и фрагменты) можно пересаживать в один или несколько константных доменов цепи T-клеточного рецептора ("TCR"), например, цепи TCR-альфа или TCR-бета, с получением химерного TCR. Без связи с теорией, полагают, что при связывании антигена химерные TCR передают сигнал через комплекс TCR. Например, scFv, как описано в настоящем описании, можно пересаживать в константный домен, например, по меньшей мере часть внеклеточного константного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена цепи TCR, например, цепи TCR-альфа и/или цепи TCR-бета. В качестве другого примера, фрагмент антитела, например, VL-домен, как описано в настоящем описании, можно трансплантировать в константный домен цепи TCR-альфа, и фрагмент антитела, например, VH-домен, как описано в настоящем описании, можно трансплантировать в константный домен цепи TCR-бета (или альтернативно VL-домен можно трансплантировать в константный домен цепи TCR-бета и VH-домен можно трансплантировать в цепь TCR-альфа). В качестве другого примера CDR антитела или фрагмента антитела можно трансплантировать в цепь TCR-альфа и/или бета с получением химерного TCR. Например, LCDR, описанные в настоящем описании, можно трансплантировать в вариабельный домен цепи TCR-альфа и HCDR, описанные в настоящем описании, можно трансплантировать в вариабельный домен цепи TCR-бета, или наоборот. Такие химерные TCR можно получать, например, способами, известными в данной области (например, Willemsen RA et al., Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr; 19(4):365-74).
Неантительные каркасы
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит неантительный каркас, например, фибронектин, анкирин, доменное антитело, липокалин, малое модульное иммунофармацевтическое средство, максиантитело, белок A или аффилин. Неантительный каркас обладает способностью связываться с антигеном-мишенью на клетке. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой полипептид встречающегося в природе белка, экспрессируемого на клетке, или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен включает неантительный каркас. Можно использовать широкое множество неантительных каркасов при условии, что полученный полипептид включает по меньшей мере одну связывающую область, которая специфически связывается с антигеном-мишенью на клетке-мишени.
Неантительные каркасы включают: фибронектин (Novartis, MA), анкирин (Molecular Partners AG, Zurich, Швейцария), доменные антитела (Domantis, Ltd., Cambridge, MA, и Ablynx nv, Zwijnaarde, Бельгия), липокалин (Pieris Proteolab AG, Freising, германия), маломодульные иммунофармацевтические средства (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), максиантитела (Avidia, Inc., Mountain View, CA), белок A (Affibody AG, Швеция) и аффилин (гамма-кристаллин и убиквитин) (Scil Proteins GmbH, Halle, Германия).
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен содержит внеклеточный домен, или его противоположный лиганд-связывающий фрагмент, молекулы, которая связывает противоположный лиганд на поверхности клетки-мишени.
Трансмембранный домен
В некоторых вариантах осуществления CAR, описанный в настоящем описании, содержит трансмембранный домен, который слит с внеклеточной последовательностью, например, внеклеточным распознающим элементом, который может содержать антигенсвязывающий домен. В одном варианте осуществления трансмембранный домен представляет собой домен, который естественным образом связан с одним из доменов в CAR. В одном варианте осуществления трансмембранный домен представляет собой домен, который не естественным образом связан с одним из доменов в CAR.
Трансмембранный домен может включать одну или несколько дополнительных аминокислот, соседних с трансмембранной областью, например, одну или несколько аминокислот, ассоциированных с внеклеточной областью белка, из которого происходит трансмембранный домен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 вплоть до 15 аминокислот внеклеточной области) и/или одну или несколько дополнительных аминокислот, ассоциированных с внутриклеточной областью белка, из которой происходит трансмембранный белок (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 вплоть до 15 аминокислот внутриклеточной области).
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой домен, который минимизирует взаимодействия с другими элементами, например, другими трансмембранными доменами. В некоторых случаях трансмембранный домен минимизирует связывание таких доменов с трансмембранными доменами тех же ли отличающихся поверхностных мембранных белков, например, для минимизации взаимодействий с другими представителями рецепторного комплекса. Подходящие примеры могут быть получены путем выбора или модификации посредством аминокислотной замены известного трансмембранного домена. В одном варианте осуществления трансмембранный домен способен стимулировать гомодимеризацию с другим CAR на клеточной поверхности.
Трансмембранный домен может содержать встречающуюся в природе или не встречающуюся в природе синтетическую последовательность. Когда он является встречающимся в природе, трансмембранный домен может происходить из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка.
Трансмембранные области, пригодные для применения в молекулах, описанных в настоящем описании, могут происходить из любого одного или нескольких, например, из альфа-, бета- или зета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может включать по меньшей мере трансмембранную область(и), например, из KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C или CD19. В одном варианте осуществления трансмембранный домен происходит из CD8. В одном варианте осуществления трансмембранный домен происходит из CD28. В одном аспекте трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен из последовательности, приведенной в качестве SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 42.
В одном варианте осуществления последовательность, например, между трансмембранным доменом и другой последовательностью или доменом, с которыми он слит, может находиться последовательность шарнирной области или спейсера. В некоторых вариантах осуществления также можно использовать различные шарнирные области человека (также называемые "спейсерами"), например, включая, но не ограничиваясь ими, шарнирную область Ig (иммуноглобулина) человека. Необязательно, короткий олигопептидный или полипептидный линкер длиной от 2 до 10 аминокислот может образовывать связь между трансмембранным доменом и другим доменом, например, внутриклеточным сигнальным доменом или костимулирующим доменом CAR. Дублет глицин-серин является особенно подходящим линкером. В одном аспекте шарнирная область или спейсер представляют собой аминокислотную последовательность, предоставленную в качестве SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В одном аспекте шарнирная область или спейсер содержат шарнирную область KIR2DS2.
В одном варианте осуществления трансмембранный домен может представлять собой не встречающуюся в природе последовательность, и в этом случае он может содержать в основном гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В одном варианте осуществления на каждом конце трансмембранного домена находится триплет фенилаланина, триптофана и валина.
Необязательно, короткий олигопептидный или полипептидный линкер длиной от 2 до 10 аминокислот может образовывать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматической областью CAR. Дублет глицин-серин является особенно подходящим линкером. Например, в одном аспекте линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления линкер кодируется нуклеотидной последовательностью GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 11).
Цитоплазматический домен
Цитоплазматический домен или область CAR включает внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен обычно ответственен за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую введен CAR.
Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в CAR по изобретению включают цитоплазматические последовательности T-клеточного рецептора (TCR) и корецепторов, которые действуют совместно для инициации передачи сигнала после связывания рецептором антигена, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую рекомбинантную последовательность, которая имеет ту же функциональную способность.
Известно, что сигналы, индуцируемые TCR отдельно, являются недостаточными для полной активации T-клеток, и что также требуется вторичный и/или костимулирующий сигнал. Таким образом, можно считать, что активация T-клеток опосредуется двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: последовательности, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные внутриклеточные сигнальные домены), и последовательности, которые действуют независимым от антигена образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий (вторичный цитоплазматический домен, например, костимулирующий домен).
Первичный сигнальный домен
Первичный цитоплазматический сигнальный домен регулирует первичную активацию комплекса TCR либо стимулирующим путем, либо ингибиторным путем. Первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы, или ITAM.
Примеры содержащих ITAM первичных внутриклеточных сигнальных доменов, которые особенно применимы в рамках изобретения, включают сигнальные домены TCR-зета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известный как "ICOS"), FcεRI, DAP10, DAP12 и CD66d. В одном варианте осуществления CAR по изобретению содержит внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен CD3-зета, например, последовательность CD3-зета, описанную в настоящем описании.
В одном варианте осуществления первичный сигнальный домен содержит модифицированный домен ITAM, например, мутантный домен ITAM, который имеет измененную (например, увеличенную или сниженную) активность по сравнению с нативным доменом ITAM. В одном варианте осуществления первичный сигнальный домен содержит модифицированный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, оптимизированный и/или укороченный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен. В одном варианте осуществления первичный сигнальный домен содержит один, два, три, четыре или более мотивов ITAM. Следующие примеры молекул, содержащих первичный внутриклеточный сигнальный домен, которые являются особенно пригодными для применения в рамках настоящего изобретения, включают DAP10, DAP12 и CD32.
Первичный внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный фрагмент или аналог первичной стимулирующей молекулы (например, CD3-зета - номер доступа GenBank № BAG36664.1). Первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать целую внутриклеточную область или фрагмент внутриклеточной области, которые являются достаточными для индукции внутриклеточного сигнала, когда антигенсвязывающий домен, с которым он слит, связывает распознаваемый им антиген. В некоторых вариантах осуществления первичный внутриклеточный сигнальный домен обладает по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичностью последовательность с целой внутриклеточной областью или фрагментом внутриклеточной области, который является достаточным для индукции внутриклеточного сигнала, встречающейся в природе стимулирующей молекулы, например, внутриклеточной первичной стимулирующей молекулы человека (номер доступа GenBank № BAG36664.1) или другого млекопитающего, например, не являющегося человеком вида, например, грызуна, мартышки, человекообразной обезьяны или мыши. В некоторых вариантах осуществления первичный внутриклеточный сигнальный домен обладает по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления первичный внутриклеточный сигнальный домен обладает по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью или отличается не более чем на 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотный остаток от соответствующих остатков целой внутриклеточной области или фрагмента внутриклеточной области, который является достаточным для индукции внутриклеточного сигнала, встречающейся в природе первичной стимулирующей молекулы человека, например, встречающейся в природе первичной стимулирующей молекулы, описанной в настоящем описании.
Костимулирующий сигнальный домен
Внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать сигнальный домен CD3-зета сам по себе или в комбинации с любым другим желаемым внутриклеточным сигнальным доменом(ами), пригодным в контексте CAR по изобретению. Например, внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать часть в виде цепи CD3-зета и костимулирующий сигнальный домен. Костимулирующий сигнальный домен относится к части CAR, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. В одном варианте осуществления внутриклеточный домен сконструирован так, чтобы он содержал сигнальный домен CD3-зета и сигнальный домен CD28. В одном аспекте внутриклеточный домен сконструирован так, чтобы он содержал сигнальный домен CD3-зета и сигнальный домен ICOS.
Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от рецептора антигена или его лигандов, которая требуется для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают молекулу MHC класса I, белки рецепторов TNF, иммуноглобулин-подобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, рецептор Toll-лигана, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM 1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, и лиганд, который специфически связывается с CD83, и т.п. Например, было продемонстрировано, что костимуляция CD27 усиливает экспансию, эффекторную функцию и выживаемость клеток, экспрессирующих CAR человека (например, T-клеток, NK-клеток) in vitro и усиливает персистенцию и противоопухолевую активность T-клеток in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). Следующие примеры таких костимулирующих молекул включают CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM 1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD 162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKG2D и NKG2C.
Внутриклеточные сигнальные домены в цитоплазматической части CAR по изобретению могут быть связаны друг с другом в случайном или определенном порядке. Необязательно короткий олиго- или полипептидный линкер, например, длиной от 2 до 10 аминокислот (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот), может образовывать связь между внутриклеточными сигнальными последовательностями. В одном варианте осуществления в качестве подходящего линкера можно использовать дублет глицин-серин. В одном варианте осуществления в качестве подходящего линкера можно использовать одну аминокислоту, например, аланин, глицин.
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен сконструирован так, чтобы он содержал два или более, например, 2, 3, 4, 5 или более, костимулирующих сигнальных доменов. В одном варианте осуществления два или более, например, 2, 3, 4, 5 или более, костимулирующих сигнальных доменов, разделены линкерной молекулой, например линкерной молекулой, описанной в настоящем описании. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит два костимулирующих сигнальных домена. В некоторых вариантах осуществления линкерная молекула представляет собой остаток глицина. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой остаток аланина.
Костимулирующий домен содержит функциональный фрагмент или аналог костимулирующей молекулы (например, ICOS, CD28 или 4-1BB). Он может содержать всю внутриклеточную область или фрагмент внутриклеточной области, который является достаточным для индукции внутриклеточного сигнала, например, когда антигенсвязывающий домен, с которым он слит, связывает распознаваемый им антиген. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий домен обладает по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичностью последовательности с целой внутриклеточной областью или фрагментом внутриклеточной области, который является достаточным для индукции внутриклеточного сигнала, встречающейся в природе костимулирующей молекулы, как описано в настоящем описании, например, внутриклеточной костимулирующей молекулы человека или другого млекопитающего, например, не являющегося человеком вида, например, грызуна, мартышки, человекообразной обезьяны или мыши. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий домен обладает по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40 или SEQ ID NO: 44.
В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен обладает по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью или отличается не более чем на 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотный остаток от соответствующих остатков целой внутриклеточной области или фрагмента внутриклеточной области, который является достаточным для индукции внутриклеточного сигнала, встречающейся в природе костимулирующей молекулы человека, например, встречающейся в природе костимулирующей молекулы человека, описанной в настоящем описании.
Любые из CAR, описанных в настоящем описании, могут включать один или несколько компонентов, приведенных в таблице 11.
Таблица 11. Последовательности различных компонентов CAR (а.к. - аминокислоты, н.к. - нуклеиновые кислоты, которые кодируют соответствующий белок)
SEQ ID NO | Описание | Последовательность |
1 | Промотор EF-1 |
|
2 | Лидерная последовательность (а.к.) | |
3 | Лидерная последовательность (н.к.) | |
4 | Шарнирная область CD8 (а.к.) | |
5 | Шарнирная область CD8 (н.к.) | |
6 | Шарнирная область IgG4 (а.к.) | |
7 | Шарнирная область IgG4 (н.к.) | |
8 | Шарнирная область IgD (а.к.) | |
9 | Шарнирная область IgD (н.к.) |
|
10 | Шарнирная область/линкер GS (а.к.) | |
11 | Шарнирная область/линкер GS (н.к.) | |
12 | CD8TM (а.к.) | |
13 | CD8TM (н.к.) | |
14 | Внутриклеточный домен 4-1BB (а.к.) | |
15 | Внутриклеточный домен 4-1BB (н.к.) | |
16 | CD27 (а.к.) | |
17 | CD27 (н.к.) | |
18 | CD3-зета (а.к.) | |
19 | CD3-зета (н.к.) | |
20 | CD3-зета (а.к.) | |
21 | CD3-зета (н.к.) |
|
22 | линкер | |
23 | линкер | |
28 | Линкер | где n=10 |
29 | Линкер | |
30 | Линкер | |
31 | Линкер | |
32 | Поли-A | A2000 |
33 | Поли-A | A150 |
34 | Поли-A | A5000 |
35 | Поли-T | T100 |
36 | Поли-T | T5000 |
37 | Поли-A | A64 |
38 | Поли-A | A400 |
Комбинация CAR
В одном аспекте экспрессирующая CAR клетка, описанная в настоящем описании, может дополнительно содержать второй CAR, например, второй CAR, который включает другой антигенсвязывающий домен, например, для той же мишени или другой мишени (например, мишень, отличная от ассоциированного со злокачественной опухолью антигена, описанного в настоящем описании, другой ассоциированной со злокачественной опухолью антиген, описанный в настоящем описании, например, CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3 или рецептор-бета фолатов). В одном варианте осуществления второй CAR включает антигенсвязывающий домен для мишени, экспрессируемой тем же типом злокачественных клеток, что и ассоциированный со злокачественной опухолью антиген. В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка содержит первый CAR, который нацелен на первый антиген, и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, но не первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацелен на второй отличающийся антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, но не костимулирующий сигнальный домен. Без связи с теорий, размещение костимулирующего сигнального домена, например, 4-1BB, CD28, ICOS, CD27 или OX-40, на первом CAR, и первичного сигнального домена, например, CD3-зета, на втором CAR может ограничить активность CAR клетками, в которых экспрессируются обе мишени. В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка содержит первый CAR к ассоциированному со злокачественной опухолью антигену, который включает антигенсвязывающий домен, который связывает антиген-мишень, описанный в настоящем описании, трансмембранный домен и костимулирующий домен, и второй CAR, который нацелен на другой антиген-мишень (например, антиген, экспрессируемый на том же типе злокачественных клеток, что и первый антиген-мишень) и включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В другом варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка содержит первый CAR, который включает антигенсвязывающий домен, который связывает антиген-мишень, описанный в настоящем описании, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацелен на антиген, отличный от первого антигена-мишени (например, антиген, экспрессируемый на том же типе злокачественных клеток, что и первый антиген-мишень), и включает антигенсвязывающий домен против антигена, трансмембранный домен и костимулирующий сигнальный домен.
В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка содержит CAR, описанный в настоящем описании (например, CAR против CD19) и ингибиторный CAR. В одном варианте осуществления ингибиторный CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, обнаруживаемый на нормальных клетках, но не на злокачественных клетках, например, нормальных клетках, которые также экспрессируют CLL. В одном варианте осуществления ингибиторный CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен ингибиторной молекулы. Например, внутриклеточный домен ингибиторного CAR может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозина и TGFR (например, TGFR-бета).
В одном варианте осуществления, когда экспрессирующая CAR клетка содержит два или более различных CAR, антигенсвязывающие домены различных CAR могут быть такими, что антигенсвязывающие домены не взаимодействуют друг с другом. Например, клетка, экспрессирующая первый и второй CAR, может иметь антигенсвязывающий домен первого CAR, например, в качестве фрагмента, например scFv, который не образует связи с антигенсвязывающим доменом второго CAR, например, антигенсвязывающий домен второго CAR представляет собой VHH.
В некоторых вариантах осуществления связывание антигенсвязывающего домена первого CAR, когда он присутствует на поверхности клетки, с распознаваемым им антигеном по существу не снижается в присутствии второго CAR. В некоторых вариантах осуществления связывание антигенсвязывающего домена первого CAR с распознаваемым им антигеном в присутствии второго CAR составляет 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от связывания антигенсвязывающего домена первого CAR с его собственным антигеном в отсутствие второго CAR.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие домены первого CAR и указанного второго CAR, когда они присутствуют на поверхности клетки, связываются друг с другом в меньшей степени, чем в случае, если бы они оба представляли собой антигенсвязывающие домены scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие домены первого CAR и второго CAR связываются друг с другом на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньше, чем в случае, если бы они оба представляли собой антигенсвязывающие домены scFv.
CAR-экспрессирующие клетки
CAR, описанные в настоящем описании, экспрессируются на клетках, например, иммунных эффекторных клетках, например, T-клетках. Например, конструкцией нуклеиновой кислоты CAR, описанного в настоящем описании, трансдуцируют T-клетку. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, описанные в настоящем описании, представляют собой T-клетки с транскрибированной in vitro РНК CAR.
Источники клеток, например T-клеток
Перед увеличением в количестве и генетической модификацией или другой модификацией источник клеток, например, иммунных эффекторных клеток, T-клеток или NK-клеток, можно получать от индивидуума. Примеры индивидуумов включают человека, мартышек, шимпанзе, собак, кошек, мышей, крыс и их трансгенные виды. T-клетки можно получать из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из области инфекции, асцитную жидкость, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные, как описано в этом разделе, подвергают анализу, описанному в настоящем описании, например, анализируют один или несколько биомаркеров.
В определенных аспектах настоящего изобретения иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки, можно получать из единицы крови, взятой от индивидуума, с использованием любого из множества способов, известных квалифицированному специалисту, таких как разделение в FicollTM. В одном аспекте клетки из циркулирующей крови индивидуума получают аферезом. Продукт афереза, как правило, содержит лимфоциты, в том числе T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В одном аспекте клетки, полученные аферезом, можно промывать для удаления фракции плазмы и, необязательно, для помещения клеток в соответствующий буфер или среды для последующих стадий обработки. В одном варианте осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В альтернативном варианте осуществления промывочный раствор лишен кальция и может быть лишен магния или может быть лишен многих, или даже всех, двухвалентных катионов.
Первоначальные стадии активации в отсутствие кальция могут приводить к усиленной активации. Как будет хорошо понятно специалистам в данной области, стадию промывания можно проводить способами, известными в данной области, как например, с использованием полуавтоматической "проточной" центрифуги (например, устройство для обработки клеток Cobe 2991, Baxter CytoMate, или Haemonetics Cell Saver 5) в соответствии с инструкциями изготовителя. После промывания клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах, например, таких как не содержащий Ca, не содержащий Mg PBS, PlasmaLyte A, или другой солевой раствор с буфером или без него. Альтернативно нежелательные компоненты образца для афереза можно удалять и клетки прямо ресуспендировать в культуральной среде.
