Лечение рака с использованием химерного антигенного рецептора cll-1
Владельцы патента RU 2741120:
ДЗЕ ТРАСТИЗ ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ ПЕНСИЛЬВАНИЯ (US)
НОВАРТИС АГ (CH)
Настоящая группа изобретений относится к иммунологии. Предложены CLL-1-связывающие домены и содержащие их полипептиды химерного антигенного рецептора (CAR), а также кодирующие молекулы нуклеиновой кислоты, векторы, цитотоксическая клетка и клетка-киллер, содержащая их популяция иммунных эффекторных клеток. Кроме того, рассмотрены способы лечения млекопитающего и кондиционирования пациента перед трансплантацией клеток, а также применение упомянутых изобретений для получения лекарственного средства и для лечения заболевания. Данная группа изобретений может найти применение в терапии различных заболеваний, связанных с CLL-1. 15 н. и 42 з.п. ф-лы, 34 ил., 11 табл., 7 пр.
Родственные заявки
Настоящая заявка притязает на приоритет РСТ заявки № РСТ/CN2014/082602, поданной 21 июля 2014, и РСТ заявки № РСТ/CN2014/090500, поданной 6 ноября 2014. Эти заявки полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Список последовательностей
Настоящая заявка содержит список последовательностей, который представлен в электронном виде в формате ASCII и таким образом полностью включен в настоящее описание. Копия указанного ASCII, созданная 15 июля 2015, называется N26077044WO3_SL.txt и имеет размер 339932 байта.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится вообще к применению иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток), сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) для лечения заболеваний, связанных с экспрессией лектиноподобного С-типа рецептора 1 (CLL-1).
Предпосылки создания изобретения
Лектиноподобный С-типа рецептор 1 (CLL-1) также известен как MICL, CLEC12A, CLEC-1, лектин 1, ассоциированный с дендритными клетками, и DCAL-2. CLL-1 является гликопротеиновым рецептором и членом большого семейства лектиноподобных рецепторов С-типа, вовлеченных в иммунную регуляцию. CLL-1 экспрессируется на гемопоэтических клетках, главным образом, на клетках врожденного иммунитета, включая моноциты, DC, pDC и гранулоциты (Cancer Res., 2004; J. Immunol., 2009), и миелоидных клетках-предшественниках (Blood, 2007). CLL-1 также обнаружен на бластах острого миелоидного лейкоза (AML) и лейкозных стволовых клетках (например, CD34+/CD38-) (Zhao et al., Haematologica, 2010, 95(1): 71-78). Экспрессия CLL-1 также может соотноситься с другими миелоидными лейкозами, такими как острый миеломоноцитарный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, острый промиеломоноцитарный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз (CML) и миелодиспластический синдром (MDS).
Сущность изобретения
В первом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), причем CAR включает антитело или фрагмент антитела, который включает человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном воплощении CAR включает антитело или фрагмент антитела, который включает человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, трансмембранный домен, описанный в настоящем описании, и внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, (например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен).
В воплощениях CAR включает человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где указанный анти-CLL-1 связывающий домен включает определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющий комплементарность участок 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющий комплементарность участок 3 тяжелой цепи (HC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2. В воплощениях человеческий CLL-1-связывающий домен также включает определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющий комплементарность участок 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющий комплементарность участок 3 легкой цепи (LC CDR3). В воплощениях человеческий CLL-1-связывающий домен включает определяющий комплементарность участок 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющий комплементарность участок 3 легкой цепи (LC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях CAR включает антитело или фрагмент антитела, который включает человеческий CLL-1-связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен, и где указанный CLL-1-связывающий домен включает один или больше участков из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2, и один или больше участков из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (HC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В одном воплощении кодированный человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает один или больше (например, все три) участков из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше (например, все три) участков из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (HC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, включающего один или больше (например, все три) LC CDR и один или больше (например, все три) НC CDR.
В одном воплощении кодированный человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 2), и/или вариабельный участок тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 2). В одном воплощении кодированный человеческий анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности из таблицы 2. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленной в таблице 2, или последовательности с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблицы 2; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленной в таблице 2, или последовательности с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблицы 2.
В других воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2. В воплощениях CLL-1-связывающий домен включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает один, два или все LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2, и один, два или все НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В одном воплощении кодированный CLL-1-связывающий домен включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:39-51, 65-77, 195, 78-90 или 196. В воплощении кодированный CLL-1-связывающий домен (например, scFv) включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39-51, 65-77, 195, 78-90 или 196, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39-51, 65-77, 195, 78-90 или 196. В другом воплощении кодированный CLL-1-связывающий домен включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 65-77 или 195, или последовательность с 95-99% идентичностью им. В другом воплощении кодированный CLL-1-связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 66-74 или 196, или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 52-64, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированный гуманизированный анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly4-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv может находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи.
В одном воплощении кодированный CAR включает трансмембранный домен, который включает трансмембранный домен белка, выбранного из группы, включающей альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном воплощении кодированный трансмембранный домен включает последовательность SEQ ID NO: 6. В одном воплощении кодированный трансмембранный домен включает аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая трансмембранный домен, включает последовательность SEQ ID NO: 17 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен соединен с трансмембранным доменом шарнирным участком, например, шарнирным участком, описанным в настоящем описании. В одном воплощении кодированный шарнирный участок включает SEQ ID NO: 2 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая шарнирный участок, включает последовательность SEQ ID NO: 13 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает последовательность, кодирующую костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен включает первичный сигнальный домен. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен и первичный сигнальный домен.
В одном воплощении кодированный костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен, полученный из белка, выбранного из группы, включающей молекулу ГКГС (МНС) класса I, белки рецепторы TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, молекулы, передающие сигнал активации лимфоцитов (белки SLAM), рецепторы, активирующие NK-клетки, BTLA, лиганд Тоll рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83. В воплощениях кодированный костимулирующий домен включает 4-1BB, CD27, CD28 или ICOS.
В одном воплощении кодированный костимулирующий домен 4-1BB включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном воплощении кодированный костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая костимулирующий домен, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В другом воплощении кодированный костимулирующий домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482. В одном воплощении кодированный костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая костимулирующий домен CD28, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 483 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В другом воплощении кодированный костимулирующий домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном воплощении кодированный костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая костимулирующий домен CD27, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 19 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В другом воплощении кодированный костимулирующий домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484. В одном воплощении кодированный костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая костимулирующий домен ICOS, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 485 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В воплощениях кодированный первичный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В воплощениях функциональный сигнальный домен CD3-дзета включает последовательность SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (человеческий CD3-дзета дикого типа) или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен 4-1ВВ и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен 4-1ВВ включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен 4-1ВВ, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18 или последовательность с 95-99% идентичностью ей, и/или SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, или нуклеотидную последовательность CD3-дзета с 95-99% идентичностью ей.
В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD27 и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен CD27, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 19 или последовательность с 95-99% идентичностью ей, и/или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 CD3-дзета или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD28 и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен CD28, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 483 или последовательность с 95-99% идентичностью ей, и/или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 CD3-дзета или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен ICOS и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен ICOS, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 485 или последовательность с 95-99% идентичностью ей, и/или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 CD3-дзета или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении изолированная молекула CAR дополнительно включает лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем описании. В одном воплощении лидерная последовательность включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей конструкцию CAR, включающую лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем описании, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, например, человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, включающий LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3, описанные в настоящем описании, человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в таблице 2, или последовательность с 95-99% идентичностью ей, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, трансмембранный домен, описанный в настоящем описании, например, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, и внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании (например, костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, костимулирующий домен CD28, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482, или костимулирующий домен ICOS, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484, или костимулирующий домен CD27, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8), и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, CD3-дзета стимулирующий домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10).
В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкцию CAR, включает последовательность человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, кодированную нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 и SEQ ID NO:64, или последовательностью с 95-99% идентичностью ей.
В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает (например, состоит из) нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность CAR SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO:103 или SEQ ID NO: 197; или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO:103 или SEQ ID NO: 197; или аминокислотную последовательность, имеющую 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO:103 или SEQ ID NO: 197.
В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает (например, состоит из) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116 или SEQ ID NO:198; или нуклеотидную последовательность, имеющую 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116 или SEQ ID NO:198.
В одном аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-CLL-1 связывающий домен, где анти-CLL-1 связывающий домен включает один или больше (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (HC CDR3) анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, включающего один или больше, например, все три, LC CDR и один или больше, например, все три, НC CDR.
В других воплощениях CLL-1-связывающий домен включает HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2. В воплощениях CLL-1-связывающий домен дополнительно включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3. В воплощениях CLL-1 связывающий домен включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях CLL-1-связывающий домен включает один, два или все LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2, и один, два или все HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196), и/или вариабельный участок тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195). В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций аминокислотной последовательности (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленного в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций аминокислотной последовательности (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленного в SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51, или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, соединяется с вариабельным участком тяжелой цепи, включающим аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, через линкер, например, линкер, описанный в настоящем описании. В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly4-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле CAR (например, полипептида), кодированной молекулой нуклеиновой кислоты. В одном воплощении изолированная молекула CAR включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 197, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле химерного антигенного рецептора (CAR) (например, полипептида), включающей анти-CLL-1-связывающий домен (например, человеческое антитело или фрагмент антитела, который специфически связывается с CLL-1), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном воплощении CAR включает антитело или фрагмент антитела, который включает анти-CLL-1-связывающий домен (например, человеческое антитело или фрагмент антитела, который специфически связывается с CLL-1, описанные в настоящем описании), трансмембранный домен, описанный в настоящем описании, и внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен, описанный в настоящем описании.
В одном воплощении анти-CLL-1-связывающий домен включает один или больше (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) анти-CLL-1-связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (НC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (НC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (НC CDR3) анти-CLL-1-связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1-связывающего домена, включающего один или больше (например, все три) LC CDR и один или больше (например, все три) НC CDR. В одном воплощении анти-CLL-1-связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 2), и/или включает вариабельный участок тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 2). В одном воплощении анти-CLL-1-связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности, указанной в таблице 2. В одном воплощении анти-CLL-1-связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленного в таблице 2, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности, представленной в таблице 2; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленного в таблице 2, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности, представленной в таблице 2.
В других воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2. В воплощениях CLL-1-связывающий домен дополнительно включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3. В воплощениях CLL-1-связывающий домен включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает один, два или все из LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2, и один, два или все из HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2.
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 65-90 или SEQ ID NO: 195-196, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) любой из вышеуказанных последовательностей; или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, присоединяется к вариабельному участку тяжелой цепи, включающему аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, через линкер, например, линкер, описанный в настоящем описании. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly4-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи.
В одном воплощении изолированная молекула CAR включает трансмембранный домен белка, выбранного из группы, включающей альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора, CD28, CD3 эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном воплощении трансмембранный домен включает последовательность SEQ ID NO: 6. В одном воплощении трансмембранный домен включает аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности SEQ ID O: 6, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен соединен с трансмембранным доменом шарнирным участком, например, шарнирным участком, описанным в настоящем описании. В одном воплощении кодированный шарнирный участок включает SEQ ID NO: 2 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен изолированной молекулы CAR включает костимулирующий домен. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен изолированной молекулы CAR включает первичный сигнальный домен. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен изолированной молекулы CAR включает костимулирующий домен и первичный сигнальный домен. В одном воплощении изолированная молекулы CAR дополнительно включает последовательность, кодирующую костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении костимулирующий домен включает функциональный сигнальный домен белка, выбранного из группы, включающей молекулу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуногллобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, молекулы, передающие сигнал активации лимфоцитов (белки SLAM), рецепторы, активирующие NK клетки, BTLA, лиганд Толл рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83. В одном воплощении костимулирующий домен 4-1ВВ включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном воплощении костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В другом воплощении костимулирующий домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482. В одном воплощении костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482. В другом воплощении костимулирующий домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном воплощении костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В другом воплощении костимулирующий домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484. В одном воплощении костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484.
В воплощениях первичный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В воплощениях функциональный сигнальный домен CD3-дзета включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (человеческий CD3-дзета дикого типа) или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен 4-1ВВ и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 7 и/или последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 7 и/или последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD27 и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 8 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD28 и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 482 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен ICOS и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 484 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь.
В одном воплощении изолированная молекула CAR дополнительно включает лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем описании. В одном воплощении лидерная последовательность включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле CAR, включающей лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем описании, например, лидерную последовательность SEQ ID NO: 1 или имеющую 95-99% идентичность ей, анти-CLL-1 связывающий домен, включающий LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3, описанный выше, например, анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в таблице 2, или последовательность с 95-99% идентичностью им, шарнирный участок, например, шарнирный участок, описанный в настоящем описании, например, шарнирный участок SEQ ID NO: 2 или имеющий 95-99% идентичность ему, трансмембранный домен, например, трансмембранный домен, описанный в настоящем описании, например, трансмембранный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, или последовательность, имеющую 95-99% идентичность ей, внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании, например, костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7 или имеющую 95-99% идентичность ей, и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, например, стимулирующий домен CD3-дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или имеющую 95-99% идентичность им. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании, например, костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7, и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, например, стимулирующий домен CD3-дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.
В одном воплощении изолированная молекула CAR включает (например, состоит из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 или SEQ ID NO: 197, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, 10, 15, 20 или 30 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), но не более 60, 50 или 40 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 или SEQ ID NO: 197, или аминокислотную последовательность, имеющую 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 197.
В одном аспекте изобретение относится к анти-CLL-1 связывающему домену, включающему один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (НC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (НC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (НC CDR3) анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1-связывающего домена, включающего один или больше (например, все три) LC CDR и один или больше, например, все три, НC CDR.
В других воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2. В воплощениях CLL-1-связывающий домен дополнительно включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3. В воплощениях CLL-1-связывающий домен включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает один, два или все LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2, и один, два или все из НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2.
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196) и/или вариабельный участок тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в in SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195). В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленного в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленного в SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51, или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, присоединяется к вариабельному участку тяжелой цепи, включающему аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, через линкер, например, линкер, описанный в настоящем описании. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly4-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи.
В другом аспекте изобретение относится к вектору, включающему молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании, например, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в настоящем описании. В одном воплощении вектор выбирают из группы, включающей ДНК, РНК, плазмиду, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор или ретровирусный вектор.
В одном воплощении вектор представляет собой лентивирусный вектор. В одном воплощении вектор дополнительно включает промотор. В одном воплощении промотор представляет собой промотор EF-1. В одном воплощении промотор EF-1 включает SEQ ID NO: 11. В другом воплощении промотор представляет собой промотор PGK, например, усеченный промотор PGK, описанный в настоящем описании.
В одном воплощении вектор представляет собой транскрибированный in vitro вектор, например, вектор, который транскрибирует РНК молекулы нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем описании. В одном воплощении нуклеотидная последовательность в векторе дополнительно включает хвост поли(А), например, хвост поли(А), описанный в настоящем описании, например, включающий примерно 150 аденозиновых оснований (SEQ ID NO: 312). В одном воплощении нуклеотидная последовательность в векторе дополнительно включает 3'UTR, например, 3'UTR, описанную в настоящем описании, например, включающую по меньшей мере один повтор 3'UTR, происходящей от человеческого бета-глобулина. В одном воплощении нуклеотидная последовательность в векторе дополнительно включает промотор, например, промотор Т2А.
В другом аспекте изобретение относится к клетке, включающей вектор, описанный в настоящем описании. В одном воплощении клетка представляет собой клетку, описанную в настоящем описании, например, иммунную эффекторную клетку, например, человеческую Т-клетку, описанную в настоящем описании, или человеческую NK-клетку, например, человеческую NK-клетку, описанную в настоящем описании. В одном воплощении человеческая Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку.
В другом воплощении CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем описании, дополнительно экспрессирует другой агент, например, агент, который усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении агент может представлять собой агент, который ингибирует ингибирующую молекулу. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекула ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета. В одном воплощении агент, который ингибирует ингибирующую молекулу, включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении агент включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, такую как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекула ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета, или фрагмент любой из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любой из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, включающий костимулирующий домен (например, 41ВВ, CD27 или CD28, например, как описано в настоящем описании) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дэета, описанный в настоящем описании). В одном воплощении агент включает первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид внутриклеточного сигнального домена, описанного в настоящем описании (например, сигнального домена CD28, описанного в настоящем описании, и/или сигнального домена CD3-дэета, описанного в настоящем описании).
В другом аспекте изобретение относится к способу получения клетки, включающему трансдукцию клетки, описанной в настоящем описании, например, иммунной эффекторной клетки, описанной в настоящем описании, например, Т-клетки или NK-клетки, описанной в настоящем описании, вектором, включющим нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании.
Настоящее изобретение также относится к способу получения популяции сконструированных методом РНК клеток, например, клеток, описанных в настоящем описании, например, Т-клеток или NK-клеток, временно экспрессирующих экзогенную РНК. Способ включает введение в клетку транскрибированной in vitro РНК или синтетической РНК, где РНК включает нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу CAR, описанную в настоящем описании.
В другом аспекте изобретение относится к способу предоставления противоопухолевого иммунитета млекопитающему, включающему введение млекопитающему эффективного количества клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, клеток, экспрессирующих молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В одном воплощении клетка представляет собой иммунную эффекторную клетку, например, аутологичную Т-клетку. В одном воплощении клетка представляет собой аллогенную иммунную эффекторную клетку, например, Т-клетку. В одном воплощении млекопитающее представляет собой человека, например, пациента с онкологическим заболеванием кроветворной системы. В другом аспекте изобретение относится к способу лечения млекопитающего, имеющего заболевание, связанное с экспрессией CLL-1 (например, пролиферативное заболевание, предраковое состояние и показание, относящееся к неонкологическому заболеванию, связанное с экспрессией CLL-1), включающему введение млекопитающему эффективного количества клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, клеток, экспрессирующих молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В одном воплощении млекопитающее представляет собой человека, например, пациента с онкологическим заболеванием кроветворной системы.
В одном воплощении заболевание является заболеванием, описанным в настоящем описании. В одном воплощении заболевание, связанное с экспрессией CLL-1, выбирают из рака кроветворной системы, такого как лейкоз, включая, но не ограничиваясь перечисленным, острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром, миелопролиферативные неоплазмы, хронический миелоидный лейкоз (CML), неоплазму бластно-плазмоцитоидных дентдритных клеток, и заболевания, связанного с экспрессией CLL-1, включая, но не ограничиваясь перечисленным, атипичные и/или неклассические раки, злокачественности, предраковые состояния или пролиферативные заболевания с экспрессированием CLL-1, и их комбинации. В одном воплощении заболевание, связанное с экспрессией CLL-1, представляет собой рак кроветворной системы, выбранный из группы, включающей один или несколько острых лейкозов, включая, но не ограничиваясь перечисленным, острый миелогенный лейкоз (или острый миелоидный лейкоз, AML), хронический миелогенный лейкоз (или хронический миелоидный лейкоз, CML), острый лимфоидный лейкоз (или острый лимфоцитарный лейкоз, ALL), хронический лимфоидный лейкоз (или хронический лимфоцитарный лейкоз, СLL) и миелодиспластический синдром, В-клеточный острый лимфоидный лейкоз («BАLL» или острый лимфобластный В-клеточный лейкоз), Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз («ТАLL» или острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз), острый лимфоидный лейкоз (ALL); один или несколько хронических лейкозов, включая, но не ограничиваясь перечисленным, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (СLL); другие онкологические заболевания кроветворной системы или гематологические состояния, включая, но не ограничиваясь перечисленным, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, неоплазму бластно-плазмоцитоидных дентдритных клеток, лимфомы, включая, но не ограничиваясь перечисленным, множественную миелому, неходжкинскую лимфому, лимфому Беркитта, мелкоклеточную фолликулярную лимфому и крупноклеточную фолликулярную лимфому, диффузную В-клеточную крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому маргинальной зоны, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, лимфому Ходжкина, плазмобластную лимфому, неоплазму бластно-плазмоцитоидных дентдритных клеток, плазмоцитарную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема и «предлейкоз», которые представляют собой разнообразный набор гематологических состояний, объединенных неэффективным продуцированием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и заболевания, связанного с экспрессией CLL-1, включая, но не ограничиваясь перечисленным, атипичные и/или неклассические раки, злокачественности, предраковые состояния или пролиферативные заболевания с экспрессированием CLL-1, и их комбинации.
В другом аспекте изобретение относится к способу укрепления общего состояния субъекта перед трансплантацией клеток, включающему введение субъекту эффективного количества клеток, включающих молекулу CAR, раскрытую в настоящем описании. В одном воплощении трансплантация клеток представляет собой трансплантацию стволовых клеток. Трансплантация стволовых клеток представляет собой трансплантацию кроветворных стволовых клеток или трансплантацию костного мозга. В одном воплощении трансплантация клеток является аллогенной или аутологичной.
В одном воплощении укрепление общего состояния субъекта перед трансплантацией клеток включает снижение числа CLL-1-эксперссирующих клеток у субъекта. Эксперссирующие CLL-1 у субъекта клетки представляют собой здоровые CLL-1-экспрессирующие клетки или раковые CLL-1-экспрессирующие клетки, и в некоторых случаях укреплением общего состояния субъекта будет снижение как здоровых CLL-1-экспрессирующих клеток, так и раковых CLL-1-экспрессирующих клеток перед трансплантацией клеток.
В одном воплощении клетки, эспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с агентом, который повышает эффективность клеток, эспрессирующих молекулу CAR, например, агентом, описанным в настоящем описании.
В одном воплощении клетки, эспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с малой усиливающей иммунитет дозой ингибитора mTOR. Без желания привязываться к теории, полагают, что лечение малой усиливающей иммунитет дозой (например, дозой, которая недостаточна для полной супрессии иммунной системы, но достаточна для улучшения иммунной функции) сопровождается снижением числа PD-1-положительных клеток или увеличением PD-1-отрицательных клеток. PD-1-Положительные Т-клетки, но не PD-1-отрицательные клетки Т-клетки, могут быть истощены путем соединения с клетками, которые экспрессируют лиганд PD-1, например, PD-L1 или PD-L2.
В воплощении такой подход можно использовать для оптимизации работоспособности клеток CAR у субъекта, описанных в настоящем описании. Без желания привязываться к теории, полагают, что в воплощении работоспособность эндогенных немодифицированных иммунных клеток, например, Т-клеток, улучшается. Без желания привязываться к теории, полагают, что в воплощении работоспособность CLL-1-экспрессирующих клеток CAR улучшается. В других воплощениях клетки, например, Т-клетки, которые являются или будут экспрессировать CAR, можно обработать ex vivo путем контакта с неким количеством ингибитора mTOR, который повышает число PD-1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или повышает отношение PD-1-отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD-1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки.
В воплощении введение малой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора, например, RAD001, или каталитического ингибитора, начинают до введения CAR-экспрессирующих клеток, описанных в настоящем описании, например, Т-клеток. В воплощении CAR-клетки вводят через достаточное время или достаточной дозировки ингибитора mTOR, так что уровень PD-1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или отношение PD-1-отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD-1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки, по меньшей мере временно возрастает.
В воплощении изобретение относится к ингибитору mTOR для применения при лечении субъекта, при котором указанный ингибитор mTOR усиливает иммунную реакцию у указанного субъекта, и при котором указанный субъект получил, получает или близок к получению иммунных эффекторных клеток, которые экспрессируют CLL-1-CAR, как описано в настоящем описании.
В воплощении клетки, например, Т-клетки, сконструированные для экспрессии CAR, собирают через достаточное время или после достаточного дозирования малой повышающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, так что уровень PD-1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или отношение PD-1-отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD-1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки, у субъекта или собранных у субъекта по меньшей мере временно возрастает.
В одном воплощении клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с агентом, который уменьшает побочное действие, связанное с введением клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, агентом, описанным в настоящем описании.
В одном воплощении клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с агентом, который лечит заболевание, связанное с CLL-1, например, агентом, описанным в настоящем описании. В другом воплощении клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с химиотерапевтическим средством, например. химиотерапевтическим средством, описанным в настоящем описании. В воплощении химиотерапевтическое средство вводят до введения клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании. Например, в схемах приема терапевтических средств, по которым желательно более одного введения химиотерапевтического средства, прием химиотерапевтического средства начинают или завершают до введения клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В воплощениях химиотерапевтическое средство вводят по меньшей мере за 5 дней, 10 дней, 15 дней, 30 дней до введения клеток, экспрессирующих молекулу CAR. В воплощениях химиотерапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство, которое повышает экспрессию CLL-1 на раковых клетках, например, опухолевых клетках, например, по сравнению с экспрессией CLL-1 на здоровых или нераковых клетках. Например, химиотерапевтическое средство представляет собой цитарабин (Ara-C). В воплощениях комбинацию химиотерапии и клеток, экспрессирующих молекулу CAR, описанную в настоящем описании, применяют для лечения рака кроветворной системы, например, лейкоза, например, AML, или минимального остаточного заболевания (MRD) рака кроветворной системы, описанного в настоящем описании.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR по изобретению, изолированной молекуле полипептида CAR по изобретению, вектору, включающему CAR по изобретению, и клетке, включающей CAR по изобретению, для применения в качестве лекарственного средства, например, как описано в настоящем описании. В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR по изобретению, изолированной молекуле полипептида CAR по изобретению, вектору, включающему CAR по изобретению, и клетке, включающей CAR по изобретению, для применения при лечении заболевания с экспрессией CLL-1, например, заболевания с экспрессией CLL-1, как описано в настоящем описании.
Другие особенности и воплощения вышеуказанных композиций и способов включают один или несколько пунктов из перечисленных далее.
В некоторых воплощениях молекула CAR к CLL-1 (например, CAR-нуклеиновой кислоты к CLL-1 или CAR-полипептида к CLL-1, описанным в настоящем описании) или CLL-1-связывающий домен, описанный в настоящем описании, включают один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), представленные в таблице 3, и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CLL-1 CAR-1, CLL-1 CAR-2, CLL-1 CAR-3, CLL-1 CAR-4, CLL-1 CAR-5, CLL-1 CAR-6, CLL-1 CAR-7, CLL-1 CAR-8, CLL-1 CAR-9, CLL-1 CAR-10, CLL-1 CAR-11, CLL-1 CAR-12, CLL-1 CAR-13 или 181268, представленные в таблице 4; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную вышеуказанным последовательностям или с до 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот, например, заменой (например, консервативной заменой)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CAR к CLL-1 (например, CAR-нуклеиновой кислоты к CLL-1 или CAR-полипептида к CLL-1, описанные в настоящем описании) или CLL-1-связывающий домен, описанный в настоящем описании, включают один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), представленные в таблице 5, и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CLL-1 CAR-1, CLL-1 CAR-2, CLL-1 CAR-3, CLL-1 CAR-4, CLL-1 CAR-5, CLL-1 CAR-6, CLL-1 CAR-7, CLL-1 CAR-8, CLL-1 CAR-9, CLL-1 CAR-10, CLL-1 CAR-11, CLL-1 CAR-12, CLL-1 CAR-13 или 181268, представленные в таблице 6; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную вышеуказанным последовательностям или с до 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот, например, заменой (например, консервативной заменой)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CAR для CLL-1 (например, CAR-нуклеиновой кислоты для CLL-1 или CAR-полипептида для CLL-1, описанные в настоящем описании) или CLL-1-связывающий домен, описанный в настоящем описании, включают один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), представленные в таблице 7, и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CLL-1 CAR-1, CLL-1 CAR-2, CLL-1 CAR-3, CLL-1 CAR-4, CLL-1 CAR-5, CLL-1 CAR-6, CLL-1 CAR-7, CLL-1 CAR-8, CLL-1 CAR-9, CLL-1 CAR-10, CLL-1 CAR-11, CLL-1 CAR-12, CLL-1 CAR-13 или 181268, представленные в таблице 8; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную вышеуказанным последовательностям или с до 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот, например, заменой (например, консервативной заменой)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанная в настоящем описании (например, CAR-нуклеиновой кислоты или CAR-полипептида), включает
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 156, LC CDR2 SEQ ID NO: 169 и LC CDR3 SEQ ID NO: 182 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 157, LC CDR2 SEQ ID NO: 170 и LC CDR3 SEQ ID NO: 183 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 158, LC CDR2 SEQ ID NO: 171 и LC CDR3 SEQ ID NO: 184 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 159, LC CDR SEQ ID NO: 172 и LC CDR3 SEQ ID NO: 185 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 160, LC CDR2 SEQ ID NO: 173 и LC CDR3 SEQ ID NO: 186 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 161, LC CDR2 SEQ ID NO: 174 и LC CDR3 SEQ ID NO: 187 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 162, LC CDR2 SEQ ID NO: 175 и LC CDR3 SEQ ID NO: 188 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 163, LC CDR2 SEQ ID NO: 176 и LC CDR3 SEQ ID NO: 189 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 164, LC CDR2 SEQ ID NO: 177 и LC CDR3 SEQ ID NO: 190 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 165, LC CDR2 SEQ ID NO: 178 и LC CDR3 SEQ ID NO: 191 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 166, LC CDR2 SEQ ID NO: 179 и LC CDR3 SEQ ID NO: 192 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 167, LC CDR2 SEQ ID NO: 180 и LC CDR3 SEQ ID NO: 193 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 168, LC CDR2 SEQ ID NO: 181 и LC CDR3 SEQ ID NO: 194 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 202, LC CDR2 SEQ ID NO: 203 и LC CDR3 SEQ ID NO: 204 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (НC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 117, HC CDR2 SEQ ID NO: 130 и HC CDR3 SEQ ID NO: 143 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 118, HC CDR2 SEQ ID NO: 131 и HC CDR3 SEQ ID NO: 144 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 119, HC CDR2 SEQ ID NO: 132 и HC CDR3 SEQ ID NO: 145 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 120, HC CDR2 SEQ ID NO: 133 и HC CDR3 SEQ ID NO: 146 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 121, HC CDR2 SEQ ID NO: 134 и HC CDR3 SEQ ID NO: 147 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 122, HC CDR2 SEQ ID NO: 135 и HC CDR3 SEQ ID NO: 148 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 123, HC CDR2 SEQ ID NO: 136 и HC CDR3 SEQ ID NO: 149 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 124, HC CDR2 SEQ ID NO: 137 и HC CDR3 SEQ ID NO: 150 CLL-1-CAR-8; or
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 125, HC CDR2 SEQ ID NO: 138 и HC CDR3 SEQ ID NO: 151 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 126, HC CDR2 SEQ ID NO: 139 и HC CDR3 SEQ ID NO: 152 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 127, HC CDR2 SEQ ID NO: 140 и HC CDR3 SEQ ID NO: 153 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 128, HC CDR2 SEQ ID NO: 141 и HC CDR3 SEQ ID NO: 154 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 129, HC CDR2 SEQ ID NO: 142 и HC CDR3 SEQ ID NO: 155 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 199, HC CDR2 SEQ ID NO: 200 и HC CDR3 SEQ ID NO: 201 181286.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанная в настоящем описании (например, CAR-нуклеиновой кислоты или CAR-полипептида), или CLL-1-связывающий домен включают
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 356, LC CDR2 SEQ ID NO: 370 и LC CDR3 SEQ ID NO: 384 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 357, LC CDR2 SEQ ID NO: 371 и LC CDR3 SEQ ID NO: 385 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 358, LC CDR2 SEQ ID NO: 372 и LC CDR3 SEQ ID NO: 386 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 359, LC CDR2 SEQ ID NO: 373 и LC CDR3 SEQ ID NO: 387 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 360, LC CDR2 SEQ ID NO: 374 и LC CDR3 SEQ ID NO: 388 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 361, LC CDR2 SEQ ID NO: 375 и LC CDR3 SEQ ID NO: 389 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 362, LC CDR2 SEQ ID NO: 376 и LC CDR3 SEQ ID NO: 390 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 363, LC CDR2 SEQ ID NO: 377 и LC CDR3 SEQ ID NO: 391 CLL-1 CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 364, LC CDR2 SEQ ID NO: 378 и LC CDR3 SEQ ID NO: 392 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 365, LC CDR2 SEQ ID NO: 379 и LC CDR3 SEQ ID NO: 393 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 366, LC CDR2 SEQ ID NO: 380 и LC CDR3 SEQ ID NO: 394 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 367, LC CDR2 SEQ ID NO: 381 и LC CDR3 SEQ ID NO: 395 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 368, LC CDR2 SEQ ID NO: 382 и LC CDR3 SEQ ID NO: 396 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 369, LC CDR2 SEQ ID NO: 383 и LC CDR3 SEQ ID NO: 397 of 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (НC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 314, HC CDR2 SEQ ID NO: 328 и HC CDR3 SEQ ID NO: 342 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 315, HC CDR2 SEQ ID NO: 329 и HC CDR3 SEQ ID NO: 343 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 316, HC CDR2 SEQ ID NO: 330 и HC CDR3 SEQ ID NO: 344 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 317, HC CDR2 SEQ ID NO: 331 и HC CDR3 SEQ ID NO: 345 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 318, HC CDR2 SEQ ID NO: 332 и HC CDR3 SEQ ID NO: 346 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 319, HC CDR2 SEQ ID NO: 333 и HC CDR3 SEQ ID NO: 347 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 320, HC CDR2 SEQ ID NO: 334 и HC CDR3 SEQ ID NO: 348 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 321, HC CDR2 SEQ ID NO: 335 и HC CDR3 SEQ ID NO: 349 CLL-1 CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 322, HC CDR2 SEQ ID NO: 336 и HC CDR3 SEQ ID NO: 350 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 323, HC CDR2 SEQ ID NO: 337 и HC CDR3 SEQ ID NO: 351 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 324, HC CDR2 SEQ ID NO: 338 и HC CDR3 SEQ ID NO: 352 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 325, HC CDR2 SEQ ID NO: 339 и HC CDR3 SEQ ID NO: 353 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 326, HC CDR2 SEQ ID NO: 340 и HC CDR3 SEQ ID NO: 354 CLL-1 CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 327, HC CDR2 SEQ ID NO: 341 и HC CDR3 SEQ ID NO: 355 181286.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанная в настоящем описании (например, CAR-нуклеиновой кислоты или CAR-полипептида), включает
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 440, LC CDR2 SEQ ID NO: 454 и LC CDR3 SEQ ID NO: 468 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 441, LC CDR2 SEQ ID NO: 455 и LC CDR3 SEQ ID NO: 469 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 442, LC CDR2 SEQ ID NO: 456 и LC CDR3 SEQ ID NO: 470 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 443, LC CDR2 SEQ ID NO: 457 и LC CDR3 SEQ ID NO: 471 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 444, LC CDR2 SEQ ID NO: 458 и LC CDR3 SEQ ID NO: 472 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 445, LC CDR2 SEQ ID NO: 459 и LC CDR3 SEQ ID NO: 473 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 446, LC CDR2 SEQ ID NO: 460 и LC CDR3 SEQ ID NO: 474 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 447, LC CDR2 SEQ ID NO: 461 и LC CDR3 SEQ ID NO: 475 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 448, LC CDR2 SEQ ID NO: 462 и LC CDR3 SEQ ID NO: 476 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 449, LC CDR2 SEQ ID NO: 463 и LC CDR3 SEQ ID NO: 477 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 450, LC CDR2 SEQ ID NO: 464 и LC CDR3 SEQ ID NO: 478 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 451, LC CDR2 SEQ ID NO: 465 и LC CDR3 SEQ ID NO: 479 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 452, LC CDR2 SEQ ID NO: 466 и LC CDR3 SEQ ID NO: 480 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 453, LC CDR2 SEQ ID NO: 467 и LC CDR3 SEQ ID NO: 481 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (НC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 398, HC CDR2 SEQ ID NO: 412 и HC CDR3 SEQ ID NO: 426 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 399, HC CDR2 SEQ ID NO: 413 и HC CDR3 SEQ ID NO: 427 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 400, HC CDR2 SEQ ID NO: 414 и HC CDR3 SEQ ID NO: 428 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 401, HC CDR2 SEQ ID NO: 415 и HC CDR3 SEQ ID NO: 429 CLL-1 -AR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 402, HC CDR2 SEQ ID NO: 416 и HC CDR3 SEQ ID NO: 430 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 403, HC CDR2 SEQ ID NO: 417 и HC CDR3 SEQ ID NO: 431 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 404, HC CDR2 SEQ ID NO: 418 и HC CDR3 SEQ ID NO: 432 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 405, HC CDR2 SEQ ID NO: 419 и HC CDR3 SEQ ID NO: 433 CLL-1-CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 406, HC CDR2 SEQ ID NO: 420 и HC CDR3 SEQ ID NO: 434 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 407, HC CDR2 SEQ ID NO: 421 и HC CDR3 SEQ ID NO: 435 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO:-408, HC CDR2 SEQ ID NO: 422 и HC CDR3 SEQ ID NO: 436 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 409, HC CDR2 SEQ ID NO: 423 и HC CDR3 SEQ ID NO: 437 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 410, HC CDR2 SEQ ID NO: 424 и HC CDR3 SEQ ID NO: 438 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 411, HC CDR2 SEQ ID NO: 425 и HC CDR3 SEQ ID NO: 439 181286.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, какие им обычно придают специалисты в данной области техники, к которым имеет отношение настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, схожие или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать при практическом или опытном использовании настоящего изобретения, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок. Кроме того, кроме того, материалы, способы и примеры являются только пояснительными и не предназначены для ограничения. Заголовки, подзаголовки или нумерованные или обозначенные буквами элементы, например, (а), (b), (i) и т.д., присутствуют только для облегчения чтения. Использование заголовков или нумерованных или обозначенных буквами элементов в настоящем документе не требует, чтобы стадии или элементы выполнялись в алфавитном порядке или чтобы стадии или элементы обязательно отделялись друг от друга. Другие особенности, цели и преимущества изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Приведенное далее подробное описание предпочтительных воплощений изобретения будут лучше пониматься при чтении в сочетании с прилагаемыми чертежами. В целях пояснения изобретения на чертежах показаны воплощения, которые предпочтительны в настоящее время. Однако следует представлять, что изобретение не ограничивается точным определенным порядком и оснащением воплощений, показанных на чертежах.
Фигура 1, включающая фигуры 1А, 1В и 1С, представляет собой ряд отображений, показывающих уровни люциферазы в мишень-положительных (PL21, THP1, HL60, U937) или мишень-отрицательных (К562) клеточных линиях, смешанных с клеточной линией JNL, трансдуцированной анти-CLL-1 CAR.
Фигура 2, включающая фигуры 2А, 2В и 2С, представляет собой ряд отображений, показывающих экспрессию CAR, определенную FACS, в клеточной линии JNL, трансдуцированной анти-CLL-1 CAR.
Фигура 3, включающая фигуры 3А и 3В, представляет собой ряд отображений, показывающих гистограммы относительной интенсивности флуоресценции по FACS, показавшему процент трансдуцированных Т-клеток. Фигура 3А показывает детекцию экспрессии CART в первичных Т-клетках с использованием белка L. Фигура 3В показывает детекцию экспрессии CART в первичных Т-клетках с использованием рекомбинантного белка CLL-1.
Фигура 4, включающая фигуры 4А, 4В и 4С, представляет собой ряд отображений, показывающих анти-CLL-1-CART-клеточный киллинг люциферизованных клеток PL21 (фиг. 4A), HL60 (фиг. 4B) и U87 (фиг. 4C).
Фигура 5, включающая фигуры 5А, 5В и 5С, представляет собой ряд отображений, показывающих продуцирование цитокинов в клетках CART-CLL-1. Нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) используют в качестве неспецифического контроля для фоновых действий Т-клеток. Измеряют TNF-альфа (фиг. 5A), IL-2 (фиг. 5B) и интерферон (IFN)-гамма (фиг. 5C).
Фигура 6 представляет изображение, показывающее, что CLL-1 экспрессируется в большинстве первичных образцов от пациентов с AML (AML бласты «заперты» с использованием стандартных характеристих бокового разброса lowCD45dim). CLL-1 измеряют проточной цитометрией с использованием коммерчески доступных антител (клон HIM3-4, eBioscience).
Фигура 7, включающая фигуры 7А и 7В, представляет собой ряд отображений, показывающих эффективность трансдукции Т-клеток, трансдуцированных CAR.
Фигура 8, включающая фигуры 8А и 8В, представляет собой ряд отображений, показывающих, что CLL1-CART клетки подвергают специфической дегрануляции CLL1+ клеточные линии и первичные образцы AML. Дегрануляцию CD107 измеряют проточной цитометрией (фиг. 8А). CLL1-CART клетки подвергают специфической дегрануляции ТНР1 и первичные образцы AML и не подвергают контрольную клеточную линию (фиг. 8В).
Фигура 9, включающая фигуры 9А и 9В, представляет собой ряд отображений, показывающих CLL1-CART клетки, продуцирующие TNF-α после инкубации с CLL1+ клеточной линией и первичными образцами AML.
Фигура 10, включающая фигуры 10А и 10В, представляет собой ряд отображений, показывающих CLL1-CART клетки, продуцирующие IL-2 после инкубации с CLL1+ клеточной линией и первичными образцами AML.
Фигура 11, включающая фигуры 11-11D, представляет собой ряд отображений, показывающих CLL1-CART клетки, специфически убивающие с CLL1+ клеточные линии MOLM14 и THP-1 и первичные образцы AML. CLL1-CART клетки приводят к специфическому лизису MOLM14 (фиг. 11D), THP-1 (фиг. 11A) и первичного образца AML (фиг. 11B), и не приводят к лизису контрольной клеточной линии JEKO (фиг. 11C), при указанных отношениях E:T.
Фигура 12, включающая фигуры 12А и 12В, представляет собой ряд отображений, показывающих быструю пролиферацию CLL-1-CART клеток в ответ на MOLM14, THP-1 и первичные образцы AML.
Фигура 13 представляет собой изображение, иллюстрирующее схематическую диаграмму анализа токсичности кроветворных стволовых клеток с использованием аутологичных ксенотрансплантатов.
Фигура 14, включающая фигуры 14А, 14В и 14С, представляет собой ряд отображений, показывающих, что CLL-1 экспрессируется на различных миелоидных клеточных линиях и В-клетках у гуманизированных мышей. Показаны характерные схемы FACS анализа периферической крови одной мыши (фиг. 14А). CLL-1 экспрессируется на моноцитах (CD14+ клетки), миелоидных клетках (CD33+ и CD123+ клетки), B-клетках (CD19+ клетки), но не на тромбоцитах (CD41+ клетки) или T-клетках (CD3+ клетки). Показаны характерные гистограммы (фиг. 14B). Показано схематическое представление результатов анализа периферической крови у 24 мышей (фиг. 14C).
Фигура 15, включающая фигуры 15А, 15В, 15С и 15D, представляет собой ряд отображений, показывающих, что CLL-1 экспрессируется на различных миелоидных клеточных линиях и В-клетках у гуманизированных мышей.
Фигура 16, включающая фигуры 16А, 16В, 16С и 16D, представляет собой ряд отображений, показывающих, что CLL-1 экспрессируется на различных миелоидных клетках-предшественниках и стволовых кроветворных клетках у гуманизированных мышей.
Фигура 17 представляет собой принципиальную схему анализа на токсичность стволовых кроветворных клеток CLL-1-CART клеток с использованием ксенотрансплантатов гуманизированной иммунной системы (HIS).
Фигура 18, включающая фигуры 18А и 18В, представляет собой ряд отображений, показывающих анализ костного мозга через 4 недели после инфузии CLL-1-CART клеток. Анализ методом проточной цитометрии выполнен в компоненте CD34+CD38- (кроветворные стволовые клетки) (фиг. 18A) и компоненте CD34+CD38+ (клетки-предшественники) (фиг. 18B).
Фигура 19, включающая фигуры 19А, 19В, 19С, 19D и 19Е, представляет собой ряд отображений, показывающих анализ костного мозга через 4 недели после Т-клеток.
Фигура 20 представляет собой изображение результатов анализа костного мозга у мышей HIS через 4 недели после Т-клеток. Показана токсичность кроветворных стволовых клеток CLL-1-CART клеток с использованием трансплантатов HIS.
Фигура 21, включающая фигуры 21А, 21В, 21С, 21D и 21Е, представляет собой ряд отображений, показывающих анализ костного мозга у мышей HIS через 4 недели после Т-клеток. Показаны характерные отображения костного мозга мышей, обработанных различными CART клетками.
Фигура 22, включающая фигуры 22А и 22В, представляет собой ряд гистограмм, показывающих относительную интенсивность флуоресценции из FACS анализа, показывающую процент трансдуцированных Т-клеток. Фигура 22А показывает детекцию экспрессии CART в первичных Т-клетках с использованием белка L. 22В показывает детекцию экспрессии CART в первичных Т-клетках с использованием рекомбинантного белка CLL-1.
Фигура 23, включающая фигуры 23А и 23В, представляет собой две диаграммы, показывающие способность к пролиферации клеток CLL-1-CART при выращивании с клетками-мишенями.
Фигура 24 представляет собой график, показывающий развитие болезни AML на модели с ксенотрансплантатом PL-21-luc после обработки CLL-1-CART клетками. Средняя биолюминесценция (+/- SEM) опухолевых клеток, показывающая нагрузку на все животное, показана в виде фотон/секунда (ф/с) ROI (интересующий участок), которым является вся мышь.
Фигура 25, включающая фигуры 25А и 25В, представляет собой две диаграммы, показывающие количественное определение CD4+ (фиг. 25A) и CD8+ (фиг. 25B) CAR+ T-клеток в периферической крови мышей с опухолью PL-21-luc.
Фигура 26, включающая фигуры 26А, 26В, 26С и 26D, представляет собой столбиковую диаграмму количественного определения CD4+ T-клеток (фиг. 26A), CD4+ CLL-1-CAR-экспрессирующих T-клеток (фиг. 26B), CD8+ T-клеток (фиг. 26C) и CD8+ CLL-1-CAR-экспрессирующих T-клеток (фиг. 26D) в костном мозгу мышей с опухолью PL-21-luc. Показано среднее число T-клеток (+/- SEM) на миллион клеток костного мозга. Значимость вычисляют однофакторным ANOVA и выражают в виде *P<0,05 и **P<0,01.
Фигура 27, включающая фигуры 27А, 27В, 27С и 27D, представляет собой столбиковую диаграмму количественного определения CD4+ T-клеток (фиг. 27A), CD4+ CLL-1-CAR-экспрессирующих T-клеток (фиг. 27B), CD8+ T-клеток (фиг. 27C) и the CD8+ CLL-1-CAR-экспрессирующих T-клеток (фиг. 27D) в селезенке мышей с опухолью PL-21-luc. Показано среднее число T-клеток (+/- SEM) на миллион спленоцитов. Значимость вычисляют однофакторным ANOVA и выражают в виде *P<0,05 и **P<0,01.
Фигура 28, включающая фигуры 28А, 28В, 28С и 28D, показывает, что лечение с индукционной химиотерапией и затем CLL-1-CAR-клетками приводит к уничтожению лейкоза в первичных ксенотрансплантатах AML. Фигура 28А является схематической иллюстрацией экспериментальной схемы комбинированной терапии из химиотерапии и CLL-1-CAR-клеток в первичных ксенотрансплантатах AML. Фигура 28В представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) CLL-1 в лейкозных клетках (компартмент живых huCD495dim). Фигура 28С представляет собой график, показывающий количественное определение числа лейкозных бластов в периферической крови на 1 мкл периферической крови (среднее +/- SD) в различные моменты времени после инъекции AML как указано. Стрелки обозначают введение Ara-C (тонкие стрелки) и введение Т-клеток (нетрансдуцированных или CLL-1-CAR-экспрессирующих Т-клеток, толстые стрелки). Фигура 28D представляет собой график, показывающий продолжительность существования трансплантатов AML.
Фигура 29, включающая фигуры 29А, 29В, 29С, 29D и 29Е, показывает различные конфигурации отдельного вектора, например, где shРНК регулируется U6 положительно или отрицательно CAR-кодирующими элементами, регулируемыми EF1-альфа. В примерах конструкций, отображенных на фиг. 29А и 29В, транскрипция происходит через промоторы U6 и EF1-альфа в одном и том же направлении. В примерах конструкций, отображенных на фиг. 29С и 29D, транскрипция происходит через промоторы U6 и EF1-альфа в различных направлениях. На фигуре 29Е shРНК (и соответствующий промотор U6) находится в первом векторе, и CAR (и соответствующий промотор EF1-альфа) находится во втором векторе.
Фигура 30 отображает структуры двух примеров конфигураций RCAR. Антигенсвязывающие члены включают антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен-переключатель. Внутриклеточные связывающие элементы включают домен-переключатель, костимулирующий сигнальный домен и первичный сигнальный домен. Две конфигурации показывают, что первый и второй домены-переключатели, описанные в настоящем описании, могут находиться в различной ориентации по отношению к антигенсвязывающему элементу и внутриклеточному связывающему элементу. В настоящем описании дополнительно описаны другие конфигурации RCAR.
Фигура 31 показывает, что пролиферация CAR-экспрессирующих трансдуцированных Т-клеток усиливается малой дозой в системе культивирования клеток. CARТ сокультивируются с клетками Nalm-6 в присутствии различных концентраций RAD001. Число CAR-положительных CD3-положительных Т-клеток (черные столбики) и всех Т-клеток (светлые столбики) оценивают через 4 дня после сокультивирования.
Фигура 32 отображает измерения роста опухоли клеток NALM-6-luc с ежедневным дозированием 0,3, 1, 3 и 10 мкг/кг (mpk) RAD001 или дозированием среды. Кружочки относятся к среде; квадраты обозначают дозу RAD001 10 мг/кг; треугольники обозначают дозу RAD001 3 мг/кг; перевернутые треугольники обозначают дозу RAD001 1 мг/кг; и ромбы обозначают дозу RAD001 0,3 мг/кг.
Фигура 33, включающая фигуры 33А и 33В, показывает фармакокинетические кривые, показывающие количество RAD001 в крови мышей NSG с опухолями NALM6. Фиг. 33А показывает РК в день 0 после первой дозы RAD001. Фиг. 33В показывает РК в день 14 после последней дозы RAD001. Ромбы обозначают дозу RAD001 0,3 мг/кг; квадраты обозначают дозу RAD001 1 мг/кг; треугольники обозначают дозу RAD001 3 мг/кг; и х обозначают дозу RAD001 10 мг/кг.
Фигура 34, включающая фигуры 34А и 34В, показывает пролиферацию in vivo гуманизированных CD19-CART клеток с дозированием RAD001 и без него. Малые дозы RAD001 (0,003 мг/кг) ежедневно ведут к усилению пролиферации CAR-T клеток выше нормального уровня пролиферации huCAR19. Фигура 34А показывает CD4+ CAR T-клетки; фиг. 34B показывает CD8+ CAR T-клетки. Кружочки обозначают PBS; квадраты обозначают huCTL019; треугольники обозначают huCTL019 с 3 мг/кг RAD001; перевернутые треугольники обозначают huCTL019 с 0,3 мг/кг RAD001; ромбы обозначают huCTL019 с 0,03 мг/кг RAD001; и темные кружочки обозначают huCTL019 с 0,003 мг/кг RAD001.
Подробное описание
Определения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют те же самые значения, какие им обычно придают специалисты в данной области техники, к которым имеет отношение изобретение.
Неопределенные артикли единственного числа относятся к одному или более чем одному (т.е., по меньшей мере одному) из грамматических объектов работы. Как пример, «(аn) элемент» обозначает один элемент или более одного элемента.
Термин «примерно», когда относится к измеряемой величине, такой как количество, протяженность во времени и т.п., предназначен для включения вариаций±20%, или в некоторых случаях±10%; или в некоторых случаях±5%; или в некоторых случаях±1%; или в некоторых случаях±0,1% от указанной величины, когда такие вариации подходят для раскрытых способов.
Термин «химерный антигенный рецептор» или, с другой стороны, «CAR» относится к рекомбинантной полипептидной конструкции, включающей по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в данном описании «внутриклеточным сигнальным доменом»), включающий функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы, определенной ниже. В некоторых воплощениях домены в полипептидной конструкции CAR находятся в одной и той же полипептидной цепи, например, включают химерный слитый белок. В некоторых воплощениях домены в полипептидной конструкции CAR не сопряжены с другими, например, находятся в различных полипептидных цепях, например, как предоставлены в RCAR, описанной ниже.
В одном аспекте стимулирующая молекула CAR представляет собой дзета-цепь, связанную с комплексом Т-клеточных рецепторов. В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен включает первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен CD3-дзета). В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен дополнительно включает один или несколько функциональных сигнальных доменов, образованных от по меньшей мере одной костимулирующей молекулы, определенной ниже. В одном аспекте костимулирующую молекулу выбирают из 4 1BB (т.е., CD137), CD27, ICOS и/или CD28. В одном аспекте CAR включает химерный слитый белок, включающий внеклеточный узнающий антиген домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR включает химерный слитый белок, включающий внеклеточный узнающий антиген домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий функциональный сигнальный домен, происходящий от костимулирующей молекулы, и функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR включает химерный слитый белок, включающий внеклеточный узнающий антиген домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий функциональные сигнальные домены, происходящие от одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домены, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR включает химерный слитый белок, включающий внеклеточный узнающий антиген домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий по меньшей мере два функциональных сигнальных домена, происходящих от одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домены, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR включает необязательную лидерную последовательность по аминоконцу (N-ter) слитого белка CАR. В одном аспекте CAR включает дополнительно лидерную последовательность по N-концу внеклеточного узнающего антиген домена, причем лидерная последовательность необязательно отщепляется от узнающего антиген домена (например, ак scFv) во время клеточного процессинга и локализации CAR на клеточной мембране.
CAR, который включает антигенсвязывающий домен (например, scFv), однодоменное антитело или TCR (например, домен, связывающий TCR-альфа, или домен, связывающий TCR-бета), который специфически связывает специфический опухолевый маркер Х, где Х может представлять собой опухолевый маркер, описанный в настоящем описании, также называют XCAR. Например, CAR, который включает антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, называют CLL-1-CAR. CAR может экспрессироваться в любой клетке, например, иммунной эффекторной клетке, как описано в настоящем описании (например, Т-клетке или NK-клетке).
Термин «сигнальный домен» относится к функциональной части белка, которая действует путем передачи информации в клетке для регулирования клеточной активности через определенные пути передачи сигнала путем генерации вторичных мессенджеров или функционируя как эффекторы, реагируя на такие мессенджеры.
Используемый в настоящем описании термин «CLL-1» относится к лектиноподобной молекуле 1 С-типа, которая является антигенной детерминантной, обнаруживаемой в предшественниках лейкозных клеток и в здоровых иммунных клетках. Лектиноподобная молекула 1 С-типа (CLL-1) также известна как MICL, CLEC12A, CLEC-1, лектин 1, ассоциированный с дендритными клетками, и DCAL-2. Человеческие и мышиные аминокислотные и нуклеотидные последовательности можно найти в общедоступной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотную последовательность человеческого CLL-1 можно найти в UniProt/Swiss-Prot, инвентарный № Q5QGZ9, и нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий CLL-1, можно найти под инвентарными №№ NM 001207010.1, NM 138337.5, NM 201623.3 и NM 201625.1. В одном воплощении антигенсвязывающая часть CAR узнает и связывает эпитоп во внеклеточном домене белка CLL-1 или его фрагменте. В одном воплощении белок CLL-1 экспрессируется в раковой клетке.
Термин «антитело», используемый в настоящем описании, относится к белку или полипептидной последовательности, происходящей от молекулы иммуноглобулина, который специфически связывается с антигеном. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными, многоцепочечными и одноцепочечными или интактными иммуноглобулинами и могут быть образованы от природных источников или от рекомбинантных источников. Антитела могут представлять собой тетрамеры молекул иммуноглобулинов.
Термин «фрагмент антитела», используемый в настоящем описании, относится к по меньшей мере одной части интактного антитела или его рекомбинантных вариантов и относится к антигенсвязывающему домену, например, вариабельному участку, определяющему антигенность интактного антитела, которая является достаточной для придания способности к узнаванию и специфического связывания фрагмента антитела с мишенью, такой как антиген. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются перечисленным фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, фрагменты антитела scFv, линейные антитела, камелидные VHH домены и полиспецифические молекулы, образованные из фрагментов антител, таких как двухвалентный фрагмент, включающий два или больше, например, два, Fab-фрагментов, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирном участке, или два или больше, например, два, изолированных CDR или других соединенных эпитопсвязывающих фрагментов антитела. Фрагменты антител также могут быть включены в одноцепочечные доменные антитела, макситела, минитела, нанотела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger и Hudson, Nature Biotechnology, 23: 1126-1136, 2005). Фрагменты антител также могут быть привиты на каркасы на основе полипептидов, такие как фибронектин типа III (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описываются фибронектиновые полипептидные минитела).
Термин «scFv» относится к слитому белку, включающему по меньшей мере одни фрагмент антитела, включающий вариабельный участок легкой цепи, и по меньшей мере одни фрагмент антитела, включающий вариабельный участок тяжелой цепи, причем вариабельные участки легкой и тяжелой цепи тесно связаны через короткий жесткий пептидный линкер, и способный экспрессироваться как одноцепочечный полипептид, и при этом scFv сохраняет специфичность интактного антитела, от которого он образован. Если не определено точно, при использовании в настоящем описании scFv может иметь вариабельные участки VL и VH в любом порядке, например, относительно Т- и С-концов полипептида, scFv может включать VL-линкер-VH или VH-линкер-VL.