Является общепризнанным, что в способах применения можно использовать условия культуральных сред, включающие 5% или менее, например 2%, сыворотки человека AB, и в них используются известные условия культуральных сред и композиции, например, описанные в Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31.
В одном аспекте T-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови человека посредством лизиса эритроцитов и устранения моноцитов, например, посредством центрифугирования в градиенте PERCOLLTM или посредством центрифужной элютриации в противотоке.
Способы, описанные в настоящем описании, могут включать, например, селекцию конкретной субпопуляции иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток, которые представляют собой популяцию с истощением регуляторных T-клеток, популяцию с истощением CD25+ клеток, с использованием, например, способа отрицательной селекции, например, описанного в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, популяция клеток с истощением регуляторных T-клеток содержит менее 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток.
В одном варианте осуществления регуляторные T-клетки, например, CD25+ T-клетки, устраняют из популяции с использованием антитела против CD25 или его фрагмента, или CD25-связывающего лиганда, IL-2. В одном варианте осуществления антитело против CD25 или его фрагмент, или CD25-связывающий лиганд конъюгированы с подложкой, например, гранулами, или в другом случае нанесены на субстрат, например, гранулы. В одном варианте осуществления антитело против CD25 или его фрагмент конъюгированы с подложкой, как описано в настоящем описании.
В одном варианте осуществления регуляторные T-клетки, например, CD25+ T-клетки, удаляют из популяции с использованием реагента для истощения CD25 от MiltenyiTM. В одном варианте осуществления соотношение клеток и реагента для истощения CD25 составляет 1e7 клеток на 20 мкл, или 1e7 клеток на 15 мкл, или 1e7 клеток на 10 мкл, или 1e7 клеток на 5 мкл, или 1e7 клеток на 2,5 мкл, или 1e7 клеток на 1,25 мкл. В одном варианте осуществления, например, для регуляторных T-клеток, например, используют истощение CD25+ клеток, превышающих 500 миллионов клеток/мл. В следующем аспекте, используют концентрацию клеток, составляющую 600, 700, 800 или 900 миллионов клеток/мл.
В одном варианте осуществления популяция иммунных эффекторных клеток, подлежащих истощению, включает приблизительно 6×109 CD25+ T-клеток. В других аспектах популяция иммунных эффекторных клеток, подлежащая истощению, включает приблизительно от 1×109 до 1×1010 CD25+ T-клеток и любое целое число между ними. В одном варианте осуществления полученная популяция с истощением регуляторных T-клеток имеет 2×109 регуляторных T-клеток, например, CD25+ клеток, или менее (например, 1×109, 5×108, 1×108, 5×107, 1×107 или менее CD25+ клеток).
В одном варианте осуществления регуляторные T-клетки, например, CD25+ клетки, удаляют из популяции с использованием системы CliniMAC с набором трубок для истощения, например, таких как трубки 162-01. В одном варианте осуществления систему CliniMAC используют с настройками для истощения, например, такими как DEPLETION2.1.
Без связи с конкретной теорией, снижение уровня отрицательных регуляторов иммунных клеток (например, снижение количества нежелательных иммунных клеток, например, клеток TREG) у индивидуума перед аферезом или в процессе изготовления продукта с CAR-экспрессирующими клетками, может снизить риск рецидива у индивидуума. В одном варианте осуществления пациента предварительно лечат одним или несколькими способами терапии, которые снижают уровень TREG, перед сбором клеток для производства продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток), тем самым снижая риск рецидива у пациента при лечении CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, при лечении CTL019). Способы уменьшения количества клеток TREG включают, но не ограничиваются ими, циклофосфамид, антитело против GITR (антитело против GITR, описанное в настоящем описании), истощение CD25 и их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления способы получения включают уменьшение количества (например, истощение) клеток TREG перед получением CAR-экспрессирующих клеток. Например, способы получения включают приведение в контакт образца, например, образца для афереза, с антителом против GITR и/или антителом против CD25 (или его фрагментом или CD25-связывающим лигандом), например, для истощения клеток TREG перед изготовлением продукта с CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетки, NK-клетки).
В одном варианте осуществления пациента предварительно лечат циклофосфамидом перед сбором клеток для производства продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток), тем самым снижая риск рецидива у пациента при лечении CAR-экспрессирующими клетками (например, при лечении CTL019). В одном варианте осуществления пациента предварительно лечат антителом против GITR перед сбором клеток для производства продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток), тем самым снижая риск рецидива у пациента при лечении CAR-экспрессирующими клетками (например, при лечении CTL019).
В одном варианте осуществления процесс производства CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) модифицируют для истощения клеток TREG перед производством продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, продукта CTL019). В одном варианте осуществления истощение CD25 используют для истощения клеток TREG перед производством продукта CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, продукта CTL019).
Способы, описанные в настоящем описании, могут включать более одной стадии селекции, например, более одной стадии истощения. Увеличение в количестве популяции T-клеток посредством отрицательной селекции можно проводить, например, с использованием комбинации антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для клеток, подвергнутых отрицательной селекции. Одним способом является сортировка и/или селекция клеток посредством негативной магнитной иммунной адгезии или проточной цитометрии, в которых используется смесь моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на клетках, подвергаемых отрицательной селекции. Например, для увеличения в количестве CD4+ клеток посредством отрицательной селекции смесь моноклональных антител может включать антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8.
Способы, описанные в настоящем описании, кроме того, могут включать удаление клеток из популяции, которые экспрессируют опухолевый антиген, например, опухолевый антиген, который не содержит CD25, например, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 или CD11b, тем самым, получая популяцию с истощенными регуляторными T-клетками, например, истощенными по CD25+ клетками, и истощенными по опухолевому антигену клетками, которая пригодна для экспрессии CAR, например, CAR, описанного в настоящем описании. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, удаляют одновременно с регуляторными T-клетками, например, CD25+ клетками. Например, антитело против CD25 или его фрагмент и антитело против опухолевого антитела, или его фрагмент, можно связывать с одной и той же подложкой, например, гранулами, которые можно использовать для удаления клеток, или антитело против CD25 или его фрагмент, или антитело против опухолевого антигена или его фрагмент, можно связывать с отдельными гранулами, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других вариантах осуществления удаление T-регуляторных клеток, например, CD25+ клеток, и удаление клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, является последовательным и может происходить, например, в любом порядке.
Также предусматриваются способы, которые включают устранение из популяции клеток, которые экспрессируют ингибитор точки контроля, например, ингибитор точки контроля, описанный в настоящем описании, например, одного или нескольких типов из PD1+ клеток, LAG3+ клеток и TIM3+ клеток, тем самым, обеспечивая популяцию с истощенными регуляторными T-клетками, например, с истощенными CD25+ клетками, и клетками, истощенными по ингибитору точки контроля, например, истощенными PD1+, LAG3+ и/или TIM3+ клетками. Иллюстративные ингибиторы точки контроля включают B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA и LAIR1. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие ингибитор точки контроля, удаляют одновременно с регуляторными T-клетками, например, CD25+ клетками. Например, антитело против CD25 или его фрагмент и антитело против ингибитора точки контроля или его фрагмент можно связывать с одними и теми же гранулами, которые можно использовать для удаления клеток, или антитело против CD25 или его фрагмент, или антитело против ингибитора точки контроля или его фрагмент, можно связывать с отдельными гранулами, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других вариантах осуществления удаление T-регуляторных клеток, например, CD25+ клеток, и удаление клеток, экспрессирующих ингибитор точки контроля, является последовательным и может происходить, например, в любом порядке.
Способы, описанные в настоящем описании, могут включать стадию положительной селекции. Например, T-клетки можно выделять посредством инкубации с гранулами, конъюгированными с антителом против CD3/против CD28 (например, 3×28), такими как DYNABEAD® M-450 CD3/CD28 T, в течение периода времени, достаточного для положительной селекции желаемых T-клеток. В одном варианте осуществления период времени составляет приблизительно 30 минут. В следующем варианте осуществления период времени находится в диапазоне от 30 минут до 36 часов или более, включая все целые числа между ними. В следующем варианте осуществления, период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В другом предпочтительном варианте осуществления период времени составляет от 10 до 24 часов, например, 24 часа. Более длительное время инкубации можно использовать для выделения T-клеток в любой ситуации, где T-клеток мало по сравнению с другими типами клеток, как например, в случае выделения инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) из ткани опухоли или от индивидуумов с иммунодефицитом. Кроме того, использование более длительного времени инкубации может повышать эффективность улавливания CD8+ T-клеток. Таким образом, посредством простого укорочения или удлинения времени T-клеткам позволяют связываться с гранулами CD3/CD28 и/или путем увеличения или снижения соотношения гранул и T-клеток (как дополнительно описано в настоящем описании), можно предпочтительно проводить селекцию в отношении или против субпопуляции T-клеток при инициации культуры или в другие моменты времени процесса. Кроме того, путем увеличения или снижения соотношения антител против CD3 и/или антител против CD28 на гранулах или другой поверхности, можно предпочтительно проводить селекцию в отношении или против субпопуляции T-клеток при инициации культуры или в другие желаемые моменты времени.
В одном варианте осуществления можно отбирать популяцию T-клеток, которая экспрессирует один или несколько из IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-21, CCF20, GM-CSF, IL-10, IL-13, гранзима B и перфорина, или других соответствующих молекул, например, других цитокинов. Способы скрининга клеточной экспрессии можно определять, например, способами, описанными в публикации PCT № WO 2013/126712. В одном варианте осуществления популяция T-клеток экспрессирует цитокин CCF20, IL-17a, IL-6 и их комбинации.
Для выделения желаемой популяции клеток посредством положительной или отрицательной селекции концентрацию клеток и величину поверхности (например, количество частиц, таких как гранулы) можно варьировать. В некоторых аспектах, может быть желательным значительное уменьшение объема, в котором гранулы и клетки смешивают друг с другом (например, увеличение концентрации клеток), для обеспечения максимального контакта клеток и гранул. Например, в одном аспекте используют концентрацию 10 миллиардов клеток/мл, 9 миллиардов клеток/мл, 8 миллиардов клеток/мл, 7 миллиардов клеток/мл, 6 миллиардов клеток/мл или 5 миллиардов клеток/мл. В одном аспекте используют концентрацию 1 миллиард клеток/мл. В следующем аспекте используют концентрацию клеток 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В следующих аспектах можно использовать концентрации, составляющие 125 или 150 миллионов клеток/мл.
Использование высоких концентраций может приводить к увеличению выхода клеток, активации клеток и экспансии клеток. Кроме того, применение высоких концентраций клеток позволяет более эффективное улавливание клеток, которые могут слабо экспрессировать представляющие интерес антигены-мишени, таких как CD28-отрицательные T-клетки, или улавливание из образцов, где присутствует множество опухолевых клеток (например, кровь при лейкозе, опухолевая ткань и т.д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и их получение может быть желательным. Например, использование высокой концентрации клеток обеспечивает более эффективную селекцию CD8+ T-клеток, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.
В сходном аспекте может быть желательным снижение концентрации клеток. Путем значительного разбавления смеси T-клеток и поверхности (например, частиц, таких как гранулы), взаимодействия между частицами и клетками минимизируют. Это приводит к селекции клеток, которые экспрессируют высокие количества желаемых антигенов, подлежащих связыванию с частицами. Например, CD4+ T-клетки экспрессируют более высокие уровни CD28 и более эффективно улавливаются, чем CD8+ T-клетки, в разбавленных концентрациях. В одном аспекте концентрация используемых клеток составляет 5×106/мл. В других аспектах используемая концентрация может составлять приблизительно от 1×105/мл до 1×106/мл, включая любое целое число между ними.
В других аспектах клетки можно инкубировать на вращающем устройстве в течение разных периодов времени при различных скоростях либо при 2-10°C, либо при комнатной температуре.
T-клетки, предназначенные для стимуляции, также можно замораживать после стадии промывания. Без связи с теорией полагают, что замораживание и последующее оттаивание обеспечивает более однородный продукт вследствие устранения гранулоцитов и в некоторой степени моноцитов из популяции клеток. После стадии промывания, которая устраняет плазму и тромбоциты, клетки можно суспендировать в растворе для замораживания. Хотя множество растворов и параметров для замораживания известно в данной области и пригодно в этом контексте, один способ вовлекает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% сывороточный альбумин человека, или культуральной среды, содержащей 10% декстран 40 и 5% декстрозу, 20% сывороточный альбумин человека и 7,5% DMSO, или 31,25% Plasmalyte-A, 31,25% декстрозу 5%, 0,45% NaCl, 10% декстран 40 и 5% декстрозу, 20% сывороточный альбумин человека, и 7,5% DMSO или другие походящие среды для замораживания клеток, содержащие, например, Hespan и PlasmaLyte A, затем клетки замораживают до -80 °C со скоростью 1 ° в минуту и хранят в парообразной фазе в емкости для хранения в жидком азоте. Можно использовать другие способы контролируемого замораживания, а также неконтролируемое замораживание сразу до -20 °C или в жидком азоте.
В некоторых аспектах криосохраненные клетки размораживают и промывают, как описано в настоящем описании, и им позволяют покоиться в течение одного часа при комнатной температуре перед активацией с использованием способов по настоящему изобретению.
Также в контексте изобретения предусматривается получение образцов крови или продукта афереза от индивидуума в период времени до того, как клетки, описанные в настоящем описании, могут потребоваться. По существу, источник клеток, подлежащих увеличению в количестве, можно собирать в любой требуемый момент времени и желаемые клетки, такие как T-клетки, можно выделять и замораживать для последующего применения в терапии иммунными эффекторными клетками любого множества заболеваний и состояний, при которых является полезной терапия иммунными эффекторными клетками, таких как заболевания и состояния, описанные в настоящем описании. В одном аспекте получение образца крови или продукта афереза проводят от в основном здорового индивидуума. В некоторых аспектах получение образца крови или продукта афереза проводят от в основном здорового индивидуума, который имеет риск развития заболевания, но у которого заболевание еще не развилось, и представляющие интерес клетки выделяют и замораживают для последующего применения. В некоторых аспектах T-клетки можно увеличивать в количестве, замораживать и использовать позднее. В некоторых аспектах взятие образцов проводят сразу после постановки диагноза конкретного заболевания, как описано в настоящем описании, но перед каким-либо из способов лечения. В следующем аспекте клетки выделяют из образца крови или продукта афереза от индивидуума перед любым из множества соответствующих способов лечения, включая, но не ограничиваясь ими, лечение средствами, такими как натализумаб, эфализумаб, противовирусные средства, химиотерапия, лучевая терапия, иммунодепрессивные средства, такие как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антитела или другие иммунодепрессивные средства, такие как CAMPATH, антитела против CD3, цитоксан, флударабин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228 и лучевая терапия.
В следующем аспекте настоящего изобретения T-клетки получают от пациента непосредственно после лечения, которое сохраняет у индивидуума функциональные T-клетки. В этом отношении было обнаружено, что в случае определенных способов лечения злокачественной опухоли, в частности, лечения лекарственными средствами, которые повреждают иммунную систему, вскоре после лечения в течение периода, когда пациенты в норме восстанавливаются после лечения, качество полученных T-клеток может быть оптимальным или улучшенным в отношении их способности увеличиваться в количестве ex vivo. Аналогично, после манипулирования ex vivo с использованием способов, описанных в настоящем описании, эти клетки могут быть в предпочтительном состоянии для повышения приживаемости и экспансии in vivo. Таким образом, в контексте изобретения предусматривается сбор клеток крови, в том числе T-клеток, дендритных клеток или других клеток гемопоэтического ростка в ходе этой стадии восстановления. Кроме того, в некоторых аспектах, можно использовать режимы мобилизации (например, мобилизация посредством GM-CSF) и кондиционирования у индивидуума, которые способствуют репопуляции, рециркуляции, регенерации и/или экспансии конкретных типов клеток, особенно в течение определенного периода времени после терапии. Иллюстративные типы клеток включают T-клетки, B-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.
В одном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, получают от индивидуума, которому вводили низкую усиливающую иммунитет дозу ингибитора mTOR. В одном варианте осуществления популяцию иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток, подлежащих модификации способами инженерии для экспрессии CAR, собирают после достаточного периода времени или после достаточного дозирования низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, так что уровень отрицательных по PD1 иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток, или соотношение отрицательные по PD-1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки/положительные по PD-1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки, у индивидуума или после взятия у индивидуума по меньшей мере временно увеличивается.
В других вариантах осуществления популяцию иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток, которые модифицированы или будут модифицированы способами инженерии для экспрессии CAR, можно обрабатывать ex vivo путем приведения в контакт с количеством ингибитора mTOR, которое увеличивает количество отрицательных по PD1 иммунных эффекторных клеток, например, T клеток, или увеличивает соотношение отрицательные по PD-1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки/положительные по PD-1 иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки.
В одном варианте осуществления популяция T-клеток является дефицитной по диаглицеринкиназе (DGK). Клетки с дефицитом DGK включают клетки, которые не экспрессируют РНК или белок DGK, или имеет сниженную или ингибированную активность DGK. Клетки с дефицитом DGK можно получать посредством генетических подходов, например, введения агентов РНК-интерференции, например, миРНК, кшРНК, микроРНК, для снижения или предотвращения экспрессии DGK. Альтернативно клетки с дефицитом DGK можно получать путем обработки ингибиторами DGK, описанными в настоящем описании.
В одном варианте осуществления популяция T-клеток имеет дефицит Ikaros. Клетки с дефицитом Ikaros включают клетки, которые не экспрессируют РНК или белок Ikaros, или обладают сниженной или ингибированной активностью Ikaros. Клетки с дефицитом Ikaros можно получать с использованием генетических подходов, например, введения агентов РНК-интерференции, например, миРНК, кшРНК, микроРНК, для снижения или предотвращения экспрессии Ikaros. Альтернативно клетки с дефицитом Ikaros можно получать путем обработки ингибиторами Ikaros, например, леналидомидом.
В некоторых вариантах осуществления популяция T-клеток является дефицитной по DGK и дефицитной по Ikaros, например, не экспрессирует DGK и Ikaros, или имеет сниженную или ингибированную активность DGK и Ikaros. Такие клетки с дефицитом DGK и Ikaros можно получать любыми способами, описанными в настоящем описании.
Аллогенный CAR
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем описании, иммунная эффекторная клетка может представлять собой аллогенную эффекторную клетку, например T-клетку. Например, клетка может представлять собой аллогенную T-клетку, например аллогенную T-клетку, лишенную экспрессии функционального T-клеточного рецептора (TCR) и/или лейкоцитарного антигена человека (HLA), например, HLA класса I и/или HLA класса II.
Например, T-клетку, лишенную функционального TCR, можно конструировать так, чтобы она не экспрессировала какой-либо функциональный TCR на ее поверхности, можно конструировать так, что она не экспрессировала одной или нескольких субъединиц, которые содержит функциональный TCR (например, можно конструировать так, чтобы она не экспрессировала (или демонстрировала сниженную экспрессию) TCR-альфа, TCR-бета, TCR-гамма, TCR-дельта, TCR-эпсилон и/или TCR-зета), или конструировать так, чтобы она продуцировала очень мало функционального TCR на ее поверхности. Альтернативно T-клетка может экспрессировать по существу нарушенный TCR, например, посредством экспрессии мутантных или укороченных форм одной или нескольких субъединиц TCR. Термин "по существу нарушенный TCR" означает, что этот TCR не индуцирует неблагоприятную иммунную реакцию у хозяина.
T-клетку, описанную в настоящем описании, можно конструировать, например, чтобы она не экспрессировала функциональный HLA на ее поверхности. Например, T-клетку, описанную в настоящем описании, можно модифицировать способами инженерии так, чтобы на клеточной поверхности подавлялась экспрессия HLA, например, HLA класса I и/или HLA класса II. В некоторых вариантах осуществления подавление HLA можно осуществлять путем снижения или устранения экспрессии микроглобулина бета-2 (B2M).