Термин «участок, определяющий комплементарность» или «CDR», используемый в настоящем описании, относится к последовательностям аминокислот в вариабельных участков антитела, которые придают антигенспецифичность и аффинность связывания. Например, вообще имеются три CDR в каждом вариабельном участке тяжелой цепи (например, HCCDR1, HCCDR2 и HCCDR3) и три CDR в каждом вариабельном участке легкой цепи (например, LCCDR1, LCCDR2 и LCCDR3). Точные границы аминокислотных последовательностей данного CDR можно определить с использованием любой из ряда хорошо известных схем, включая схемы, описанные Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации «Кабат»), Al-Lazikani et al., (1997), JMB 273, 927-948 (схема нумерации «Чотиа»), или их комбинации. По схеме нумерации по Кабату в некоторых воплощениях аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) нумеруются 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); и аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене легкой цепи (VL) нумеруются 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), и 89-97 (LCDR3). По схеме нумерации по Чотиа в некоторых воплощениях аминокислоты CDR в VH нумеруются 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); и аминокислотные остатки CDR в VL нумеруются 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). В комбинированной схеме нумерации по Кабату и Чотиа в некоторых воплощениях CDR соответствуют аминокислотным остаткам, которые являются частью CDR по Кабату, CDR по Чотиа или по той и другой схеме. Например, в некоторых воплощениях CDR соответствуют аминокислотным остаткам 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в VH, например, VH млекопитающего, например, VH человека; и аминокислотным остаткам 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в VL, например, VL млекопитающего, например, VL человека.
Часть композиции CAR по изобретению, включающая антитело или фрагмент антитела, может существовать в различных формах, например, в которых антигенсвязывающий домен экспрессируется как часть полипептидной цепи, включая, например, фрагмент однодоменного антитела (sdAB), одноцепочечное антитело (scFv), например, человеческого антитела (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В одном аспекте антигенсвязывающий домен композиции CAR по изобретению включает фрагмент антитела. В другом аспекте CAR включает фрагмент антитела, который включает scFv.
Термин «связывающий домен», используемый в настоящем описании, или «молекула антитела» (также называемая в настоящем описании «анти-мишень (например, CLL-1) связывающий фрагмент») относится к белку, например, цепи иммуноглобулина или ее фрагменту, включающим по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Термин «связывающий домен» или «молекула антитела» охватывает антитела и фрагменты антител. В одном воплощении молекула антитела представляет собой молекулу полиспецифического антитела, например, она включает несколько последовательностей вариабельного домена иммуноглобулина, причем первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из нескольких имеет специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из нескольких имеет специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении молекула полиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело имеет специфичность в отношении не более двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая имеет специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая имеет специфичность связывания в отношении второго эпитопа.
Термин «тяжелая цепь антитела» относится к более крупной из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях, и которая обычно определяет класс, к которому принадлежит антитело.
Термин «легкая цепь антитела» относится к меньшей цепи из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях. Легкие цепи каппа (κ) и лямбда (λ) относятся к двум основным изотипам легкой цепи антитела.
Термин «рекомбинантное антитело» относится к антителу, которое получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК, такие как, например, антитело, экспрессируемое экспрессирующей системой бактериофагов или дрожжей. Термин также следует истолковывать как обозначающий антитело, которое получено синтезом молекулы ДНК, кодирующей антитело, и молекула такой ДНК экспрессирует белок антитело или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где ДНК или аминокислотную последовательность получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК или аминокислотных последовательностей, которые доступны и хорошо известны в технике.
Термин «антиген» или «Ag» относится к молекуле, которая вызывает иммунную реакцию. Иммунная реакция может включать или продуцирование антител или активацию специфических иммунокомпетентных клеток или то и другое. Специалистам в данной области техники будет понятно, что любая макромолекула, включая фактически все белки или пептиды, может служить в качестве антигена. Более того, антигены могут быть образованы из рекомбинантной или геномной ДНК. Специалистам в данной области техники будет понятно, что любая ДНК, которая включает нуклеотидные последовательности или неполную нуклеотидную последовательность, кодирующие белок, который вызывает иммунную реакцию на них, кодирует «антиген», как этот термин используется в настоящем описании. Кроме того, специалистам в данной области техники будет понятно, что антиген необязательно кодируется только полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. Достаточно очевидно, что настоящее изобретение включает, но не ограничивается перечисленным, применение неполных нуклеотидных последовательностей более одного гена, и что такие нуклеотидные последовательности выстраиваются в различных комбинациях для кодирования полипептидов, которые выявляют нужную иммунную реакцию. Более того, специалистам в данной области техники будет понятно, что антиген совсем необязательно кодируется «геном». Достаточно очевидно, что антиген можно получить синтетически или можно получить из биологического образца, или он может представлять собой макромолекулу помимо полипептида. Такой биологический образец может включать, но не ограничиваться перечисленным, образец ткани, образец опухоли, клетки или жидкость с другими биологическими компонентами.
Термин «противоопухолевое действие» относится к биологическому действию, которое может проявиться различными путями, включая, но не ограничиваясь перечисленным, например, снижение объема опухоли, снижение числа опухолевых клеток, снижение числа метастазов, увеличение вероятной продолжительности жизни, снижение пролиферации опухолевых клеток, снижение выживания опухолевых клеток или облегчение различных физиологических симптомов, связанных с раковым состоянием. «Противоопухолевое действие» также может проявиться способностью пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител по изобретению предупреждать появление опухоли в первую очередь.
Термин «аутологичный» относится к любому материалу, полученному от одного и того же индивидуума, которому позднее его вводят.
Термин «аллогенный» относится к любому материалу, полученному от другого животного того же вида, что и индивидуум, которому материал вводят. Двух или больше индивидуумов называют аллогенными друг другу, когда гены в одном или нескольких локусах не являются идентичными. В некоторых аспектах аллогенный материал от индивидуумов одного и того же вида может в значительной степени не подходить для антигенного взаимодействия.
Термин «ксеногенный» относится к трансплантату, полученному от животного другого вида.
Термин «аферез», используемый в настоящем описании, относится к признанному в данной области техники экстракорпоральному способу, с помощью которого кровь донора или пациента берут у донора или пациента и пропускают через аппарат, который отделяет выбранную(ые) определенную(ые) составляющую(ие) крови и возвращает остальное в кровоток донора или пациента, например, ретрансфузией. Таким образом, в контексте «аферезный образец» относится к образцу, полученному с использованием афереза.
Тераин «комбинация» относится или к фиксированной комбинации в одной лекарственной форме или к комбинированному введению, когда соединение по настоящему изобретению и партнера по комбинации (например, другое лекарственное средство, как поясняется ниже, также называемое «терапевтическим средством» или «соагентом») могут вводиться независимо в одно и то же время или раздельно с временными интервалами, в особенности, когда такие временные интервалы учитывают, что партнеры по комбинации показывают совместное, например, синергитическое действие. Отдельные компоненты могут упаковываться в наборе или по отдельности. Один или оба компонента (например, порошки или жидкости) могут восстанавливаться или разбавляться до нужной дозы перед введением. Термины «совместное введение» или подобные, используемые в настоящем описании, предназначены для включения введения выбранного партнера по комбинации отдельному субъекту, нуждающемуся в этом (например, пациенту), и предназначены для включения схем приема лекарственных средств, в которых средства необязательно вводятся одинаковым путем введения или в одно и то же время. Термин «фармацевтическая композиция», используемый в настоящем описании, обозначает продукт, который является результатом смешивания или объединения более одного активного ингредиента, и включает как фиксированные, так и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин «фиксированная комбинация» означает, что активные ингредиенты, например, соединение по настоящему изобретению и партнер по комбинации оба вводятся пациенту одновременно в форме единой сущности или лекарственной формы. Термин «нефиксированная комбинация» означает, что активные ингредиенты, например, соединение по настоящему изобретению и партнер по комбинации оба вводятся пациенту в виде отдельных сущностей одновременно, совместно или последовательно без определенного предела по времени, причем такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента. Последнее также применимо для коктейльной терапии, например, введения трех или больше активных ингредиентов.
Термин «рак» относится к заболеванию, характеризуемому быстрым и неуправляемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распределяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части организма. Примеры различных раковых заболеваний описаны в настоящем описании и включают, но не ограничиваются перечисленным, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, цервикальный рак, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почек, рак печени, рак головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легких и т.п.. Термины «опухоль» и «рак» в настоящем описании используются взаимозаменяемо, например, оба термина охватывают солидные и жидкие, например, диффузные или переносимые кровотоком опухоли. Используемые в настоящем описании термины «рак» или «опухоль» включают предзлокачественные, а также злокачественные раки и опухоли.
«Полученная из», как этот термин используется в настоящем описании, показывает соотношение между первой и второй молекулой. Как правило, термин относится к структурному сходству между первой и второй молекулой и не означает или не включает ограничение способа или источника первой молекулы, которую получают из второй молекулы. Например, в случае внутриклеточного сигнального домена, который получают из молекулы CD3-дзета, внутриклеточный сигнальный домен сохраняет достаточную структуру CD3-дзета, так что имеет требуемую функцию, а именно, способность генерировать сигнал в соответствующих условиях. Он не означает или не включает ограничение по определенному способу получения внутриклеточного сигнального домена, например, не означает, что для предоставления внутриклеточного сигнального домена необходимо исходить из последовательности CD3-дзета и делетировать нежелательную последовательность, или улучшить мутации для того, чтобы получить внутриклеточный сигнальный домен.
Выражение «заболевание, связанное с экспрессией CLL-1» включает, но не ограничивается перечисленным, заболевание, связанное с клеткой, которая экспрессирует CLL-1, или состояние, связанное с клеткой, которая экспрессирует CLL-1, включая, например, пролиферативные заболевания, такие как рак или злокачественность, или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз; или неродственное раку показание, связанное с клеткой, которая экспрессирует CLL-1 (например, CLL-1 дикого типа или мутантный). Во избежание сомнений заболевание, связанное с экспрессией CLL-1, может включать состояние, связанное с клеткой, которая в настоящее время не экспрессирует CLL-1, например, поскольку экспрессия CLL-1 регулируется отрицательно, например, из-за лечения молекулой, таргетной для CLL-1, например, ингибитором CLL-1, описанным в настоящем описании, но которая какое-то время экспрессировала CLL-1. В одном аспекте рак, связанный с экспрессией CLL-1, представляет собой рак кроветворной системы. В одном аспекте рак кроветворной системы включает, но не ограничивается перечисленным, лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная лимфома, неходжкинская лимформа, лимфома Беркетта и мелкоклеточная и крупноклеточная фолликулярная лимфома). Другие заболевания, связанные с экспрессией CLL-1, включают, но не ограничиваются перечисленным, например, атипичные и/или неклассические раковые заболевания, злокачественности, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, связанные с экспрессией CLL-1. Также могут быть включены неродственные раку показания, связанные с экспрессией CLL-1. В некоторых воплощениях опухолевые антигенэкспрессирующие клетки экспрессируют, или в любое время экспрессируют, мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В одном воплощении опухолевая антигенэкспрессирующая клетка продуцирует белок опухолевый антиген (например, дикого типа или мутантный), и опухолевый белок антиген может присутствовать на нормальных уровнях или пониженных уровнях. В одном воплощении опухолевая антигенэкспрессирующая клетка продуцирует детектируемые уровни опухолевого белка антигена в один момент и затем продуцирует по существу недетектируемые уровни опухолевого белка антигена.
Термины «консервативные модификации последовательности» или «консервативные замены» относятся к модификациям аминокислот, которые существенно не влияют или не изменяют связывающие характеристики антитела или фрагмента антитела, содержащих аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают замены, присоединения и делеции. Модификации можно ввести в антитело или фрагмент антитела по изобретению стандартными способами, известными в технике, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, определены в технике. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или больше аминокислотных остатков в CAR по изобретению можно заменить другими аминокислотными остатками из семейства с такими же боковыми цепями, и измененный CDR можно проверить с использованием функциональных анализов, описанных в настоящем описании.
Термин «стимуляция» относится к первичной реакции, вызванной связыванием стимулирующей молекулы (например, комплекса TCR/CD3) с ее родственным лигандом, посредством чего опосредуется событие сигнальной трансдукции, такое как, но без ограничения, сигнальная трансдукция через комплекс TCR/CD3. Стимуляция может опосредовать измененную экспрессию некоторых молекул, такую как отрицательная регуляция TGF-β, и/или реорганизация цитоскелетных структур, и т.п..
Термин «стимулирующая молекула» относится к молекуле, экспрессированной Т-клеткой, которая обеспечивает первичную(ые) цитоплазматическую(ие) сигнальную(ые) последовательность(и), которая(ые) регулирует(ют) первичную активацию комплекса TCR путем стимуляции в отношении по меньшей мере некоторого аспекта пути передачи сигнала Т-клетками. В одном аспекте первичный сигнал инициируют, например, путем связывания комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, нагруженной пептидом, и которое ведет к опосредованию Т-клеточной реакции, включая, но не ограничиваясь перечисленным, пролиферацию, активацию, дифференцировку и т.п. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также называемая «первичным сигнальным доменом»), которая действует путем стимуляции, может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина или ITAM. Примеры ITAM-содержащей первичной цитоплазматической сигнальной последовательности, которая является отдельным применением в изобретении, включают, но не ограниваются перечисленным, последовательности TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известную как ʺICOSʺ), FcεRI, CD66d, DAP10 и DAP12. В специфическом CAR по изобретению внутриклеточный сигнальный домен в любом одном или нескольких CARS по изобретению включает внутриклеточную сигнальную последовательность, например, первичную сигнальную последовательность CD3-дзета. В специфическом CAR по изобретению первичная сигнальная последовательность CD3-дзета представляет собой последовательность, представленную как SEQ ID NO: 9, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п. В специфическом CAR по изобретению первичная сигнальная последовательность CD3-дзета представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п.
Термин «антигенпрезентирующая клетка» или «АРС» относится к клетке иммунной системы, такой как акцессорная клетка (например, В-клетка, дендритная клетка и т.п.), которая отображает чужеродный антиген в комплексе с главными комплексами гистосовместимости (ГКГС) на своей поверхности. Т-Клетки могут узнавать такие комплексы с использованием своих Т-клеточных рецепторов (TCR). АРС процессируют антигены и представляют их Т-клеткам.
«Внутриклеточный сигнальный домен» как термин, используемый в настоящем описании, относится к внутриклеточной части молекулы. Внутриклеточный сигнальный домен генерирует сигнал, который промотирует иммунную эффекторную функцию CAR-содержащей клетки, например, CART клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например, в CART клетке, включают цитолитическую активность и хелперную активность, включая секрецию цитокинов. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен трансдуцирует сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение определенной функции. Хотя может быть использован весь внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях нет необходимости использовать полную цепь. До степени, до которой используют отсеченную часть внутриклеточного сигнального домена, такую отсеченную часть можно использовать вместо интактной цепи до тех пор, пока она трансдуцирует сигнал эффекторной функции. Таким образом, термин «внутриклеточный сигнальный домен» означает включение любой отсеченной части внутриклеточного сигнального домена, достаточной для трансдукции сигнала эффекторной функции.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен может включать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Примеры первичных внутриклеточных сигнальных доменов включают домены, полученные из молекул, ответственных за первичную стимуляцию или антигензависимую стимуляцию. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен может включать костимулирующий внутриклеточный домен. Примеры костимулирующих внутриклеточных сигнальных доменов включают домены, полученные из молекул, ответственных за костимулирующие сигналы или антигеннезависимую стимуляцию. Например, в случае CART первичный внутриклеточный сигнальный домен может включать цитоплазматическую последовательность Т-клеточного рецептора, и костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен может включать цитоплазматическую последовательность из корецептора или костимулирующей молекулы.
Первичный внутриклеточный сигнальный домен может включать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина или ITAM. Примеры ITAM-содержащих первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают, но не ограничиваются перечисленным, последовательности, полученные из CD3-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как «ICOS»), FcεRI, CD66d, DAP10 и DAP12.
Термин «дзета» или альтернативно «дзета-цепь», «CD3-дзета» или «TCR-дзета» определяется как белок, предоставленный GenBank, инв. № BAG36664.1, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п., и «дзета стимулирующий домен» или альтернативно «CD3-дзета стимулирующий домен» или «TCR-дзета стимулирующий домен» определяется как аминокислотные остатки из цитоплазматического домена дзета-цепи, которые являются достаточными для функциональной передачи начального сигнала, необходимого для активации Т-клеток. В одном аспекте цитоплазматический домен дзета включает остатки с 52 по 164 из GenBank, инв. № BAG36664.1, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п., которые являются их функциональными ортологами. В одном аспекте «дзета стимулирующий домен» представляет собой последовательность, представленную как SEQ ID NO: 9. В одном аспекте «дзета стимулирующий домен» или «CD3-дзета стимулирующий домен» представляет собой последовательность, представленную как SEQ ID NO: 10.
Термин «костимулирующая молекула» относится к близкому партнеру по связыванию на Т-клетке, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, посредством чего опосредуется костимулирующая реакция с помощью Т-клетки, такая как, но без ограничения, пролиферация. Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности иные, чем антигенные рецепторы или их лиганды, которые требуются для эффективной иммунной реакции. Костимулирующие молекулы включают, но не ограничиваются перечисленным, молекулу класса I ГКГС, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Толл-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83.
Костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части костимулирующей молекулы.
Внутриклеточный сигнальный домен может включать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которой его получают, или его функциональный фрагмент.
Термин «4-1ВВ» относится к члену суперсемейства TNFR с аминокислотной последовательностью, представленной в GenBank, инв. № AAA62478.2, или эквивалентными остатками от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п.; и «4-1ВВ костимулирующий домен» определяется как аминокислотные остатки GenBank, инв. № AAA62478.2, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п.. В одном аспекте «4-1ВВ костимулирующий домен» представляет собой последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п..
«Иммунная эффекторная клетка» как термин, используемый в настоящем описании, относится к клетке, которая вовлечена в иммунную реакцию, например, в промотирование иммунной эффекторной реакции. Примеры иммунных эффекторных клеток включают Т-клетки, например, альфа/бета Т-клетки и гамма/дельта Т-клетки, В-клетки, природные киллерные (NK) клетки (NKT), тучные клетки и фагоциты миелоидного происхождения.
«Иммунная эффекторная функция или иммунная эффекторная реакция» как термин, используемый в настоящем описании, относится к функции или реакции, например, иммунной эффекторной клетки, которая усиливает или промотирует иммунную атаку клетки-мишени. Например, иммунная эффекторная функция или реакция относится к свойству Т- или NK-клетки промотировать киллинг или ингибирование роста или пролиферации клетки-мишени. В случае Т-клетки примерами эффекторной функции или реакции являются первичная стимуляция и костимуляция.
Термин «эффекторная функция» относится к определенной функции клетки. Эффекторной функцией Т-клетки, например, может являться цитолитическая активность или хелперная активность, включая секрецию цитокинов.
Термин «кодирование» относится к неотъемлемому свойству специфической последовательности нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, для служения в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих или определенную последовательность нуклеотидов (например, рРНК, тРНК и мРНК) или определенную последовательность аминокислот и биологические свойства, проистекающие из этого. Таким образом, ген, кДНК или РНК кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей такому гену, продуцирует белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно предоставляется в списках последовательностей, так и некодирующая цепь, используемые в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут называться кодирующими белок или другой продукт такого гена или кДНК.
Если не оговорено иное, «нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность» включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга, и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Выражение «нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК, также может включать интроны» означает, что нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в каком-то варианте содержать интрон(ы).
Термины «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» используются в настоящем описании как взаимозаменяемые и относятся к количеству соединения, препарата, материала или композиции, описанных в настоящем описании, эффективному для достижения определенного биологического результата.
Термин «эндогенный» относится к любому материалу от или полученному в организме, клетке, ткани или системе.
Термин «экзогенный» относится к любому материалу от или полученному вне организма, клетки, такни или системы.
Термин «экспрессия» относится к транскрипции и/или трансляции определенной нуклеотидной последовательности, полученной с помощью промотора.
Термин «трансферный вектор» относится к композиции вещества, которая включает изолированную нуклеиновую кислоту, и которую можно использовать для доставки нуклеиновой кислоты в клетку. В технике известно много векторов, включая, но не ограничиваясь перечисленным, линейные полинукелеотиды, полинукелеотиды, связанные с ионногенными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Таким образом, термин «трансферный вектор» включает автономно реплицирующиеся плазмиду или вирус. Термин также следует истолковывать как включающий дополнительно неплазмидные и невирусные соединения, которые облегчают перенос нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновое производное, липосома и т.п. Примеры вирусных трансферных векторов включают, но не ограничиваются перечисленным, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и т.п.
Термин «экспрессирующий вектор» относится к вектору, включающему рекомбинантный полинуклеотид, включающий экспрессирующие регулярные последовательности, оперативно соединенные с экспрессируемой нуклеотидной последовательностью. Экспрессирующий вектор включает достаточные цис-действующие элементы для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут быть предоставлены клеткой-реципиентом или в in vitro экспрессирующей системе. Экспрессирующие векторы включают все векторы, известные в технике, включая космиды, плазмиды (например, открытые или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые включают рекомбинантный полинуклеотид.
Термин «лентивирус» относится к роду семейства Retroviridae. Лентивирусы уникальны среди ретровирусов по способности инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-реципиента, так что они являются одним из наиболее эффективных способов доставки вектора в ген. Примерами лентивирусов являются HIV, SIV и FIV.
Термин «лентивирусный вектор» относится к вектору, полученному из по меньшей мере части лентивирусного генома, включая в особенности самоинактивирующийся лентивирусный вектор, описанный в Milone et al., Mol. Ther., 17(8): 1453-1464 (2009). Другие примеры лентивирусных векторов, которые можно использовать в клинических условиях, включают, но не ограничиваются перечисленным. например, технологию доставки генов LENTIVECTOR® от Oxford BioMedica, векторную систему LENTIMAX™ от Lentigen и т.п.. Неклинические типы векторов также доступны и должны быть известны специалистам в данной области техники.
Термин «гомологичность» или «идентичность» относится к идентичности субъединиц последовательности двух полимерных молекул, например, двух молекул нуклеиновых кислот или двух молекул РНК или двух полипептидных молекул. Когда позиция субъединицы в обеих из двух молекул занята одной и той же мономерной единицей, например, если позиция в каждой из двух молекул ДНК занята аденином, тогда они являются гомологичными или идентичными в этой позиции. Гомология между двумя последовательностями является прямой функцией числа совпадений или гомологичных позиций; например, если половина (например, пять позиций в полимере длиной в десять субъединиц) позиций в двух последовательностях являются гомологичными, две последовательности являются гомологичными на 50%; если 90% позиций (например, 9 из 10) совпадают или являются гомологичными, две последовательности являются гомологичными на 90%.
«Гуманизированные» формы не являющихеся человеческими (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2, или другие антигенсвязывающие последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части, гуманизированные антитела и фрагменты таких антител представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело или фрагмент антитела), в которых остатки из определяющего комплементарность участка (CDR) реципиента заменяются остатками из CDR вида, не относящегося к человеку, такого как мышь, крыса или кролик, имеющего желательную специфичность, аффинность и потенциал. В некоторых случаях остатки каркасного участка Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Более того, гуманизированное антитело/фрагмент антитела может включать остатки, которые не обнаруживаются ни в антителе реципиента, ни в введенном CDR или каркасных последовательностях. Такие модификации могут дополнительно улучшать и оптимизировать действии антитела или фрагмента антитела. Вообще гуманизированное антитело или фрагмент такого антитела будет включать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все участки CDR соответствуют участкам нечеловеческого иммуноглобулина, и все или значительная часть участков FR представляют собой участки последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или фрагмент такого антитела также может включать по меньшей мере часть константного участка (Fc) иммуноглобулина, типично участка иммуноглобулина человека. Другие подробности см. в Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.
«Полностью человеческий» относится к иммуноглобулину, такому как антитело или фрагмент антитела, где вся молекула человеческого происхождения или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной человеческой форме антитела или иммуноглобулина.
Термин «изолированный» означает измененный или извлеченный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, присутствующие по природе в живом организме, не являются «изолированными», но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отдельные от материалов, с которыми совместно существуют в своем природном состоянии, являются «изолированными». Изолированные нуклеиновая кислота или белок могут существовать по существу в чистой форме или могут существовать в ненативной окружающей среде, такой как, например, клетка-реципиент.
В контексте настоящего изобретения используются приведенные далее аббревиатуры для обычно используемых нуклеотидных оснований. «А» относится к аденозину, «С» относится к цитозину, «G» относится к гуанозину, «Т» относится к тимидину и «U» относится к уридину.
Термин «операбельно соединенный» или «транскрипционный контроль» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной нуклеотидной последовательностью, полученной при экспрессии последней. Например, первая нуклеотидная последовательность операбельно соединена со второй нуклеотидной последовательностью, когда первая нуклеотидная последовательность заменяется в функциональном соотношении второй нуклеотидной последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Операбельно соединенные ДНК-последовательности могут соприкасаться друг с другом и, например, где необходимо, соединять два кодирующих белок участка, находятся в одной и той же рамке считывания.
Термин «парентеральное» введение иммуногенной композиции включает, например, подкожную (s/c), внутривенную (i.v.) или интрастернальную инъекцию, внутриопухолевые или инфузионные методы.
Термин «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотид» относятся к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам в одно- или двухцепочечной форме. Если нет конкретных ограничений, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют свойства связывания, схожие с эталонной нуклеиновой кислотой, и метаболизируются подобно нуклеотидам, встречающимся в природе. Если не указано иное, определенная нуклеотидная последовательность также косвенно охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденного кодона), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также точно указанную последовательность. Конкретно замен вырожденного кодона можно достигнуть путем генерации последовательностей, в которых третья позиция одного или нескольких (или всех) выбранных кодонов заменена смешанными основными и/или дезоксинозиновыми остатками (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260: 2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8: 91-98 (1994)).
Термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются как взаимозаменяемые и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно соединенных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и нет ограничения по числу аминокислот, которые могут составлять белковую или пептидную последовательность. Полипептиды включают любой пептид или белок, включающий две или больше аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Используемый в настоящем описании термин относится как к коротким цепям, которые обычно в технике называют пептидами, олигопептидами и олигомерами, например, так и к более длинным цепям, которые обычно называют в технике белками, которых существует множество типов. «Полипептиды» включают, например, среди прочих, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептидам, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.
Термин «протомер» относится к ДНК последовательности, узнаваемой синтетическим аппаратом клетки или введенным синтетическим аппаратом, требуемым для инициации специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.
Термин «промотор/регуляторная последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, которая требуется для экспрессии генного продукта, операбельно соединенного с промотором/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях такая последовательность может представлять собой коровую промоторную последовательность, и в других случаях такая последовательность также может включать энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, которые требуются для экспрессии генного продукта. Промотор/регуляторная последовательность может представлять собой элемент, который экспрессирует генный продукт в ткани специфически.
Термин «конститутивный» промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, когда операбельно связана с полинуклеотидом, который кодирует или точно определяет генный продукт, вызывает продуцирование генного продукта в клетке при большинстве или всех физиологических состояниях клетки.
Термин «индуцируемый промотор» относится к нуклеотидной последовательности, которая, когда операбельно связана с полинуклеотидом, который кодирует или точно определяет генный продукт, вызывает продуцирование генного продукта в клетке по существу только тогда, когда в клетке присутствует индуктор, который соответствует промотору.
Термин «тканеспецифический» промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, когда операбельно связана с полинуклеотидом, который кодирует или точно определяет генный продукт, вызывает продуцирование генного продукта в клетке по существу только если клетка представляет собой клетку ткани типа, соответствующего промотору.
Термин «жесткий полипептидный линкер» или «линкер», используемый в контексте scFv, относится к полипептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как глицин и/или сериновые остатки, используемых отдельно или в комбинации, для соединения вариабельных участков тяжелой и легкой цепи. В одном воплощении жесткий полипептидный линкер представляет собой линкер Gly/Ser и включает аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 38), где n равен положительному числу, равному или превышающему 1. Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 и n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10. В одном воплощении жесткие полипептидные линкеры включают, но не ограничивается указанным, (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO:27) или (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO:28). В другом воплощении линкеры включают несколько повторов (Gly2Ser), (GlySer) или (Gly3Ser) (SEQ ID NO:29). В объем изобретения также включены линкеры, описанные в WO2012/138475, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
При использовании в настоящем описании 5'-кэп (также называемый РНК-кэп, РНК-7-метилгуанозиновый кэп или РНК m7G-кэп) представляет собой модифицированный нуклеотид гуанин, который добавлен к «фронту» или 5'-концу эукариотной матричной РНК вскоре после начала транскрипции. Состоит 5'-кэп из концевой группы, которая соединяется с первым транскрибированным нуклеотидом. Его присутствие критично для узнавания рибосомой и защиты от РНКаз. Добавление кэпа сочетается с транскрипцией и происходит котранскрипционно, так что одно влияет на другое. Вскоре после начала транскрипции 5'-конец мРНК, будучи синтезированным, связывается синтезирующим кэп комплексом, связанным с РНК-полимеразой. Такой ферментный комплекс катализирует химические реакции, которые требуются для кэпирования мРНК. Синтез протекает как многостадийная биохимическая реакция. Кэпирующую группу можно модифицировать для модуляции функциональности мРНК, такой как стабильность или эффективность трансляции.
При использовании в настоящем описании «in vitro транскрибированная РНК» относится к РНК, предпочтительно, мРНК, которая синтезирована in vitro. Как правило, in vitro транскрибированную РНК генерируют из транскрипционного вектора in vitro. Транскрипционный вектор in vitro включает матрицу, которую используют для генерации in vitro транскрибированной РНК.
При использовании в настоящем описании «поли(А)» представляет собой ряд аденозинов, присоединенных путем полиаденилирования к мРНК. В предпочтительном воплощении конструкции для временной экспрессии поли-А предпочтительно представляет собой от 50 до 5000 (SEQ ID NO: 30), предпочтительно больше 64, предпочтительнее больше 100, наиболее предпочтительно больше 300 или 400. Последовательности поли(А) иожно модифицировать химически или ферментативно для модуляции функциональности мРНК, такой как локализация, стабильность или эффективность трансляции.
При использовании в настоящем описании «полиаденилирование» относится к ковалентной связи полиаденилильной части или ее модифицированного варианта с молекулой матричной РНК. В эукариотных организмах большинство молекул матричной РНК (мРНК) являются полиаденилированными по 3'-концу. Хвост 3'-поли(А) представляет собой длинную последовательность из адениновых нуклеотидов (обычно нескольких сотен), добавленных к пре-мРНК через действие фермента полиаденилатполимеразы. В высших эукариотах хвост поли(А) добавлен к транскриптам, которые содержат специфическую последовательность сигнал полиаденилирования. Хвост поли(А) и белок, связанный с ним, способствуют защите мРНК от разрушения экзонуклеазами. Полиаденилирование также важно для терминации транскрипции, экспорта мРНК из ядра и трансляции. Полиаденилирование происходит в ядре непосредственно после транскрипции ДНК в РНК, но кроме того, также может происходить позднее в цитоплазме. После терминации транскрипции цепь мРНК расщепляется под действием эндонуклеазного комплекса, ассоциированного с РНК-полимеразой. Сайт расщепления обычно характеризуется присутствием последовательности оснований AAUAAA вблизи сайта расщепления. После расщепления мРНК аденозиновые остатки присоединяются к свободному 3'-концу в сайте расщепления.
При использовании в настоящем описании «временная» относится к экспрессии неинтегрированного трансгена в течение часов, дней или недель, где период времени экспрессии меньше, чем период времени экспрессии гена, если интегрирован в геном или содержится в устойчивом плазмидном репликоне в клетке-хозяине.
Используемые в настоящем описании термины «лечить», «лечение» и «лечащий» относятся к ослаблению или уменьшению интенсивности развития, тяжести и/или длительности пролиферативного расстройства или уменьшению интенсивности одного или нескольких симптомов (предпочтительно одного или нескольких видимых симптомов) пролиферативного расстройства, в результате введения одной или нескольких терапий (например, одного или нескольких терапевтических сресдств, таких как CAR по изобретению). В определенных воплощениях термины «лечить», «лечение» и «лечащий» относятся к уменьшению интенсивности по меньшей мере одного измеряемого параметра пролиферативного расстройства, такого как рост опухоли, необязательно заметного для пациента. В других воплощениях термины «лечить», «лечение» и «лечащий» относятся к ингибированию развития пролиферативного расстройства физически, например, путем стабилизации видимого симптома, физиологически, например, путем стабилизации физического параметра, или тому и другому. В других воплощениях термины «лечить», «лечение» и «лечащий» относятся к уменьшению или стабилизации размера опухоли или числа раковых клеток.
Термин «путь сигнальной трансдукции» относится к биохимическому соотношению между различными молекулами сигнальной трансдукции, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Выражение «рецептор клеточной поверхности» включает молекулы и комплексы молекул, способные принимать сигнал и передавать сигнал через мембрану клетки.
Термин «субъект» предназначен для включения живых организмов, в которых может быть вызвана иммунная реакция (например, млекопитающего, человека).
Термин «по существу очищенная» клетка относится к клетке, которая по существу свободна от других типов клеток. По существу очищенной клеткой также называется клетка, которая отделена от других типов клеток, с которыми она обычно связана в своем естественном состоянии. В некоторых случаях популяцией по существу чистых клеток называется гомогенная популяция клеток. В других случаях такой термин относится просто к клетке, которая отделена от клеток, с которыми она обычно связана в своем естественном состоянии. В некоторых аспектах клетки культивируют in vitro. В других аспектах клетки не культивируют in vitro.
Термин «терапевтический», используемый в настоящем описании, обозначает лечение. Терапевтическое действие получают путем уменьшения, супрессии, ремиссии или устранения болезненного состояния.
Термин «профилактический», используемый в настоящем описании, обозначает предупреждение или протективное лечение болезни или болезненного состояния.
В контексте настоящего изобретения «опухолевый антиген» или «антиген гиперолиферативного расстройства» или «антиген, ассоциированный с гиперолиферативным расстройством» относятся к антигенам, которые обычны для специфических гиперолиферативных расстройств. В некоторых аспектах антигены гиперолиферативного расстройства по настоящему изобретению происходят от раковых заболеваний, включая, но не ограничиваясь перечисленным, первичную или метастазирующую меланому, тимому, лимфому, саркому, рак легких, рак печени, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, лейкоз, рак матки, цервикальный рак, рак мочевого пузыря, рак почек, и аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы и т.п..
Термин «трансфицированный» или «трансформированный» или «трансдуцированный» относится к процессу, путем которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или вводят в клетку-реципиента. «Трансфицированная» или «трансформированная» или «трансдуцированная» клетка представляет собой клетку, которая трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована экзогенной нуклеиновой кислотой. Клетка включает первичную клетку субъекта и ее потомство.
Термин «специфически связывает» относится к антителу или лиганду, которые узнают и связываются со сходным партнером по связыванию (например, стимулирующей и/или костимулирующей молекулой, присутствующей в Т-клетке) белком, присутствующем в образце, но такие антитело или лиганд по существу не узнают или не связываются с другими молекулами в образце.
«Регулирующий химерный антигенный рецептор (RCAR)» при использовании в настоящем описании относится к набору полипептидов, типично двум в самых простых воплощениях, которые, когда находятся в иммунной эффекторной клетке, придают клетке специфичность в отношении клетки-мишени, обычно раковой клетке, и с генерацией регулируюющего внутриклеточного сигнала. В некоторых воплощениях RCAR включает по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в настоящем описании «внутриклеточным сигнальным доменом»), включающий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы и/или костимулирующей молекулы, определенных в настоящем описании в контексте в связи с молекулой CAR. В некоторых воплощениях полипептиды набора в RCAR не соприкасаются друг с другом, например, находятся в различных полипептидных цепях. В некоторых воплощениях RCAR включает молекулу димеризации, может соединять полипептиды друг с другом, например, может соединять антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых воплощениях RCAR экспрессируется в клетке (например, иммунной эффекторной клетке), описанной в настоящем описании, например, RCAR-экспрессирующей клетке (также называемой в настоящем описании «RCARХ-клеткой»). В одном воплощении RCARХ-клетка представляет собой Т-клетку и называется RCARТ-клеткой. В одном воплощении RCARХ-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCARN-клеткой. RCAR может предоставить RCAR-экспрессирующую клетку со специфичностью к клетке-мишени, обычно опухолевой клетке, и с генерацией регулирующего сигнала или пролиферации, что может оптимизировать иммунное эффекторное свойство RCAR-экспрессирующей клетки. В воплощениях RCAR-клетка опирается, по меньшей мере частично, на антигенсвязывающий домен для обеспечения специфичности к клетке-мишени, которая включает антиген, связываемый антигенсвязывающим доменом.
Термин «мембранный якорь» или «мембрансвязывающий домен», используемый в настоящем описании, относится к полипептиду или группе, например, миристоильной группе, достаточным для закрепления внеклеточного или внутриклеточного домена в плазматической мембране.
Термин «переключающий домен», используемый в настоящем описании, например, в связи с RCAR, относится к элементу, типично элементу на основе полипептида, который в присутствии димеризующей молекулы ассоциируется с другим переключающим доменом. Результатом ассоциации является функциональное сочетание первого элемента, соединенного с, например, слитого с, первым переключающим доменом, и второго элемента, соединенного с, например, слитого с, вторым переключающим доменом. Первый и второй переключающие домены вместе называются переключателем гомодимеризации. В воплощениях первый и второй переключающие домены являются одинаковыми, например, они представляют собой полипептиды, имеющие одинаковую первичную последовательность, и вместе называются переключателем гомодимеризации. В воплощениях первый и второй переключающие домены отличаются друг от друга, например, они представляют собой полипептиды, имеющие различные первичные последовательности, и вместе называются переключателем гетеродимеризации. В воплощениях переключатель является внутриклеточным. В воплощениях переключатель является внеклеточным. В воплощениях переключающий домен представляет собой элемент на основе полипептида, например, FKBP или на основе FKB, и димеризующая молекула является небольшой молекулой, например, рапалогом. В воплощениях переключающий домен представляет собой элемент на основе полипептида, например, scFv, который связывает myc пептид, и димеризующая молекула представляет собой полипептид, его фрагмент или полимер полипептида, например, myc лиганд или полимеры myc лиганда, которые связывают один или больше myc scFv. В воплощениях переключающий домен представляет собой элемент на основе полипептида, например, myc рецептор, и димеризующая молекула представляет собой антитело или его фрагменты, например, myc антитело.
«Димеризующая молекула» как термин, используемый в настоящем описании, например, в связи с RCAR, относится к молекуле, которая промотирует ассоциацию первого переключающего домена со вторым переключающим доменом. В воплощениях димеризующая молекула не встречается по природе у субъекта или не встречается в концентрациях, которые приведут к существенной димеризации. В воплощениях димеризующая молекула является небольшой молекулой, например, рапамицина или раполога, например, RAD001.
Термин «биоэквивалент» относится к количеству агента иного, чем эталонное соединение (например, RAD001), требуемому для получения действия, эквивалентного действию, производимому эталонной дозой или эталонным количеством эталонного соединения (например, RAD001). В одном воплощении действие является уровнем ингибирования mTOR, например, при измерении по ингибированию киназы P70 S6, например, по оценке в анализе in vivo или in vitro, например, при измерении с помощью анализа, описанного в настоящем описании, например, анализа Boulay, или измерении уровней фосфорилированного S6 вестерн-блоттингом. В одном воплощении действием является изменение отношения PD-1-положительные/PD-1-отрицательные Т-клетки при измерении сортингом клеток. В одном воплощении биоэквивалентное количество или доза ингибитора mTOR является количеством или дозой, которые достигают такого же уровня ингибирования киназы P70 S6, как эталонная доза или эталонное количество эталонного соединения. В одном воплощении биоэквивалентное количество или доза ингибитора mTOR является количеством или дозой, которые достигают такого же уровня изменение отношения PD-1-положительные/PD-1-отрицательные Т-клетки, как эталонная доза или эталонное количество эталонного соединения.
Термин «малая иммуностимулирующая доза», когда используется в связи с ингибитором mTOR, например, аллостерическим ингибитором mTOR, например, RAD001 или рапамицином, или каталитическим ингибитором mTOR, относится к дозе ингибитора mTOR, которая частично, но не полностью, ингибирует активность mTOR, при измерении с помощью ингибирования активности киназы P70 S6. Способы оценки активности mTOR, например, с помощью ингибирования киназы P70 S6, обсуждаются в настоящем описании. Доза недостаточна для того, чтобы привести к полной иммунной супрессии, но достаточна для усиления иммунной реакции. В одном воплощении малая иммуностимулирующая доза ингибитора mTOR приводит к уменьшению числа PD-1-положительных Т-клеток и/или повышению числа PD-1-отрицательных Т-клеток, или повышает отношение PD-1-отрицательные Т-клетки/PD-1-положительные Т-клетки. В одном воплощении малая иммуностимулирующая доза ингибитора mTOR приводит к повышению числа наивных Т-клеток. В одном воплощении малая иммуностимулирующая доза ингибитора mTOR приводит к одному или нескольким из следующих изменений:
усиление экспрессии одного или нескольких из следующих маркеров: CD62Lhigh, CD127high, CD27+ и BCL2, например, на Т-клетках памяти, например, предшественниках Т-клеток памяти;
уменьшение экспрессии KLRG1, например, на Т-клетках памяти, например, предшественниках Т-клеток памяти; и
повышение числа предшественников Т-клеток памяти, например, клеток с одной из комбинаций следующих характеристик: повышенный CD62Lhigh, повышенный CD127high, повышенный CD27+, сниженный KLRG1 и повышенный BCL2;
причем любое из изменений, описанных выше, происходит, например, по меньшей мере временно, например, по сравнению с субъектом, не получавшим лечение.
«Рефрактерный» при использовании в настоящем описании относится к заболеванию, например, раку, которое не реагирует на лечение. В воплощениях рефрактерный рак может быть резистентным к лечению до или при начале лечения. В других воплощениях рефрактерный рак может становиться резистентным во время лечения. Рефрактерным раком также называют резистентный рак.
«Рецидивный» или «рецидив» при использовании в настоящем описании относится к повторному появлению заболевания (например, рака) или признаков и симптомов заболевания, такого как рак, после периода улучшения или восприимчивости, например, после предыдущего курса терапии, например, противораковой терапии. Например, период восприимчивости может включать падение уровня раковых клеток ниже определенного порога, например, ниже 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Повторное появление может включать уровень раковых клеток, превышающих определенный порога, например, выше 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%.
Интервалы: во всем настоящем раскрытии различные аспекты могут быть представлены в формате интервалов. Следует иметь в виду, что описание в формате интервалов дается только для удобства и краткости и не должно рассматриваться как неизменное ограничение объема изобретения. Соответственно, описание интервала следует рассматривать как конкретно раскрытые все возможные подинтервалы, а также отдельные числовые значения в таком интервале. Например, описание интервала, такого как от 1 до 6, следует рассматривать как имеющее конкретно раскрытые подинтервалы, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также как отдельные числа в таком интервале, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Как другой пример, интервал, такой как идентичность 95-99%, включает что-то с идентичностью 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, и включает подинтервалы, такие как идентичность 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% и 98-99%. Это применимо независимо от ширины интервала.
Описание
Настоящее изобретение относится к композициям веществ и способам для применения для лечения заболевания, такого как рак, с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR) CLL-1.
В одном аспекте изобретение относится к ряду химерных антигенных рецепторов (CAR), включающих антитело или фрагмент антитела, сконструированные для специфического связывания с белком CLL-1 или его фрагментом. В одном аспекте изобретение относится к клетке (например, иммунной эффекторной клетке, например, Т-клетке или NK-клетке), сконструированной для эеспрессии CAR, где CAR Т-клетки («CART») проявляют противоопухолевое свойство. В одном аспекте клетку трансформируют CAR, и по меньшей мере часть конструкции CAR экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых воплощениях клетка (например, иммунная эффекторная клетка, например, Т-клетка или NK-клетка) трансдуцирована вирусным вектором, кодирующим CAR. В некоторых воплощениях вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор. В некоторых воплощениях вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых воплощениях клетка может устойчиво экспрессировать CAR. В другом воплощении клетка (например, иммунная эффекторная клетка, например, Т-клетка или NK-клетка) трансфицирована нуклеиновой кислотой, например, мРНК, кДНК, ДНК, кодирующей CAR. В некоторых воплощениях клетка может временно экспрессировать CAR.
В одном аспекте связывающая часть человеческого анти-CLL-1 белка представляет собой фрагмент антитела scFv. В одном аспекте такие фрагменты антител являются функциональными в том отношении, что они сохраняют эквивалентную аффинность связывания, например, они связывают тот же антиген с эффективностью, сравнимой с антителом IgG, имеющим такие же вариабельные участки тяжелой и легкой цепи. В одном аспекте такие фрагменты антител являются функциональными в том отношении, что они обеспечивают биологическую реакцию, которая может включать, но не ограничиваться, активацию иммунной реакции, ингибирование происхождения сигнальной трансдукции из ее антигена-мишени, ингибирование киназной активности и т.п., что будет понятно специалистам в данной области техники.
В некоторых аспектах антитела по изобретению включаются в химерный антигенный рецептор (CAR). В одном аспекте CAR включает полипептидную последовательность, представленную в настоящем описании как SEQ ID NO: 91-103.
В одном аспекте анти-CLL-1 связывающий домен, например, человеческий scFv, часть CAR по изобретению кодируется трансгеном, последовательность которого является кодоном, оптимизированным для экспрессии в клетке млекопитающего. В одном аспекте вся конструкция CAR по изобретению кодируется трансгеном, полная последовательность которого является кодоном, оптимизированным для экспрессии в клетке млекопитающего. Оптимизация кодона относится к открытию, что частота появления синонимичных кодонов (т.е., кодонов, которые кодируют одну и ту же аминокислоту) в кодирующей ДНК смещена в различных видах. Такое вырождение кодонов допускает, чтобы идентичный полипептид был кодирован несколькими нуклеотидными последовательностями. Ряд способов оптимизации кодонов известен в технике и включает, например, способы, раскрытые, как минимум, в патентах США №№ 5786464 и 6114148.
В одном аспекте человеческий CLL-1-связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 39-51. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 39. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 40. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 41. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 42. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 43. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 44. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 45. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 46. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 47. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 48. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 49. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 50. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 51. В одном аспекте CAR по изобретению объединяют антигенсвязывающий домен специфического антитела с внутриклеточной сигнальной молекулой. Например, в некоторых аспектах внутриклеточная сигнальная молекула включает, но не ограничивается перечисленным, цепь CD3-дзета, сигнальные молекулы 4-1ВВ и CD28 и их комбинации. В одном аспекте антигенсвязывающий домен связывается с CLL-1. В одном аспекте CLL-1-CAR включает CAR, выбранный из последовательности, представленной в одной или нескольких SEQ ID NO: 91-103 или 197. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 91. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 92. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 94. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 96. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 97. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 98. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 99. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 101. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 102. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 197. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям CLL-1-CAR и их применению в лекарственных средствах и способах лечения, в числе других заболеваний, рака или любой злокачественности или аутоиммунных заболеваний с участием тканей или клеток, которые экспрессируют CLL-1.
В одном аспекте CAR по изобретению можно использовать для устранения CLL-1-экспрессирующих здоровых клеток, посредством чего они пригодны для применения в качестве терапии кондиционирования клеток перед трансплантацией клеток. В одном аспекте CLL-1-экспрессирующие здоровые клетки представляют собой CLL-1-экспрессирующие здоровые стволовые клетки, и трансплантация клеток является трансплантацией стволовых клеток.
В одном аспекте изобретение относится к клетке (например, иммунной эффекторной клетке, например, Т-клетке или NK-клетке), сконструированной для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) по настоящему изобретению, причем клетка (например, CAR-экспрессирующая иммунная эффекторная клетка, например, CAR Т-клетка, например, «CART») проявляет противоопухолевое свойство. Предочтительным антигеном является CLL-1. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR включает фрагмент человеческого анти-CLL-1 антитела. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR включает фрагмент человеческого анти-CLL-1 антитела, включающий scFv. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR включает человеческий анти-CLL-1 scFv. Соответственно, изобретение относится к CLL-1-CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен и встроен в иммунную эффекторную клетку, например, Т-клетку или NK-клетку), и способам его применения для адоптивной терапии. В одном аспекте CLL-1-CAR включает человеческий анти-CLL-1 связывающий домен.
В одном аспекте CLL-1-CAR включает по меньшей мере один внутриклеточный домен, выбранный из группы из сигнального домена CD137 (4-1ВВ), сигнального домена CD28, сигнального домена CD3-дзета и их любой комбинации. В одном аспекте CLL-1-CAR включает по меньшей мере один внутриклеточный домен, выбранный из одной или нескольких костимулирующих молекул иных, чем CD137 (4-1ВВ) или CD28.
Химерный антигенный рецептор (CAR)
Настоящее изобретение относится к CAR (например, полипептиду CAR), который включает анти-CLL-1 связывающий домен (например, человеческий или гуманизированный анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, и где указанный анти-CLL-1 связывающий домен включает определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 1 (HC CDR1), определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 2 (HC CDR2) и определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 3 (HC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи анти-CLL-1 связывающего домена, внесенных в список в таблице 2. Анти-CLL-1 связывающий домен CAR может дополнительно включать участок легкой цепи 1 (LC CDR1), определяющий комплементарность участок легкой цепи 2 (LC CDR2) и определяющий комплементарность участок легкой цепи 3 (LC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи анти-CLL-1 связывающего домена, внесенных в список в таблице 2.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в настоящем описании, например, кодирующей CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен (например, человеческий или гуманизированный CLL-1-связывающий домен, описанный в настоящем описании), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, и где указанный анти-CLL-1 связывающий домен включает определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 1 (HC CDR1), определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 2 (HC CDR2) и определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 3 (HC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи анти-CLL-1 связывающего домена, внесенных в список в таблице 2.
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен CAR может дополнительно включать участок легкой цепи 1 (LC CDR1), определяющий комплементарность участок легкой цепи 2 (LC CDR2) и определяющий комплементарность участок легкой цепи 3 (LC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи анти-CLL-1 связывающего домена, внесенных в список в таблице 2.
В конкретных аспектах конструкция CAR по изобретению включает scFv домен, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, scFv, которому может предшествовать необязательная лидерная последовательность, такая как представленная в SEQ ID NO: 1, и за которым может следовать необязательная шарнирная последовательность, такая как представленная в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, трансмембранный участок, такой как представленный в SEQ ID NO: 6, внутриклеточный сигнальный домен, который включает SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и последовательность CD3-дзета, которая включает SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, например, где домены являются смежными и в одной и той же рамке считывания, образуя отдельный слитый белок. В изобретение также включена нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид каждого из фрагментов scFv, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51. В изобретение также включена нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид каждого из фрагментов scFv, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, и каждый из доменов SEQ ID NO: 1, 2 и 6-9. В одном аспекте пример конструкции CLL-1-CAR включает необязательную лидерную последовательность, внеклеточный антигенсвязывающий домен, шарнир, транмсембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен.
В некоторых воплощениях полноразмерные последовательности CAR также представлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 91-103, показанные в таблице 2.
Пример лидерной последовательности представлен как SEQ ID NO: 1. Пример шарнирной/спейсерной последовательности представлен как SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Пример последовательности транмсембранного домена представлен как SEQ ID NO: 6. Пример последовательности внутриклеточного сигнального домена белка 4-1ВВ представлен как SEQ ID NO: 7. Пример последовательности внутриклеточного сигнального домена CD27 представлен как SEQ ID NO: 8. Пример последовательности домена CD3-дзета представлен как SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.
В одном аспекте настоящее изобретение охватывает конструкцию рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включающую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, где молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую CLL-1-связывающий домен, например, описанный в настоящем описании, например, смежный с и в той же рамке считывания, что и нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен. В одном аспекте CLL-1-связывающий домен выбирают из одной или нескольких SEQ ID NO: 39-51. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 39. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 40. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 41. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 42. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 43. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 44. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 45. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 46. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 47. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 48. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 49. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 50. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 51.
В одном аспекте настоящее изобретение охватывает конструкцию рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включающую трансген, кодирующий CAR, где молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую анти-CLL-1 связывающий домен, выбранный из одной или нескольких последовательностей SEQ ID NO: 39-51, где последовательность является смежной с или в той же рамке считывания, что и нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен. Пример внутриклеточного сигнального домена, который может быть использован в CAR, включает, но не ограничивается перечисленным, один или больше внутриклеточных сигнальных доменов, например, CD3-дзета, CD28, 4-1ВВ и т.п. В некоторых случаях CAR может включать любую комбинацию CD3-дзета, CD28, 4-1ВВ и т.п. В одном аспекте нуклеотидную последовательность конструкции CAR по изобретению выбирают из одной или нескольких SEQ ID NO: 104-116 или 198. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 104. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 105. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 106. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 107. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 108. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 109. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 110. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 111. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 112. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 113. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 114. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 115. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 116. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 198. Нуклеотидные последовательности, кодирующие нужные молекулы, можно получить с использованием рекомбинантных методов, известных в технике, таких как, например, скрининг библиотек из клеток, экспрессирующих ген, образование гена из вектора, известного как включающего их, или выделение прямо из клеток и тканей, содержащих их, с использованием стандартных методов. С другой стороны, представляющую интерес нуклеиновую кислоту можно получить синтетически, а не клонированием.
Настоящее изобретение включает конструкции ретровирусных и лентивирусных векторов, экспрессирующие CAR, которые могут быть непосредственно трансдуцированы в клетку.
Настоящее изобретение включает конструкцию РНК, которая может быть непосредственно трансдуцирована в клетку. Способ генерации мРНК для применения в трансфекции включает транскрипцию in vitro (IVT) матрицы с помощью специально созданных праймеров с последующим присоединением поли(А) для получения конструкции, содержащей 3'- и 5'-нетранслируемую последовательность («UTR»), 5'-кэп и/или внутренний сайт входа рибосомы (IRES), нуклеиновую кислоту, которую экспрессируют, и хвост поли(А) типично в 50-2000 оснований в длину (SEQ ID NO: 35). Полученная таким образом РНК может эффективно трансфицировать различные виды клеток. В одном воплощении матрица включает последовательности для CAR. В одном воплощении РНК-CAR вектор трансдуцируют в Т-клетку путем электропорации.
Антигенсвязывающий домен
CAR по настоящему изобретению включают мишень-специфический связывающий домен. Выбор группы зависит от типа и числа лигандов, которые определяют поверхность клетки-мишени. Например, антигенсвязывающий домен можно выбрать для узнавания лиганда, который действует как маркер клеточной поверхности на клетках-мишенях, связанных с определенным болезненным состоянием. Так, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут действовать как лиганды для антигенсвязывающего домена в CAR по изобретению, включают маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.
В одном аспекте CAR-опосредуемая Т-клеточная реакция может быть направлена на антиген, представляющий интерес, путем конструирования антигенсвязывающего домена, который спецфически связывает нужный антиген в CАR.
В одном аспекте CAR по настоящему изобретению включает связывающий домен, который специфически связывает CLL-1. В одном аспекте антигенсвязывающий домен специфически связывает человеческий CLL-1.
Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном, включая, но не ограничиваясь перечисленным, моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, его функциональный фрагмент, включая, но не ограничиваясь перечисленным, однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VНH) нанотела от камелидов, и с другой стороны, каркас, известный в технике как функционирующий как антигенсвязывающий домен, такой как домен рекомбинантного фибронектина, и т.п. В некоторых случаях благоприятно получать антигенсвязывающий домен от того же вида, в котором в конечном счете будет примнен CAR. Например, для применения людьми может быть благоприятно, чтобы антигенсвязывающий домен CAR включал человеческие или гуманизированные остатки для антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела.
В некоторых случаях благоприятно получать антигенсвязывающий домен из того же вида, в котором в конечном счете будет примнен CAR. Например, для применения людьми может быть благоприятно, чтобы антигенсвязывающий домен CAR включал человеческие или гуманизированные остатки для антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела. Так, в одном аспекте антигенсвязывающий домен включает человеческое антитело или фрагмент такого антитела.
Так, в одном аспекте антигенсвязывающий домен включает человеческое антитело или фрагмент такого антитела. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (НC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (НC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (НC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1-связывающего домена, включающего один или больше, например, все три, LC CDR и один или больше, например, все три, НC CDR. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (НC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (НC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (НC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческий анти-CLL-1 связывающий домен имеет два вариабельных участка тяжелой цепи, причем каждый содержит НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3, описанные в настоящем описании. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает человеческий вариабельный домен легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 4), и/или человеческий вариабельный домен тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 3). В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает человеческий вариабельный домен тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 3), например, по меньшей мере два вариабельных участка тяжелой цепи, описанных в настоящем описании (например, в таблице 3). В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности из таблицы 4. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленной в таблице 4, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности из таблицы 4; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленной в таблице 3, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности из таблицы 3. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 52-64, или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, присоединяется к вариабельному участку тяжелой цепи, включающему аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например. в таблице 2, через линкер, например, линкер, описанный в настоящем описании. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly4-Ser)n, где n равен 1. 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи.
В одном аспекте часть антигенсвязывающего домена включает одну или больше последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 39-41. В одном аспекте CAR выбирают из одной или нескольких последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 91-103 или 197.
В одном аспекте анти-CLL-1 связывающий домен характеризуется определенными функциональными особенностями или свойствами антитела или фрагмента антитела. Например, в одном аспекте часть композиции CAR по изобретению, которая включает антигенсвязывающий домен, специфически связывает человеческий CLL-1.
В одном аспекте изобретение относится к антигенсвязывающему домену, включающему антитело или фрагмент антитела, где связывающий домен антитела специфически связывается с белком CLL-1 или его фрагментом, где антитело или фрагмент антитела включает вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39-51. В одном аспекте антигенсвязывающий домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39-51. В некоторых аспектах scFv является смежным с и в той же рамке считывания, что и лидерная последовательность. В одном аспекте лидерная последовательность представляет собой полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1.