В некоторых вариантах осуществления T-клетка может быть лишена функционального TCR и функционального HLA, например, HLA класса I и/или HLA класса II.
Модифицированные T-клетки, которые лишены экспрессии функционального TCR и/или HLA, можно получать любыми подходящими способами, включая нокаут или нокдаун одной или нескольких субъединиц TCR или HLA. Например, T-клетка может включать нокдаун TCR и/или HLA с использованием миРНК, кшРНК, коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами (CRISPR), нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), или эндонуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN).
В некоторых вариантах осуществления аллогенная клетка может представлять собой клетку, которая не экспрессирует или экспрессирует на низких уровнях ингибиторную молекулу, например, посредством любого способа, описанного в настоящем описании. Например, клетка может представлять собой клетку, которая не экспрессирует или экспрессирует на низких уровнях ингибиторную молекулу, например, которая может снижать способность экспрессирующей CAR клетки индуцировать иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибиторных молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAF9, аденозин и TGFR (например, TGFR-бета). Ингибирование ингибиторной молекулы, например, посредством ингибирования на уровне ДНК, РНК или белка, может оптимизировать эффективность экспрессирующей CAR клетки. В некоторых вариантах осуществления можно использовать ингибиторную нуклеиновую кислоту, например дцРНК, например, миРНК или кшРНК, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами (CRISPR), нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN) или эндонуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), например, как описано в настоящем описании.
миРНК и кшРНК для ингибирования TCR или HLA
В некоторых вариантах осуществления экспрессию TCR и/или экспрессию HLA можно ингибировать с использованием миРНК или кшРНК, которая нацелена на нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR и/или HLA, и/или ингибиторную молекулу, описанную в настоящем описании (например, PD1, PD-F1, PD-F2, CTFA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTFA, TIGIT, FAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAF9, аденозин и TGFR-бета), в клетке, например, T-клетке.
Экспрессирующие системы для миРНК и кшРНК и иллюстративные кшРНК описаны, например, в абзацах 649 и 650 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
CRISPR для ингибирования TCR или HLA
"CRISPR" или "CRISPR против TCR и/или HLA" или "CRISPR для ингибирования TCR и/или HLA", как используют в рамках изобретения, относится к набору коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами, или к системе, содержащей такой набор повторов. "Cas", как используют в рамках изобретения, относится к ассоциированному с CRISPR белку. Система "CRISPR/Cas" относится к системе, происходящей из CRISPR и Cas, которую можно использовать для сайленсинга или мутации генов TCR и/или HLA, и/или ингибиторной молекулы, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-F1, PD-F2, CTFA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета), в клетке, например, T-клетке.
Система CRISPR/Cas и ее применение описаны, например, в абзацах 651-658 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
TALEN для ингибирования TCR и/или HLA
"TALEN" или "TALEN против HLA и/или TCR" или "TALEN для ингибирования HLA и/или TCR" относится к эффекторной нуклеазе, подобной активатору транскрипции, которая представляет собой искусственную нуклеазу, которую можно использовать для редактирования гена HLA и/или TCR и/или ингибиторной молекулы, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-F1, PD-F2, CTFA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета), в клетке, например, T-клетке.
TALEN и их применение описаны, например, в абзацах 659-665 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Нуклеаза с цинковыми пальцами для ингибирования HLA и/или TCR
"ZFN" или "нуклеаза с цинковыми пальцами" или "ZFN против HLA и/или TCR" или "ZFN для ингибирования HLA и/или TCR" относятся к нуклеазе с цинковыми пальцами, которая представляет собой искусственную нуклеазу, которую можно использовать для редактирования гена HLA и/или TCR и/или ингибиторной молекулы, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-F1, PD-F2, CTFA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета), в клетке, например, T-клетке.
ZFN и их применение описаны, например, в абзацах 666-671 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Экспрессия теломеразы
Без связи с какой-либо конкретной теорией, в некоторых вариантах осуществления терапевтическая T-клетка имеет кратковременную персистенцию у пациента вследствие укороченных теломер в T-клетке; таким образом, трансфекция гена теломеразы может удлинить теломеры T-клеток и повысить персистенцию T-клеток у пациента. См. Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007). Таким образом, в одном варианте осуществления иммунная эффекторная клетка, например T-клетка, эктопически экспрессирует субъединицу теломеразы, например, каталитическую субъединицу теломеразы, например TERT, например, hTERT. В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к способу получения CAR-экспрессирующей клетки, включающему приведение клетки в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, каталитическую субъединицу теломеразы, например TERT, например hTERT. Клетку можно приводить в контакт с нуклеиновой кислотой до, одновременно или после приведения в контакт с конструкцией, кодирующей CAR.
В одном аспекте изобретение относится к способу получения популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток). В одном варианте осуществления способ включает: предоставление популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток), приведение популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR; и приведение в контакт популяции иммунных эффекторных клеток с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например hTERT, в условиях, которые позволяют экспрессию CAR и теломеразы.
В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицу теломеразы, представляет собой ДНК. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицу теломеразы, содержит промотор, способный запускать экспрессию субъединицы теломеразы.
В одном варианте осуществления hTERT имеет аминокислотную последовательность белка с ID GenBank AAC51724.1 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795), как указано в SEQ ID NO: 82 настоящего описания.
В одном варианте осуществления hTERT имеет последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 82. В одном варианте осуществления hTERT имеет последовательность SEQ ID NO: 82. В одном варианте осуществления hTERT содержит делецию (например, не более чем 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) на N-конце, на C-конце или на обоих из них. В одном варианте осуществления hTERT содержит трансгенную аминокислотную последовательность (например, не более чем 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) на N-конце, C-конце или обоих из них.
В одном варианте осуществления hTERT кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты с номером доступа GenBank № AF018167 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Lip-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795), как указано в SEQ ID NO: 83 настоящего описания.
В одном варианте осуществления hTERT кодируется нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 83. В одном варианте осуществления hTERT кодируется нуклеиновой кислотой SEQ ID NO: 83.
Активация и увеличение в количестве иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток)
Иммунные эффекторные клетки, такие как T-клетки, можно активировать и увеличивать в количестве, в основном с использованием способов, описанных, например, в патентах США 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041 и публикации патентной заявки США № 20060121005. В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки подвергают анализу, как описано в настоящем описании (например, анализируют один или несколько биомаркеров) до, в процессе или после активации или до, в процессе или после увеличения в количестве.
Как правило, популяцию иммунных эффекторных клеток, можно увеличивать в количестве путем контакта с поверхностью, имеющей связанное с ней средство, которое стимулирует сигнал, ассоциированный с комплексом CD3/TCR, и лиганд, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности T-клеток. В частности, популяции T-клеток можно стимулировать, как описано в настоящем описании, например, путем контакта с антителом против CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом, или антителом против CD2, иммобилизованным на поверхности, или путем контакта с активатором протеинкиназы C (например, бриостатин) совместно с ионофором кальция. Для стимуляции вспомогательной молекулы на поверхности T-клеток можно использовать лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяцию T-клеток можно приводить в контакт с антителом против CD3 и антителом против CD28 в условиях, пригодных для стимуляции пролиферации T-клеток. Для стимуляции пролиферации либо CD4+ T-клеток, либо CD8+ T-клеток, можно использовать антитело против CD3 и антитело против CD28. Примеры антител против CD28 включают 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besançon, Франция), которые можно использовать, а также можно использовать и другие способы, широко известные в данной области (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
В определенных аспектах первичный стимулирующий сигнал и костимулирующий сигнал для T-клеток может быть предоставлен посредством различных протоколов. Например, средства, обеспечивающие каждый сигнал, могут быть в растворе или могут быть связанными с поверхностью. Когда они связаны с поверхностью, средства могут быть связаны с одной и той же поверхностью (т.е. в "цис"-форме) или с различными поверхностями (т.е. в "транс"-форме). Альтернативно одно средство может быть связано с поверхностью, а другое средство может находиться в растворе. В одном аспекте средство, обеспечивающее костимулирующий сигнал, связано с клеточной поверхностью, и средство, обеспечивающее первичный активирующий сигнал, находится в растворе или связано с поверхностью. В некоторых аспектах оба средства могут находиться в растворе. В одном аспекте средства могут быть в растворимой форме, а затем могут быть сшиты с поверхностью, такой как клетка, экспрессирующая Fc-рецепторы или антитело или другое связывающее соединение, которое будет связываться со средствами. В этом отношении, см., например, публикации патентных заявок США № 20040101519 и 20060034810 для искусственных антигенпредставляющих клеток (aAPC), которые предусматриваются для применения для активации и увеличения в количестве T-клеток в рамках настоящего изобретения.
В одном аспекте два средства иммобилизованы на гранулах, либо на одних и тех же гранулах, т.е. "цис", либо на различных гранулах, т.е. "транс". В качестве примера, средство, обеспечивающее первичный сигнал активации, представляет собой антитело против CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент и средство, обеспечивающее костимулирующий сигнал, представляет собой антитело против CD28 или его антигенсвязывающий фрагмент; и оба средства совместно иммобилизованы на одних и тех же гранулах в эквивалентных молекулярных количествах. В одном аспекте используют соотношение 1:1 для каждого антитела, связанного с гранулами, для увеличения в количестве CD4+ T-клеток и роста T-клеток. В некоторых аспектах настоящего изобретения используют такое соотношение антител против CD3:CD28, связанных с гранулами, при котором происходит увеличение экспансии T-клеток по сравнению с экспансией, наблюдаемой с использованием соотношения 1:1. В одном конкретном аспекте наблюдается увеличение в от приблизительно 1 до приблизительно 3 раз по сравнению с экспансией, наблюдаемой с использованием соотношения 1:1. В одном аспекте соотношение антител против CD3:CD28, связанных с гранулами, находится в диапазоне от 100:1 до 1:100, включая все целые числа между ними. В одном аспекте с частицами связано больше антитела против CD28, чем антитела против CD3, т.е. соотношение CD3:CD28 меньше единицы. В определенных аспектах соотношение антитела против CD28 и антитела против CD3, связанного с гранулами, превышает 2:1. В одном конкретном аспекте используют соотношение антител против CD3:CD28, связанных с гранулами, равное 1:100. В одном аспекте используют соотношение антител против CD3:CD28, связанных с гранулами, равное 1:75. В следующем аспекте используют соотношение антител против CD3:CD28, связанных с гранулами, равное 1:50. В одном аспекте используют соотношение антител против CD3:CD28, связанных с гранулами, равное 1:30. В одном предпочтительном аспекте используют соотношение антител против CD3:CD28, связанных с гранулами, равное 1:10. В одном аспекте используют соотношение антител против CD3:CD28, связанных с гранулами, равное 1:3. В следующем аспекте используют соотношение антител против CD3:CD28, связанных с гранулами, равное 3:1.
Для стимуляции T-клеток и других клеток-мишеней можно использовать отношения частиц к клеткам от 1:500 до 500:1, включая любые целые числа между ними. Как будет хорошо понятно специалистам в данной области, отношение частиц к клеткам может зависеть от размера частиц относительно клетки-мишени. Например, гранулы малых размеров могут связать только несколько клеток, в то время как гранулы больших размеров могут связывать множество клеток. В некоторых аспектах для стимуляции T-клеток можно использовать соотношение клеток и частиц, которое находится в диапазоне от 1:100 до 100:1, включая любые целые числа между ними, и в следующих аспектах соотношение включает от 1:9 до 9:1, включая любые целые числа между ними. Соотношение частиц с антителом против CD3 и антителом против CD28 и T-клеток, которое приводит к стимуляции T-клеток, может варьироваться, как отмечалось выше, однако определенные пригодные величины включают 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 и 15:1, причем одно пригодное соотношение частиц на T-клетку составляет по меньшей мере 1:1. В одном аспекте используют соотношение частиц и клеток 1:1 или менее. В одном конкретном аспекте пригодное соотношение частица:клетка равно 1:5. В следующих аспектах соотношение частиц и клеток может варьироваться в зависимости от дня стимуляции. Например, в одном аспекте соотношение частиц и клеток составляет от 1:1 до 10:1 на первые сутки, и дополнительные частицы добавляют к клеткам каждые стуки или раз в двое суток после этого в течение вплоть до 10 суток, в конечных соотношениях от 1:1 до 1:10 (исходя из количества клеток в день добавления). В одном конкретном аспекте соотношение частиц и клеток составляет 1:1 в первый день стимуляции и его доводят до 1:5 не третьи и пятые сутки стимуляции. В одном аспекте частицы добавляют раз в сутки или раз в двое суток до конечного соотношения 1:1 на первые сутки и 1:5 на третьи и пятые сутки стимуляции. В одном аспекте соотношение частиц и клеток составляет 2:1 на первые сутки стимуляции и его доводят до 1:10 на третьи и пятые сутки стимуляции. В одном аспекте частицы добавляют раз в стуки или раз в двое суток до конечного соотношения 1:1 на первые сутки, и 1:10 на третьи и пятые сутки стимуляции. Специалисту в данной области будет понятно, что множество других соотношений может быть пригодным для применения в рамках настоящего изобретения. В частности, соотношения будут варьироваться в зависимости от размера частиц и от размера и типа клеток. В одном аспекте наиболее типичные соотношения для применения составляют около 1:1, 2:1 и 3:1 на первые сутки.
В следующих аспектах клетки, такие как T-клетки, комбинируют с покрытыми средством гранулами, затем гранулы и клетки разделяют, а затем клетки культивируют. В альтернативном аспекте перед культивированием покрытые средством гранулы и клетки не отделяют, а культивируют вместе. В следующем аспекте гранулы и клетки сначала концентрируют с использованием силы, такой как магнитная сила, что приводит к увеличенному лигированию маркеров клеточной поверхности, тем самым индуцируя стимуляцию клеток.
В качестве примера, белки клеточной поверхности можно лигировать, позволяя парамагнитным гранулам, с которыми связаны антитело против CD3 и антитело против CD28 (гранулы 3 ×28) контактировать с T-клетками. В одном аспекте клетки (например, от 104 до 109 T-клеток) и гранулы (например, парамагнитные гранулы DYNABEAD® M-450 CD3/CD28 T в соотношении 1:1) комбинируют в буфере, например PBS (без двухвалентных катионов, таких как кальций и магний). Вновь, специалисту в данной области будет хорошо понятно, что можно использовать любую концентрацию клеток. Например, клетки-мишени могут быть очень редкими в образце и могут составлять только 0,01% образца, или весь образец (т.е. 100%) может состоять из представляющих интерес клеток-мишеней. Таким образом, в контексте настоящего изобретения предусматривается любое количество клеток. В некоторых аспектах может быть желательным значительное уменьшение объема, в котором частицы и клетки смешивают друг с другом (т.е. увеличение концентрации клеток) для обеспечения максимального контакта клеток и частиц. Например, в одном аспекте используют концентрацию приблизительно 10 миллиардов клеток/мл, 9 миллиардов клеток/мл, 8 миллиардов клеток/мл, 7 миллиардов клеток/мл, 6 миллиардов клеток/мл, 5 миллиардов клеток/мл или 2 миллиарда клеток/мл. В одном аспекте используют более 100 миллионов клеток/мл. В следующем аспекте используют концентрацию клеток, составляющую 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В другом аспекте используют концентрацию клеток 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В следующих аспектах можно использовать концентрации 125 или 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может приводить к увеличению выхода клеток, активации клеток и экспансии клеток. Кроме того, применение высоких концентраций клеток позволяет более эффективное улавливание клеток, которые могут слабо экспрессировать представляющие интерес антигены-мишени, таких как отрицательные по CD28 T-клетки. Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и в некоторых аспектах может быть желательным их получение. Например, использование высокой концентрации клеток позволяет более эффективную селекцию CD8+ T-клеток, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.
В одном варианте осуществления клетки, трансдуцированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании, увеличивают в количестве, например, способом, описанным в настоящем описании. В одном варианте осуществления клетки увеличивают в количестве в культуре в течение периода, составляющего от нескольких часов (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 час) до приблизительно 14 суток (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 суток). В одном варианте осуществления клетки увеличивают в количестве в течение периода от 4 до 9 суток. В одном варианте осуществления клетки увеличивают в количестве в течение периода 8 суток или менее, например, 7, 6 или 5 суток. В одном варианте осуществления клетки, например, клетки с CAR против CD19, описанные в настоящем описании, увеличивают в количестве в культуре в течение 5 суток, и полученные клетки являются более эффективными, чем те же клетки, которые увеличивали в количестве в культуре в течение 9 суток в тех же условиях культивирования. Эффективность может определяться, например, различными функциями T-клеток, например, пролиферацией, уничтожением клеток-мишеней, продукцией цитокинов, активацией, миграцией и их комбинациями. В одном варианте осуществления клетки, например, клетки с CAR против CD19, описанные в настоящем описании, которые увеличивали в количестве в течение 5 суток, демонстрируют увеличение удвоений клеток по меньшей мере в один, два, три или четыре раза при стимуляции антигеном по сравнению с теми же клетками, которые увеличивали в количестве в течение 9 суток в тех же условиях культивирования. В одном варианте осуществления клетки, например, клетки, экспрессирующие CAR против CD19, описанные в настоящем описании, увеличивают в количестве в культуре в течение 5 суток, и полученные клетки проявляют более высокую продукцию провоспалительных цитокинов, например, уровни IFN- γ и/или GM-CSF, по сравнению с теми же клетками, которые увеличивали в количестве в культуре в течение 9 суток в тех же условиях культивирования. В одном варианте осуществления клетки, например, клетки с CAR против CD19, описанные в настоящем описании, которые увеличивали в количестве в течение 5 суток, демонстрируют увеличение продукции провоспалительных цитокинов в пг/мл, например, уровни IFN-γ и/или GM-CSF, по меньшей мере в один, два, три, четыре, пять, десять раз или более по сравнению с теми же клетками, которые увеличивали в количестве в культуре в течение 9 суток в тех же условиях культивирования.
Также может быть желательным несколько циклов стимуляции, так чтобы время культивирования T-клеток составляло 60 суток или более. Условия, пригодные для культивирования T-клеток, включают соответствующие среды (например, минимальная поддерживающая среда или среда RPMI 1640 или, X-vivo 15, (Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, эмбриональная сыворотка человек или сыворотка человека), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ и TNF-α или любые другие добавки для роста клеток, известные специалисту в данной области. Другие добавки для роста клеток включают, но не ограничиваются ими, поверхностно-активное вещество, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 и X-Vivo 20, Optimizer, с добавлением аминокислот, пирувата натрия и витаминов, либо бессывороточные, либо дополненные соответствующем количеством сыворотки (или плазмы) или определенным набором гормонов, и/или количеством цитокина(ов), достаточным для роста и экспансии T-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые подлежат инфузии индивидууму. Клетки-мишени поддерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например, при соответствующей температуре (например, 37°C) и в соответствующей атмосфере (например, воздух плюс 5% CO2).
В одном варианте осуществления клетки увеличивают в количестве в подходящей среде (например, среды, описанные в настоящем описании), которая включает один или несколько интерлейкинов, которые приводят к увеличению количества клеток по меньшей мере в 200 раз (например, в 200 раз, в 250 раз, в 300 раз, в 350раз) в период экспансии в течение 14 суток, например, при измерении способом, описанным в настоящем описании, таким как проточная цитометрия. В одном варианте осуществления клетки увеличивают в количестве в присутствии IL-15 и/или IL-7 (например, IL-15 и IL-7).
В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, например, способы получения CAR-экспрессирующих клеток, включают удаление регуляторных T-клеток, например, CD25+ T-клеток, из популяции, например, с использованием антитела против CD25 или его фрагмента, или CD25-связывающего лиганда, IL-2. Способы удаления регуляторных T-клеток, например, CD25+ T-клеток, из популяции клеток описаны в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления способы, например, способы получения, кроме того, включают приведение в контакт популяции клеток (например, популяции клеток с истощением регуляторных T-клеток, таких как CD25+ T-клетки; или популяции клеток, которую ранее приводили в контакт с антителом против CD25, его фрагментом, или CD25-связывающим лигандом) с IL-15 и/или IL-7. Например, популяцию клеток (например, которую ранее приводили в контакт с антителом против CD25, его фрагментом или CD25-связывающим лигандом) увеличивают в количестве в присутствии IL-15 и/или IL-7.