В одном аспекте человеческий анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В одном аспекте человеческий анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой Fv, Fab, (Fab')2 или бифункциональное (например, биспецифическое) гибридное антитело (см., например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol., 17, 105 (1987)). В одном аспекте антитела и их фрагменты по изобретению связывают белок CLL-1 или его фрагмент с аффинностью дикого типа или усиленной аффинностью.
В некоторых случаях человеческий scFv получают из библиотеки дисплеев. Библиотека дисплеев представляет собой набор элементов; каждый элемент включает доступный полипептидный компонент и возместимый компонент, который кодирует или идентифицирует полипептидный компонент. Полипептидный компонент варьируется таким образом, что представляются различные аминокислотные последовательности. Полипептидный компонент может иметь любую длину, например, от трех аминокислот до более 300 аминокислот. Элемент библиотеки дисплеев может включать более одного полипептидного компонента, например, две полипептидные цепи Fab. В одном примере воплощения библиотеку дисплеев можно использовать для идентификации человеческого CLL-1-связывающего домена. При отборе полипептидный компонент каждого члена библиотеки зондируют с CLL-1 или его фрагментом, и если полипептидный компонент связывается с CLL-1, член библиотеки дисплеев идентифицируют, типично путем удерживания на носителе.
Удержанные члены библиотеки дисплеев извлекают из носителя и анализируют. Анализ может включать амплификацию и последующую селекцию в схожих или различных условиях. Например, можно чередовать положительную и отрицательную селекции. Анализ также может включать определение аминокислотной последовательности полипептидного компонента, т.е., CLL-1-связывающего домена, и очистку полипептидного компонента для подробной характеризации.
Ряд форматов можно использовать для библиотек дисплеев. Примеры включают фаговый дисплей. В фаговом дисплее белковый компонент типично ковалентно соединен с белком фаговой оболочки. Связь является результатом трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей белковый компонент, слитый с белком оболочки. Связь может включать жесткий пептидный линкер, протеазный сайт или аминокислоту, внедренную в результате супрессии стоп-кодона. Фаговый дисплей описан, например, в U.S. 5223409; Smith (1985), Science, 228: 1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999), J. Biol. Chem., 274: 18218-30; Hoogenboom et al. (1998), Immunotechnology, 4: 1-20; Hoogenboom et al. (2000), Immunol. Today, 2: 371-8, и Hoet et al. (2005), Nat. Biotechnol., 23(3), 344-8. Отображение бактериофагов белкового компонента можно вырастить и харвестировать с использованием стандартных методов получения фагов, например, преципитацией ПЭГ из культуральной среды. После селекции отдельных фаговых дисплеев нуклеиновую кислоту, кодирующую выбранные белковые компоненты, можно выделить из клеток, инфицированных выбранными фагами, или из самих фагов после амплификации. Отдельные колонии или бляшки можно пикировать, нуклеиновую кислоту изолируют и секвенируют.
Другие форматы дисплеев включают клеточный дисплей (см., например, WO 03/029456), гибриды белок-нуклеиновая кислота (см., например, US 6207446), рибосомный дисплей (см., например, Mattheakis et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 9022; и Hanes et al. (2000), Nat. Biotechnol., 18: 1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol., 328: 404-30; и Schaffitzel et al. (1999), J. Immunol. Methods, 231(1-2): 119-35), и периплазматический дисплей E. coli (2005, Nov. 22; PMID: 16337958).
В некоторых случаях sсFv можно получить согласно способу, известному в технике (см., например, Bird et al., (1988), Science, 242: 423-426; и Huston et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883). Молекулы sсFv можно получить, соединяя участки VH и VL вместе с использованием жестких полипептидных ликеров. Молекулы sсFv включают линкер (например, линкер Ser-Gly) оптимизированной длины и/или композиции аминокислот. Длина линкера может существенно влиять как на сложение, так и на взаимодействие вариабельных участков sсFv. Действительно, если используют короткий полипептидный линкер (например, в 5-10 аминокислот), предотвращается внутрицепной (intrachain) фолдинг. Внутрицепной фолдинг также требуется для того, чтобы свести два вариабельных участка вместе с образованием функционального сайта связывания эпитопа. Например, об ориентации и размере линкера см., например, Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 6444-6448, публикации заявок на патент США №№ 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, и публикации PCT №№ WO2006/020258 и WO2007/024715, включенные в настоящее описание в качестве ссылок.
Фрагмент sсFv может включать между его участками VH и VL линкер с по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или большим числом аминокислотных остатков. Линкерная последовательность может включать любую встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых воплощениях линкерная последовательность включает аминокислоты глицин и серин. В другом воплощении линкерная последовательность включает наборы из повторов глицина и серина, таких как (Gly4Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, равное или больше единицы (SEQ ID NO: 25). В одном воплощении линкер может представлять собой (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO: 27) или (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 28). Изменение в длине линкера может сохранить или усилить активность, давая развитие превосходной эффективности в исследованиях активности.
Примеры конструкций человеческого CLL-1-CAR и антигенсвязывающих доменов
Примеры конструкций CLL-1-CAR, раскрытые в настоящем описании, включают scFv (например, человеческий scFv, как раскрыто в таблице 2 в настоящем описании, необязательно с предшествующей лидерной последовательностью, например, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 12, например, лидерными аминокислотной и нуклеотидной последовательностями, соответственно). Последовательности фрагментов человеческого scFv (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 39-51 и нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 52-64) приводятся в настоящем описании в таблице 2. Конструкция CLL-1-CAR может дополнительно включать необязательный шарнирный домен, например, шарнирный домен CD8 (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или кодированный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 13); трансмембранный домен, например, трансмембранный домен CD8 (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или кодированный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17); внутриклеточный домен, например, 4-1ВВ внутриклеточный домен 4-1ВВ (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или кодированный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 18); и функциональный сигнальный домен, например, домен CD3-дзета (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или 10 или кодированный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 20 или 21). В некоторых воплощениях домены являются смежными и находятся в одной и той же рамке считывания, образуя отдельный слитый белок. В других воплощениях домены находятся в различных полипептидах, например, как в молекуле RCAR, как описано в настоящем описании.
В некоторых воплощениях полноразмерная молекула CLL-1-CAR включает аминокислотную последовательность или кодируется нуклеотидной последовательностью CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, приведенными в таблице 2, или последовательностью по существу идентичною (например, на 95-99%) им.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает аминокислотную последовательность scFv CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, приведенную в таблице 2, или включает аминокислотную последовательность scFv или кодируется нуклеотидной последовательностью CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, или последовательностью, по существу идентичную (например, на 95-99%) или с изменениями аминокислот до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами) в любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает вариабельный участок тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, представленные в таблице 2, или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную или с изменениями аминокислот до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HCCDR1, HCCDR2 и/или HCCDR3), представленных в таблице 3; и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LCCDR1, LCCDR2 и/или LCCDR3) CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, представленных в таблице 4; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную или с изменениями аминокислот до 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HCCDR1, HCCDR2 и/или HCCDR3), представленных в таблице 5; и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LCCDR1, LCCDR2 и/или LCCDR3), CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, представленных в таблице 6; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную или с изменениями аминокислот до 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HCCDR1, HCCDR2 и/или HCCDR3), представленных в таблице 7; и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LCCDR1, LCCDR2 и/или LCCDR3), CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, представленных в таблице 8; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную или с изменениями аминокислот до 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из вышеуказанных последовательностей.
Последовательности гуманизированных CDR доменов scFv приводятся в таблицах 3, 5 и 7 для вариабельных доменов тяжелой цепи и в таблицах 4, 6 и 8 для вариабельных доменов легкой цепи. «ID» обозначает соответствующий SEQ ID NO для каждого CDR.
CDR, приведенные в таблицах 3 и 4, соответствуют комбинации схем нумерации Кабата и Чотиа.
Таблица 3. CDR вариабельных доменов тяжелой цепи
Кандидат | HCDR1 | ID | HCDR2 | ID | HCDR3 | ID |
CLL-1-CAR 9 | ANTFSDHVMH | 125 | YIHAANGGTHYSQKFQD | 138 | GGYNSDAFDI | 151 |
CLL-1-CAR 6 | GGSFSGYYWS | 122 | EINHSGSTNYNPSLKS | 135 | GSGLVVYAIRVGSGWFDY | 148 |
CLL-1-CAR 10 | GFTFSSYSMN | 126 | YISSSSSTIYYADSVKG | 139 | DLSVRAIDAFDI | 152 |
CLL-1-CAR 11 | GFTFNSYGLH | 127 | LIEYDGSNKYYGDSVKG | 140 | EGNEDLAFDI | 153 |
CLL-1-CAR 12 | GFNVSSNYMT | 128 | VIYSGGATYYGDSVKG | 141 | DRLYCGNNCYLYYYYGMDV | 154 |
CLL-1-CAR 1 | GGTFSSYAIS | 117 | GIIPIFGTANYAQKFQ | 130 | DLEMATIMGGY | 143 |
CLL-1-CAR 2 | GFTFDDYAMH | 118 | LISGDGGSTYYADSVKG | 131 | VFDSYYMDV | 144 |
CLL-1-CAR 3 | GGSISSSSYYWG | 119 | SIYYSGSTYYNPSLKS | 132 | PGTYYDFLSGYYPFY | 145 |
CLL-1-CAR 4 | GFTFSSYWMS | 120 | NINEDGSAKFYVDSVKG | 133 | DLRSGRY | 146 |
CLL-1-CAR 5 | GGPVRSGSHYWN | 121 | YIYYSGSTNYNPSLEN | 134 | GTATFDWNFPFDS | 147 |
CLL-1-CAR 7 | GFTFSSYSMN | 123 | SISSSSSYIYYADSVKG | 136 | DPSSSGSYYMEDSYYYGMDV | 149 |
CLL-1-CAR 8 | GFTFSSYEMN | 124 | YISSSGSTIYYADSVKG | 137 | EALGSSWE | 150 |
CLL-1-CAR 13 | GYPFTGYYIQ | 129 | WIDPNSGNTGYAQKFQG | 142 | DSYGYYYGMDV | 155 |
181268 | GFTFSSYEMN | 199 | YISSSGSTIYYADSVKG | 200 | DPYSSSWHDAFDI | 201 |
Таблица 4. CDR вариабельных доменов легкой цепи
Кандидат | LCDR1 | ID | LCDR2 | ID | LCDR3 | ID |
CLL-1-CAR 9 | RASQDISSWLA | 164 | AASSLQS | 177 | QQSYSTPLT | 190 |
CLL-1-CAR 6 | RASQSISSYLN | 161 | AASSLQS | 174 | QQSYSTPPWT | 187 |
CLL-1-CAR 10 | QASQDISNYLN | 165 | DASNLET | 178 | QQAYSTPFT | 191 |
CLL-1-CAR 11 | QASQFIKKNLN | 166 | DASSLQT | 179 | QQHDNLPLT | 192 |
CLL-1-CAR 12 | RASQSISSYLN | 167 | AASSLQS | 180 | QQSYSTPPLT | 193 |
CLL-1-CAR 1 | TGTSSDVGGYNYVS | 156 | DVSNRPS | 169 | SSYTSSSTLDVV | 182 |
CLL-1-CAR 2 | RSSQSLVYTDGNTYLN | 157 | KVSNRDS | 170 | MQGTHWSFT | 183 |
CLL-1-CAR 3 | RASQGISSYLA | 158 | AASTLQS | 171 | QQLNSYPYT | 184 |
CLL-1-CAR 4 | RASQSISGSFLA | 159 | GASSRAT | 172 | QQYGSSPPT | 185 |
CLL-1-CAR 5 | RASQSISSYLN | 160 | AASSLQS | 173 | QQSYSTPWT | 186 |
CLL-1-CAR 7 | TGSSGSIASNYVQ | 162 | EDNQRPS | 175 | QSYDSSNQVV | 188 |
CLL-1-CAR 8 | QASQDISNYLN | 163 | DASNLET | 176 | QQYDNLPLT | 189 |
CLL-1-CAR 13 | RASQGISSALA | 168 | DASSLES | 181 | QQFNNYPLT | 194 |
181268 | RASQSVSSSYLA | 202 | GASSRAT | 203 | QQYGSSPLT | 204 |
Таблица 5. CDR вариабельных доменов тяжелой цепи согласно схеме нумерации Кабата (Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)
Кандидат | HCDR1 | ID | HCDR2 | ID | HCDR3 | ID |
146259- CLL-1-CAR9 |
DHVMH | 322 | YIHAANGGTHYSQKFQD | 336 | GGYNSDAFDI | 350 |
139119- CLL-1-CAR6 |
GYYWS | 319 | EINHSGSTNYNPSLKS | 333 | GSGLVVYAIRVGSGWFDY | 347 |
146261- CLL-1-CAR10 |
SYSMN | 323 | YISSSSSTIYYADSVKG | 337 | DLSVRAIDAFDI | 351 |
146262- CLL-1-CAR11 |
SYGLH | 324 | LIEYDGSNKYYGDSVKG | 338 | EGNEDLAFDI | 352 |
146263- CLL-1-CAR12 |
SNYMT | 325 | VIYSGGATYYGDSVKG | 339 | DRLYCGNNCYLYYYYGMDV | 353 |
139115- CLL-1-CAR1 |
SYAIS | 314 | GIIPIFGTANYAQKFQG | 328 | DLEMATIMGGY | 342 |
139116- CLL-1-CAR2 |
DYAMH | 315 | LISGDGGSTYYADSVKG | 329 | VFDSYYMDV | 343 |
139118- CLL-1-CAR3 |
SSSYYWG | 316 | SIYYSGSTYYNPSLKS | 330 | PGTYYDFLSGYYPFY | 344 |
139122- CLL-1-CAR4 |
SYWMS | 317 | NINEDGSAKFYVDSVKG | 331 | DLRSGRY | 345 |
139117- CLL-1-CAR5 |
SGSHYWN | 318 | YIYYSGSTNYNPSLEN | 332 | GTATFDWNFPFDS | 346 |
139120- CLL-1-CAR7 |
SYSMN | 320 | SISSSSSYIYYADSVKG | 334 | DPSSSGSYYMEDSYYYGMDV | 348 |
139121- CLL-1-CAR8 |
SYEMN | 321 | YISSSGSTIYYADSVKG | 335 | EALGSSWE | 349 |
146264- CLL-1-CAR13 |
GYYIQ | 326 | WIDPNSGNTGYAQKFQG | 340 | DSYGYYYGMDV | 354 |
181268 | SYEMN | 327 | YISSSGSTIYYADSVKG | 341 | DPYSSSWHDAFDI | 355 |
Таблица 6. CDR вариабельных доменов легкой цепи согласно схеме нумерации Кабата (Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)
Кандидат | LCDR1 | ID | LCDR2 | ID | LCDR3 | ID |
146259- CLL-1-CAR9 |
RASQDISSWLA | 364 | AASSLQS | 378 | QQSYSTPLT | 392 |
139119- CLL-1-CAR6 |
RASQSISSYLN | 361 | AASSLQS | 375 | QQSYSTPPWT | 389 |
146261- CLL-1-CAR10 |
QASQDISNYLN | 365 | DASNLET | 379 | QQAYSTPFT | 393 |
146262- CLL-1-CAR11 |
QASQFIKKNLN | 366 | DASSLQT | 380 | QQHDNLPLT | 394 |
146263- CLL-1-CAR12 |
RASQSISSYLN | 367 | AASSLQS | 381 | QQSYSTPPLT | 395 |
139115- CLL-1-CAR1 |
TGTSSDVGGYNYVS | 356 | DVSNRPS | 370 | SSYTSSSTLDVV | 384 |
139116- CLL-1-CAR2 |
RSSQSLVYTDGNTYLN | 357 | KVSNRDS | 371 | MQGTHWSFT | 385 |
139118- CLL-1-CAR3 |
RASQGISSYLA | 358 | AASTLQS | 372 | QQLNSYPYT | 386 |
139122- CLL-1-CAR4 |
RASQSISGSFLA | 359 | GASSRAT | 373 | QQYGSSPPT | 387 |
139117- CLL-1-CAR5 |
RASQSISSYLN | 360 | AASSLQS | 374 | QQSYSTPWT | 388 |
139120- CLL-1-CAR7 |
TGSSGSIASNYVQ | 362 | EDNQRPS | 376 | QSYDSSNQVV | 390 |
139121- CLL-1-CAR8 |
QASQDISNYLN | 363 | DASNLET | 377 | QQYDNLPLT | 391 |
146264- CLL-1-CAR13 |
RASQGISSALA | 368 | DASSLES | 382 | QQFNNYPLT | 396 |
181268 | RASQSVSSSYLA | 369 | GASSRAT | 383 | QQYGSSPLT | 397 |
Таблица 7. CDR вариабельных доменов тяжелой цепи согласно схеме нумерации Чотиа (Al-Lazikani et al., (1997), JMB 273, 927-948)
Кандидат | HCDR1 | ID | HCDR2 | ID | HCDR3 | ID |
146259- CLL-1-CAR9 |
ANTFSDH | 406 | HAANGG | 420 | GGYNSDAFDI | 434 |
139119- CLL-1-CAR6 |
GGSFSGY | 403 | NHSGS | 417 | GSGLVVYAIRVGSGWFDY | 431 |
146261- CLL-1-CAR10 |
GFTFSSY | 407 | SSSSST | 421 | DLSVRAIDAFDI | 435 |
146262- CLL-1-CAR11 |
GFTFNSY | 408 | EYDGSN | 422 | EGNEDLAFDI | 436 |
146263- CLL-1-CAR12 |
GFNVSSN | 409 | YSGGA | 423 | DRLYCGNNCYLYYYYGMDV | 437 |
139115- CLL-1-CAR1 |
GGTFSSY | 398 | IPIFGT | 412 | DLEMATIMGGY | 426 |
139116- CLL-1-CAR2 |
GFTFDDY | 399 | SGDGGS | 413 | VFDSYYMDV | 427 |
139118- CLL-1-CAR3 |
GGSISSSSY | 400 | YYSGS | 414 | PGTYYDFLSGYYPFY | 428 |
139122- CLL-1-CAR4 |
GFTFSSY | 401 | NEDGSA | 415 | DLRSGRY | 429 |
139117- CLL-1-CAR5 |
GGPVRSGSH | 402 | YYSGS | 416 | GTATFDWNFPFDS | 430 |
139120- CLL-1-CAR7 |
GFTFSSY | 404 | SSSSSY | 418 | DPSSSGSYYMEDSYYYGMDV | 432 |
139121- CLL-1-CAR8 |
GFTFSSY | 405 | SSSGST | 419 | EALGSSWE | 433 |
146264- CLL-1-CAR13 |
GYPFTGY | 410 | DPNSGN | 424 | DSYGYYYGMDV | 438 |
181268 | GFTFSSY | 411 | SSSGST | 425 | DPYSSSWHDAFDI | 439 |
Таблица 8. CDR вариабельных доменов легкой цепи согласно схеме нумерации Чотиа (Al-Lazikani et al., (1997), JMB 273, 927-948)
Кандидат | LCDR1 | ID | LCDR2 | ID | LCDR3 | ID |
146259- CLL-1-CAR9 |
SQDISSW | 448 | AAS | 462 | SYSTPL | 476 |
139119- CLL-1-CAR6 |
SQSISSY | 445 | AAS | 459 | SYSTPPW | 473 |
146261- CLL-1-CAR10 |
SQDISNY | 449 | DAS | 463 | AYSTPF | 477 |
146262- CLL-1-CAR11 |
SQFIKKN | 450 | DAS | 464 | HDNLPL | 478 |
146263- CLL-1-CAR12 |
SQSISSY | 451 | AAS | 465 | SYSTPPL | 479 |
139115- CLL-1-CAR1 |
TSSDVGGYNY | 440 | DVS | 454 | YTSSSTLDV | 468 |
139116- CLL-1-CAR2 |
SQSLVYTDGNTY | 441 | KVS | 455 | GTHWSF | 469 |
139118- CLL-1-CAR3 |
SQGISSY | 442 | AAS | 456 | LNSYPY | 470 |
139122- CLL-1-CAR4 |
SQSISGSF | 443 | GAS | 457 | YGSSPP | 471 |
139117- CLL-1-CAR5 |
SQSISSY | 444 | AAS | 458 | SYSTPW | 472 |
139120- CLL-1-CAR7 |
SSGSIASNY | 446 | EDN | 460 | YDSSNQV | 474 |
139121- CLL-1-CAR8 |
SQDISNY | 447 | DAS | 461 | YDNLPL | 475 |
146264- CLL-1-CAR13 |
SQGISSA | 452 | DAS | 466 | FNNYPL | 480 |
181268 | SQSVSSSY | 453 | GAS | 467 | YGSSPL | 481 |
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанного в настоящем описании (например, CAR нуклеиновой кислоты или CAR полипептида), включает
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранных из следующих:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 156, LC CDR2 SEQ ID NO: 169 и LC CDR3 SEQ ID NO: 182 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 157, LC CDR2 SEQ ID NO: 170 и LC CDR3 SEQ ID NO: 183 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 158, LC CDR2 SEQ ID NO: 171 и LC CDR3 SEQ ID NO: 184 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 159, LC CDR2 SEQ ID NO: 172 и LC CDR3 SEQ ID NO: 185 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 160, LC CDR2 SEQ ID NO: 173 и LC CDR3 SEQ ID NO: 186 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 161, LC CDR2 SEQ ID NO: 174 и LC CDR3 SEQ ID NO: 187 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 162, LC CDR2 SEQ ID NO: 175 и LC CDR3 SEQ ID NO: 188 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 163, LC CDR2 SEQ ID NO: 176 и LC CDR3 SEQ ID NO: 189 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 164, LC CDR2 SEQ ID NO: 177 и LC CDR3 SEQ ID NO: 190 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 165, LC CDR2 SEQ ID NO: 178 и LC CDR3 SEQ ID NO: 191 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 166, LC CDR2 SEQ ID NO: 179 и LC CDR3 SEQ ID NO: 192 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 167, LC CDR2 SEQ ID NO: 180 и LC CDR3 SEQ ID NO: 193 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 168, LC CDR2 SEQ ID NO: 181 и LC CDR3 SEQ ID NO: 194 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 202, LC CDR2 SEQ ID NO: 203 и LC CDR3 SEQ ID NO: 204 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (HC) одного из следующих:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 117, HC CDR2 SEQ ID NO: 130 и HC CDR3 SEQ ID NO: 143 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 118, HC CDR2 SEQ ID NO: 131 и HC CDR3 SEQ ID NO: 144 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 119, HC CDR2 SEQ ID NO: 132 и HC CDR3 SEQ ID NO: 145 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 120, HC CDR2 SEQ ID NO: 133 и HC CDR3 SEQ ID NO: 146 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 121, HC CDR2 SEQ ID NO: 134 и HC CDR3 SEQ ID NO: 147 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 122, HC CDR2 SEQ ID NO: 135 и HC CDR3 SEQ ID NO: 148 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 123, HC CDR2 SEQ ID NO: 136 и HC CDR3 SEQ ID NO: 149 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 124, HC CDR2 SEQ ID NO: 137 и HC CDR3 SEQ ID NO: 150 CLL-1-CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 125, HC CDR2 SEQ ID NO: 138 и HC CDR3 SEQ ID NO: 151 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 126, HC CDR2 SEQ ID NO: 139 и HC CDR3 SEQ ID NO: 152 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 127, HC CDR2 SEQ ID NO: 140 и HC CDR3 SEQ ID NO: 153 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 128, HC CDR2 SEQ ID NO: 141 и HC CDR3 SEQ ID NO: 154 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 129, HC CDR2 SEQ ID NO: 142 и HC CDR3 SEQ ID NO: 155 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 199, HC CDR2 SEQ ID NO: 200 и HC CDR3 SEQ ID NO: 201 181286.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанного в настоящем описании (например, CAR нуклеиновой кислоты или CAR полипептида), или CLL-1-связывющий домен включают
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранных из следующих:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 356, LC CDR2 SEQ ID NO: 370 и LC CDR3 SEQ ID NO: 384 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 357, LC CDR2 SEQ ID NO: 371 и LC CDR3 SEQ ID NO: 385 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 358, LC CDR2 SEQ ID NO: 372 и LC CDR3 SEQ ID NO: 386 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 359, LC CDR2 SEQ ID NO: 373 и LC CDR3 SEQ ID NO: 387 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 360, LC CDR2 SEQ ID NO: 374 и LC CDR3 SEQ ID NO: 388 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 361, LC CDR2 SEQ ID NO: 375 и LC CDR3 SEQ ID NO: 389 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 362, LC CDR2 SEQ ID NO: 376 и LC CDR3 SEQ ID NO: 390 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 363, LC CDR2 SEQ ID NO: 377 и LC CDR3 SEQ ID NO: 391 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 364, LC CDR2 SEQ ID NO: 378 и LC CDR3 SEQ ID NO: 392 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 365, LC CDR2 SEQ ID NO: 379 и LC CDR3 SEQ ID NO: 393 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 366, LC CDR2 SEQ ID NO: 380 и LC CDR3 SEQ ID NO: 394 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 367, LC CDR2 SEQ ID NO: 381 и LC CDR3 SEQ ID NO: 395 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 368, LC CDR2 SEQ ID NO: 382 и LC CDR3 SEQ ID NO: 396 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 369, LC CDR2 SEQ ID NO: 383 и LC CDR3 SEQ ID NO: 397 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (HC) одного их следующих:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 314, HC CDR2 SEQ ID NO: 328 и HC CDR3 SEQ ID NO: 342 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 315, HC CDR2 SEQ ID NO: 329 и HC CDR3 SEQ ID NO: 343 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 316, HC CDR2 SEQ ID NO: 330 и HC CDR3 SEQ ID NO: 344 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 317, HC CDR2 SEQ ID NO: 331 и HC CDR3 SEQ ID NO: 345 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 318, HC CDR2 SEQ ID NO: 332 и HC CDR3 SEQ ID NO: 346 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 319, HC CDR2 SEQ ID NO: 333 и HC CDR3 SEQ ID NO: 347 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 320, HC CDR2 SEQ ID NO: 334 и HC CDR3 SEQ ID NO: 348 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 321, HC CDR2 SEQ ID NO: 335 и HC CDR3 SEQ ID NO: 349 CLL-1-CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 322, HC CDR2 SEQ ID NO: 336 и HC CDR3 SEQ ID NO: 350 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 323, HC CDR2 SEQ ID NO: 337 и HC CDR3 SEQ ID NO: 351 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 324, HC CDR2 SEQ ID NO: 338 и HC CDR3 SEQ ID NO: 352 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 325, HC CDR2 SEQ ID NO: 339 и HC CDR3 SEQ ID NO: 353 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 326, HC CDR2 SEQ ID NO: 340 и HC CDR3 SEQ ID NO: 354 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 327, HC CDR2 SEQ ID NO: 341 и HC CDR3 SEQ ID NO: 355 181286.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанного в настоящем описании (например, CAR нуклеиновой кислоты или CAR полипептида), включает
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранных из следующих:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 440, LC CDR2 SEQ ID NO: 454 и LC CDR3 SEQ ID NO: 468 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 441, LC CDR2 SEQ ID NO: 455 и LC CDR3 SEQ ID NO: 469 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 442, LC CDR2 SEQ ID NO: 456 и LC CDR3 SEQ ID NO: 470 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 443, LC CDR2 SEQ ID NO: 457 и LC CDR3 SEQ ID NO: 471 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 444, LC CDR2 SEQ ID NO: 458 и LC CDR3 SEQ ID NO: 472 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 445, LC CDR2 SEQ ID NO: 459 и LC CDR3 SEQ ID NO: 473 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 446, LC CDR2 SEQ ID NO: 460 и LC CDR3 SEQ ID NO: 474 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 447, LC CDR2 SEQ ID NO: 461 и LC CDR3 SEQ ID NO: 475 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 448, LC CDR2 SEQ ID NO: 462 и LC CDR3 SEQ ID NO: 476 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 449, LC CDR2 SEQ ID NO: 463 и LC CDR3 SEQ ID NO: 477 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 450, LC CDR2 SEQ ID NO: 464 и LC CDR3 SEQ ID NO: 478 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 451, LC CDR2 SEQ ID NO: 465 и LC CDR3 SEQ ID NO: 479 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 452, LC CDR2 SEQ ID NO: 466 и LC CDR3 SEQ ID NO: 480 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 453, LC CDR2 SEQ ID NO: 467 и LC CDR3 SEQ ID NO: 481 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (HC) из следующих:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 398, HC CDR2 SEQ ID NO: 412 и HC CDR3 SEQ ID NO: 426 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 399, HC CDR2 SEQ ID NO: 413 и HC CDR3 SEQ ID NO: 427 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 400, HC CDR2 SEQ ID NO: 414 и HC CDR3 SEQ ID NO: 428 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 401, HC CDR2 SEQ ID NO: 415 и HC CDR3 SEQ ID NO: 429 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 402, HC CDR2 SEQ ID NO: 416 и HC CDR3 SEQ ID NO: 430 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 403, HC CDR2 SEQ ID NO: 417 и HC CDR3 SEQ ID NO: 431 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 404, HC CDR2 SEQ ID NO: 418 и HC CDR3 SEQ ID NO: 432 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 405, HC CDR2 SEQ ID NO: 419 и HC CDR3 SEQ ID NO: 433 CLL-1-CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 406, HC CDR2 SEQ ID NO: 420 и HC CDR3 SEQ ID NO: 434 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 407, HC CDR2 SEQ ID NO: 421 и HC CDR3 SEQ ID NO: 435 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 408, HC CDR2 SEQ ID NO: 422 и HC CDR3 SEQ ID NO: 436 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 409, HC CDR2 SEQ ID NO: 423 и HC CDR3 SEQ ID NO: 437 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 410, HC CDR2 SEQ ID NO: 424 и HC CDR3 SEQ ID NO: 438 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 411, HC CDR2 SEQ ID NO: 425 и HC CDR3 SEQ ID NO: 439 181286.
В воплощениях анти-CLL-1 полностью человеческие одноцепочечные вариабельные фрагменты генерируют и клонируют в лентивирусные CAR-экспрессирующие векторы с внутриклеточным доменом CD3-дзета и внутриклеточным костимулирующим доменом 4-1ВВ. В таблице 1 приводятся названия примеров полностью человеческих CLL-1 scFv.
Таблица 1. Конструкции CAR-CLL-1
Конструкции ID | Название |
139115 | CLL-1 (или CLL-1-CAR-1) |
139116 | CLL-2 (или CLL-1-CAR-2) |
139117 | CLL-3 (или CLL-1-CAR-3) |
139118 | CLL-4 (или CLL-1-CAR-4) |
139119 | CLL-5 (или CLL-1-CAR-5) |
139120 | CLL-6 (или CLL-1-CAR-6) |
139121 | CLL-7 (или CLL-1-CAR-7) |
139122 | CLL-8 (или CLL-1-CAR-8) |
146259 | CLL-9 (или CLL-1-CAR-9) |
146261 | CLL-10 (или CLL-1-CAR-10) |
146262 | CLL-11 (или CLL-1-CAR-11) |
146263 | CLL-12 (или CLL-1-CAR-12) |
146264 | CLL-13 (или CLL-1-CAR-13) |
В воплощениях порядок, в котором домены VL и VH появляются в scFv, изменяется (т.е., ориентация VL-VH или VH-VL), и где или три или четыре копии субъединицы «G4S» (SEQ ID NO: 25), в которых каждая субъединица включает последовательность GGGGS (SEQ ID NO: 25) (например, (G4S)3 (SEQ ID NO: 28) или (G4S)4(SEQ ID NO: 27)), соединяют вариабельные домены для создания полного домена scFv, как показано в таблице 2.
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности CLL-1-scFv доменов и молекул CLL-1-CAR приводятся в таблице 2. Аминокислотные последовательности вариабельной тяжелой цепи и вариабельной легкой цепи для каждого scFv также приводятся в таблице 2. Отмечается, что фрагменты scFv (SEQ ID NO: 39-51) с лидерной последовательностью (например, аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 или нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 12) также охватываются настоящим изобретением.
Лидерная (аминокислотная последовательность) SEQ ID NO: 1
MALPVTALLLPLALLLHAARP
Лидерная (nucleic acid sequence) (SEQ ID NO: 12)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
Шарнирный CD8 (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 2)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
Шарнирный CD8 (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 13)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGA
Трансмембранный CD8 (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 6)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
Трансмембранный CD8 (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 17)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
Внутриклеточный домен 4-1BB (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 7)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
Внутриклеточный домен 4-1BB (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 18)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
Внутриклеточный домен CD28 (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 482)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 482)
Внутриклеточный домен CD28 (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 483)
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 483)
Внутриклеточный домен ICOS (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 484)
T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T L (SEQ ID NO: 484)
Внутриклеточный домен ICOS (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 485)
ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA (SEQ ID NO: 485)
Домен CD3-дзета (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 9)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 20)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
Домен CD3-дзета (аминокислотная последовательность; эталонная последовательность NCBI NM_000734.3) (SEQ ID NO:10)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета (нуклеотидная последовательность; эталонная последовательность NCBI NM_000734.3); (SEQ ID NO:21)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccag
aaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttt
tggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaagga
agaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcgg
aggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggc
acgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgc
ccttcacatgcaggccctgccccctcgc
Шарнирный IgG4 (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO:36)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
Шарнирный IgG4 (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO:37)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
В воплощениях такие клоны (например, в таблице 2) все содержат изменение остатка Q/K в сигнальном домене костимулирующего домена, полученного из цепи CD3-дзета.
Таблица 2. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности CLL-1-scFv доменов и молекул CLL-1-CAR
Название/
Описание |
SEQ ID NO: | Последовательность |
146259 | ||
146259- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 9 |
47 | QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKAPANTFSDHVMHWVRQAPGQRFEWMGYIHАANGGTHYSQKFQDRVTITRDTSANTVYMDLSSLRSEDTAVYYCARGGYNSDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFNGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK |
146259- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 9 |
60 | CАAGTGCАACTCGTCCAGTCCGGTGCAGАAGTCАAGGАACCCGGAGCCTCCGTGАAAGTGTCCTGCАAAGCTCCTGCCАACACTTTCTCGGACCACGTGATGCACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGCGCTTCGАATGGATGGGATACATTCATGCCGCCАATGGCGGTACCCACTACTCCCАAАAGTTCCAGGATAGAGTCACCATCACCCGGGACACCAGCGCCАACACCGTGTATATGGATCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGGCGGATACАACTCAGACGCGTTCGACATTTGGGGACAGGGTACTATGGTCACCGTGTCATCCGGGGGCGGTGGCAGCGGGGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCAGGGGGAGGAGGGTCCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCGTCATCGGTGTCCGCGTCCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACGTGTCGCGCCAGCCAGGACATCTCCTCGTGGTTGGCATGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCCCCGАAGCTGCTCATCTACGCCGCCTCCTCCCTTCАATCGGGAGTGCCCTCGCGGTTCАACGGАAGCGGАAGCGGGACAGATTTTACCCTGACTATTAGCTCGCTGCAGCCCGAGGACTTCGCTACTTACTACTGCCАACAGAGCTACTCCACCCCACTGACTTTCGGCGGGGGTACCАAGGTCGAGATCАAG |
146259- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 9 |
73 | QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKAPANTFSDHVMHWVRQAPGQRFEWMGYIHАANGGTHYSQKFQDRVTITRDTSANTVYMDLSSLRSEDTAVYYCARGGYNSDAFDIWGQGTMVTVSS |
146259- ак, VL ScFv
CLL-1-CAR 9 |
86 | DIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFNGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK |
146259- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 9 |
99 | MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKAPANTFSDHVMHWVRQAPGQRFEWMGYIHАANGGTHYSQKFQDRVTITRDTSANTVYMDLSSLRSEDTAVYYCARGGYNSDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFNGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
146259- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 9 |
112 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTCGTCCAGTCCGGTGCAGАAGTCАAGGАACCCGGAGCCTCCGTGАAAGTGTCCTGCАAAGCTCCTGCCАACACTTTCTCGGACCACGTGATGCACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGCGCTTCGАATGGATGGGATACATTCATGCCGCCАATGGCGGTACCCACTACTCCCАAАAGTTCCAGGATAGAGTCACCATCACCCGGGACACCAGCGCCАACACCGTGTATATGGATCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGGCGGATACАACTCAGACGCGTTCGACATTTGGGGACAGGGTACTATGGTCACCGTGTCATCCGGGGGCGGTGGCAGCGGGGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCAGGGGGAGGAGGGTCCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCGTCATCGGTGTCCGCGTCCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACGTGTCGCGCCAGCCAGGACATCTCCTCGTGGTTGGCATGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCCCCGАAGCTGCTCATCTACGCCGCCTCCTCCCTTCАATCGGGAGTGCCCTCGCGGTTCАACGGАAGCGGАAGCGGGACAGATTTTACCCTGACTATTAGCTCGCTGCAGCCCGAGGACTTCGCTACTTACTACTGCCАACAGAGCTACTCCACCCCACTGACTTTCGGCGGGGGTACCАAGGTCGAGATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
139119 | ||
139119- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 6 |
44 | QVQLQESGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWVGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTАADTAVYYCARGSGLVVYAIRVGSGWFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGDSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLMYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPWTFGQGTKVDIK |
139119- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 6 |
57 | CАAGTGCАACTTCАAGАATCAGGCGCAGGACTTCTCАAGCCATCCGАAACACTCTCCCTCACTTGCGCGGTGTACGGGGGАAGCTTCTCGGGATACTACTGGTCCTGGATTAGGCAGCCTCCCGGCАAAGGCCTGGАATGGGTCGGGGAGATCАACCACTCCGGTTCАACCАACTACАACCCGTCGCTGАAGTCCCGCGTGACCATTTCCGTGGACACCTCTАAGАATCAGTTCAGCCTGАAGCTCTCGTCCGTGACCGCGGCGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTCGGGGATCAGGACTGGTGGTGTACGCCATCCGCGTGGGCTCGGGCTGGTTCGATTACTGGGGCCAGGGАACCCTGGTCACTGTGTCGTCCGGCGGAGGAGGTTCGGGGGGCGGAGACAGCGGTGGAGGGGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCGTCCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCATCCCAGAGCATTTCCAGCTACCTGАACTGGTATCAGCAGАAGCCCGGАAAGGCCCCTАAGCTGTTGATGTACGCCGCCAGCAGCTTGCAGTCGGGCGTGCCGAGCCGGTTTTCCGGTTCCGGCTCCGGGACTGACTTCACCCTGACTATCTCATCCCTGCАACCCGAGGACTTCGCCACTTATTACTGCCAGCAGTCCTACTCАACCCCTCCCTGGACGTTCGGACAGGGCACCАAGGTCGATATCАAG |
139119- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 6 |
70 | QVQLQESGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWVGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTАADTAVYYCARGSGLVVYAIRVGSGWFDYWGQGTLVTVSS |
139119- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 6 |
83 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLMYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPWTFGQGTKVDIK |
139119- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 6 |
96 | MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLQESGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWVGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTАADTAVYYCARGSGLVVYAIRVGSGWFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGDSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLMYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPWTFGQGTKVDIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
139119- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 6 |
109 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTTCАAGАATCAGGCGCAGGACTTCTCАAGCCATCCGАAACACTCTCCCTCACTTGCGCGGTGTACGGGGGАAGCTTCTCGGGATACTACTGGTCCTGGATTAGGCAGCCTCCCGGCАAAGGCCTGGАATGGGTCGGGGAGATCАACCACTCCGGTTCАACCАACTACАACCCGTCGCTGАAGTCCCGCGTGACCATTTCCGTGGACACCTCTАAGАATCAGTTCAGCCTGАAGCTCTCGTCCGTGACCGCGGCGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTCGGGGATCAGGACTGGTGGTGTACGCCATCCGCGTGGGCTCGGGCTGGTTCGATTACTGGGGCCAGGGАACCCTGGTCACTGTGTCGTCCGGCGGAGGAGGTTCGGGGGGCGGAGACAGCGGTGGAGGGGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCGTCCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCATCCCAGAGCATTTCCAGCTACCTGАACTGGTATCAGCAGАAGCCCGGАAAGGCCCCTАAGCTGTTGATGTACGCCGCCAGCAGCTTGCAGTCGGGCGTGCCGAGCCGGTTTTCCGGTTCCGGCTCCGGGACTGACTTCACCCTGACTATCTCATCCCTGCАК,CCCGAGGACTTCGCCACTTATTACTGCCAGCAGTCCTACTCАACCCCTCCCTGGACGTTCGGACAGGGCACCАAGGTCGATATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАК,CTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
146261 | ||
146261- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 10 |
48 | QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSVRAIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQAYSTPFTFGPGTKVEIK |
146261- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 10 |
61 | CАAGTGCАACTTGTTCАATCCGGTGGAGGTCTTGTGCAGCCCGGAGGATCACTCAGACTGTCGTGCGCCGCCTCTGGGTTCACTTTCTCCTCATACTCGATGАACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGАAAGGGCCTGGАATGGGTGTCATACATCTCCTCCTCATCCTCCACCATCTACTACGCCGATTCCGTGАAGGGCCGCTTCACTATTTCCCGGGACАACGCGАК,АAACTCGCTCTATCTGCАAATGАACTCCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGACCTGAGCGTGCGGGCTATTGATGCGTTCGACATCTGGGGACAGGGCACCATGGTCACAGTGTCCAGCGGAGGCGGCGGCAGCGGTGGAGGAGGATCAGGGGGAGGAGGTTCGGGGGGCGGTGGCTCCGATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGTCGAGCCTCTCCGCCTCCGTCGGCGACAGAGTGACCATCACGTGTCAGGCATCCCAGGACATTAGCАACTACCTGАATTGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCACCCАAGTTGCTGATCTACGACGCCTCCАACCTGGАAACCGGAGTGCCATCCAGGTTCTCGGGCAGCGGCTCGGGАК,CCGACTTCACTTTTACTATCTCCTCCCTGCАACCCGAGGATTTCGCGACCTACTACTGCCAGCAGGCCTACAGCACCCCTTTCACCTTCGGGCCGGGАACTАAGGTCGАAATCАAG |
146261- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 10 |
74 | QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSVRAIDAFDIWGQGTMVTVSS |
146261- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 10 |
87 | DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQAYSTPFTFGPGTKVEIK |
146261- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 10 |
100 | MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSVRAIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQAYSTPFTFGPGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
146261- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 10 |
113 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTTGTTCАATCCGGTGGAGGTCTTGTGCAGCCCGGAGGATCACTCAGACTGTCGTGCGCCGCCTCTGGGTTCACTTTCTCCTCATACTCGATGАК,CTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGАAAGGGCCTGGАATGGGTGTCATACATCTCCTCCTCATCCTCCACCATCTACTACGCCGATTCCGTGАAGGGCCGCTTCACTATTTCCCGGGACАACGCGАAАAACTCGCTCTATCTGCАAATGАACTCCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGACCTGAGCGTGCGGGCTATTGATGCGTTCGACATCTGGGGACAGGGCACCATGGTCACAGTGTCCAGCGGAGGCGGCGGCAGCGGTGGAGGAGGATCAGGGGGAGGAGGTTCGGGGGGCGGTGGCTCCGATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGTCGAGCCTCTCCGCCTCCGTCGGCGACAGAGTGACCATCACGTGTCAGGCATCCCAGGACATTAGCАACTACCTGАATTGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCACCCАAGTTGCTGATCTACGACGCCTCCАACCTGGАAACCGGAGTGCCATCCAGGTTCTCGGGCAGCGGCTCGGGАACCGACTTCACTTTTACTATCTCCTCCCTGCАACCCGAGGATTTCGCGACCTACTACTGCCAGCAGGCCTACAGCACCCCTTTCACCTTCGGGCCGGGАACTАAGGTCGАAATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
146262 | ||
146262- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 11 |
49 | EVQLVQSGGGVVRSGRSLRLSCАК,SGFTFNSYGLHWVRQAPGKGLEWVALIEYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDKSKSTLYLQMDNLRAEDTAVYYCAREGNEDLAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQFIKKNLNWYQHKPGKAPKLLIYDASSLQTGVPSRFSGNRSGTTFSFTISSLQPEDVATYYCQQHDNLPLTFGGGTKVEIK |
146262- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 11 |
62 | GАAGTGCАATTGGTGCАATCAGGAGGAGGAGTGGTCAGATCTGGАAGАAGCCTGAGACTGTCATGCGCGGCTTCGGGCTTTACCTTCАACTCCTACGGCCTCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGАAАAGGCCTCGАATGGGTCGCACTGATTGAGTACGACGGGTCCАACАAGTACTACGGAGATAGCGTGАAGGGCCGCTTCACCATCTCACGGGACАAGTCCАAGTCCACCCTGTATCTGCАAATGGACАACCTGAGGGCCGAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGАAGGАAACGАAGATCTGGCCTTCGATATTTGGGGCCAGGGTACTCTTGTGACCGTGTCGAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGTTCCGGCGGCGGGGGGAGCGАAATCGTGCTGACCCAGTCGCCTTCCTCCCTCTCCGCTTCCGTGGGGGACCGGGTCACTATTACGTGTCAGGCGTCCCАATTCATCАAGАAGАATCTGАACTGGTACCAGCACАAGCCGGGАAAGGCCCCCАAACTGCTCATCTACGACGCCAGCTCGCTGCAGACTGGCGTGCCTTCCCGGTTTTCCGGGАACCGGTCGGGАACCACCTTCTCATTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCGGAGGACGTGGCGACCTACTACTGCCAGCAGCATGACАACCTTCCACTGACTTTCGGCGGGGGCACCАAGGTCGAGATTАAG |
146262- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 11 |
75 | EVQLVQSGGGVVRSGRSLRLSCАASGFTFNSYGLHWVRQAPGKGLEWVALIEYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDKSKSTLYLQMDNLRAEDTAVYYCAREGNEDLAFDIWGQGTLVTVSS |
146262- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 11 |
88 | EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQFIKKNLNWYQHKPGKAPKLLIYDASSLQTGVPSRFSGNRSGTTFSFTISSLQPEDVATYYCQQHDNLPLTFGGGTKVEIK |
146262- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 11 |
101 | MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLVQSGGGVVRSGRSLRLSCАASGFTFNSYGLHWVRQAPGKGLEWVALIEYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDKSKSTLYLQMDNLRAEDTAVYYCAREGNEDLAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQFIKKNLNWYQHKPGKAPKLLIYDASSLQTGVPSRFSGNRSGTTFSFTISSLQPEDVATYYCQQHDNLPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
146262- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 11 |
114 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАATTGGTGCАATCAGGAGGAGGAGTGGTCAGATCTGGАAGАAGCCTGAGACTGTCATGCGCGGCTTCGGGCTTTACCTTCАACTCCTACGGCCTCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGАAАAGGCCTCGАATGGGTCGCACTGATTGAGTACGACGGGTCCАACАAGTACTACGGAGATAGCGTGАAGGGCCGCTTCACCATCTCACGGGACАAGTCCАAGTCCACCCTGTATCTGCАAATGGACАACCTGAGGGCCGAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGАAGGАAACGАAGATCTGGCCTTCGATATTTGGGGCCAGGGTACTCTTGTGACCGTGTCGAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGTTCCGGCGGCGGGGGGAGCGАAATCGTGCTGACCCAGTCGCCTTCCTCCCTCTCCGCTTCCGTGGGGGACCGGGTCACTATTACGTGTCAGGCGTCCCАATTCATCАAGАAGАATCTGАACTGGTACCAGCACАAGCCGGGАAAGGCCCCCАAACTGCTCATCTACGACGCCAGCTCGCTGCAGACTGGCGTGCCTTCCCGGTTTTCCGGGАACCGGTCGGGАACCACCTTCTCATTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCGGAGGACGTGGCGACCTACTACTGCCAGCAGCATGACАACCTTCCACTGACTTTCGGCGGGGGCACCАAGGTCGAGATTАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
146263 | ||
146263- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 12 |
50 | QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАК,SGFNVSSNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGATYYGDSVKGRFTVSRDNSKNTVYLQMNRLTAEDTAVYYCARDRLYCGNNCYLYYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPLTFGQGTKVEIK |
146263- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 12 |
63 | CАAGTGCАACTCGTGGАATCAGGCGGAGGACTCGTGCАACCCGGAGGTTCCCTTAGACTGTCATGTGCCGCTTCCGGGTTCАATGTGTCCAGCАACTACATGACCTGGGTCAGACAGGCGCCGGGАAAGGGACTTGАATGGGTGTCCGTGATCTACTCCGGTGGAGCАACATACTACGGAGACTCCGTGАAAGGCCGCTTTACCGTGTCCCGCGATАACTCGАAGАACACCGTGTACTTGCAGATGАACAGGCTGACTGCCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGCGCCCGGGACAGGCTGTACTGTGGАAACАACTGCTACCTGTACTACTACTACGGGATGGACGTGTGGGGACAGGGCACTCTCGTCACTGTGTCATCCGGGGGGGGCGGTAGCGGTGGCGGAGGGTCCGGCGGAGGAGGCTCAGGGGGAGGCGGАAGCGATATCCAGGTCACCCAGTCTCCCTCCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTCACCATTACTTGCCGGGCGTCGCAGTCGATCAGCTCCTACCTGАACTGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCCCCGАAGCTGCTGATCTACGCGGCCTCGTCCCTGCАAAGCGGCGTCCCGTCGCGGTTCAGCGGTTCCGGTTCGGGАACCGACTTCACCCTGACTATTTCCTCCCTGCАACCCGAGGATTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTCCTACTCCACCCCACCTCTGACCTTCGGCCАAGGАACCАAGGTCGАAATCАAG |
146263- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 12 |
76 | QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFNVSSNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGATYYGDSVKGRFTVSRDNSKNTVYLQMNRLTAEDTAVYYCARDRLYCGNNCYLYYYYGMDVWGQGTLVTVSS |
146263- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 12 |
89 | DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPLTFGQGTKVEIK |
146263- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 12 |
102 | MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFNVSSNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGATYYGDSVKGRFTVSRDNSKNTVYLQMNRLTAEDTAVYYCARDRLYCGNNCYLYYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
146263- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 12 |
115 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTCGTGGАATCAGGCGGAGGACTCGTGCАACCCGGAGGTTCCCTTAGACTGTCATGTGCCGCTTCCGGGTTCАATGTGTCCAGCАACTACATGACCTGGGTCAGACAGGCGCCGGGАAAGGGACTTGАATGGGTGTCCGTGATCTACTCCGGTGGAGCАACATACTACGGAGACTCCGTGАAAGGCCGCTTTACCGTGTCCCGCGATАACTCGАAGАACACCGTGTACTTGCAGATGАACAGGCTGACTGCCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGCGCCCGGGACAGGCTGTACTGTGGАAACАACTGCTACCTGTACTACTACTACGGGATGGACGTGTGGGGACAGGGCACTCTCGTCACTGTGTCATCCGGGGGGGGCGGTAGCGGTGGCGGAGGGTCCGGCGGAGGAGGCTCAGGGGGAGGCGGАAGCGATATCCAGGTCACCCAGTCTCCCTCCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTCACCATTACTTGCCGGGCGTCGCAGTCGATCAGCTCCTACCTGАACTGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCCCCGАAGCTGCTGATCTACGCGGCCTCGTCCCTGCАAAGCGGCGTCCCGTCGCGGTTCAGCGGTTCCGGTTCGGGАACCGACTTCACCCTGACTATTTCCTCCCTGCАACCCGAGGATTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTCCTACTCCACCCCACCTCTGACCTTCGGCCАAGGАACCАAGGTCGАAATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАК,ATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
139115 | ||
139115- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 1 |
39 | EVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLEMATIMGGYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLDVVFGGGTKLTVL |
139115- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 1 |
52 | GАAGTGCАACTCCАACAGTCAGGCGCAGАAGTCАAGАAGCCCGGATCGTCAGTGАAAGTGTCCTGCАAAGCCTCCGGCGGАACCTTCAGCTCCTACGCАATCAGCTGGGTGCGGCAGGCGCCCGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGGTATCATTCCGATCTTTGGCACCGCCАATTACGCCCAGАAGTTCCAGGGACGCGTCACАATCACCGCCGACGАATCGACTTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCGTCCTTGAGGAGCGАAGATACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGGATCTGGAGATGGCCACTATCATGGGGGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTGTCCTCGGGAGGAGGGGGATCAGGCGGCGGCGGTTCCGGGGGAGGAGGАAGCCAGTCCGCGCTGACTCAGCCAGCTTCCGTGTCTGGTTCGCCGGGACAGTCCATCACTATTAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGACGTGGGCGGCTACАACTATGTGTCATGGTACCAGCAGCACCCGGGGАAGGCGCCTАAGCTGATGATCTACGACGTGTCCАACCGCCCTAGCGGAGTGTCCАACAGATTCTCCGGTTCGАAGTCAGGGАACACTGCCTCCCTCACGATTAGCGGGCTGCАAGCCGAGGATGАAGCCGACTACTACTGCTCCTCCTATACCTCCTCCTCGACCCTGGACGTGGTGTTCGGAGGAGGCACCАAGCTCACCGTCCTT |
139115- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 1 |
65 | EVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLEMATIMGGYWGQGTLVTVSS |
139115- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 1 |
78 | QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLDVVFGGGTKLTVL |
139115- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 1 |
91 | MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLEMATIMGGYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGНNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLDVVFGGGTKLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
139115- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 1 |
104 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАACTCCАACAGTCAGGCGCAGАAGTCАAGАAGCCCGGATCGTCAGTGАAAGTGTCCTGCАAAGCCTCCGGCGGАACCTTCAGCTCCTACGCАATCAGCTGGGTGCGGCAGGCGCCCGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGGTATCATTCCGATCTTTGGCACCGCCАATTACGCCCAGАAGTTCCAGGGACGCGTCACАATCACCGCCGACGАATCGACTTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCGTCCTTGAGGAGCGАAGATACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGGATCTGGAGATGGCCACTATCATGGGGGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTGTCCTCGGGAGGAGGGGGATCAGGCGGCGGCGGTTCCGGGGGAGGAGGАAGCCAGTCCGCGCTGACTCAGCCAGCTTCCGTGTCTGGTTCGCCGGGACAGTCCATCACTATTAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGACGTGGGCGGCTACАACTATGTGTCATGGTACCAGCAGCACCCGGGGАAGGCGCCTАAGCTGATGATCTACGACGTGTCCАACCGCCCTAGCGGAGTGTCCАACAGATTCTCCGGTTCGАAGTCAGGGАACACTGCCTCCCTCACGATTAGCGGGCTGCАAGCCGAGGATGАAGCCGACTACTACTGCTCCTCCTATACCTCCTCCTCGACCCTGGACGTGGTGTTCGGAGGAGGCACCАAGCTCACCGTCCTTACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАК,GCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАК,GGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
139116 | ||
139116- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 2 |
40 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCАК,SGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSLISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCARVFDSYYMDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGSGGSEIVLTQSPLSLPVTPGQPASISCRSSQSLVYTDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSDTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQGTHWSFTFGQGTRLEIK |
139116- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 2 |
53 | GАAGTGCАATTGGTGGАAAGCGGAGGAGGAGTGGTGCАACCTGGAGGАAGCCTGAGACTGTCATGTGCCGCCTCGGGATTCACTTTCGATGACTACGCАATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGАAAGGGTCTGGАATGGGTGTCCCTCATCTCCGGCGATGGGGGTTCCACTTACTATGCGGATTCTGTGАAGGGCCGCTTCACАATCTCCCGGGACАATTCCАAGАACACTCTGTACCTTCАAATGАACTCCCTGAGGGTGGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCGAGAGTGTTTGACTCGTACTATATGGACGTCTGGGGАAAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGCGGTGGCGGTGGATCGGGGGGCGGCGGCTCCGGGAGCGGAGGTTCCGAGATTGTGCTGACTCAGTCGCCGTTGTCACTGCCTGTCACCCCCGGGCAGCCGGCCTCCATTTCATGCCGGTCCAGCCAGTCCCTGGTCTACACCGATGGGАACACTTACCTCАACTGGTTCCAGCAGCGCCCAGGACAGTCCCCGCGGAGGCTGATCTACАAAGTGTCАAACCGGGACTCCGGCGTCCCCGATCGGTTCTCGGGАAGCGGCAGCGACACCGACTTCACGCTGАAGATTTCCCGCGTGGАAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGTATGCAGGGCACCCACTGGTCGTTTACCTTCGGACАAGGАACTAGGCTCGAGATCАAG |
139116- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 2 |
66 | EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCАASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSLISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCARVFDSYYMDVWGKGTTVTVSS |
139116- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 2 |
79 | EIVLTQSPLSLPVTPGQPASISCRSSQSLVYTDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSDTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQGTHWSFTFGQGTRLEIK |
139116- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 2 |
92 | MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCАASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSLISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCARVFDSYYMDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGSGGSEIVLTQSPLSLPVTPGQPASISCRSSQSLVYTDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSDTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQGTHWSFTFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
139116- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 2 |
105 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАATTGGTGGАAAGCGGAGGAGGAGTGGTGCАACCTGGAGGАAGCCTGAGACTGTCATGTGCCGCCTCGGGATTCACTTTCGATGACTACGCАATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGАAAGGGTCTGGАATGGGTGTCCCTCATCTCCGGCGATGGGGGTTCCACTTACTATGCGGATTCTGTGАAGGGCCGCTTCACАATCTCCCGGGACАATTCCАAGАACACTCTGTACCTTCАAATGАACTCCCTGAGGGTGGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCGAGAGTGTTTGACTCGTACTATATGGACGTCTGGGGАAAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGCGGTGGCGGTGGATCGGGGGGCGGCGGCTCCGGGAGCGGAGGTTCCGAGATTGTGCTGACTCAGTCGCCGTTGTCACTGCCTGTCACCCCCGGGCAGCCGGCCTCCATTTCATGCCGGTCCAGCCAGTCCCTGGTCTACACCGATGGGАACACTTACCTCАACTGGTTCCAGCAGCGCCCAGGACAGTCCCCGCGGAGGCTGATCTACАAAGTGTCАAACCGGGACTCCGGCGTCCCCGATCGGTTCTCGGGАAGCGGCAGCGACACCGACTTCACGCTGАAGATTTCCCGCGTGGАAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGTATGCAGGGCACCCACTGGTCGTTTACCTTCGGACАAGGАACTAGGCTCGAGATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
139118 | ||
139118- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 3 |
41 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVSISVDTSKNQFSLKLKYVTАADTAVYYCATPGTYYDFLSGYYPFYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYАASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPYTFGQGTKLEIK |
139118- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 3 |
54 | CАAGTGCAGCTTCАAGАAAGCGGTCCAGGACTCGTCАAGCCATCAGАAACTCTTTCCCTCACTTGTACCGTGTCGGGAGGCAGCATCTCCTCGAGCTCCTACTACTGGGGTTGGATTAGACAGCCCCCGGGАAAGGGGTTGGAGTGGATCGGTTCCATCTACTACTCCGGGTCGACCTACTACАACCCTTCCCTGАAATCTCGGGTGTCCATCTCCGTCGACACCTCCАAGАACCAGTTCAGCCTGАAGCTGАAATATGTGACCGCGGCCGATACTGCCGTGTACTATTGCGCCACCCCGGGАACCTACTACGACTTCCTCTCGGGGTACTACCCGTTTTACTGGGGACAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCCTCGGGCGGCGGAGGTTCAGGCGGTGGCGGATCGGGGGGAGGAGGCTCAGACATTGTGATGACCCAGAGCCCGTCCAGCCTGAGCGCCTCCGTGGGCGATAGGGTCACGATTACTTGCCGGGCGTCCCAGGGАATCTCАAGCTACCTGGCCTGGTACCАACAGАAGCCCGGАAAGGCACCCАAGTTGCTGATCTATGCCGCTAGCACTCTGCAGTCCGGGGTGCCTTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCGGGCACCGACTTCACCCTGACCATTTCCTCACTGCАACCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGCTGАACTCCTACCCTTACACATTCGGACAGGGАACCАAGCTGGАAATCАAG |
139118- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 3 |
67 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVSISVDTSKNQFSLKLKYVTАADTAVYYCATPGTYYDFLSGYYPFYWGQGTLVTVSS |
139118- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 3 |
80 | DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYАASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPYTFGQGTKLEIK |
139118- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 3 |
93 | MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVSISVDTSKNQFSLKLKYVTАADTAVYYCATPGTYYDFLSGYYPFYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYАASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАК,GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
139118- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 3 |
106 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCAGCTTCАAGАAAGCGGTCCAGGACTCGTCАAGCCATCAGАAACTCTTTCCCTCACTTGTACCGTGTCGGGAGGCAGCATCTCCTCGAGCTCCTACTACTGGGGTTGGATTAGACAGCCCCCGGGАAAGGGGTTGGAGTGGATCGGTTCCATCTACTACTCCGGGTCGACCTACTACАACCCTTCCCTGАAATCTCGGGTGTCCATCTCCGTCGACACCTCCАAGАACCAGTTCAGCCTGАAGCTGАAATATGTGACCGCGGCCGATACTGCCGTGTACTATTGCGCCACCCCGGGАACCTACTACGACTTCCTCTCGGGGTACTACCCGTTTTACTGGGGACAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCCTCGGGCGGCGGAGGTTCAGGCGGTGGCGGATCGGGGGGAGGAGGCTCAGACATTGTGATGACCCAGAGCCCGTCCAGCCTGAGCGCCTCCGTGGGCGATAGGGTCACGATTACTTGCCGGGCGTCCCAGGGАATCTCАAGCTACCTGGCCTGGTACCАACAGАAGCCCGGАAAGGCACCCАAGTTGCTGATCTATGCCGCTAGCACTCTGCAGTCCGGGGTGCCTTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCGGGCACCGACTTCACCCTGACCATTTCCTCACTGCАACCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGCTGАACTCCTACCCTTACACATTCGGACAGGGАACCАAGCTGGАAATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGA,CTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАК,GCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
139122 | ||
139122- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 4 |
42 | QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINEDGSAKFYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDLRSGRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSISGSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGLGTKLEIK |
139122- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 4 |
55 | CАAGTGCАACTCGTGGАATCTGGTGGAGGACTCGTGCАACCCGGAGGATCATTGCGACTCTCGTGTGCGGCATCCGGCTTTACCTTTTCATCCTACTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCCCCCGGGАAGGGACTGGАATGGGTCGCGАACATCАACGAGGACGGCTCGGCCАAGTTCTACGTGGACTCCGTGАAGGGCCGCTTCACGATCTCACGGGATАACGCCАAGАATTCCCTGTATCTGCАAATGАACAGCCTGAGGGCCGAGGACACTGCGGTGTACTTCTGCGCACGCGACCTGAGGTCCGGGAGATACTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCGAGCGGAGGAGGGGGGTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGTGGCGGCGGTAGCGАAATTGTGTTGACCCAGTCCCCTGGАACCCTGAGCCTGTCACCTGGAGGACGCGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCCAGAGCATCTCAGGGTCCTTCCTGGCTTGGTACCAGCAGАAGCCGGGACAGGCTCCGAGACTTCTGATCTACGGCGCCTCCTCGCGGGCGACCGGАATCCCGGATCGGTTCTCCGGCTCGGGАAGCGGАACTGACTTCACTCTTACCATTTCCCGCCTGGAGCCGGАAGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGGTCATCCCCTCCАACCTTCGGCCTGGGАACTАAGCTGGАAATCАAA |
139122- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 4 |
68 | QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINEDGSAKFYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDLRSGRYWGQGTLVTVSS |
139122- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 4 |
81 | EIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSISGSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGLGTKLEIK |
139122- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 4 |
94 | MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINEDGSAKFYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDLRSGRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSISGSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGLGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
139122- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 4 |
107 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTCGTGGАATCTGGTGGAGGACTCGTGCАACCCGGAGGATCATTGCGACTCTCGTGTGCGGCATCCGGCTTTACCTTTTCATCCTACTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCCCCCGGGАAGGGACTGGАATGGGTCGCGАACATCАACGAGGACGGCTCGGCCАAGTTCTACGTGGACTCCGTGАAGGGCCGCTTCACGATCTCACGGGATАACGCCАAGАATTCCCTGTATCTGCАAATGАACAGCCTGAGGGCCGAGGACACTGCGGTGTACTTCTGCGCACGCGACCTGAGGTCCGGGAGATACTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCGAGCGGAGGAGGGGGGTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGTGGCGGCGGTAGCGАAATTGTGTTGACCCAGTCCCCTGGАACCCTGAGCCTGTCACCTGGAGGACGCGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCCAGAGCATCTCAGGGTCCTTCCTGGCTTGGTACCAGCAGАAGCCGGGACAGGCTCCGAGACTTCTGATCTACGGCGCCTCCTCGCGGGCGACCGGАATCCCGGATCGGTTCTCCGGCTCGGGАAGCGGАACTGACTTCACTCTTACCATTTCCCGCCTGGAGCCGGАAGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGGTCATCCCCTCCАACCTTCGGCCTGGGАACTАATGGАAATCАAАACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
139117 | ||
139117- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 5 |
43 | EVQLQQSGPGLVRPSETLSLTCTVSGGPVRSGSHYWNWIRQPPGRGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLENRVTISIDTSNNHFSLKLSSVTАADTALYFCARGTATFDWNFPFDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGSGGSDIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKLEIK |
139117- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 5 |
56 | GАAGTGCАACTCCАACАATCCGGTCCAGGACTCGTCAGACCCTCCGАAACTCTCTCGCTTACATGCACTGTGTCCGGCGGCCCTGTGCGGTCCGGCTCTCATTACTGGАACTGGATTCGCCAGCCCCCGGGACGCGGACTGGAGTGGATCGGCTACATCTATTACTCGGGGTCGACTАACTACАACCCGAGCCTGGАAАATAGAGTGACCATCTCАATCGACACGTCCАACАACCACTTCTCGCTGАAGTTGTCCTCCGTGACTGCCGCCGATACTGCCCTGTACTTCTGTGCTCGCGGАACCGCCACCTTCGACTGGАACTTCCCTTTTGACTCATGGGGCCAGGGGACCCTTGTGACCGTGTCCAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGTGGTGGCGGGAGCGGTAGCGGCGGАAGCGACATCCAGATGACCCAGTCACCGTCCTCGCTGTCCGCATCCATTGGGGATCGGGTCACTATTACTTGCCGGGCGTCCCAGTCCATCTCGTCCTACCTGАACTGGTATCAGCAGАAGCCAGGGАК,AGCCCCCАAGCTGCTGATCTACGCGGCCAGCAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCTTCАAGGTTTAGCGGCAGCGGATCGGGАACCGACTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTCCАACCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCTACTCCACCCCGTGGACCTTCGGACAGGGАACCАAGCTGGAGATCАAG |
139117- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 5 |
69 | EVQLQQSGPGLVRPSETLSLTCTVSGGPVRSGSHYWNWIRQPPGRGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLENRVTISIDTSNNHFSLKLSSVTАADTALYFCARGTATFDWNFPFDSWGQGTLVTVSS |
139117- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 5 |
82 | DIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKLEIK |
139117- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 5 |
95 | MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLQQSGPGLVRPSETLSLTCTVSGGPVRSGSHYWNWIRQPPGRGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLENRVTISIDTSNNHFSLKLSSVTАADTALYFCARGTATFDWNFPFDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGSGGSDIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
139117- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 5 |
108 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАACTCCАACАATCCGGTCCAGGACTCGTCAGACCCTCCGАAACTCTCTCGCTTACATGCACTGTGTCCGGCGGCCCTGTGCGGTCCGGCTCTCATTACTGGАACTGGATTCGCCAGCCCCCGGGACGCGGACTGGAGTGGATCGGCTACATCTATTACTCGGGGTCGACTАACTACАACCCGAGCCTGGАAАATAGAGTGACCATCTCАATCGACACGTCCАACАACCACTTCTCGCTGАAGTTGTCCTCCGTGACTGCCGCCGATACTGCCCTGTACTTCTGTGCTCGCGGАACCGCCACCTTCGACTGGАACTTCCCTTTTGACTCATGGGGCCAGGGGACCCTTGTGACCGTGTCCAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGTGGTGGCGGGAGCGGTAGCGGCGGАAGCGACATCCAGATGACCCAGTCACCGTCCTCGCTGTCCGCATCCATTGGGGATCGGGTCACTATTACTTGCCGGGCGTCCCAGTCCATCTCGTCCTACCTGАACTGGTATCAGCAGАAGCCAGGGАAAGCCCCCАAGCTGCTGATCTACGCGGCCAGCAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCTTCАAGGTTTAGCGGCAGCGGATCGGGАACCGACTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTCCАACCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCTACTCCACCCCGTGGACCTTCGGACAGGGАACCАAGCTGGAGATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
139120 | ||
139120- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 7 |
45 | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPSSSGSYYMEDSYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQVVFGGGTKLTVL |
139120- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 7 |
58 | GАAGTGCАATTGGTGGАATCTGGAGGAGGACTTGTGАAACCTGGTGGАAGCCTGAGACTTTCCTGTGCGGCCTCGGGATTCACTTTCTCCTCCTACTCCATGАACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGGАAGGGACTGGАATGGGTGTCATCCATCTCCTCCTCATCGTCGTACATCTACTACGCCGATAGCGTGАAGGGGCGGTTCACCATTTCCCGGGACАACGCTАAGАACAGCCTCTATCTGCАAATGАATTCCCTCCGCGCCGAGGACACTGCCGTGTACTACTGCGCGAGGGACCCCTCATCАAGCGGCAGCTACTACATGGAGGACTCGTATTACTACGGАATGGACGTCTGGGGCCAGGGАACCACTGTGACGGTGTCCTCCGGTGGAGGGGGCTCCGGGGGCGGGGGATCTGGCGGAGGAGGCTCCАACTTCATGCTGACCCAGCCGCACTCCGTGTCCGАAAGCCCCGGАAAGACCGTGACАATTTCCTGCACCGGGTCCTCCGGCTCGATCGCATCАAACTACGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGCGCCCCCACCACTGTCATCTACGAGGATАACCAGCGGCCGTCGGGTGTCCCAGACCGGTTTTCCGGTTCGATCGATAGCAGCAGCАACAGCGCCTCCCTGACCATTTCCGGCCTCАAGACCGAGGATGAGGCTGACTACTACTGCCAGTCGTATGACTCCTCGАACCАAGTGGTGTTCGGTGGCGGCACCАAGCTGACTGTGCTG |
139120- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 7 |
71 | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPSSSGSYYMEDSYYYGMDVWGQGTTVTVSS |
139120- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 7 |
84 | NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQVVFGGGTKLTVL |
139120- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 7 |
97 | MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPSSSGSYYMEDSYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQVVFGGGTKLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
139120- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 7 |
110 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАATTGGTGGАATCTGGAGGAGGACTTGTGАAACCTGGTGGАAGCCTGAGACTTTCCTGTGCGGCCTCGGGATTCACTTTCTCCTCCTACTCCATGАACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGGАAGGGACTGGАATGGGTGTCATCCATCTCCTCCTCATCGTCGTACATCTACTACGCCGATAGCGTGАAGGGGCGGTTCACCATTTCCCGGGACАACGCTАAGАACAGCCTCTATCTGCАAATGАATTCCCTCCGCGCCGAGGACACTGCCGTGTACTACTGCGCGAGGGACCCCTCATCАAGCGGCAGCTACTACATGGAGGACTCGTATTACTACGGАATGGACGTCTGGGGCCAGGGАACCACTGTGACGGTGTCCTCCGGTGGAGGGGGCTCCGGGGGCGGGGGATCTGGCGGAGGAGGCTCCАACTTCATGCTGACCCAGCCGCACTCCGTGTCCGАAAGCCCCGGАAAGACCGTGACATTTCCTGCACCGGGTCCTCCGGCTCGATCGCATCАAACTACGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGCGCCCCCACCACTGTCATCTACGAGGATАК,CCAGCGGCCGTCGGGTGTCCCAGACCGGTTTTCCGGTTCGATCGATAGCAGCAGCАК,CAGCGCCTCCCTGACCATTTCCGGCCTCАAGACCGAGGATGAGGCTGACTACTACTGCCAGTCGTATGACTCCTCGАACCАAGTGGTGTTCGGTGGCGGCACCАAGCTGACTGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
139121 | ||
139121- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 8 |
46 | QVNLRESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREALGSSWEWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKLEIK |
139121- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 8 |
59 | CАAGTGАACCTGAGAGАAAGCGGCGGAGGACTTGTGCАACCTGGAGGАAGCCTGAGACTGTCATGTGCCGCGTCCGGCTTCACCTTCTCGTCCTACGAGATGАACTGGGTCCGCCAGGCACCGGGCАAAGGACTGGАATGGGTGTCCTACATTTCCTCGTCCGGGTCCACCATCTATTACGCCGACTCCGTGA,GGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACАACGCCАAGАACTCCCTCTACCTCCАAATGАACTCACTGAGGGCAGAGGACACTGCGGTCTACTACTGCGCCCGCGАAGCTTTGGGTAGCTCCTGGGAGTGGGGCCAGGGАACCACTGTGACCGTGTCCTCGGGTGGAGGGGGCTCCGGTGGCGGGGGTTCAGGGGGTGGCGGАAGCGATATCCAGATGACTCAGTCACCАAGCTCCCTGAGCGCCTCAGTGGGAGATCGGGTCACАATCACGTGCCAGGCGTCCCAGGACATTTCTАACTACCTCАATTGGTACCAGCAGАAGCCGGGGАAGGCCCCCАAGCTTCTGATCTACGATGCCTCCАACCTGGАAACCGGCGTGCCCTCCCGCTTCTCGGGATCGGGCAGCGGCACTGACTTCACCTTTACCATCTCGTCCCTGCАACCTGAGGACATCGCCACCTATTACTGCCAGCAGTACGATАACCTCCCGCTGACTTTCGGAGGCGGАACTАAGCTGGAGATTАAG |
139121- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 8 |
72 | QVNLRESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREALGSSWEWGQGTTVTVSS |
139121- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 8 |
85 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKLEIK |
139121- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 8 |
98 | MALPVTALLLPLALLLHАARPQVNLRESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREALGSSWEWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
139121- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 8 |
111 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGАACCTGAGAGАAAGCGGCGGAGGACTTGTGCАACCTGGAGGАAGCCTGAGACTGTCATGTGCCGCGTCCGGCTTCACCTTCTCGTCCTACGAGATGАACTGGGTCCGCCAGGCACCGGGCАAAGGACTGGАATGGGTGTCCTACATTTCCTCGTCCGGGTCCACCATCTATTACGCCGACTCCGTGАAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACАACGCCАAGАACTCCCTCTACCTCCАAATGАACTCACTGAGGGCAGAGGACACTGCGGTCTACTACTGCGCCCGCGАAGCTTTGGGTAGCTCCTGGGAGTGGGGCCAGGGАACCACTGTGACCGTGTCCTCGGGTGGAGGGGGCTCCGGTGGCGGGGGTTCAGGGGGTGGCGGАAGCGATATCCAGATGACTCAGTCACCАAGCTCCCTGAGCGCCTCAGTGGGAGATCGGGTCACАATCACGTGCCAGGCGTCCCAGGACATTTCTАACTACCTCАATTGGTACCAGCAGАAGCCGGGGАAGGCCCCCАAGCTTCTGATCTACGATGCCTCCАACCTGGАAACCGGCGTGCCCTCCCGCTTCTCGGGATCGGGCAGCGGCACTGACTTCACCTTTACCATCTCGTCCCTGCАACCTGAGGACATCGCCACCTATTACTGCCAGCAGTACGATАACCTCCCGCTGACTTTCGGAGGCGGАACTАAGCTGGAGATTАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАК,CGАК,CTCАК,TCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
146264 | ||
146264- ак,
ScFv-домен CLL-1-CAR 13 |
51 | QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYPFTGYYIQWVRQAPGQGLEWMGWIDPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDSYGYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQGISSALAWYQQKPGKPPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYPLTFGGGTKVEIK |
146264- нк,
ScFv-домен CLL-1-CAR 13 |
64 | CАAGTGCАACTCGTCCAGTCCGGTGCAGАAGTGАAАAAGAGCGGAGCCTCAGTGАAAGTGTCCTGCАAGGCCTCCGGTTACCCCTTCACTGGATACTACATTCAGTGGGTCCGCCАAGCCCCGGGACAGGGTCTGGAGTGGATGGGGTGGATTGACCCTАACTCGGGАAATACGGGATACGCGCAGАAGTTCCAGGGCCGCGTGACCATGACCAGGАACACCTCGATCAGCACCGCCTACATGGАACTGTCCTCCCTGCGGTCGGAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGCCTCCGATTCCTATGGGTACTACTACGGАATGGACGTCTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCCTCGGGAGGCGGAGGGAGCGGCGGGGGTGGATCGGGAGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCACCATCАAGCCTTAGCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACATTCACTTGTCGGGCGTCCCAGGGАATCTCCTCCGCTCTGGCTTGGTATCAGCAGАAGCCTGGGАAGCCTCCGАAGCTGTTGATCTACGACGCGAGCAGCCTGGАATCAGGGGTGCCCTCCCGGTTTTCCGGGTCCGGTTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATTTCGTCCCTCCАACCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTTCАACАACTACCCGCTGACCTTCGGAGGAGGCACTАAGGTCGAGATCАAG |
146264- ак,
VH ScFv CLL-1-CAR 13 |
77 | QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYPFTGYYIQWVRQAPGQGLEWMGWIDPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDSYGYYYGMDVWGQGTLVTVSS |
146264- ак,
VL ScFv CLL-1-CAR 13 |
90 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQGISSALAWYQQKPGKPPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYPLTFGGGTKVEIK |
146264- ак,
полный CAR, CLL-1-CAR 13 |
103 | MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYPFTGYYIQWVRQAPGQGLEWMGWIDPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDSYGYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQGISSALAWYQQKPGKPPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
146264- нк,
полный CAR, CLL-1-CAR 13 |
116 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTCGTCCAGTCCGGTGCAGАAGTGАAАAAGAGCGGAGCCTCAGTGАAAGTGTCCTGCАAGGCCTCCGGTTACCCCTTCACTGGATACTACATTCAGTGGGTCCGCCАAGCCCCGGGACAGGGTCTGGAGTGGATGGGGTGGATTGACCCTАACTCGGGАAATACGGGATACGCGCAGАAGTTCCAGGGCCGCGTGACCATGACCAGGАACACCTCGATCAGCACCGCCTACATGGАACTGTCCTCCCTGCGGTCGGAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGCCTCCGATTCCTATGGGTACTACTACGGАATGGACGTCTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCCTCGGGAGGCGGAGGGAGCGGCGGGGGTGGATCGGGAGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCACCATCАAGCCTTAGCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACATTCACTTGTCGGGCGTCCCAGGGАATCTCCTCCGCTCTGGCTTGGTATCAGCAGАAGCCTGGGАAGCCTCCGАAGCTGTTGATCTACGACGCGAGCAGCCTGGАATCAGGGGTGCCCTCCCGGTTTTCCGGGTCCGGTTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATTTCGTCCCTCCАACCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTTCАACАACTACCCGCTGACCTTCGGAGGAGGCACTАAGGTCGAGATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
181268 | ||
181268- ак,
VH ScFv |
195 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPYSSSWHDAFDIWGQGTMVTVSS |
181268- ак,
VL ScFv |
196 | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVDIK |
181268- ак,
полный CAR |
197 | MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPYSSSWHDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVDIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
181268- нк,
полный CAR |
198 | ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАACTCGTGGАAAGCGGTGGAGGTCTTGTGCАACCTGGAGGTTCCTTGCGCCTGTCATGTGCAGCTTCCGGCTTCACTTTCTCCTCGTACGAGATGАATTGGGTGCGGCAGGCGCCTGGАAAGGGGCTGGАATGGGTGTCCTACATCTCАAGCTCCGGCTCGACCATCTACTACGCGGACAGCGTGАAGGGGCGGTTCACGATTTCGAGGGACАACGCCАAGАACTCGCTCTATCTGCАAATGАACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCCGGGACCCCTACTCCTCCTCATGGCACGACGCCTTTGATATCTGGGGCCAGGGАACCATGGTCACCGTCAGCAGCGGGGGCGGAGGTTCCGGGGGAGGGGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCCGAGATTGTGTTGACTCAGAGCCCGGGTACCCTGTCGCTGAGCCCCGGAGAGCGGGCCACCCTTTCATGCCGCGCCAGCCAGTCCGTGTCCTCATCCTACCTCGCGTGGTACCAGCAGАAACCTGGCCAGGCCCCGCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCTCGCGCGCАACCGGАATCCCCGACCGGTTCTCCGGGTCTGGCAGCGGАACCGACTTCACTCTCACCATTTCGAGGCTGGAGCCGGАAGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCTCCTCGCCACTGACTTTCGGCGGAGGАACCАAGGTCGATATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАК,GCАК,CCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG |
В воплощениях фрагменты CAR scFv затем клонируют в лентивирусные векторы для создания конструкции полноразмерного CAR в одной кодирующей рамке и с использованием промтора EF1-альфа для экспрессии (SEQ ID NO: 11).
Промтор EF1-альфа
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
Gly/Ser (SEQ ID NO:25)
GGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO:26): эта последовательность может охватывать 1-6 повторяющихся звеньев «Gly Gly Gly Gly Ser»
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO:27)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO:28)
GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO:29)
GGGS
ПолиA: (A)5000 (SEQ ID NO:30)
Эта последовательность может охватывать 50-5000 аденинов.
ПолиA: (T)100 (SEQ ID NO:31)
ПолиA: (T)5000 (SEQ ID NO:32)
Эта последовательность может охватывать 50-5000 тиминов.
ПолиA: (A)5000 (SEQ ID NO:33)
Эта последовательность может охватывать 100-5000 аденинов.
ПолиA: (A)400 (SEQ ID NO:34)
ПолиA: (A)2000 (SEQ ID NO:35)
Gly/Ser (SEQ ID NO:38): эта последовательность может охватывать 1-10 повторяющихся звеньев «Gly Gly Gly Ser»
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
В одном воплощении CLL-1-CAR может включать один или больше, например, одни, два или три, CDR вариабельного домена тяжелой цепи и/или один или больше, например, одни, два или три, CDR вариабельного домена легкой цепи или вариабельную тяжелую цепь (VH) или вариабельную легкую цепь (VL) анти-CLL-1 (CLEC12A) антитела, раскрытого в публикации РСТ WO2014/051433, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Фрагменты CAR csFv можно клонировать в лентивирусные векторы для создания конструкции полноразмерного CAR в одной кодирующей рамке и с использованием промтора EF1-альфа для экспрессии (SEQ ID NO: 11).
Конструкция CAR может включать линкер Gly/Ser, имеющий одну или несколько из следующих последовательностей: GGGGS (SEQ ID NO:25); охватывающую 1-6 повторяющихся звеньев «Gly Gly Gly Gly Ser», например, GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26); GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27); GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 28); GGGS (SEQ ID NO: 29); или охватывающую 1-10 повторяющихся звеньев «Gly Gly Gly Ser», например, GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 38). В воплощениях конструкция CAR включает последовательность поли(А), например, последовательность, охватывающую 50-5000 или 100-5000 аденинов (например, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35), или последовательность, охватывающую 50-5000 тиминов (например, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32). С другой стороны, конструкция CAR может включать, например, линкер, включающий последовательность GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 486).
Биспецифические CAR
В одном воплощении молекула полиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело имеет специфичность в отношении не более чем двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется последовательностью первого вариабельного домена иммуноглобулина, который имеет специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и последовательностью второго вариабельного домена иммуноглобулина, который имеет специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении первый и второй эпитопы находятся на одном и том же антигене, например, одном и том же белке (или субъединице полимерного белка). В одном воплощении первый и второй эпитопы перекрываются. В одном воплощении первый и второй эпитопы не перекрываются. В одном воплощении первый и второй эпитопы находятся в различных антигенах, например, различных белках (или различных субъединицах полимерного белка). В одном воплощении молекула биспецифического антитела включает последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые имеют специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые имеют специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении молекула биспецифического антитела включает половину антитела, имеющую специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и половину антитела, имеющую специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении молекула биспецифического антитела включает половину антитела или ее фрагмент, имеющие специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и половину антитела или ее фрагмент, имеющие специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении молекула биспецифического антитела включает scFv или его фрагмент, имеющие специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и scFv или его фрагмент, имеющие специфичность связывания в отношении второго эпитопа.