В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, приводят в контакт с композицией, содержащей полипептид интерлейкина-15 (IL-15), полипептид альфа-рецептора интерлейкина-15 (IL-15Ra) или комбинацию как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, например, hetIL-15, в процессе получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo. В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, приводят в контакт с композицией, содержащей полипептид IL-15, в процессе получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo. В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, приводят в контакт с композицией, содержащей комбинацию как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, в процессе получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo. В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, приводят в контакт с композицией, содержащей hetIL-15, в процессе получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo.
В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, приводят в контакт с композицией, содержащей hetIL-15, в процессе увеличения в количестве ex vivo. В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, приводят в контакт с композицией, содержащей полипептид IL-15, в процессе увеличения в количестве ex vivo. В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, приводят в контакт с композицией, содержащей как полипептид IL-15, так и полипептид IL-15Ra, в процессе увеличения в количестве ex vivo. В одном варианте осуществления приведение в контакт приводит к выживанию и пролиферации субпопуляции лимфоцитов, например, CD8+ T-клеток.
В одном варианте осуществления клетки культивируют (например, увеличивают в количестве, стимулируют и/или трансдуцируют) в среде, содержащей сыворотку. Сыворотка может представлять собой, например, сыворотку AB человека (hAB). В некоторых вариантах осуществления сыворотка hAB присутствует в количестве приблизительно 2%, приблизительно 5%, приблизительно 2-3%, приблизительно 3-4%, приблизительно 4-5% или приблизительно 2-5%. Как показано в примере 15 настоящего изобретения, 2% и 5% сыворотки являются пригодными уровнями, которые позволяют многократное увеличение в количестве T-клеток. Более того, как показано в Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10,1038/cti.2014.31, среда, содержащая 2% сыворотку AB человека, является пригодной для увеличения в количестве T-клеток ex vivo.
T-клетки, подвергнутые воздействию в течение различной длительности периодов стимуляции, могут проявлять различные характеристики. Например, типичная кровь или мононуклеарные клеточные продукты подвергнутой аферезу периферической крови имеют популяцию хелперных T-клеток (TH, CD4+), которая превышает популяцию цитотоксических или супрессорных T-клеток (TC, CD8+). Экспансия T-клеток ex vivo посредством стимуляции рецепторов CD3 и CD28 продуцирует популяцию T-клеток, которая до приблизительно 8-9 суток состоит в основном из TH-клеток, в то время как после 8-9 суток, популяция T-клеток содержит значительно более высокую популяцию TC-клеток. Таким образом, в зависимости от цели лечения, инфузия индивидууму популяции T-клеток, содержащей в основном TH-клетки, может быть преимущественной. Аналогично, если антигенспецифическая подгруппа TC-клеток является выделенной, может быть предпочтительным увеличение в количестве этой подгруппы в большей степени.
Кроме того, в дополнение к маркерам CD4 и CD8, другие фенотипические маркеры значительно варьируются, однако по большей части, являются воспроизводимыми в ходе процесса экспансии клеток. Таким образом, такая воспроизводимость обеспечивает возможность адаптации продукта в виде активированных T-клеток к конкретным целям.
В некоторых вариантах осуществления клетки, трансдуцированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании, можно выбирать для введения на основе, например, уровней одного или нескольких белков из CCL20, GM-CSF, IFNγ, IL-10, IL-13, IL-17a, IL-2, IL-21, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, TNFα и/или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления клетки, трансдуцированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании, можно выбирать для введения на основе, например, уровней экспрессии белков CCL20, IL-17a, IL-6 и их комбинаций.
После конструирования CAR, описанного в настоящем описании, различные анализы можно использовать для оценки активности молекулы, такой как, но не ограничиваясь ими, способность к экспансии T-клеток после стимуляции антигеном, поддержание экспансии T-клеток в отсутствие рестимуляции и активность против злокачественной опухоли в различных моделях in vitro и на животных. Анализы для оценки эффектов CAR против CD19 более подробно описаны ниже.
Анализ с использованием вестерн-блоттинга экспрессии CAR в первичных T-клетках можно использовать для обнаружения присутствия мономеров и димеров, например, как описано в абзаце 695 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Экспансию CAR+ T-клеток in vitro после антигенной стимуляции можно измерять проточной цитометрией. Например, смесь CD4+ и CD8+ T-клеток стимулируют APC αCD3/αCD28 с последующей трансдукцией лентивирусными векторами, экспрессирующими GFP под контролем промоторов, подлежащих анализу. Иллюстративные промоторы включают промоторы гена CMV IE, EF-1α, убиквитина C или фосфоглицерокиназы (PGK). Флуоресценцию GFP оценивают на 6 сутки культивирования в подгруппах CD4+ и/или CD8+ T-клеток с использованием проточной цитометрии. См., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Альтернативно смесь CD4+ и CD8+ T-клеток стимулируют покрытыми αCD3/αCD28 магнитными гранулами на 0 сутки и трансдуцируют посредством CAR на 1 сутки с использованием бицистронного лентивирусного вектора, экспрессирующего CAR вместе с eGFP, с использованием рибосомальной последовательности пропуска 2A. После промывания культуры повторно стимулируют либо клетками K562 с ассоциированным со злокачественной опухолью антигеном, как описано в настоящем описании, (K562-ассоциированный со злокачественной опухолью антиген), либо клетками K562 дикого типа (K562 дикого типа), либо клетками K562, экспрессирующими hCD32 и 4-1BBL, в присутствии антитела против CD3 и антитела против CD28 (K562-BBL-3/28). К культурам раз в двое суток добавляют экзогенный IL-2 в количестве 100 МЕ/мл. GFP+ T-клетки подсчитывают проточной цитометрией с использованием подсчета на основе гранул. См., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).
Также можно измерять длительную экспансию CAR+ T-клеток в отсутствие рестимуляции. См., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). В кратком изложении измеряют средний объем T-клеток (фл) на 8 сутки культивирования с использованием устройства для подсчета частиц Coulter Multisizer III, Nexcelom Cellometer Vision или Millipore Scepter, после стимуляции покрытыми αCD3/αCD28 магнитными гранулами на 0 сутки и трансдукции указанным CAR на 1 сутки.
Также для измерения активности CAR-экспрессирующей клетки (например, T-клетки, NK-клетки) можно использовать модели на животных, например, как описано в абзаце 698 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Дозозависимый ответ на лечение CAR можно оценивать, например, как описано в абзаце 699 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Оценка пролиферации клеток и продукции цитокинов описана ранее, например, в абзаце 700 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В другом варианте осуществления эффективность продукта популяции клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, CAR-экспрессирующих клеток), например, продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), например, клеток CTF019) оценивают с использованием панели цитокинов Fuminex® для определения уровней экспрессии цитокинов. Продукт популяции клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, произведенных CAR-экспрессирующих клеток), например, продукт клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, клеток CTF019) активируют in vitro посредством экспрессирующих CD19 клеток K562 (K562-19), которые имитируют CD19-экспрессирующие В-клетки при CLL. После активации клеток (например, T-клеток, NK-клеток) измеряют профили экспрессии цитокинов в клеточных средах сокультуры и эффективность активированных клеток (например, продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19, например, клеток CTL019) сопоставляют с экспрессией различных цитокинов, включая, но не ограничиваясь ими CCL-20/MIP-3a, GM-CSF, IFNγ, IF-10, IF-13, IF-17a, IF-2, IF-21, IF-4, IF-5, IF-6, IF-9, TNFα и/или их комбинации.
В одном варианте осуществления уровни экспрессии цитокинов являются информативными в отношении эффективности популяции клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, в отношении уничтожения опухолевых клеток). В одном варианте осуществления уровни экспрессии цитокинов, описанных в настоящем описании, используют для улучшения популяции клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, продукта CAR-экспрессирующих клеток, например, продукта клеток, экспрессирующих CAR против CD19, например, клеток CTF019) перед инфузией пациентам. В одном варианте осуществления уровни экспрессии цитокинов, описанных в настоящем описании, обеспечивают конечный результат в процессе оптимизации процесса производства.
Цитотоксичность можно оценивать посредством стандартного анализа высвобождения 51Cr, например, как описано в абзаце 701 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Для оценки специфического транспорта и пролиферации CAR в моделях на животных, имеющих опухоль, можно использовать технологии визуализации, например, как описано в абзаце 702 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Также для оценки CAR, описанных в настоящем описании, можно использовать другие способы анализа, включая способы анализа, описанные в разделе "Примеры" настоящего описания, а также способы анализа, которые известны в данной области.
Альтернативно или в комбинации со способами, описанными в настоящем описании, описаны способы и композиции для одного или нескольких из: обнаружения и/или количественного определения CAR-экспрессирующих клеток (например, in vitro или in vivo (например, клинический мониторинг)); экспансии и/или активации иммунных клеток; и/или CAR-специфической селекции, которые вовлекают применение лиганда CAR. В одном иллюстративном варианте осуществления лиганд CAR представляет собой антитело, которое связывается с молекулой CAR, например, связывается с внеклеточным антигенсвязывающим доменом CAR (например, антитело, которое связывается с антигенсвязывающим доменом, например, антиидиотипическое антитело; или антитело, которое связывается с константной областью внеклеточного связывающего домена). В других вариантах осуществления лиганд CAR представляет собой молекулу антигена CAR (например, молекулу антигена CAR, как описано в настоящем описании).
В одном аспекте описан способ обнаружения и/или количественного определения CAR-экспрессирующих клеток. Например, лиганд CAR можно использовать для обнаружения и/или количественного определения CAR-экспрессирующих клеток in vitro или in vivo (например, клинический мониторинг CAR-экспрессирующих клеток у пациента или дозирование пациенту). Способ включает:
предоставление лиганда CAR (необязательно, меченого лиганда CAR, например, лиганда CAR, который включает метку, гранулу, радиоактивную или флуоресцентную метку);
получение CAR-экспрессирующей клетки (например, получение образца, содержащего CAR-экспрессирующие клетки, как например, производство образца, или клинического образца);
приведение в контакт CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR в условиях, при которых происходит связывание, тем самым осуществляя определение уровня (например, количества) присутствующих CAR-экспрессирующих клеток. Обнаружение связывания CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR можно проводить с использованием стандартных способов, таких как FACS, ELISA и т.п.
В другом аспекте описан способ увеличения в количестве и/или активации клеток (например, иммунных эффекторных клеток). Способ включает:
предоставление CAR-экспрессирующей клетки (например, первой CAR-экспрессирующей клетки или временно экспрессирующей CAR-клетки);
приведение в контакт CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR, например, лигандом CAR, как описано в настоящем описании), в условиях, при которых происходит экспансия и/или пролиферация иммунных клеток, тем самым продуцируя популяцию активированных и/или увеличенных в количестве клеток.
В определенных вариантах осуществления лиганд CAR находится на (например, иммобилизован на или связан с) подложке, например, не встречающейся в природе подложке). В некоторых вариантах осуществления подложка представляет собой неклеточную подложку. Неклеточная подложка может представлять собой твердую подложку, выбранную, например, из планшета (например, микропланшет для титрования), мембраны (например, нитроцеллюлозная мембрана), матрицы, чипа или гранулы. В некоторых вариантах осуществления лиганд CAR находится в подложке (например, на поверхности подложки). Лиганд CAR может быть иммобилизован, присоединен или ковалентно или нековалентно связан (например, сшит) с подложкой. В одном варианте осуществления лиганд CAR связан (например, ковалентно связан) с гранулой. В вышеупомянутых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток можно увеличивать в количестве in vitro или ex vivo. Кроме того, способ может включать культивирование популяции иммунных клеток в присутствии лиганда молекулы CAR, например, с использованием любого из способов, описанных в настоящем описании.
В других вариантах осуществления способ экспансии и/или активации клеток, кроме того, включает добавление второй стимулирующей молекулы, например, CD28. Например, лиганд CAR и вторую стимулирующую молекулу можно иммобилизовывать на подложке, например, одной или нескольких гранулах, тем самым обеспечивая усиленную экспансию и/или активацию клеток.
В другом аспекте, предусматривается способ селекции или экспансии CAR-экспрессирующих клеток. Способ включает приведение в контакт CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR, как описано в настоящем описании; и селекцию клеток на основе связывания лиганда CAR.
В других вариантах осуществления предусматривается способ истощения, снижения уровня и/или уничтожения CAR-экспрессирующих клеток. Способ включает приведение в контакт CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR, как описано в настоящем описании; и нацеливание на клетку на основе связывания лиганда CAR, тем самым, уменьшая количество и/или вызывая гибель CAR-экспрессирующих клеток. В одном варианте осуществления лиганд CAR связан с токсичным средством (например, токсин или разрушающее клетки лекарственное средство). В другом варианте осуществления антиидиотипическое антитело может вызывать активность эффекторных клеток, например, активность ADCC или ADC.
Иллюстративные антитела против CAR, которые можно использовать в способах, описанных в настоящем описании, описаны, например, в WO 2014/190273 и Jena et al., "Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials", PLOS March 2013 8:3 e57838, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
В некоторых аспектах и вариантах осуществления композиции и способы, описанные в настоящем описании, оптимизированы для конкретной подгруппы T-клеток, например, как описано в заявке США с серийным номером № PCT/US2015/043219, поданной 31 июля 2015 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления оптимизированные подгруппы T-клеток проявляют увеличенное персистирование по сравнению с контрольными T-клетками, например, T-клетками другого типа (например, CD8+ или CD4+), экспрессирующими ту же конструкцию.
В некоторых вариантах осуществления CD4+ T-клетка содержит CAR, описанный в настоящем описании, который содержит внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для (например, оптимизированный для, например, обеспечивающий увеличенное персистирование) CD4+ T-клетки, например, домен ICOS. В некоторых вариантах осуществления CD8+ T-клетка содержит CAR, описанный в настоящем описании, который содержит внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для (например, оптимизированный для, например, обеспечивающий увеличенное персистирование) CD8+ T-клетки, например, домен 4-1BB, домен CD28 или другой костимулирующий домен, отличный от домена ICOS. В некоторых вариантах осуществления CAR, описанный в настоящем описании, содержит антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, как например, CAR, содержащий антигенсвязывающий домен.
В одном аспекте в рамках настоящего изобретения описан способ лечения индивидуума, например, индивидуума, имеющего злокачественную опухоль. Способ включает введение указанному индивидууму эффективного количества:
1) CD4+ T-клеток, содержащих CAR (CARCD4+), содержащий:
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании;
трансмембранный домен; и
внутриклеточный сигнальный домен, например, первый костимулирующий домен, например, домен ICOS; и
2) CD8+ T-клеток, содержащих CAR (CARCD8+), содержащий:
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании;
трасмембранный домен; и
внутриклеточный сигнальный домен, например, вторичный костимулирующий домен, например, домен 4-1BB, домен CD28 или другой костимулирующий домен, отличный от домена ICOS; где CARCD4+ и CARCD8+ отличаются друг от друга.
Необязательно, способ, кроме того, включает введение:
3) второй CD8+ T-клетки, содержащей CAR (второй CARCD8+), содержащий:
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании;
трансмембранный домен; и
внутриклеточный сигнальный домен, где второй CARCD8+ содержит внутриклеточный сигнальный домен, например, костимулирующий сигнальный домен, не присутствующий на CARCD8+, и необязательно не содержит сигнальный домен ICOS.
Трансфекция РНК
В рамках настоящего изобретения описаны способы продуцирования транскрибированной in vitro РНК CAR. РНК CAR и способы ее применения описаны, например, в абзацах 553-570 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В одном варианте осуществления транскрибированную in vitro РНК CAR можно вводить в клетку посредством временной трансфекции. РНК может иметь 3ʹ-UTR, 5ʹ-UTR или обе из них. 5ʹ-UTR может содержать последовательность Kozak. РНК может содержать IRES. РНК содержать 5ʹ-кэп. РНК может содержать последовательность поли-A. РНК можно получать с использованием ДНК-матрицы, которая содержит промотор, например, промотор T7, T7 или SP6. РНК можно вводить в клетки-мишени с использованием любого из ряда различных способов, например, коммерчески доступных способов, которые включают, но не ограничиваются ими, электропорацию, Gene Pulser II, Multiporator, опосредуемую катионным липосомами трансфекцию с использованием липофекции, инкапсулирование в полимер, опосредуемую пептидом трансфекцию или биолистические системы доставки частиц, такие как "генные пушки".
Невирусные способы доставки
В некоторых аспектах невирусные способы доставки можно использовать для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в настоящем описании, в клетку, или ткань, или индивидууму. Подходящие невирусные способы доставки включают транспозоны (например, Sleeping Beauty, piggyBac и транспозоны на основе pT2). Иллюстративные невирусные способы доставки и способы их применения описаны, например, в абзацах 571-579 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Способы производства/продуцирования
В одном аспекте способы производства CAR-экспрессирующих клеток согласно изобретению описаны в настоящем описании (например, в разделе "Источник клеток" и "Активация и увеличение в количестве клеток").
В одном варианте осуществления предусматривается способ производства CAR-экспрессирующих клеток. Способ включает:
предоставление препарата CAR-экспрессирующих клеток (например, множество CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток, таких как T-клетки или NK-клетки) (например, клетки, экспрессирующие CAR против CD19, как описано в настоящем описании, например, такие как CTL019);
получение величины уровня (например, определение уровня экспрессии) одного или нескольких генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 с получением профиля экспрессии генов для образца;
(необязательно) сравнение полученного профиля экспрессии генов с исторической записью о профиле экспрессии генов;
определение различий между полученной и исторической экспрессией генов; и
регистрацию определенного отличия в протоколе о контроле качества.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы включают стадии предоставления препарата CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), как описано в настоящем описании, например, таких как CTL019);
определения уровней экспрессии одного или нескольких генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L и KLRG1 с получением профиля экспрессии генов (например, генной сигнатуры) для образца;
сопоставления генной сигнатуры с ответом пациента на терапию CAR-экспрессирующей клеткой (например, T-клеткой, NK-клеткой) (например, клеткой, экспрессирующей CAR против CD19 (например, T-клеткой, NK-клеткой), как описано в настоящем описании, например, такой как CTL019); и
оптимизации препарата CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) на основе сопоставления генной сигнатуры и ответа пациента перед инфузией пациентам.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы включают получение величины уровня (например, определение уровня экспрессии) цитокина, например, одного или нескольких цитокинов, приведенных в таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6) и таблице 17, таблице 18, таблице 20, секретируемого CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) в ответ на распознавание антигена. В одном варианте осуществления предусматриваемые способы включают определение уровней экспрессии одного или нескольких из цитокинов CCL20/MIP3a, IL-17a, IL-6 и/или их комбинаций, секретируемых CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) в ответ на распознавание антигена. В одном варианте осуществления предусматриваемые способы, кроме того, включают включение цитокинов, секретируемых CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), например, одного или нескольких цитокинов, приведенных в таблице 14, таблице 15 и таблице 16, в анализ эффективности. В одном варианте осуществления предусматриваемые способы, кроме того, включают включение цитокинов CCL20/MIP3a, IL-17a, IL-6 и/или их комбинаций, в анализ эффективности.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы включают включение цитокинов, секретируемых CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), например, одного или нескольких цитокинов, приведенных в таблице 14, таблице 15, таблице 16 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6) и таблице 17, в анализ эффективности, и определение того, может ли препарат CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), как описано в настоящем описании, например, таких как CTL019) иметь клинический эффект. В одном варианте осуществления CCL20/MIP3a, IL-17a, IL-6 и/или их комбинации используют в анализе эффективности для определения того, может ли препарат CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), как описано в настоящем описании, например, таких как CTL019) иметь клинический эффект. В одном варианте осуществления предусматриваемые способы, кроме того, включают коррекцию инфузируемой дозы CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) для достижения клинической эффективности.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы включают стадию предоставления образца крови, например, образца T-клеток, от индивидуума, имеющего злокачественную опухоль.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы, кроме того, включают стадию сравнения полученных отличий профиля экспрессии генов с профилем экспрессии генов эталонном образце.
В одном варианте осуществления эталонный образец представляет собой препарат CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, клеток, экспрессирующих CAR против CD19, как описано в настоящем описании, например, таких как CTL019) из отличающейся партии клеток относительно партии для продукции терапевтического препарата CAR-экспрессирующих клеток.
В одном варианте осуществления эталонный образец представляет собой образец от здорового донора с произведенным продуктом CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) (например, клеток, экспрессирующих CAR против CD19, как описано в настоящем описании, например, таких как CTL019). В одном варианте осуществления эталонный образец представляет собой образец здорового донора с произведенным продуктом клеток, экспрессирующих CAR против CD19, например, таким как продукт CTL019.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы, кроме того, включают стадию регистрации результата сравнения в протоколе о контроле качества для препарата терапевтических CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток).
В одном варианте осуществления определенное отличие сравнивают с исторической записью для эталонного образца.
В одном варианте осуществления препарат CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) представляет собой препарат клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, CTL019).
В одном варианте осуществления препарат CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) включает препарат клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, CTL019).
В одном варианте осуществления препарат CAR-экспрессирующих клеток (например, T-клеток, NK-клеток) состоит из препарата клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, CTL019).
В одном аспекте предусматривается способ, включающий:
предоставление образца крови, например, образца T-клеток, от индивидуума, имеющего злокачественную опухоль;
определение уровней экспрессии одного или нескольких генов, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14 (например, CCL20, IL-17a и/или IL-6), таблице 17, таблице 18, таблице 20, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L или KLRG1, с получением профиля экспрессии генов для образца;
сравнение полученного профиля экспрессии генов с эталонной величиной, например, исторической записью об экспрессии генов;
определение отличий между полученной и эталонной величиной; и
регистрации определенного отличия в протоколе о контроле качества.
Способ может включать стадию сравнения полученных отличий в профиле экспрессии генов с эталонным образцом.
В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, кроме того, включают введение средства, истощающего T-клетки, после введения клеток (например, иммунных эффекторных клеток, как описано в настоящем описании), тем самым, снижая уровень (например, истощая) CAR-экспрессирующих клеток (например, клеток, экспрессирующих CAR против CD19). Такие средства, истощающие T-клетки, можно использовать для эффективного истощения CAR-экспрессирующих клеток (например, клеток, экспрессирующих CAR против CD19) для смягчения токсичности. В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки производили способом, описанным в настоящем описании, например, анализировали (например, до или после трансфекции или трансдукции) в соответствии со способом, описанным в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления средство, истощающее T-клетки, вводят через одну, две, три, четыре или пять недель после введения клетки, например, популяции иммунных эффекторных клеток, описанной в настоящем описании.
В одном варианте осуществления средство, истощающее T-клетки, представляет собой средство, которое истощает CAR-экспрессирующие клетки, например, путем индукции антителозависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичности (ADCC) и/или индуцируемой комплементом клеточной гибели. Например, CAR-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем описании, также могут эксрессировать антиген (например, антиген-мишень), который распознается молекулами, способными индуцировать клеточную смерть, например, индуцируемую ADCC или комплементом клеточную смерть. Например, CAR-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем описании, также могут экспрессировать белок-мишень (например, рецептор), на который может быть нацелено антитело или фрагмент антитела. Примеры таких белков-мишеней включают, но не ограничиваются ими, EpCAM, VEGFR, интегрины (например, интегрины α νβЗ, α4, αI3/4β3, α4β7, α5β1, ανβ3, aν), представители суперсемейства рецеторов TNF (например, TRAIL-R1, TRAIL-R2), рецептор PDGF, рецептор интерферона, рецептор фолатов, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, рецептор IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD11, CD11a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/рецептор IgE, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/басигин, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7 и EGFR, и их укороченные версии (например, версии, в которых сохранены один или несколько внеклеточных эпитопов, но которые лишены одной или нескольких областей в цитоплазматическом домене).
В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующая клетка коэкспрессирует CAR и белок-мишень, например, экспрессирует естественным образом белок-мишень или модифицирована способами инженерии для экспрессии белка-мишени. Например, клетка, например, популяция иммунных эффекторных клеток, может включать нуклеиновую кислоту (например, вектор), включающую нуклеиновую кислоту CAR (например, нуклеиновую кислоту CAR, как описано в настоящем описании) и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-мишень.
В одном варианте осуществления истощающее T-клетки средство представляет собой ингибитор CD52, например, молекулу антитела против CD52, например, алемтузумаб.
В других вариантах осуществления клетка, например, популяция иммунных эффекторных клеток, экспрессирует молекулу CAR, как описано в настоящем описании (например, CAR против CD19) и белок-мишень, распознаваемый средством, истощающим T-клетки. В одном варианте осуществления белок-мишень представляет собой CD20. В некоторых вариантах осуществления, в которых белок-мишень представляет собой CD20, истощающее T-клетки средство представляет собой антитело против CD20, например ритуксимаб.
В следующих вариантах осуществления любого из вышеупомянутых способов способы, кроме того, включают трансплантацию клетки, например, гемопоэтической стволовой клетки, или костного мозга млекопитающему.
В другом аспекте изобретение относится к способу адаптации млекопитающего перед трансплантацией клеток. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих нуклеиновую кислоту или полипептид CAR, например, нуклеиновую кислоту или полипептид CAR против CD19. В некоторых вариантах осуществления трансплантация клеток представляет собой трансплантацию стволовых клеток, например, трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток или трансплантацию костного мозга. В других вариантах осуществления адаптация индивидуума перед трансплантацией клеток включает снижение количества экспрессирующих мишень клеток у индивидуума, например, экспрессирующих CD19 нормальных клеток или экспрессирующих CD19 злокачественных клеток.
Конструкции нуклеиновых кислот, кодирующие CAR
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие одну или несколько конструкций CAR, моно вводить в иммунную эффекторную клетку (например, T-клетку), как описано в настоящем описании. В одном аспекте молекулу нуклеиновой кислоты предоставляют в качестве матричной РНК-транскрипта. В одном аспекте молекулу нуклеиновой кислоты предоставляют в качестве конструкции ДНК.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем описании, вводят в клетку, которую анализировали способом, описанным в настоящем описании, например, в которой анализировали один или несколько биомаркеров. В некоторых вариантах осуществления клетку, содержащую нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем описании, анализируют способом, описанным в настоящем описании, например, анализируют один или несколько биомаркеров.
Молекулы нуклеиновых кислот, описанные в настоящем описании, могут представлять собой молекулу ДНК, молекулу РНК или их комбинацию. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой мРНК, кодирующую полипептид CAR, как описано в настоящем описании. В других вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор, который включает любую из вышеупомянутых молекул нуклеиновых кислот.
Молекулы нуклеиновых кислот могут кодировать, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, и они могут содержать, например, последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании, например, в таблице 11, таблице 12 или таблице 13.
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие желаемые молекулы, можно получать с использованием рекомбинантных способов, известных в данной области, например, таких как скрининг библиотек клеток, экспрессирующих ген, получение гена из вектора, о котором известно, что он его включает, или выделение непосредственно из клеток или тканей, содержащих его, с использованием стандартных способов. Альтернативно представляющий интерес ген может получать способами синтеза, а не клонировать.
Также описаны векторы, в которые встроена ДНК по настоящему изобретению. Векторы, происходящие из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для достижения долговременного переноса генов, поскольку они обеспечивают долговременное стабильное встраивание трансгена и его увеличение в количестве в дочерних клетках. Лентивирусные векторы имеют дополнительное преимущество над векторами, происходящими из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мыши, поскольку они могут трансдуцировать непролиферирующие клетки, такие как гепатоциты. Также они имеют дополнительное преимущество, состоящее в низкой иммуногенности. Ретровирусный вектор также может представлять собой, например, гамма-ретровирусный вектор. Гамма-ретровирусный вектор может включать, например, промотор, сигнал упаковывания (ψ), участок связывания праймера (PBS), один или несколько (например, два) длинных концевых повторов (LTR) и представляющий интерес трансген, например, ген, кодирующий CAR. Гамма-ретровирусный вектор может быть лишен структурных генов вируса, таких как gag, pol и env. Иллюстративные гамма-ретровирусные векторы включают вирус лейкоза мышей (MLV), вирус некроза селезенки (SFFV) и вирус миелопролиферативной саркомы (MPSV), и векторы, происходящие из них. Другие гамма-ретровирусные векторы описаны, например, в Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713.
В другом варианте осуществления вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый CAR по изобретению, представляет собой аденовирусный вектор (A5/35). В другом варианте осуществления экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, можно проводить с использованием транспозонов, таких как sleeping beauty, crisper, CAS9 и нуклеазы с цинковыми пальцами. См. ниже June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9,10: 704-716, включенную в настоящее описание в качестве ссылки.
В кратком изложении, экспрессии природных или синтетических нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, обычно достигают путем функционального связывания нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CAR или его части, с промотором, и встраивания конструкции в экспрессирующий вектор. Векторы могут быть пригодными для репликации и встраивания у эукариот. Типичные клонирующие векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации и промотор, пригодные для регуляции экспрессии желаемой последовательности нуклеиновой кислоты.
Экспрессирующие конструкции также можно использовать для иммунизации нуклеиновыми кислотами и генной терапии с использованием стандартных протоколов доставки генов. Способы доставки генов известны в данной области. См., например, патенты США № 5399346, 5580859, 5589466, включенные в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. В другом варианте осуществления изобретение относится к вектору для генной терапии.
Нуклеиновую кислоту можно клонировать в множество типов векторов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включающий, но не ограничивающийся ими, плазмиду, фагмиду, производное фага, вирус животных и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают экспрессирующие векторы, реплицирующиеся векторы, векторы для получения зондов и векторы для секвенирования.
Кроме того, экспрессирующий вектор может быть предоставлен клетке в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна в данной области и описана, например, в Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), и в других справочниках по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые пригодны в качестве векторов, включают, но не ограничиваются ими, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. Как правило, подходящий вектор содержит ориджин репликации, функциональный по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, удобные участки для эндонуклеаз рестрикции, и один или несколько селективных маркеров (например, WO 01/96584; WO 01/29058 и патент США № 6326193).
Был разработан ряд систем на основе вирусов для переноса генов в клетки млекопитающих. Например, ретровирусы обеспечивают удобную платформу для систем доставки генов. Выбранный ген можно встраивать в вектор и упаковывать в ретровирусные частицы с использованием способов, известных в данной области. Затем рекомбинантный вирус можно выделять и доставлять в клетки индивидуума либо in vivo, либо ex vivo. В данной области известен ряд ретровирусных систем. В некоторых вариантах осуществления используют аденовирусные векторы. В данной области известен ряд аденовирусных векторов. В одном варианте осуществления используют лентивирусные векторы.
Дополнительные промоторные элементы, например энхансеры, регулируют частоту инициаций транскрипции. Как правило, они расположены в области на 30-110 п.о. выше участка инициации, хотя было показано, что ряд промоторов также содержат функциональные элементы ниже участка инициации. Спейсер между промоторными элементами часто является гибким, так что промоторная функция сохраняется, когда элементы инвертируются или смещаются друг относительно друга. В промоторе тимидинкиназы (tk) спейсер между промоторными элементами может быть увеличен до 50 п.о. до того, когда активность начнет снижаться. Оказалось, что в зависимости от промотора индивидуальные элементы могут функционировать либо совместно, либо независимо, активируя транскрипцию. Иллюстративные промоторы включают промоторы гена IE CMV, EF-1α, убиквитина C или фосфоглицерокиназы (PGK).
Примером промотора, который способен экпрессировать трансген CAR в T-клетке млекопитающего, является промотор EF1a. Нативный промотор EF1a контролирует экспрессию альфа-субъединицы комплекса фактора элонгации 1, который ответственен за ферментативную доставку аминоацил-тРНК в рибосому. Промотор EF1a широко используют в экспрессирующих плазмидах млекопитающих, и было показано, что он является эффективным для запуска экспрессии CAR с трансгенов, клонированных в лентивирусный вектор. См., например, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). В одном аспекте промотор EF1a содержит последовательность, представленную в качестве SEQ ID NO: 11.
Другим примером промотора является последовательность предраннего промотора цитомегаловируса (CMV). Эта промоторная последовательность представляет собой последовательность мощного конститутивного промотора, способного обеспечивать высокие уровни экспрессии любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ним. Однако также можно использовать другие конститутивные промоторные последовательности, включая, но не ограничиваясь ими, ранний промотор вируса 40 обезьян (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор MoMuLV, промотор вируса лейкоза птиц, предранний промотор вируса Эпштейна-Барр, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, но не ограничиваясь ими, промотор актина, промотор миозина, промотор фактора элонгации 1α, промотор гемоглобина и промотор креатинкиназы. Кроме того, изобретение не ограничивается применением конститутивных промоторов. Также в качестве части изобретения предусматриваются индуцибельные промоторы. Применение индуцибельных промоторов обеспечивает молекулярный переключатель, способный запускать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, когда такая экспрессия желательна, или выключать экспрессию, когда экспрессия является нежелательной. Примеры индуцибельных промоторов включают, но не ограничиваются ими металлотиониновый промотор, гликокортикоидный промотор, прогестероновый промотор и тетрациклиновый промотор.
Другим примером промотора является промотор фосфоглицераткиназы (PGK). В некоторых вариантах осуществления может быть желательным укороченный промотор PGK (например, промотор PGK с одной или несколькими, например, 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 или 400, нуклеотидными делециями по сравнению с промоторной последовательностью PGK дикого типа).
Также вектор может включать, например, сигнальную последовательность для облегчения секреции, сигнал полиаденилирования и терминатор транскрипции (например, из гена бычьего гормона роста (BGH)), элемент, позволяющий эписомальную репликацию и репликацию у прокариот (например, ориджин SV40 и ColE1 или другие, известные в данной области) и/или элемент, позволяющие селекцию (например, ген устойчивости к ампициллину и/или зеоциновый маркер).
Для оценки экспрессии полипептида CAR или его частей экспрессирующий вектор, подлежащий введению в клетку, также может содержать либо ген селективного маркера, либо репортерный ген, или оба из них, для облегчения идентификации и селекции экспрессирующих клеток из популяции клеток, которые намереваются трансфицировать или инфицировать вирусными векторами. В других аспектах селективный маркер может содержаться на отдельном фрагменте ДНК и использоваться в методике сотрансфекции. Как селективные маркеры, так и репортерные гены, могут фланкироваться соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках-хозяевах. Пригодные селективные маркеры включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как neo и т.п.
Репортерные гены используют для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. Репортерные гены описаны, например, в абзаце 599 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В некоторых вариантах осуществления вектор может содержать две или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании, например, CAR против CD19, и второй CAR, например, ингибиторный CAR или CAR, который специфически связывается с антигеном, отличным от CD19. В таких вариантах осуществления две или более последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих CAR, кодируются одной молекулой нуклеиновой кислоты в той же рамке считывания, что и одна полипептидная цепь. В этом аспекте два или более CAR, например, могут быть разделены одним или несколькими участками расщепления пептидов (например, участок ауторасщепления или субстрат для внутриклеточной протеазы). Примеры участков расщепления пептидов включают участки T2A, P2A, E2A или F2A.
Способы введения и экспрессии генов в клетках известны в данной области. В контексте экспрессирующего вектора вектор может быть легко введен в клетку-хозяина, например, клетку млекопитающих, бактерий, дрожжей или насекомых, любым способом, известным в данной области. Например, экспрессирующий вектор можно переносить в клетку-хозяина физическим, химическим или биологическим способами, например, способами, описанными в абзацах 601-603 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В случае, когда используют невирусную систему доставки, иллюстративным носителем для доставки является липосома. Для введения нуклеиновых кислот в клетку (in vitro, ex vivo или in vivo) предусматривается применение липидных составов, и оно описано, например, в абзацах 604-605 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Независимо от способа, использованного для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку-хозяина или иного воздействия на клетку ингибитора по настоящему изобретению, для подтверждения присутствия последовательности рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине можно проводить различные анализы. Такие анализы включают, например, "молекулярно-биологические" анализы, хорошо известные специалистам в данной области, такие как саузерн- и нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; "биохимические" анализы, такие как обнаружение присутствия или отсутствия конкретного пептида, например, иммунологическими способами (ELISA и вестерн-блоттинг), или анализы, описанные в настоящем описании, для идентификации средств, входящих в объем изобретения.
Способы терапии
В одном аспекте изобретение относится к способам лечения заболевания, ассоциированного с экспрессией опухолевого антигена, описанного в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки анализируют способом, описанным в настоящем описании, например, анализируют один или несколько биомаркеров, и клетки вводят индивидууму в качестве части лечения, описанного в настоящем описании. Например, иммунные эффекторные клетки можно вводить в качестве части комбинированной терапии, описанной в настоящем описании.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) путем предоставления индивидууму, нуждающемуся в этом, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), модифицированных способами инженерии для экспрессии CAR. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой В-клеточную злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой ALL (острый лимфобластный лейкоз), CLL (хронический лимфоцитарный лейкоз), DLBCL (диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома), MCL (лимфома из клеток мантийной зоны) или MM (множественная миелома).
В одном аспекте изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) путем предоставления индивидууму, нуждающемуся в этом, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), сконструированных для экспрессии CAR против CD19, где злокачественные клетки экспрессируют CD19. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой В-клеточную злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой ALL (острый лимфобластный лейкоз), CLL (хронический лимфоцитарный лейкоз), DLBCL (диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома), MCL (лимфома из клеток мантийной зоны), лимфома Ходжкина или MM (множественная миелома).
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) путем предоставления индивидууму, нуждающемуся в этом, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), модифицированных способами инженерии для экспрессии CAR против CD22, где злокачественные клетки экспрессируют CD22. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой В-клеточную злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой ALL (острый лимфобластный лейкоз), CLL (хронический лимфоцитарный лейкоз), DLBCL (диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома), MCL (лимфома из клеток мантийной зоны), лимфому Ходжкина или MM (множественная миелома).
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) путем предоставления индивидууму, нуждающемуся в этом, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), модифицированных способами инженерии для экспрессии CAR против CD20, где злокачественные клетки экспрессируют CD20. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой В-клеточную злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой ALL (острый лимфобластный лейкоз), CLL (хронический лимфоцитарный лейкоз), DLBCL (диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома), MCL (лимфома из клеток мантийной зоны), лимфому Ходжкина или MM (множественная миелома).
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) путем предоставления индивидууму, нуждающемуся в этом, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), модифицированных способами инженерии для экспрессии CAR против ROR1, где злокачественные клетки экспрессируют ROR1. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой В-клеточную злокачественную опухоль. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой ALL (острый лимфобластный лейкоз), CLL (хронический лимфоцитарный лейкоз), DLBCL (диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома), MCL (лимфома из клеток мантийной зоны), лимфому Ходжкина или MM (множественная миелома).
Изобретение относится к типу клеточной терапии, где иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки) генетически модифицируют (например, посредством трансдукции лентивирусного вектора) для экспрессии CAR и CAR-экспрессирующую клетку инфузируют реципиенту, нуждающемуся в этом. Инфузированная клетка способна уничтожать опухолевые клетки у реципиента. В отличие от терапии антителами, модифицированные посредством CAR иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки) способны реплицироваться in vivo, что приводит к долговременной персистенции, которая может приводить к длительному контролю опухоли. CAR-экспрессирующие клетки (например, T-клетки или NK-клетки), полученные с использованием лентивирусных векторов, имеют стабильную экспрессию CAR. В различных аспектах иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки), вводимые пациенту, или их потомство, сохраняются у пациента в течение по меньшей мере четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одиннадцати месяцев, двенадцати месяцев, тринадцати месяцев, четырнадцати месяцев, пятнадцати месяцев, шестнадцати месяцев, семнадцати месяцев, восемнадцати месяцев, девятнадцати месяцев, двадцати месяцев, двадцати одного месяца, двадцати двух месяцев, двадцати трех месяцев, двух лет, трех лет, четырех лет или пяти лет после введения T-клеток пациенту.
Также изобретение относится к типу клеточной терапии, в которой иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки) модифицируют, например, посредством РНК, транскрибированной in vitro, для временной экспрессии CAR и CAR-экспрессирующую клетку вводят путем инфузии реципиенту, нуждающемуся в этом. CAR-экспрессирующие клетки (например, T-клетки, NK-клетки), полученные посредством трансдукции РНК CAR (например, путем трансфекции или электропорации), временно экспрессируют РНК CAR в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 суток после трансдукции. Инфуцированная клетка способна уничтожать опухолевые клетки у реципиента. Таким образом, в различных аспектах иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки), вводимые пациенту, персистируют в течение менее чем одного месяца, например, трех недель, двух недель, одной недели, после введения пациенту T-клеток.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) путем предоставления индивидууму, нуждающемуся в этом, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), модифицированных способами инженерии для экспрессии CAR, например, CAR, описанного в настоящем описании.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) путем предоставления индивидууму, нуждающемуся в этом, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), модифицированных способами инженерии для экспрессии CAR, который специфически нацелен или связывается с опухолевым антигеном (или ассоциированным со злокачественной опухолью антигеном), описанным в настоящем описании, где индивидуум идентифицирован как отвечающий или частично отвечающий индивидуум. В других вариантах осуществления способы предусматривают лечение злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL) у частично отвечающего индивидуума или не отвечающего индивидуума путем предоставления индивидууму терапии злокачественной опухоли, отличной от терапии CAR, например, путем предоставления индивидууму лечения, которое является стандартным для конкретного типа злокачественной опухоли. В другом варианте осуществления способ лечения включает изменение производства CAR-экспрессирующих клеток для увеличения в количестве наивных T-клеток, например, как описано в настоящем описании, для индивидуума, идентифицированного как частично отвечающий или не отвечающий индивидуум, перед введением CAR-экспрессирующей клетки, например, CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании.
В одном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки) модифицируют способами инженерии для экспрессии CAR против CD19 для лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL), где злокачественные клетки экспрессируют CD19. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль, подлежащая лечению, представляет собой ALL или CLL. Молекулы CAR против CD19, подлежащие экспрессии в иммунной эффекторной клетке, могут содержать любой антигенсвязывающий домен против CD19, известный в данной области (например, антигенсвязывающие домены, представленные в таблице 12) в комбинации с любым доменом CAR, описанным в настоящем описании, для получения полной конструкции CAR. Например, полная конструкция CAR представляет собой CAR, приведенный в таблице 13. В таблице 13 предоставлены иллюстративные полные конструкции CAR против CD19, полученные с использованием различных доменов CAR (например, трансмембранный и внутриклеточный сигнальный домены), приведенных в таблице 12, и антигенсвязывающих доменов против CD19, приведенных в таблице 12. Аминокислотные последовательности обозначают (а.к.) и последовательности нуклеиновых кислот обозначают (nt).
Таблица 13. Конструкции CAR против CD19
Название | Последовательность |
CAR 1 | |
104875 CAR 1 - полная - nt |
|
104875 CAR 1 - полная - а.к. |
|
CAR 2 | |
104876 CAR 2 - полная - nt |
|
104876 CAR 2 - полная - а.к. |
|
CAR3 | |
104877 CAR3- полная - nt |
|
104877 CAR3 - полная - а.к. |
|
CAR 4 | |
104878 CAR 4 - полная - nt |
|
104878 CAR 4 - полная - а.к. |
|
CAR 5 | |
CAR5 scFv-домен | |
104879 CAR 5 - полная - nt |
|
104879 CAR 5 - полная - а.к. |
|
CAR 6 | |
104880 CAR6 - полная - nt |
|
104880 CAR6 - полная - а.к. | |
CAR 7 | |
104881 CAR 7 полная - nt |
|
104881 CAR 7 полная - а.к. | |
CAR 8 | |
104882 CAR 8 - полная - nt | |
104882 CAR 8- полная - а.к. |
|
CAR 9 | |
105974 CAR 9 - полная - nt |
|
105974 CAR 9 - полная - а.к. |
|
CAR10 | |
105975 CAR 10 полная - nt | |
105975 CAR 10 полная - а.к. |
|
CAR11 | |
105976 CAR 11 полная - nt | |
105976 CAR 11 полная - а.к. |
|
CAR12 | |
105977 CAR 12 - полная - nt |
|
105977 CAR 12 - полная - а.к. |
|
CTL019 | |
CTL019 полная - nt |
|
CTL019 полная - а.к. |
Ассоциированные с CD19 заболевания и/или нарушения
В одном аспекте изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли, например, злокачественной опухоли, ассоциированной с экспрессией CD19, посредством терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками). Иллюстративные злокачественные опухоли включают, но не ограничиваются ими, например, один или несколько острых лейкозов, включая, но не ограничиваясь ими, например, В-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз ("B-ALL"), T-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз ("T-ALL"), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL); один или несколько хронических лейкозов, включая, но не ограничиваясь ими, например, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). Дополнительные злокачественные опухоли или гематологические состояния, ассоциированные с экспрессией CD19, включают, но не ограничиваются ими, например, В-клеточный промиелоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема, и "предлейкоз", который представляет собой многообразную группу гематологических состояний, объединенных неэффективной продукцией (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и т.п. Кроме того, заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, включает, но не ограничиваясь ими, например, атипичные и/или неклассические злокачественные опухоли, новообразования, предзлокачественные состояния или пролиферативные заболевания, ассоциированные с экспрессией CD19.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения CLL.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способам лечения ALL.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способам лечения В-клеточного ALL.
В одном аспекте изобретение относится к способам лечения отвечающего индивидуума (например, полностью отвечающего и частично отвечающего индивидуума), имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL) CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, клетками, экспрессирующими CAR против CD19 (например, T-клетки, NK-клетки), как описано в настоящем описании, например, такими как CTL019). В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения отвечающего индивидуума (например, полностью отвечающего и частично отвечающего индивидуума) CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) в комбинации с другим лекарственным средством, например, другим лекарственным средством, описанным в настоящем описании (например, другим CAR, например, другим CAR, описанным в настоящем описании, ингибиторный CAR, например, ингибиторным CAR, описанным в настоящем описании, ингибитором киназы (например, ингибитором киназы, описанным в настоящем описании, например, ингибитором mTOR, ингибитором ВТК), ингибитором точки контроля, например, ингибитором точки контроля, описанным в настоящем описании, стандартной терапией и т.п.). Комбинация может представлять собой, например, комбинацию с любым средством, описанным в настоящем описании. В одном варианте осуществления после лечения CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), например, первоначального лечения CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), частично отвечающего индивидуума исследуют любым из способов, описанных в настоящем описании, например, таким как исследование сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), и, если статус не изменился и/или ухудшился, например, до не отвечающего индивидуума, тогда индивидууму проводят альтернативную терапию, например, стандартную терапию конкретной злокачественной опухоли.
В одном аспекте изобретение относится к способам лечения не отвечающего индивидуума, имеющего злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL) CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, клетками, экспрессирующими CAR против CD19 (например, T-клетками, NK-клетками), как описано в настоящем описании, например, такими как CTL019). В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения не отвечающего индивидуума CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) в комбинации с другим лекарственным средством, например, другим лекарственным средством, описанным в настоящем описании (например, другим CAR, например, другим CAR, описанным в настоящем описании, ингибиторным CAR, например, ингибиторным CAR, описанным в настоящем описании, ингибитором киназы (например, ингибитором киназы, описанным в настоящем описании, например, ингибитором mTOR, ингибитором ВТК), ингибитором точки контроля, например, ингибитором точки контроля, описанным в настоящем описании, стандартной терапией и т.д.). Комбинация может представлять собой, например, комбинацию с любым средством, описанным в настоящем описании. В одном варианте осуществления после лечения CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), например, первоначального лечения CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками), не отвечающего индивидуума исследуют любым из способов, описанных в настоящем описании, например, таким как исследование сигнатуры набора генов клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), и, если статус изменился и/или улучшился, например, до частично отвечающего индивидуума, например, полностью отвечающего индивидуума, тогда индивидууму проводят альтернативную терапию, описанную в настоящем описании.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL или CLL), включающим стадии: (1) идентификации частично отвечающего индивидуума и/или не отвечающего индивидуума, (2) введения частично отвечающему индивидууму и/или не отвечающему индивидууму ингибитора mTOR, описанного в настоящем описании, например, такого как RAD001 и рапамицин, например, в дозе и/или по схеме дозирования, описанной в настоящем описании; и (3) введения CAR (например, CAR против CD19, описанного в настоящем описании, например, такого как CTL019), например, после введения ингибитора mTOR, таким образом, осуществляя лечение злокачественной опухоли. В одном варианте осуществления способ, кроме того, включает введение ингибитора mTOR и/или CAR в комбинации с одним или несколькими ингибиторами точки контроля, описанными в настоящем описании, например, такими как ингибитор PD1.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL или CLL), включающим стадии: (1) идентификации частично отвечающего индивидуума (например, пациента) и/или не отвечающего индивидуума (например, пациента), (2) увеличения в количестве популяции T-клеток у частично отвечающего индивидуума и/или не отвечающего индивидуума путем селекции популяции менее истощенных и/или более наивных T-клеток, (3) введения (например, посредством трансформации, трансдукции, инфицирования, электропорации и т.д.) CAR (например, CAR против CD19, описанного в настоящем описании, например, такого как CTL019) в указанную увеличенную в количестве популяцию T-клеток, таким образом, трансформируя популяцию T-клеток индивидуума; и (4) введения популяции CAR-экспрессирующих T-клеток частично отвечающему индивидууму и/или не отвечающему индивидууму, таким образом, осуществляя лечение злокачественной опухоли.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL или CLL), включающим стадии: (1) идентификации частично отвечающего индивидуума (например, пациента) и/или не отвечающего индивидуума (например, пациента), (2) повторной оценки частично отвечающего индивидуума и/или не отвечающего индивидуума (например, пациента) в более поздний период времени в отношении наивных T-клеток и/или менее истощенного фенотипа, и (3), например, если индивидуум имеет увеличение количества наивных T-клеток и/или менее истощенный фенотип, проведения терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, T-клетками, NK-клетками) (например, клетками, экспрессирующими CAR против CD19 (например, T-клетками, NK-клетками), как описано в настоящем описании, например, такими как CTL019), таким образом, осуществляя лечение злокачественной опухоли. В одном варианте осуществления более поздний период времени включает по меньшей мере 1 час, по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 3 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 7 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 9 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 11 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере 1 неделю, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 1 год, по меньшей мере 2 года, по меньшей мере 3 года, по меньшей мере 4 года, по меньшей мере 5 лет, по меньшей мере 6 лет, по меньшей мере 7 лет, по меньшей мере 8 лет, по меньшей мере 9 лет, по меньшей мере 10 лет или 11 лет или более.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL или CLL), включающим стадии (1) идентификации частично отвечающих и/или не отвечающих индивидуумов; и (2) лечения альтернативной терапией, например, стандартной терапией конкретной злокачественной опухоли (например, стандартной терапией ALL или CLL). В одном варианте осуществления частично отвечающего индивидуума лечат только стандартной терапией (например, стандартной терапией злокачественной опухоли, такой как ALL или CLL) в отсутствие лечения CAR. В одном варианте осуществления не отвечающего индивидуума лечат только стандартной терапией (например, стандартной терапией гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL или CLL) в отсутствие лечения CAR.
В одном варианте осуществления стандартное лечение CLL включает, но не ограничивается ими, иллюстративные способы терапии, описанные в настоящем описании, например, описанные в таблице A, и их комбинации.
Таблица A: Иллюстративные способы терапии CLL
Первая линия, ≥ 70 лет с сопутствующими заболеваниями | Без del (11q) или del (17p) | Del (17p) | Del (11q) |
Обинутузумаб+хлорамбуцил | X | X | X |
Ритуксан+хлорамбуцил | X | X | |
Ритуксан | X | ||
Хлорамбуцил | X | ||
Флударабин±ритуксан | X | X | |
Кладрибин | X | ||
Бендамустин±ритуксан | X | X | |
ПЦР (пентостатин, циклофосфамид, ритуксан) | X | X | |
Первая линия, < 70 лет без значительных сопутствующих заболеваний | |||
FCR (флударабин, циклофосфамид, ритуксан) | X | X | X |
FR (флударабин, ритуксан) | X | X | |
ПЦР | X | X | |
Бендамустин±ритуксан | X | X | |
Обинутузумаб+хлорамбуцил | X | X | X |
Вторая линия - рецидивирующие/рефрактерные ≥ 70 лет | |||
Имбрувика | X | X | X |
Сниженная доза FCR | X | X | |
Сниженная доза PCRR | X | X | |
Бендамустин±ритуксан | X | X | |
Офатумумаб | X | X | X |
Алемутузумаб+ритуксан | X | X | X |
Высокая доза метилпреднизона (HDMP)+ритуксимаб | X | X | X |
Леналидомид+ритуксан | X | X | X |
Ритуксимаб с частым введением дозы | X | X | |
Вторая линия - рецидивирующие/рефрактерные < 70 лет без значительных сопутствующих заболеваний | |||
Имбрувика | X | X | X |
LCR (флударабин, циклофосфамид, ритуксан) | X | X | |
ПЦР | X | X | |
Бендамустин±ритуксан | X | X | |
Флударабин+алемтузумаб | X | X | |
R-CHOP (ритуксан, циклофосфамид, дозорубицин, винкристин, преднизон) | X | X | X |
Офатумумаб | X | X | X |
OFAR (оксалиплатин, флудара, цитарабин, ритуксан) | X | X | X |
HDMP+ритуксимаб | X | X | X |
Леналидомид+ритуксан | X | X | X |
В одном варианте осуществления стандартная терапия CLL включает (1) лучевую терапию, (2) химиотерапию, (3) хирургическую операцию (например, удаление селезенки), (4) направленную терапию, (5) трансплантацию стволовых клеток или их комбинации. В одном варианте осуществления стандартная терапия включает внешнюю лучевую терапию. В одном варианте осуществления стандартная терапия включает внутреннюю лучевую терапию (например, радиоактивное вещество, запаянное в иглах, проводах и катетерах, например, которые помещают непосредственно в или вблизи злокачественной опухоли).
В одном варианте осуществления стандартная терапия ALL включает, но не ограничивается ими, иллюстративные способы терапии, описанные в настоящем описании, например, описанные в таблице B, и их комбинации.
Таблица B: Иллюстративные способы терапии ALL
Первая линия |
RCHOP (ритуксан, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизон) |
RCHOP 14 с частым введением дозы (категория 3) |
EPOCH (этопозид, преднизон, винкристин, циклофосфамид, доксорубицин) со скорректированной дозой+ритуксан |
Терапия первой линии для индивидуумов с плохой или очень неустойчивой функцией левого желудочка |
RCEPP (ритуксимаб, циклофосфамид, этопозид, преднизон, прокарбазин) |
RCEOP (ритуксимаб, циклофосфамид, этопозид, винкристин, преднизон) |
RCNOP (ритуксимаб, циклофосфамид, митоксантрон, винкристин, преднизон) |
RCEOP (ритуксимаб, циклофосфамид, этопозид, винкристин, преднизон) |
EPOCH (этопозид, преднизон, винкристин, циклофосфамид, доксорубицин) со скорректированной дозой+ритуксан |
Вторая линия - переход на спасательную терапию высокой дозой аутологичных стволовых клеток |
DHAP (дексаметазон, цисплатин, цитарабин)±ритуксан |
ESHAP (этопозид, метилпреднизолон, цитарабин, цисплатин) ± ритуксан |
GDP (гемцитабин, дексаметазон, цисплатин)±ритуксан |
GemOx (гемцитабин, оксалиплатин)±ритуксан |
ICE (ифосфамид, карбоплатин, этопозид)+ритуксан |
MINE (месна, ифосфамид, митоксантрон, этопозид)±ритуксан |
Терапия второй линии (не кандидаты для терапии в высокой дозе) |
CEPP (циклофосфамид, этопозид, преднизон, прокарбазин)±ритуксан |
CEOP (циклофосфамид, этопозид, винкристин, преднизон)±ритуксан |
DA-EPOCH±ритуксан |
Ревлимид±ритуксан |
Ритуксан |
GemOx±ритуксан |
GDP±ритуксан |
Бендамустин+ритуксан |
В одном варианте осуществления стандартное лечение ALL включает (1) химиотерапию, (2) лучевую терапию, (3) трансплантацию стволовых клеток, (4) биологическую терапию, (5) направленную терапию и их комбинации.
В одном варианте осуществления стандартная терапия включает, но не ограничивается ими, флударабин с циклофосфамидом (FC); флударабин с ритуксимабом (FR); флударабин, циклофосфамид и ритуксимаб (FCR); циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон (CHOP) и их комбинации. Основные химиотерапевтические средства, предусматриваемые для применения, включают, но не ограничиваются ими, анастрозол (Arimidex®), бикалутамид (Casodex®), блеомицин сульфат (Blenoxane®), бусульфан (Myleran®), бусульфан инъекционный (Busulfex®), капецитабин (Xeloda®), N4-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (Paraplatin®), кармустин (BiCNU®), хлорамбуцил (Leukeran®), цисплатин (Platinol®), кладрибин (Leustatin®), циклофосфамид (Cytoxan® или Neosar®), цитарабин, цитозин арабинозид (Cytosar-U®), инъекционный липосомальный цитарабин (DepoCyt®), дакарбазин (DTIC-Dome®), дактиномицин (актиномицин D, космеган), даунорубицин гидрохлорид (Cerubidine®), инъекционный липосомальный даунорубицина цитрат (DaunoXome®), дексаметазон, доцетаксел (Taxotere®), доксорубицина гидрохлорид (Adriamycin®, Rubex®), этопозид (Vepesid®), флударабина фосфат (Fludara®), 5-фторурацил (Adrucil®, Efudex®), флутамид (Eulexin®), тезацитибин, гемцитабин (дифтордезоксицитидин), гидроксимочевину (Hydrea®), идарубицин (Idamycin®), ифосфамид (IFEX®), иринотекан (Camptosar®), L-аспарагиназу (ELSPAR®), лейковорин кальций, мелфалан (Alkeran®), 6-меркаптопурин (Purinethol®), метотрексат (Folex®), митоксантрон (Novantrone®), милотарг, паклитаксел (Taxol®), феникс (иттрий-90/MX-DTPA), пентостатин, имплантат полифепросана 20 с кармустином (Gliadel®), тамоксифена цитрат (Nolvadex®), тенипозид (Vumon®), 6-тиогуанин, тиотепу, тирапазамин (Tirazone®), топотекана гидрохлорид для инъекций (Hycamptin®), винбластин (Velban®), винкристин (Oncovin®), и винорелбин (Navelbine®) и их комбинации.
В одном варианте осуществления химиотерапия включает антиметаболит, включающий, но не ограничивающийся ими, антагонисты фолиевой кислоты (также называемые в настоящем описании антифолатами), аналоги пиримидинов, аналоги пуринов и ингибиторы дезаминазы: метотрексат (Rheumatrex®, Trexall®), 5-фторурацил (Adrucil®, Efudex®, Fluoroplex®), флоксуридин (FUDF®), цитарабин (Cytosar-U®, Tarabine PFS), 6-меркаптопурин (Puri-Nethol®)), 6-тиогуанин (Thioguanin Tabloid®), флударабина фосфат (Fludara®), пентостатин (Nipent®), пеметрексед (Alimta®), ралтитрексед (Tomudex®), кладрибин (Leustatin®), клофарабин (Clofarex®, Clolar®), цитарабин липосомальный (также известный как липосомальный Ara-C, DepoCytTM); децитабин (Dacogen®); гидроксимочевина (Hydrea®, DroxiaTM и MylocelTM); меркаптопурин (Puri-Nethol®), пралатрексат (FolotynTM). капецитабин (Xeloda®), неларабин (Arranon®), азацитидин (Vidaza®) и гемцитабин (Gemzar®). Подходящие антиметаболиты включают, например, 5-фторурацил (Adrucil®, Efudex®, Fluoroplex®), флоксуридин (FUDF®), капецитабин (Xeloda®), пеметрексед (Alimta®), ралтитрексед (Tomudex®) и гемцитабин (Gemzar®), и их комбинации. В одном варианте осуществления аналог пурина представляет собой флударабин.
В одном варианте осуществления химиотерапия включает алкилирующее средство, включающее, но не ограничивающееся ими, азотистые иприты, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевину и триазены: урацил мустард (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), хлорметин (Mustargen®), циклофосфамид (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, RevimmuneTM), ифосфамид (Mitoxana®), мелфалан (Alkeran®), хлорамбуцил (Leukeran®), пипоброман (Amedel®, Vercyte®), триэтиленмеламин (Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), триэтилентиофосфорамин, темозоломид (Temodar®), тиотепу (Thioplex®), бусульфан (Busilvex®, Myleran®), кармустин (BiCNU®), ломустин (CeeNU®), стрептозоцин (Zanosar®) и дакарбазин (DTIC-Dome®) и их комбинации. Дополнительные иллюстративные алкилирующие средства включают, но не ограничиваются ими, оксалиплатин (Eloxatin®); темозоломид (Temodar® и Temodal®); дактиномицин (также известный как актиномицин-D, Cosmegen®); мелфалан (также известный как L-PAM, L-сарколизин и фенилаланин мустард, Alkeran®); алтретамин (также известный как гексаметилмеламин (HMM), Hexalen®); кармустин (BiCNU®); бендамустин (Treanda®); бусульфан (Busulfex® и Myleran®); карбоплатин (Paraplatin®); ломустин (также известный как CCNU, CeeNU®); цисплатин (также известный как CDDP, Platinol® и Platinol®-AQ); хлорамбуцил (Leukeran®); циклофосфамид (Cytoxan® и Neosar®); дакарбазин (также известный как DTIC, DIC и имидазол карбоксамид, DTIC-Dome®); алтретамин (также известный как гексаметилмеламин (HMM), Hexalen®); ифосфамид (Ifex®); преднумустин; прокарбазин (Matulane®); мехлорэтамин (также известный как азотистый иприт, мустин и мехлорэтамин гидрохлорид, Mustargen®); стрептозоцин (Zanosar®); тиотепу (также известную как тиофосфоамид, TESPA и TSPA, Thioplex®); циклофосфамид (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®), бендамустин HCl (Treanda®) и их комбинации. В одном варианте осуществления алкилирующее средство представляет собой циклофосфамид.
В одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой ингибитор киназы, например, ингибитор тирозинкиназы, включающий, но не ограничивающийся ими, эрлотиниба гидрохлорид (Tarceva®); линифаниб (N-[4-(3-амино-1H-индазол-4-ил)фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина, также известная как ABT 869, доступная от Genentech); сунитиниба малат (Sutent®); босутиниб (4-[(2,4-дихлор-5-метоксифенил)амино]-6-метокси-7-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропокси]хинолин-3-карбонитрил, также известный как SKI-606 и описанный в патенте США № 6780996); дасатиниб (Sprycel®); пазопаниб (Votrient®); сорафениб (Nexavar®); зактиму (ZD6474); и иматиниб или иматиниба мезилат (Gilvec® и Gleevec®). В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор ВТК, выбранный из ибрутиниба (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM- 71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774 и LFM-A13. В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор CDK4, выбранный из алоизина A; флавопиридола или HMR-1275, 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-[(3S,4R)-3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил]-4-хроменон; кризотиниб (PF-02341066; 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-[(2R,3S)-2-(гидроксиметил)-1-метил-3-пирролидинил]-4H-1-бензопиран-4-она гидрохлорид (P276-00); 1-метил-5-[[2-[5-(трифторметил)-1H-имидазол-2-ил]-4-пиридинил]окси]-A-[4-(трифторметил)фенил]-1H-бензимидазол-2-амин (RAF265); индисулам (E7070); росковитин (CYC202); пальбоциклиб (PD0332991); динациклиб (SCH727965); N-[5-[[(5-трет-бутилоксазол-2-ил)метил]тио]тиазол-2-ил]пиперидин-4-карбоксамид (BMS 387032); 4-[[9-хлор-7-(2,6-дифторфенил)-5H-пиримидо[5,4-d][2]бензазепин-2-ил]амино]бензойную кислоту (MLN8054); 5-[3-(4,6-дифтор-1H-бензимидазол-2-ил)-1H-индазол-5-ил]-N-этил-4-метил-3-пиридинметанамин (AG-024322); 4-(2,6-дихлорбензоиламино)-1H-пиразол-3-карбоновой кислоты N-(пиперидин-4-ил)амид (AT7519); 4-[2-метил-1-(1-метилэтил)-1H-имидазол-5-ил]-N-[4-(метилсульфонил)фенил]-2-пиримидинамин (AZD5438); и XL281 (BMS908662). В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор MNK, выбранный из CGP052088; 4-амино-3-(п-фторфениламино)пиразолo[3,4-d]пиримидин (CGP57380); церкоспорамид; ETC-1780445-2 и 4-амино-5-(4-фторанилино)пиразолo[3,4-d]пиримидин.
В одном варианте осуществления направленная терапия включает, но не ограничивается ими, антитело против CD20 или его функциональный фрагмент, например, такой как ритуксимаб (Rituxan® и MabThera®); тозитумомаб (Bexxar®); и офатумумаб (Arzerra®) и их комбинации. В одном варианте осуществления направленная терапия включает, но не ограничивается ими, антитело против CD52 или его функциональный фрагмент, например, такое как алемтузумаб (Campath®).
В одном варианте осуществления биологическая терапия включает иммунотерапию. Иллюстративные антрациклины включают, но не ограничиваются ими, доксорубицин (Adriamycin® и Rubex®); блеомицин (lenoxane®); даунорубицин (даунорубицина гидрохлорид, дауномицин и рубидомицина гидрохлорид, Cerubidine®); даунорубицин липосомальный (липосомы даунорубицина цитрата, DaunoXome®); митоксантрон (DHAD, Novantrone®); эпирубицин (EllenceTM); идарубицин (Idamycin®, Idamycin PFS®); митомицин С (Mutamycin®); гелданамицин; гербимицин; равидомицин; дезацетилравидомицин и их комбинации.
В одном варианте осуществления трансплантация стволовых клеток включает трансплантацию аутогенных стволовых клеток. В одном варианте осуществления трансплантация стволовых клеток включает трансплантацию аллогенных стволовых клеток. В одном варианте осуществления трансплантация стволовых клеток включает аллогенную трансплантацию костного мозга. В одном варианте осуществления трансплантация стволовых клеток включает трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (HSCT). В одном варианте осуществления гемопоэтические стволовые клетки происходят из различных тканей, включая, но не ограничиваясь ими, костный мозг, периферическую кровь, пуповинную кровь и их комбинации.
В одном варианте осуществления предусматриваемые способы включают определение того, идентифицируется ли индивидуум как имеющий статистически значимое отличие в уровне экспрессии одного или нескольких маркеров, приведенных в таблице 1A, таблице 1B, таблице 7A, таблице 7B, таблице 8, таблице 9, таблице 10, таблице 14, таблице 15 и таблице 16, или биомаркера PD-1, биомаркера LAG-3, биомаркера TIM-3, биомаркера CD57, биомаркера CD27, биомаркера CD122, биомаркера CD62L и биомаркера KLRG1, относительно эталонного уровня, и введение индивидууму терапевтически эффективной дозы CAR-экспрессирующей клетки, например, T-клетки или NK-клетки. В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка (например, T-клетка, NK-клетка) представляет собой клетку, экспрессирующую CAR против CD19 (например, T-клетку, NK-клетку), описанную в настоящем описании, например, такую как CTL019.
В одном аспекте изобретение относится к способам лечения заболевания, ассоциированного с экспрессией CD19. В одном аспекте изобретение относится к способам лечения заболевания, где часть опухоли является отрицательной по CD19 и часть опухоли является положительной по CD19. Например, предусматриваемые способы являются пригодными для лечения индивидуумов, которым проводили терапию заболевания, ассоциированного с повышенной экспрессией CD19, где индивидуум, которому проводили лечение против повышенных уровней CD19, демонстрирует заболевание, ассоциированное с повышенными уровнями CD19.
В одном аспекте предусматриваемые способы включают вектор, содержащий CAR против CD19, функционально связанный с промотором, для экспрессии в клетках млекопитающих (например, T-клетках или NK-клетках). В одном аспекте предусматриваемые способы включают рекомбинантную клетку (например, T-клетку или NK-клетку), экспрессирующую CAR против CD19, для применения для лечения опухолей, экспрессирующих CD19, где рекомбинантную T-клетку, экспрессирующую CAR против CD19, называют клеткой, экспрессирующей CAR против CD19. В одном аспекте клетка, экспрессирующая CAR против CD19 (например, T-клетка, NK-клетка), вводимая согласно описанным способам, способна приводить в контакт опухолевую клетку по меньшей мере с одним CAR против CD19, экспрессируемым на ее поверхности, так что CAR-экспрессирующая клетка нацеливается на опухолевую клетку и происходит ингибирование роста опухоли.
В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста опухолевой клетки, экспрессирующей CD19, включающему приведение в контакт опухолевой клетки с клеткой, экспрессирующей CAR против CD19 (например, T-клеткой, NK-клеткой), описанной в настоящем описании, так что CAR-экспрессирующая клетка активируется в ответ на антиген и нацеливается на злокачественную опухоль, где происходит ингибирование роста опухоли.
В одном аспекте изобретение относится к типу клеточной терапии, где T-клетки генетически модифицированы для экспрессии CAR и CAR-экспрессирующую клетку (например, T-клетку, NK-клетку) вводят путем инфузии реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная путем инфузии клетка способна уничтожать опухолевые клетки реципиента. В отличие от антительной терапии, модифицированные посредством CAR клетки (например, T-клетки или NK-клетки) способны реплицироваться in vivo, что приводит к длительной персистенции, которая может приводить к длительному контролю опухоли. В различных аспектах клетки, вводимые пациенту, или их потомство, персистируют у пациента в течение по меньшей мере четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одиннадцати месяцев, двенадцати месяцев, тринадцати месяцев, четырнадцати месяцев, пятнадцати месяцев, шестнадцати месяцев, семнадцати месяцев, восемнадцати месяцев, девятнадцати месяцев, двадцати месяцев, двадцати одного месяца, двадцати двух месяцев, двадцати трех месяцев, двух лет, трех лет, четырех лет или пяти лет после введения клетки пациенту.
Также изобретение относится к типу клеточной терапии, где клетки (например, T-клетки, NK-клетки) модифицированы, например, транскрибированной in vitro РНК, для временной экспрессии химерного рецептора антигена (CAR), и CAR-экспрессирующую клетку (например, T-клетку, NK-клетку) вводят путем инфузии реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная путем инфузии клетка способна уничтожать опухолевые клетки реципиента. Таким образом, в различных аспектах клетки, введенные пациенту, сохраняются в течение менее чем одного месяца, например, трех недель, двух недель, одной недели после введения клеток (например, T-клеток, NK-клеток) пациенту.
Без связи с какой-либо конкретной теорией, иммунный ответ против опухолевых клеток, индуцируемый модифицированными посредством CAR клетками (например, T-клетками, NK-клетками), может представлять собой активный или пассивный иммунный ответ или альтернативно может быть следствием прямого относительно непрямого иммунного ответа. В одном аспекте трансдуцированные CAR T-клетки проявляют специфическую секрецию провоспалительных цитокинов и мощную цитолитическую активность в ответ на злокачественные клетки человека, экспрессирующие CD19, выдерживают ингибирование растворимым CD19 и опосредуют неспецифический цитолиз и опосредуют регрессию развернутой опухоли человека. Например, опухолевые клетки без антигена в гетерогенной области экспрессирующей CD19 опухоли могут быть чувствительными к непрямому разрушению перенацеленных на CD19 T-клеток, которые ранее реагировали с соседними положительными по антигену злокачественными клетками.
В одном аспекте полностью человеческие модифицированные посредством CAR клетки (например, T-клетки, NK-клетки), описанные в настоящем описании, могут представлять собой тип вакцины для иммунизации ex vivo и/или терапии in vivo у млекопитающего. В одном аспекте млекопитающим является человек.
Что касается иммунизации ex vivo, по меньшей мере одно из следующих событий происходит in vitro перед введением клетку в млекопитающего: i) увеличение клеток в количестве, ii) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в клетки или iii) криоконсервация клеток.
Методики ex vivo хорошо известны в данной области и более подробно рассмотрены ниже. В кратком изложении, выделяют клетки индивидуума (например, человека) и генетически модифицируют (т.е. трансдуцируют или трансфицируют in vitro) вектором, экспрессирующим CAR, описанный в настоящем описании. Модифицированную посредством CAR клетку можно вводить реципиенту-млекопитающему для обеспечения терапевтической пользы. Реципиент-млекопитающее может представлять собой человека и модифицированная посредством CAR клетка может быть аутологичной для реципиента. Альтернативно клетки могут быть аллогенными, сингенными или ксеногенными в отношении реципиента.
Гематологическая злокачественная опухоль
Гематологические злокачественные состояния представляют собой типы злокачественной опухоли, такие как лейкоз, лимфома и злокачественные лимфоролиферативные состояния, которые поражают кровь, костный мозг и лимфатическую систему.
Лейкоз можно подразделить на острый лейкоз и хронический лейкоз. Острый лейкоз можно далее подразделить на острый миелогенный лейкоз (AML) и острый лимфоидный лейкоз (ALL). Хронический лейкоз включает хронический миелогенный лейкоз (CML) и хронический лимфоидный лейкоз (CLL). Другие родственные состояния включают миелодиспластические синдромы (MDS, ранее известный как "предлейкоз"), которые представляют собой многообразную совокупность гематологических состояний, объединенных неэффективной продукцией (или дисплазией) миелоидных клеток крови и риском трансформации в AML.
Лимфома представляет собой группу опухолей из клеток крови, которая развивается из лимфоцитов. Иллюстративные лимфомы включают неходжкинскую лимфому и лимфому Ходжкина.
Настоящее изобретение относится к композициям и способам для лечения злокачественной опухоли. В одном аспекте злокачественная опухоль представляет собой гематологическую злокачественную опухоль, включая, но не ограничиваясь ими, лейкоз или лимфому. В одном аспекте CAR-экспрессирующие клетки (например, T-клетки, NK-клетки) по изобретению можно использовать для лечения злокачественных опухолей и новообразований, таких как, но не ограничиваясь ими, например, острые лейкозы, включая, но не ограничиваясь ими, например, В-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("B-ALL"), T-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("T-ALL"), острый лимфоидный лейкоз (ALL); один или несколько хронических лейкозов, включая, но не ограничиваясь ими, например, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); дополнительные гематологические злокачественные опухоли или гематологические состояния, включая, но не ограничиваясь ими, например, В-клеточный промиелоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, плазмабластную лимфому, новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема, и "предлейкоз", который представляет собой многообразный набор гематологических состояний, объединенных неэффективной продукцией (или дисплазией) миелоидных клеток крови и т.п. Кроме того, заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, включает, но не ограничивается ими, например, атипичные и/или неклассические злокачественные опухоли, новообразования, предзлокачественные состояния или пролиферативные заболевания, экспрессирующие CD19.
Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования пролиферации или снижения популяции CD19-экспрессирующих клеток, причем способы включают приведение в контакт популяции клеток, содержащей CD19-экспрессирующую клетку, с клеткой, экспрессирующей CAR против CD19 (например, T-клеткой, NK-клеткой), описанной в настоящем описании, которая связывается с CD19-экспрессирующей клеткой. В конкретном аспекте изобретение относится к способам ингибирования пролиферации или уменьшения популяции злокачественных клеток, экспрессирующих CD19, причем способы включают приведение в контакт популяции CD19-экспрессирующих злокачественных клеток с клеткой, экспрессирующей CAR против CD19 (например, T-клеткой, NK-клеткой), описанной в настоящем описании, которая связывается с CD19-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации или уменьшения популяции злокачественных клеток, экспрессирующих CD19, причем способы включают приведение в контакт популяции CD19-экспрессирующих злокачественных клеток с клеткой, экспрессирующей CAR против CD19 (например, T-клеткой, NK-клеткой), описанной в настоящем описании, которая связывается с CD19-экспрессирующей клеткой. В определенных аспектах клетка, экспрессирующая CAR против CD19 (например, T-клетка, NK-клетка) снижает количество, уровень, величину или процент клеток и/или злокачественных клеток по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 99% у индивидуума с миелоидным лейкозом или другой злокачественной опухолью или другой злокачественной опухолью, ассоциированной с CD19-экспрессирующими клетками, или в модели на животных для этих заболеваний, относительно отрицательного контроля. В одном аспекте индивидуумом является человек.
Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, лечения и/или управления течением заболевания, ассоциированного с CD19-экспрессирующими клетками (например, гематологической злокачественной опухоли или атипичной злокачественной опухоли, экспрессирующей CD19), причем способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, CAR-экспрессирующей клетки (например, T-клетки, NK-клетки), описанной в настоящем описании, которая связывается с CD19-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте индивидуумом является человек. Неограничивающие примеры нарушений, ассоциированных с CD19-экспрессирующими клетками, включают аутоиммунные нарушения (такие как волчанка), воспалительные нарушения (такие как аллергия и астма) и злокачественные опухоли (такие как гематологические злокачественные опухоли или атипичные злокачественные опухоли, экспрессирующие CD19).
Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, лечения и/или управления течением заболевания, ассоциированного с CD19-экспрессирующими клетками, причем способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, клетки, экспрессирующей CAR против CD19 (например, T-клетки, NK-клетки), описанной в настоящем описании, которая связывается с CD19-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте индивидуумом является человек.
Настоящее изобретение относится к способам предупреждения рецидива злокачественной опухоли, ассоциированной с CD19-экспрессирующими клетками (например, гематологической злокачественной опухоли, такой как ALL и CLL), причем способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, клетки, экспрессирующей CAR против CD19 (например, T-клетки, NK-клетки), описанной в настоящем описании, которая связывается с CD19-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества клеток, экспрессирующих CAR против CD19 (например, T-клеток, NK-клеток), описанных в настоящем описании, которые связываются с CD19-экспрессирующей клеткой, в комбинации с эффективным количеством другого терапевтического средства.
Комбинированная терапия
Будет понятно, что любую терапию злокачественной опухоли, как описано выше и здесь, можно проводить в комбинации с одним или несколькими дополнительными способами терапии для лечения и/или снижения симптомов злокачественной опухоли, описанной в настоящем описании. Фармацевтические композиции можно вводить одновременно с, до или после одного или нескольких других дополнительных способов терапии или лекарственных средств. В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в комбинации с другими известными средствами и способами терапии. Введение "в комбинации", как используют в рамках изобретения, означает, что два (или более) различных способа лечения осуществляют у индивидуума в процессе наличия у индивидуума нарушения, например, два или более способа лечения проводят после диагностирования у пациента нарушения и пока не произойдет излечение или устранение нарушения, или пока лечение не прекратят по другим причинам. В некоторых вариантах осуществления введение одного лекарственного средства все еще проводят, когда начинается введение второго, так что существует перекрывание с точки зрения введения. Это иногда называют в настоящем описании "одновременной" или "совместной" доставкой. В других вариантах осуществления доставка одного лекарственного средства заканчивается до начала доставки другого лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления в любом случае лечение является более эффективным вследствие комбинированного введения. Например, второе лекарственное средство является более эффективным, например, эквивалентный эффект наблюдают при использовании меньшего количества второго лекарственного средства, или второе лекарственное средство снижает симптомы в большей степени, чем наблюдалось бы, если бы второе лекарственное средство вводили в отсутствие первого лекарственного средства, или аналогичную ситуацию наблюдают для первого лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления доставка является такой, что снижение симптома или другого параметра, связанного с нарушением, является более высоким, чем наблюдалось бы при доставке одного лекарственного средства в отсутствие другого. Эффект двух способов лечения может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или более чем аддитивным. Доставка может быть такой, что эффект первого доставляемого лекарственного средства все еще поддается обнаружению, когда доставляют второе лекарственное средство.
CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное лекарственное средство можно вводить одновременно, в одной или в отдельных композициях, или последовательно. В случае последовательного введения сначала можно вводить CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, а затем можно вводить дополнительное средство, или порядок введения может быть обратным.
Терапию CAR и/или введение других лекарственных средств, проведение процедур и способов, можно осуществлять в периоды активного нарушения или в период ремиссии или менее активного заболевания. Терапию CAR можно проводить до другого лечения, одновременно с другим лечением, после лечения или в ходе ремиссии нарушения.
При введении в комбинации терапию CAR и дополнительное средство (например, второе или третье средство), или все их них, можно вводить в количестве или дозировке, превышающей, являющейся более низкой или такой же, как и количество или дозировка каждого средства, используемого индивидуально, например, в качестве монотерапии. В определенных вариантах осуществления введенное количество или дозировка терапии CAR, дополнительного средства (например, второго или третьего средства), или всех из них, являются более низкими (например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50%), чем количество или дозировка каждого средства, используемого индивидуально, например, в качестве монотерапии. В других вариантах осуществления количество или дозировка терапии CAR, дополнительного средства (например, второго или третьего средства), или всех из них, которые приводят к желаемому эффекту (например, лечение злокачественной опухоли), являются более низкими (например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% более низкой), чем количество или дозировка каждого средства, используемого индивидуально, например, в качестве монотерапии, требуемые для достижения того же терапевтического эффекта.
В следующих аспектах экспрессирующую CAR клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в терапевтическом режиме в комбинации с хирургической операцией, химиотерапией, лучевой терапией, иммунодепрессивными средствами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммунодеструктивными средствами, такими как CAMPATH, антитела против CD3, или другими способами терапии на основы антител, цитоксином, флударабином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофеноловой кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и лучевой терапией, пептидной вакциной, такой как пептидная вакцина, описанная в Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971.
В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в комбинации с химиотерапевтическим средством. Иллюстративные химиотерапевтические средства включают средства, описанные в абзацах 873-874 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, и их комбинации.
Иллюстративные алкилирующие средства включают, но не ограничиваются ими, средства, описанные в абзаце 875 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, и их комбинации.
Иллюстративные ингибиторы mTOR включают, но не ограничиваются ими, RAD001, темсиролимус; ридафоролимус (ранее известный как деферолимус, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2-[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-дигидрокси-19,30-диметокси-15,17,21,23,29,35-гексаметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36-диокса-4-азатрицикло[30,3,1,04,9]-гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-12-ил]пропил]-2-метоксициклогексилдиметилфосфинат, также известный как AP23573 и MK8669, и описанный в публикации PCT № WO 03/064383); эверолимус (Afinitor® или RAD001); рапамицин (AY22989, Sirolimus®); симапимод (CAS 164301-51-3); эмсиролимус, (5-{2,4-бис[(3S)-3-метилморфолин-4-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-7-ил}-2-метоксифенил)метанол (AZD8055); 2-амино-8-[транс-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3-пиридинил)-4-метилпиридо[2,3-d]пиримидин-7(8H)-он (PF04691502, CAS 1013101-36-4) и N2-[1,4-диоксо-4-[[4-(4-оксо-8-фенил-4H-1-бензопиран-2-ил)морфолиний-4-ил]метокси]бутил]-L-аргинилглицил-L-α-аспартил-L-серин, внутренняя соль (SF1126, CAS 936487-67-1), XL765 и их комбинации.
Иллюстративные иммуномодуляторы включают, но не ограничиваются ими, иммуномодуляторы, описанные в абзаце 882 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, и их комбинации.
Иллюстративные антрациклины включают, но не ограничиваются ими, антрациклины, описанные в абзаце 883 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, и их комбинации.
Иллюстративные алкалоиды барвинка включают, но не ограничиваются ими, алкалоиды барвинка, описанные в абзаце 884 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, и их комбинации.
Иллюстративные ингибиторы протеасом включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы протеасом, описанные в абзаце 884 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, и из комбинации.
В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с онколитическим вирусом. В некоторых вариантах осуществления онколитические вирусы способны селективно реплицироваться в злокачественных клетках и запускать гибель или замедлять рост злокачественных клеток. В некоторых случаях, онколитические вирусы не имеют эффекта или имеют минимальный эффект на незлокачественные клетки. Онколитический вирус включает, но не ограничивается ими, онколитический аденовирус, онколитические вирусы простого герпеса, онколитический ретровирус, онколитический парвовирус, онколитический вирус коровьей оспы, онколитический вирус Синбис, онколитический вирус гриппа или онколитический РНК-вирус (например, онколитический реовирус, онколитический вирус болезни Ньюкасла (NDV), онколитический вирус кори или онколитический вирус везикулярного стоматита (VSV)).
В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие CAR, описанные в настоящем описании, вводят индивидууму в комбинации с молекулой, которая снижает популяцию клеток TREG. Способы снижения уровня клеток TREG известны в данной области и включают, например, истощение CD25, введение циклофосфамида, модулирование функции GITR. Без связи с теорией, полагают, что уменьшение количества клеток TREG у индивидуума до афереза или до введения CAR-экспрессирующих клеток, описанных в настоящем описании, уменьшает количество нежелательных иммунных клеток (например, TREG) в микроокружении опухоли и снижает риск рецидива у индивидуума.
В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят индивидууму в комбинации с молекулой, нацеленной на GITR и/или модулирующей функции GITR, такой как агонист GITR и/или антитело против GITR, которые истощают регуляторные T-клетки (TREG). В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, описанный в настоящем описании, вводят индивидууму в комбинации с циклофосфамидом. В одном варианте осуществления молекулы, связывающие GITR, и/или молекулы, модулирующие функции GITR (например, агонист GITR и/или истощающие TREG антитела против GITR), вводят до введения CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном варианте осуществления агонист GITR можно вводить до афереза клеток. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид вводят индивидууму до введения (например, инфузии или реинфузии) CAR-экспрессирующей клетки или до афереза клеток. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид и антитело против GITR вводят индивидууму до введения (например, инфузии или реинфузии) CAR-экспрессирующей клетки или до афереза клеток. В одном варианте осуществления индивидуум имеет злокачественную опухоль (например, солидную злокачественную опухоль или гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL или CLL). В одном варианте осуществления индивидуум имеет CLL. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет ALL. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет солидную злокачественную опухоль, например, солидную злокачественную опухоль, описанную в настоящем описании. Иллюстративные агонисты GITR включают, но не ограничиваются ими, слитые белки GITR и антитела против GITR (например, двухвалентные антитела против GITR) например, такие как слитый белок GITR, описанный в патенте США № 6111090, патенте Европы № 090505B1, патенте США № 8586023, публикации PCT № WO 2010/003118 и 2011/090754, или антитело против GITR, описанное, например, в патенте США № 7025962, патенте Европы № 1947183B1, патенте США № 7812135, патенте США № 8388967, патенте США № 8591886, патенте Европы № EP 1866339, публикации PCT № WO 2011/028683, публикации PCT № WO 2013/039954, публикации PCT № WO2005/007190, публикации PCT № WO 2007/133822, публикации PCT № WO2005/055808, публикации PCT № WO 99/40196, публикации PCT № WO 2001/03720, публикации PCT № WO99/20758, публикации PCT № WO2006/083289, публикации PCT № WO 2005/115451, патенте США № 7618632 и публикации PCT № WO 2011/051726.
В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, например, такую как клетка, экспрессирующая CAR против CD19, (например, T-клетку, NK-клетку), например CTL019, вводят индивидууму, например, индивидууму, идентифицированному как частично отвечающий или не отвечающий индивидуум, в комбинации с агонистом GITR, например, агонистом GITR, описанным в настоящем описании. В одном варианте осуществления агонист GITR вводят до введения CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном варианте осуществления агонист GITR можно вводить до афереза клеток. В одном варианте осуществления индивидуум имеет злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL). В одном варианте осуществления индивидуум имеет ALL. В одном варианте осуществления индивидуум имеет CLL.
В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, например, такую как клетка, экспрессирующая CAR против CD19, (например, T-клетку, NK-клетку), например CTL019, вводят индивидууму, например, индивидууму, идентифицированному как частично отвечающий или не отвечающий индивидуум, в комбинации с ингибитором mTOR, например, ингибитором mTOR, описанным в настоящем описании, например, ингибитором каскада передачи сигнала, являющегося мишенью рапамицина, таким как RAD001. В одном варианте осуществления ингибитор mTOR вводят до CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном варианте осуществления ингибитор mTOR можно вводить до афереза клеток. В одном варианте осуществления индивидуум имеет злокачественную опухоль (например, гематологическую злокачественную опухоль, такую как ALL и CLL). В одном варианте осуществления индивидуум имеет ALL. В одном варианте осуществления индивидуум имеет CLL.
Ингибитор киназы
В одном варианте осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в режиме лечения в комбинации с ингибитором киназы, например, ингибитором CDK4, ингибитором ВТК, ингибитором MNK, ингибитором mTOR, ингибитором ITК, и т.д. В одном варианте осуществления индивидуум является полностью отвечающим индивидуумом и индивидууму проводят режим лечения, который включает введение CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, в комбинации с ингибитором киназы, например, ингибитором киназы, описанным в настоящем описании, например, в дозе или по схеме дозирования, описанным в настоящем описании. В одном варианте осуществления индивидуум является частично отвечающим или не отвечающим, и индивидууму проводят терапевтический режим, который включает введение CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, в комбинации с ингибитором киназы, например, ингибитором киназы, описанным в настоящем описании, например, в дозе или по схеме дозирования, описанным в настоящем описании.
В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор CDK4, например, ингибитор CDK4, описанный в настоящем описании, например, ингибитор CDK4/6, например, такой как 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8H-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она гидрохлорид (также называемый палбоциклибом или PD0332991). В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор BTK, например, ингибитор BTK, описанный в настоящем описании, например, такой как ибрутиниб. В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, например, ингибитор mTOR, описанный в настоящем описании, например, такой как рапамицин, аналог рапамицина, OSI-027. Ингибитор mTOR может представлять собой, например, ингибитор mTORC1 и/или ингибитор mTORC2, например, ингибитор mTORC1 и/или ингибитор mTORC2, описанный в настоящем описании. В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор MNK, например, ингибитор MNK, описанный в настоящем описании, например, такой как 4-амино-5-(4-фторанилино)пиразолo[3,4-d]пиримидин. Ингибитор MNK может представлять собой, например, ингибитор MNK1a, MNK1b, MNK2a и/или MNK2b.
В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор CDK4, выбранный из алоизина A; флавопиридола или HMR-1275, 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-[(3S,4R)-3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил]-4-хроменона; кризотиниба (PF-02341066); 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-[(2R,3S)-2-(гидроксиметил)-1-метил-3-пирролидинил]-4H-1-бензопиран-4-она гидрохлорида (P276-00); 1-метил-5-[[2-[5-(трифторметил)-1H-имидазол-2-ил]-4-пиридинил]окси]-N-[4-(трифторметил)фенил]-1H-бензимидазол-2-амина (RAF265); индисулама (E7070); росковитина (CYC202); палбоциклиба (PD0332991); динациклиба (SCH727965); N-[5-[[(5-трет-бутилоксазол-2-ил)метил]тио]тиазол-2-ил]пиперидин-4-карбоксамида (BMS 387032); 4-[[9-хлор-7-(2,6-дифторфенил)-5H-пиримидо[5,4-d][2]бензазепин-2-ил]амино]бензойной кислоты (MLN8054); 5-[3-(4,6-дифтор-1H-бензимидазол-2-ил)-1H-индазол-5-ил]-N-этил-4-метил-3-пиридинметанамина (AG-024322); 4-(2,6-дихлорбензоиламино)-1H-пиразол-3-карбоновой кислоты N-(пиперидин-4-ил)амида (AT7519); 4-[2-метил-1-(1-метилэтил)-1H-имидазол-5-ил]-N-[4-(метилсульфонил)фенил]-2-пиримидинамина (AZD5438) и XL281 (BMS908662).
В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор CDK4, например, палбоциклиб (PD0332991), и палбоциклиб вводят в дозе приблизительно 50 мг, 60 мг, 70 мг, 75 мг, 80 мг, 90 мг, 100 мг, 105 мг, 110 мг, 115 мг, 120 мг, 125 мг, 130 мг, 135 мг (например, 75 мг, 100 мг или 125 мг) каждые сутки в течение периода времени, например, каждые сутки в течение 14-21 суток курса из 28 суток, или каждые сутки в течение 7-12 суток курса из 21 суток. В одном варианте осуществления проводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более курсов введения палбоциклиба.
В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор BTK, выбранный из ибрутиниба (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774 и LFM-A13.
В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор BTK, например, ибрутиниб (PCI-32765), и ибрутиниб вводят в дозе приблизительно 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 420 мг, 440 мг, 460 мг, 480 мг, 500 мг, 520 мг, 540 мг, 560 мг, 580 мг, 600 мг (например, 250 мг, 420 мг или 560 мг) каждые сутки в течение периода времени, например, каждые сутки в течение курса из 21 суток или каждые сутки в течение курса из 28 суток. В одном варианте осуществления проводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более курсов введения ибрутиниба.
В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, выбранный из темсиролимуса; ридафоролимуса (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-дигидрокси-19,30-диметокси-15,17,21,23, 29,35-гексаметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36-диокса-4-азатрицикло[30,3,1,04,9]гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-12-ил]пропил]-2-метоксициклогексилдиметилфосфината, также известного как AP23573 и MK8669; эверолимуса (RAD001); рапамицина (AY22989); семапимода; (5-{2,4-бис[(3S)-3-метилморфолин-4-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-7-ил}-2-метоксифенил)метанола (AZD8055); 2-амино-8-[транс-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3-пиридинил)-4-метил-пиридо[2,3-d]пиримидин-7(8H)-она (PF04691502); и N2-[1,4-диоксо-4-[[4-(4-оксо-8-фенил-4H-1-бензопиран-2-ил)морфолиний-4-ил]метокси]бутил]-L-аргинилглицил-L-α-аспартил-L-серина, внутренней соли (SF1126) и XL765.
В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, например рапамицин, и рапамицин вводят в дозе приблизительно 3 мг, 4 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 9 мг, 10 мг (например, 6 мг) каждые сутки в течение периода времени, например, каждые сутки в течение курса из 21 суток или каждые сутки в течение курса из 28 суток. В одном варианте осуществления проводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более курсов введения рапамицина. В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, например, эверолимус, и эверолимус вводят в дозе приблизительно 2 мг, 2,5 мг, 3 мг, 4 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 9 мг, 10 мг, 11 мг, 12 мг, 13 мг, 14 мг, 15 мг (например, 10 мг) каждые сутки в течение периода времени, например, каждые сутки в течение курса из 28 суток. В одном варианте осуществления проводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более курсов введения эверолимуса.
В одном варианте осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор MNK, выбранный из CGP052088; 4-амино-3-(п-фторфениламино)пиразолo[3,4-d]пиримидина (CGP57380); церкоспорамида; ETC-1780445-2 и 4-амино-5-(4-фторанилино)пиразолo[3,4-d]пиримидина.
В некоторых вариантах осуществления способов, применений и композиций, описанных в настоящем описании, ингибитор BTK представляет собой ингибитор BTK, описанный в международной заявке WO/2015/079417, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Например, в некоторых вариантах осуществления ингибитор BTK представляет собой соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль;
R1 представляет собой водород, C1-C6 алкил, необязательно замещенный гидрокси;
R2 представляет собой водород или галоген;
R3 представляет собой водород или галоген;
R4 представляет собой водород;
R5 представляет собой водород или галоген;
или R4 и R5 связаны друг с другом и обозначают связь, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH=CH-, -CH=CH-CH2-; -CH2-CH=CH- или -CH2-CH2-CH2-;
R6 и R7 обозначают независимо друг от друга H, C1-C6 алкил, необязательно замещенный гидроксилом, C3-C6 циклоалкил, необязательно замещенный галогеном или гидрокси, или галоген;
R8, R9, R, Rʹ, R10 и R11 независимо друг от друга обозначают H, или C1-C6 алкил, необязательно замещенный C1-C6 алкокси; или любые два из R8, R9, R, Rʹ, R10 и R11 вместе с атомом углерода, с которым они связаны, могут образовывать 3-6-членное насыщенное карбоциклическое кольцо;
R12 представляет собой водород или C1-C6 алкил, необязательно замещенный галогеном или C1-C6 алкокси;
или R12 и любой из R8, R9, R, Rʹ, R10 или R11 вместе с атомами, с которыми они связаны, могут образовывать 4, 5, 6 или 7-членное азациклическое кольцо, которое может быть необязательно замещено галогеном, циано, гидроксилом, C1-C6 алкилом или C1-C6 алкокси;
n равен 0 или 1; и
R13 представляет собой C2-C6 алкенил, необязательно замещенный C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси или N,N-ди-C1-C6 алкиламино; C2-C6 алкинил, необязательно замещенный C1-C6 алкилом или C1-C6 алкокси; или C2-C6 алкиленилоксид, необязательно замещенный C1-C6 алкилом.
Низкая усиливающая иммунитет доза ингибитора TOR
В способах, описанных в настоящем описании, можно использовать низкую усиливающую иммунитет дозу ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора mTOR, включая рапалоги, такие как RAD001. Введение низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR (например, дозы, которая является недостаточной для полного подавления иммунной системы, но является достаточной для улучшения иммунной функции) может оптимизировать эффективность иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или CAR-экспрессирующих клеток, у индивидуума. Способы измерения ингибирования mTOR, дозировки, режимы лечения и подходящие фармацевтические композиции описаны в патентной заявке США № 2015/0140036, поданной 13 ноября 2014 года, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном варианте осуществления введение низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR может приводить к одному или нескольким из следующих:
i) уменьшение количества положительных по PD-1 иммунных эффекторных клеток;
ii) увеличение количества отрицательных по PD-1 иммунных эффекторных клеток;
iii) увеличение соотношения отрицательные по PD-1 иммунные эффекторные клетки/положительные по PD-1 иммунные эффекторные клетки;
iv) увеличение количества наивных T-клеток;
v) увеличение экспрессии одного или нескольких из следующих маркеров: CD62Lhigh, CD127high, CD27 и BCL2, например, на T-клетках памяти, например, предшественниках T-клеток памяти;
vi) уменьшение экспрессии KLRG1, например, на T-клетках памяти, например, предшественниках T-клеток памяти; или
vii) увеличение количества предшественников T-клеток памяти, например, клеток с любой или комбинацией из следующих характеристик: увеличенный уровень CD62Lhigh, увеличенный уровень CD127high, увеличенный уровень CD27+, сниженный уровень KLRG1 и увеличенный уровень BCL2;
и где любое из вышеуказанных, например, i), ii), iii), iv), v), vi) или vii), происходит, например, по меньшей мере временно, например, по сравнению с индивидуумом без лечения.
В другом варианте осуществления введение низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR приводит к увеличенной или пролонгированной пролиферации CAR-экспрессирующих клеток, например, в культуре или у индивидуума, например, по сравнению с индивидуумом, котором не вводили CAR-экспрессирующие клетки, или индивидуумом, которому не проводили лечение. В некоторых вариантах осуществления увеличенная пролиферация ассоциирована с увеличением количества CAR-экспрессирующих клеток. В другом варианте осуществления введение низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR приводит к увеличенному уничтожению злокачественных клеток CAR-экспрессирующими клетками, например, в культуре или у индивидуума, например, по сравнению с индивидуумом, которому не проводили лечение CAR-экспрессирующими клетками, или индивидуумом, которому не проводили лечение. В некоторых вариантах осуществления увеличенное уничтожение злокачественных клеток ассоциировано со снижением объема опухоли.
В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с низкой усиливающей иммунитет дозой ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора mTOR, например, RAD001, или каталитического ингибитора mTOR. Например, введение низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR можно начинать до введения CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании; завершать до введения CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании; начинать в то же время, что и введение CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании; проводить с перекрыванием с введением CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании; или продолжать после введения CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании.
Альтернативно или дополнительно, введение низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR может оптимизировать иммунные эффекторные клетки, подлежащие модификации способами инженерии для экспрессии молекулы CAR, описанной в настоящем описании. В таких вариантах осуществления введение низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора, например, RAD001, или каталитического ингибитора начинают или завершают до сбора от индивидуума иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, подлежащих модификации способами инженерии для экспрессии молекулы CAR, описанной в настоящем описании.
В другом варианте осуществления иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки, подлежащие модификации способами инженерии для экспрессии молекулы CAR, описанной в настоящем описании, например, после сбора от индивидуума, или CAR-экспрессирующие иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки, например, до введения индивидууму, можно культивировать в присутствии низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR.
В одном варианте осуществления введение индивидууму низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR включает введение, например, один раз в неделю, например, в дозированной форме с немедленным высвобождением, от 0,1 до 20, от 0,5