В некоторых воплощениях молекула антитела является молекулой полиспецифического (например, биспецифического или триспецифического) антитела. Протоколы для получения молекул биспецифических или триспецифических антител известны в технике, включая, но не ограничиваясь перечисленным, например, подход «застежка-кнопка», описанный, например, в US 5731168; спаривание Fc с использованием электростатического взаимодействия, описанное, например, в WO 09/089004, WO 06/106905 и WO 2010/129304; образование гетеродимера доменами, сконструированными с обменом цепей (SEED), описанное, например, в WO 07/110205; обмен антигенсвязыващими фрагментами Fab, описанный, например, в WO 08/119353, WO 2011/131746 и WO 2013/060867; конъюгирование двух антител, например, путем сшивания антител, с образованием биспецифической структуры с использованием гетеробифункционального реагента, имеющего аминную реакционную группу и сульфгидрильную реакционную группу, описанное, например, в US 4433059; протоколы детерминант биспецифических антител, полученных рекомбинацией половин антител (пар тяжелая-легкая цепь или Fab) из различных антител через цикл восстановления и окисления дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями, как описано, например, в US 4444878; трифункциональных антител, например, трех Fab'-фрагментов, сшитых через сульфгидрильные реакционные группы, описанный, например, в US 5273743; биосинтетических связывающих белков, например, пары scFv, сшитых по С-концевым хвостам, предпочтительно, через химическое сшивание по дисульфидным или аминным реакционным группам, как описано, например, в US 5534254; бифункциональных антител, например, Fab-фрагментов с различными специфичностями связывания, димеризованных через лейциновые молнии (например, c-fos и c-jun), в которых заменен константный домен, как описано, например, в US 5582996; биспецифических и олигоспецифических моно- и олиговалентных рецепторов, например, участков VH-CH1 двух антител (двух Fab-фрагментов), соединенных через полипептидный спейсер между участком СН1 одного антитела и участком VH другого антитела, типично с ассоциированными легкими цепями, как описано, например, в US 5591828; биспецифических конъюгатов ДНК-антитело, например, от сшивания антител или Fab-фрагментов через двухцепочечный отрезок ДНК, как описано, например, в US 5635602; биспецифических слитых белков, например, экспрессирующей конструкции, содержащей два scFv с гидрофильным спиральным пептидным линкером между ними и полным константным участком, как описано, например, в US 5637481; поливалентных и полиспецифических связывающих белков, например, димера полипептидов, имеющих первый домен со связывающим участком вариабельного домена тяжелой цепи Ig и второй домен со связывающим участком вариабельного домена легкой цепи Ig, обычно называемых диателами (структуры более высокого порядка также охватываются как создающие биспецифические, триспецифические или тетраспецифические молекулы, как описано, например, в US 5837242; конструкций минител с соединенными VL и VH цепями, дополнительно соединенными пептидными спейсерами с шарнирным участком антитела и участком CD3, которые могут быть димеризованы с образованием биспецифических/поливалентных молекул, как описано, например, в US 5837821; VH и VL доменов, соединенных коротким пептидным линкером (например, в 5 или 10 аминокислот) или без линкера вовсе в любой ориентации, которые могут образовывать димеры с образованием биспецифических диател, тримеры и тетрамеры, как описано, например, в US 5844094; нити VH-доменов (или VL-доменов в членах семейства), соединенных пептидными связями со сшивающими группами по С-концу, дополнительно ассоциированных с VL-доменами, с образованием ряда FV (или scFv), как описано, например, в US 5864019; и одноцепочечные связывающие полипептиды как с VH-, так и с VL-доменом, соединенными через пептидный линкер, объединяют в поливалентные структуры через нековалентное или химическое сшивание с образованием, например, гомобивалентных, гетеробивалентных, тривалентных и тетравалентных структур, с использованием формата типа двух scFv или диател, как описано, например, в US 5869620. Другие примеры полиспецифических и биспецифических молекул и способы их получения находят, например, в US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396, US6476198, US6511663, US6670453, US6743896, US6809185, US6833441, US7129330, US7183076, US7521056, US7527787, US7534866, US7612181, US2002004587A1, US2002076406A1, US2002103345A1, US2003207346A1, US2003211078A1, US2004219643A1, US2004220388A1, US2004242847A1, US2005003403A1, US2005004352A1, US2005069552A1, US2005079170A1, US2005100543A1, US2005136049A1, US2005136051A1, US2005163782A1, US2005266425A1, US2006083747A1, US2006120960A1, US2006204493A1, US2006263367A1, US2007004909A1, US2007087381A1, US2007128150A1, US2007141049A1, US2007154901A1, US2007274985A1, US2008050370A1, US2008069820A1, US2008152645A1, US2008171855A1, US2008241884A1, US2008254512A1, US2008260738A1, US2009130106A1, US2009148905A1, US2009155275A1, US2009162359A1, US2009162360A1, US2009175851A1, US2009175867A1, US2009232811A1, US2009234105A1, US2009263392A1, US2009274649A1, EP346087A2, WO0006605A2, WO02072635A2, WO04081051A1, WO06020258A2, WO2007044887A2, WO2007095338A2, WO2007137760A2, WO2008119353A1, WO2009021754A2, WO2009068630A1, WO9103493A1, WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1. Перечисленные выше заявки полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок.
В каждом антителе или фрагменте антитела (например, scFv) молекулы биспецифического антитела VH может располагаться выше или ниже VL. В некоторых воплощениях верхнее антитело или фрагмент антитела (например, scFv) выстраивают в ряд с его VH (VH1) выше его VL (VL1), и нижнее антитело или фрагмент антитела (например, scFv) выстраивают в ряд с его VL (VL2) выше его VH (VH2), так что вся молекула биспецифического антитела имеет аранжировку VH1-VL1-VL2-VH2. В других воплощениях верхнее антитело или фрагмент антитела (например, scFv) выстраивают в ряд с его VL (VL1) выше его VH (VH1), и нижнее антитело или фрагмент антитела (например, scFv) выстраивают в ряд с его VH (VH2) выше его VL (VL2), так что вся молекула биспецифического антитела имеет аранжировку VL1-VH1-VH2-VL2. Необязательно между двумя антителами или фрагментами антител (например, scFv), располагается линкер, например, между VL1 и VL2, если конструкция выстроена в виде VH1-VL1-VL2-VH2, или между VН1 и VН2, если конструкция выстроена в виде VL1-VH1-VH2-VL2. Линкер может представлять собой линкер, описанный в настоящем описании, например, линкер (Gly4-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 64). Как правило, линкер между двумя scFv должен быть достаточно длинным для того, чтобы избежать ошибочного спаривания между доменами двух scFv. Необязательно линкер располагается между VL и VH первого scFv. Необязательно линкер располагается между VL и VH второго scFv. В конструкциях, в которых имеется несколько линкеров, любые два или больше линкеров могут быть одинаковыми или различными. Соответственно, в некоторых воплощениях биспецифический CAR включает VL, VH и, необязательно, один или больше линкеров в ряду, как описано в настоящем описании.
В одном аспекте молекула биспецифического антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, например, scFv, которая имеет специфичность связывания в отношении CLL-1, например, включает scFv, описанный в настоящем описании, например, описанный в таблице 2, или включает CDR легкой цепи и/или CDR тяжелой цепи из CLL-1-scFv, описанного в настоящем описании, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, например, scFv, которая имеет специфичность связывания в отношении второго эпитопа в другом антигене. В некоторых аспектах вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении антигена, экспрессированного на клетках AML, например, антигена иного, чем CLL-1. Например, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении CD33. Как другой пример, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении FLT3. Например, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении фолатного рецептора бета. В некоторых аспектах вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении антигена, экспрессированного на В-клетках, например, CD19, CD20, CD22 или ROR1.
Химерный TCR
В одном аспекте антитела к CLL-1 и фрагменты антител по настоящему изобретению (например, описанные в таблице 2) могут быть привиты на один или несколько константных доменов цепи Т-клеточного рецептора («TCR»), например, цепи TCR-альфа или TCR-бета, для создания химерного TCR, который специфически связывается с CLL-1. Без связи с какой-либо теорией, полагают, что химерные TCR будут передавать сигнал через комплекс TCR после связывания антигена. Например, CLL-1-scFv, раскрытый в настоящем описании, можно привить на константный домен, например, по меньшей мере часть внеклеточного константного домена, трансмембранный домен и цитоплазматический домен цепи TCR-альфа, например, цепи TCR-альфа и/или цепи TCR-бета. Как другой пример, фрагмент антитела к CLL-1, например, VL домен, описанный в настоящем описании, можно привить на константный домен цепи TCR-альфа, и фрагмент антитела к CLL-1, например, VН домен, описанный в настоящем описании, можно привить на константный домен цепи TCR-бета (или альтернативно, VL домен можно привить на константный домен цепи TCR-бета, и VН домен можно привить к цепи TCR-альфа). Как другой пример, CDR антитела к CLL-1 или фрагмент антитела, например, CDR антитела к CLL-1 или фрагмента антитела, описанные в таблицах 3, 4, 5, 6, 7 и 8, можно привить к цепи TCR-альфа и/или бета-цепи для создания химерного TCR, который специфически связывается с CLL-1. Например, LCDR, раскрытые в настоящем описании, можно привить на вариабельный домен цепи TCR-альфа, и НCDR, раскрытые в настоящем описании, можно привить на вариабельный домен цепи TCR-бета, или наоборот. Такие химерные TCR можно получить способами, известными в технике (см., например, Willemsen RA et al., Gene Therapy, 2000; 7: 1369-1377; Zhang T. et al., Cancer Gene Ther., 2004; 11: 487-496; Aggen et al., Gene Ther., 2012, Apr; 19(4): 365-74).
Трансмембранный домен
Что касается трансмембранного домена, в различных воплощениях можно создать CAR, включающий трансмембранный домен, который соединен с внеклеточным доменом CAR. Трансмембранный домен может включать одну или больше дополнительных аминокислот, соседних с трансмембранным участком, например, одну или больше аминокислот, ассоциированных с внеклеточным участком белка, из которого который трансмембранный белок получают (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и до 15 аминокислот внеклеточного участка), и/или одну или больше дополнительных аминокислот, ассоциированных с внутриклеточным участком белка, из которого получен трансмембранный белок (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и до 15 аминокислот внутриклеточного участка). В одном аспекте трансмембранный домен является доменом, который ассоциирован с одним из других доменов, которые используются в CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен можно выбрать или модифицировать путем аминокислотной замены для того, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами одних и тех же или различных поверхностных мембранных белков, например, для минимизации взаимодействий с другими членами рецепторного комплекса. В одном аспекте трансмембранный домен способен к гомодимеризации с другим CAR на поверхности клетки CART. В другом аспекте аминокислотная последовательность трансмембранного домена может быть модифицирована или заменена так, чтобы минимизировать взаимодействия со связывающими доменами нативного партнера по связыванию, присутствующего в той же CART.
Трансмембранный домен можно получить или из природного или из рекомбинантного источника. Когда источник является природным, домен можно получить из любого мембрансвязанного или трансмембранного белка. В одном аспекте трансмембранный домен способен передавать сигнал к внутриклеточному(ым) домену(ам), всякий раз, когда CAR связан с мишенью. Трансмембранный домен для определенного применения в настоящем изобретении может включать по меньшей мере трансмембранный(е) участок(ки), например, цепи альфа, бета или дзета Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8 (например, CD8-альфа, CD8-бета), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. В некоторых воплощениях трансмембранный домен может включать по меньшей мере трансмембранный(е) участок(ки) костимулирующей молекулы, например, молекулы ГКГС I класса, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83.
В некоторых случаях трансмембранный домен может присоединяться к внеклеточному участку CAR, например, антигенсвязывающему домену CAR, через шарнир, например, шарнир из человеческого белка. Например, в одном воплощении ширнир может представлять собой шарнир человеческого Ig (иммуноглобулина), например, шарнир IgG4, или шарнир CD8. В одном воплощении шарнир или спейсер включает (например, состоит из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В одном аспекте трансмембранный домен включает (например, состоит из) трансмембранный домен SEQ ID NO: 6.
В одном аспекте шарнир или спейсер включает шарнир IgG4. Например, в одном воплощении шарнир или спейсер включает шарнир аминокислотную последовательность ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM (SEQ ID NO: 3). В некоторых воплощениях шарнир или спейсер включает шарнир, кодированный нуклеотидной последовательностью GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG (SEQ ID NO: 14).
В одном аспекте шарнир или спейсер включает шарнир IgD. Например, в одном воплощении шарнир или спейсер включает шарнир аминокислотной последовательности RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH (SEQ ID NO:4). В некоторых воплощениях шарнир или спейсер включает шарнир, кодированный нуклеотидной последовательностью AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT (SEQ ID NO:15).
В одном аспекте трансмембранный домен может быть рекомбинантным, и в таком случае он будет включать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В одном аспекте в каждом конце рекомбинантного домена могут быть обнаружены триплет фенилаланина, триптофана и валина.
Необязательно короткий олиго- или полипептидный линкер от 2 до 10 аминокислот в длину может образовывать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим участком CAR. Дублет глицин-серин предоставляет особенно подходящий линкер. Например, в одном аспекте линкер включает аминокислотную последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 5). В некоторых воплощениях линкер кодирован нуклеотидной последовательностью GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 16).
В одном аспекте шарнир или спейсер включает шарнир KIR2DS2.
Цитоплазматический домен
Цитоплазматический домен или участок CAR по настоящему изобретению включает внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен, как правило, ответственен за активацию по меньшей мере одной из естественных эффекторных функций иммунной клетки, в которую введен CAR.
Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в CAR по изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторы, которые действуют сообща для инициации сигнальной трансдукции после сцепления антигена с рецептором, а также любое производное или вариант таких последовательностей и любую рекомбинантную последовательность, которая имеет такую же функциональную способность.
Известно, что сигналы, генерированные через один TCR, являются недостаточными для полной активации Т-клетки, и что также требуется вторичный и/или костимулирующий сигнал. Таким образом, можно сказать, что активация Т-клетки опосредуется двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: последовательностями, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные внутриклеточные сигнальные домены), и последовательностями, которые действуют антигеннезависимо, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичный цитоплазматический сигнальный домен, например, костимулирующий домен).
Первичный сигнальный домен регулирует первичную активацию комплекса TCR или путем стимуляции или путем ингибирования. Первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые действуют путем стимуляции, содержат сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные активирующие мотивы на основе тирозина или ITAM.
Примеры ITAM, содержащих первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые особенно используются в изобретении, включают ITAM TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известный как «ICOS»), FcεRI, DAP10, DAP12 и CD66d. В одном воплощении CAR по изобретению включает внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен CD3-дзета.
В одном воплощении первичный сигнальный домен включает модифицированный домен ITAM, например, мутированный домен ITAM, который имеет измененную (например, увеличенную или уменьшенную) активность по сравнению с нативным доменом ITAM. В одном воплощении первичный сигнальный домен включает модифицированный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, оптимизированный и/или усеченный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен. В одном воплощении первичный сигнальный домен включает одни, два, три, четыре или больше мотивов ITAM.
Другие примеры молекул, содержащих первичный внутриклеточный сигнальный домен, которые имеют особое применение в изобретении, включают молекулы DAP10, DAP12 и CD32.
Внутриклеточный сигнальный домен CAR может включать первичный сигнальный домен, например, CD3-дзета сигнальный домен сам по себе или может быть объединен в любым(и) другим(и) нужным(и) внутриклеточным(и) сигнальным(и) доменом(амии), применимым(и) в контексте CAR по изобретению. Например, внутриклеточный сигнальный домен CAR может включать первичный сигнальный домен, например, часть цепи CD3-дзета, и костимулирующий сигнальный домен. Костимулирующий сигнальный домен относится к части CAR, включающей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности иную, чем антигенный рецептор или его лиганды, которая требуется для эффективной реакции лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают молекулу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецеторы NK-клетки, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83, и т.п.. Например, показано, что костимуляция CD27 усиливает экспансию, эффекторную функцию и выживаемость человеческих клеток CART in vitro и увеличивает стойкость и противоопухолевую аетивность in vivo (Song et al., Blood, 2012, 119(3): 696-706). Внутриклеточные сигнальные последовательности в цитоплазматической части CAR по изобретению могут соединяться друг с другом произвольно или в определенном порядке. Необязательно короткий олиго- или полипептидный линкер, например, длиной от 2 до 10 аминокислот (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот), может образовывать связь между внутриклеточными сигнальными последовательностями. В одном воплощении в качестве подходящего линкера можно использовать одну аминокислоту, например, аланин, глицин.
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий два или больше, например, 2, 3, 4, 5 или больше, костимулирующих сигнальных доменов. В одном воплощении два или больше, например, 2, 3, 4, 5 или больше, костимулирующих сигнальных доменов разделены линкерной молекулой, например, линкерной молекулой, описанной в настоящем описании. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает два костимулирующих домена. В некоторых воплощениях линкерная молекула представляет собой глициновый остаток. В некоторых воплощениях линкер представляет собой аланиновый остаток.
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1ВВ. В одном аспекте сигнальный домен CD3-дзета представляет собой сигнальный домен SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (человеческий CD3-дзета дикого типа).
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD27. В одном аспекте сигнальный домен CD27 включает аминокислотную последовательность QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO: 8). В одном аспекте сигнальный домен CD27 кодируется нуклеотидной последовательностью AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 19).
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В одном аспекте сигнальный домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482. В одном аспекте сигнальный домен CD28 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 483.
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен ICOS. В одном аспекте сигнальный домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484. В одном аспекте сигнальный домен ICOS кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 485.
В одном аспекте CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем описании, может дополнительно включать второй CAR, например, CAR, который включает другой антигенсвязывающий домен, например, для той же мишени (CLL-1) или другой мишени (например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатного рецептора бета). В одном воплощении второй CAR включает антигенсвязывающий домен к мишени, экспрессированной в клетках острого миелоидного лейкоза, таких как, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатного рецептора бета. В одном воплощении CAR-экспрессирующая клетка включает первый CAR, который специфически связывает первый антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, но не первичный сигнальный домен, и второй CAR, который специфически связывает второй отличный от первого антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, но не костимулирующий сигнальный домен. Без желания привязываться к теории, размещение костимулирующего сигнального домена, например, 4-1BB, CD28, CD27, ICOS или OX-40, в первом CAR и первичного сигнального домена, например, CD3-дзета, во втором CAR может ограничить активность CAR для клеток, где экспрессируется обе мишени. В одном воплощении CAR-экспрессирующая клетка включает первый CLL-1-CAR, который включает CLL-1-связывающий домен, трансмембранный домен и костимулирующий домен, и второй CAR, который специфически связывает антиген иной, чем CLL-1 (например, антиген, экспрессированный на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатного рецептора бета), и включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В другом воплощении CAR-экспрессирующая клетка включает первый CLL-1-CAR, который включает CLL-1-связывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и второй CAR, который специфически связывает антиген иной, чем CLL-1 (например, антиген, экспрессированный на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатного рецептора бета), и включает антигенсвязывающий домен для антигена, трансмембранный домен и костимулирующий домен.
В одном воплощении CAR-экспрессирующая клетка включает CLL-1-CAR, описанный в настоящем описании, и ингибирующий CAR. В одном воплощении ингибирующий CAR включает антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, находящийся на здоровых клетках, но не на раковых клетках, например, здоровых клетках, которые также экспрессируют CLL-1. В одном воплощении ингибирующий CAR включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен ингибирующей молекулы. Например, внутриклеточный сигнальный домен ингибирующей молекулы может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета.
В одном воплощении, когда CAR-экспрессирующая клетка включает два или больше различных CAR, антигенсвязывающие домены различных CAR могут быть такими, что антигенсвязывающие домены не взаимодействуют друг с другом. Например, клетка, экспрессирующая первый и второй CAR, может иметь антигенсвязывающий домен первого CAR, например, фрагмент, например, scFv, который не образует ассоциацию с антигенсвязывающим доменом второго CAR, например, антигенсвязывающий домен второго CAR представляет собой VHH.
В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен включает антигенсвязывающие однодоменные молекулы (SDAB), определяющие комплементарность участки которых являются частью одного полипептидного домена. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленным, вариабельные домены тяжелой цепи, связывающие молекулы, по природе лишенные легких цепей, отдельные домены, образованные от обычных 4-цепочечных антител, сконструированные домены и однодоменные каркасы иные, чем каркасы, образованные от антител. Молекулы SDAB могут быть из любых молекул, известных в технике, или любых будущих однодоменных молекул. Молекулы SDAB можно получить от любого вида, включая, но не ограничиваясь перечисленным, мышь, человека, верблюда, ламу, рыбу, акулу, козу, кролика и корову. Этот термин также включает встречающиеся в природе молекулы однодоменных антител вида иного, чем камелиды и акулы.
В одном аспекте молекулу SDAB можно получить из вариабельного участка иммуноглобулина, находящегося в рыбе, такого как, например, который получают из изотипа иммуноглобулина, известного как новый антигенный рецептор (NAR), обнаруженного в сыворотке акулы. Способы получения однодоменных молекул, образованных из вариабельного участка NAR («IgNARs»), описаны в WO 03/014161 и Streltsov (2005), Protein Sci., 14: 2901-2909.
Согласно другому аспекту молекула SDAB представляет собой встречающуюся в природе однодоменную антигенсвязывающую молекулу, известную как тяжелоцепочечная, лишенная легких цепей. Такие однодоменные молекулы раскрываются в WO 9404678 и Hamers-Casterman C. et al. (1993), Nature, 363: 446-448, например. Для ясности, такой вариабельный домен, образованный от тяжелоцепочечной молекулы, по природе лишенной легких цепей, известен в данном случае как VHH или нанотело, для того, чтобы отличить его от обычного VH четырехцепочечных иммуноглобулинов. Такую VHH молекулу можно получить от вида верблюдовых, например, верблюда, ламы, дромедара, альпаки и гуанако. Кроме верблюдовых, продуцировать тяжелоцепочечные молекулы, по природе лишенные легких цепей, могут другие виды; такие VHH входят в объем изобретения.
Молекулы SDAB могут быть рекомбинантными, с присоединенными CDR, гуманизированными, камелизированными, деиммунизированными и/или генерированными in vitro (например, выбранные с помощью фагового дисплея).
Также обнаружено, что существуют клетки, имеющие несколько химерных внедренных в мембрану рецепторов, включающих антигенсвязывающий домен, в которых могут быть нежелательными взаимодействия между антигенсвязывающими доменами рецепторов, например, поскольку они ингибирует способность одного или нескольких антигенсвязывающийх доменов связывать свой родственный антиген. Соответственно, в настоящем описании раскрываются клетки, имеющие первый и второй невстречающиеся в природе локализованные в мембране химерные рецепторы, включающие антигенсвязывающие домены, которые минимизируют такие взаимодействия. В настоящем описании также раскрываются нуклеиновые кислоты, кодирующие первый и второй не встречающиеся в природе локализованные в мембране химерные рецепторы, включающие антигенсвязывающие домены, которые минимизируют такие взаимодействия, а также способы получения и применения таких клеток и нуклеиновых кислот. В одном воплощении антигенсвязывающий домен одного из указанных первого и второго не встречающихся в природе локализованных в мембране химерных рецепторов, включает scFv, и другой включает одно-VH домен, например, верблюда, акулы, или одно-VH домен миноги, или одно-VH домен, полученный из человеческой или мышиной последовательности.
В некоторых воплощениях изобретение относится к первому и второму CAR, где антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR не включает вариабельный легкий домен и вариабельный тяжелый домен. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR представляет собой scFv, а другой не является scFv. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает одно-VH домен, например, верблюда, акулы, или одно-VH домен миноги, или одно-VH домен, полученный из человеческой или мышиной последовательности. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает нанотело. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает камелидный VHH домен.
В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает scFv, и другой включает одно-VH домен, например, верблюда, акулы, или одно-VH домен миноги, или одно-VH домен, полученный из человеческой или мышиной последовательности. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает scFv, и другой включает нанотело. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает scFv, и другой включает камелидный VHH домен.
В некоторых воплощениях, при наличии на поверхности клетки, связывание антигенсвязывающего домена указанного первого CAR с его родственным антигеном по существу не ослабляется присутствием указанного второго CAR. В некоторых воплощениях связывание антигенсвязывающего домена указанного первого CAR с его родственным антигеном в присутствии указанного второго CAR составляет 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от связывания антигенсвязывающего домена указанного первого CAR с его родственным антигеном в отсутствие указанного второго CAR.
В некоторых воплощениях, при наличии на поверхности клетки, антигенсвязывающие домены указанного первого CAR и указанного второго CAR ассоциируются друг с другом слабее, чем если бы оба домена представляли собой scFv антигенсвязывающие домены. В некоторых воплощениях, при наличии на поверхности клетки, антигенсвязывающие домены указанного первого CAR и указанного второго CAR ассоциируются друг с другом на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньше, чем если бы оба домена представляли собой scFv антигенсвязывающие домены.
В другом аспекте CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем описании, может дополнительно экспрессировать другой агент, например, агент, который усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении агент может представлять собой агент, который подавляет ингибирующую молекулу. Ингибирующие молекулы, например, PD1, могут, в некоторых воплощениях, снижать способность CAR-экспрессирующей клетки подготавливать иммунную эффекторную реакцию. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В одном воплощении агент, который подавляет ингибирующую молекулу, включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении агент включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, такую как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета, или фрагмент любой из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любой из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, включающий костимулирующий домен (например, 4-1BB, CD27, ICOS или CD28, описанные в настоящем описании), и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в настоящем описании). В одном воплощении агент включает первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид внутриклеточного сигнального домена, описанного в настоящем описании (например, сигнальный домен CD28, описанный в настоящем описании, и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в настоящем описании). В воплощениях CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем описании, включает переключающий костимулирующий рецептор, например, описанный в WO 2013/019615, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. PD1 представляет собой ингибирующий член семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках (Agata et al., 1996, Int. Immunol., 8: 765-75). Показано, что два лиганда для PD1 - PD-L1 и PD-L2 отрицательно регулируют активацию T-клеток после связывания с PD1 (Freeman et al., 2000, J. Exp. Med., 192: 1027-34; Latchman et al., 2001, Nat. Immunol., 2: 261-8; Carter et al., 2002, Eur. J. Immunol., 32: 634-43). PD-L1 обилен в раковых клетках человека (Dong et al., 2003, J. Mol. Med., 81: 281-7; Blank et al., 2005, Cancer Immunol. Immunother., 54: 307-314; Konishi et al., 2004, Clin. Cancer Res., 10: 5094). Иммунную супрессию можно реверсировать путем ингибирования локального взаимодействия PD1 с PD-L1.
В одном воплощении агент включает внеклеточный домен (ECD) ингибирующей молекулы, например, запрограммированной гибели 1 (PD1), который может быть слит с трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом, такими как 41ВВ и CD3-дзета (также называемым в настоящем описании PD1-CAR). В одном воплощении PD1-CAR, когда используется в комбинациях с CLL-1-CAR, описанным в настоящем описании, улучшает стойкость CAR-экспрессирующей клетки, например, Т-клетки или NK-клетки. В одном воплощении CAR представляет собой PD1-CAR, включающий внеклеточный домен PD1, указанный как подчеркнутый в SEQ ID NO: 24. В одном воплощении PD1-CAR включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO:24).
В одном воплощении PD1-CAR включает аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 22).
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO:22).
В одном воплощении агент включает нуклеотидную последовательность, кодирующую PD1-CAR, например, PD1-CAR, описанный в настоящем описании. В одном воплощении нуклеотидная последовательность для PD1-CAR показана ниже, причем ниже в SEQ ID NO: 23 PD1-ECD почеркнут.
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc (SEQ ID NO: 23).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к популяции CAR-экспрессирующих клеток, например, клеток CART или CAR-экспрессирующих NK-клеток. В некоторых воплощениях популяция CAR-экспрессирующих клеток включает смесь клеток, экспрессирующих различные CAR. Например, в одном воплощении популяция CAR-экспрессирующих клеток (например, клеток CART или CAR-экспрессирующих NK-клеток) может включать первую клетку, экспрессирующую CAR, имеющий анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, имеющий другой анти-CLL-1 связывающий домен, например, анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, который отличается от анти-CLL-1 связывающего домена в CAR, экспрессированном первой клеткой. Как другой пример, популяция CAR-экспрессирующих клеток может включать первую клетку, экспрессирующую CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен, например, описанный в настоящем описании, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, который включает антигенсвязывающий домен для мишени иной, чем CLL-1, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета). В одном воплощении популяция CAR-экспрессирующих клеток включает, например, первую клетку, экспрессирующую CAR, который включает первичный внутриклеточный сигнальный домен, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, который включает вторичный сигнальный домен, например, костимулирующий сигнальный домен.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к популяции клеток, где по меньшей мере одна клетка в популяции экспрессирует CAR, имеющий анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, и вторая клетка экспрессирует другой агент, например, агент, который усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении агент может представлять собой агент, который подавляет ингибирующую молекулу. Ингибирующие молекулы, например, в некоторых воплощениях снижают способность CAR-экспрессирующей клетки подготавливать иммунную эффекторную реакцию. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В одном воплощении агент, который подавляет ингибирующую молекулу, включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении агент включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, такую как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета, или фрагмент любой из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любой из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, включающий костимулирующий домен (например, 4-1BB, CD27, ICOS или CD28, описанные в настоящем описании), и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в настоящем описании). В одном воплощении агент включает первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид внутриклеточного сигнального домена, описанного в настоящем описании (например, сигнальный домен CD28, описанный в настоящем описании, и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в настоящем описании).
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам, включающим введение популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, клеток CART или CAR-экспрессирующих NK-клеток), например, смеси клеток, экспрессирующих различные CAR, в комбинации с другим агентом, например, ингибитором киназы, таким как ингибитор киназы, описанный в настоящем описании. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам, включающим введение популяции клеток, где по меньшей мере одна клетка в популяции экспрессирует CAR, имеющий противораковый ассоциированный антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, и вторая клетка экспрессирует другой агент, например, агент, который усиливает активность CAR-экспрессирующих клеток, в комбинации с другим агентом, например, ингибитором киназы, таким как ингибитор киназы, описанный в настоящем описании.
CAR рецептора природной клетки-киллера (NKR)
В одном воплощении молекула CAR, описанная в настоящем описании, включает один или больше компонентов рецептора природной клетки-киллера (NKR), посредством чего образуется NKR-CAR. Компонент NKR может представлять собой трансмембранный домен, шарнирный домен или цитоплазматический домен любого из следующих рецепторов природной клетки-киллера: иммуноглобулиноподобный рецептор клетки-киллера (KIR), например, KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1 и KIR3DP1; природный цитотоксический рецептор (NCR), например, NKp30, NKp44, NKp46; сигнальную молекулу активации лимфоцитов (SLAM) семейства рецепторов иммунных клеток, например, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME и CD2F-10; Fc-рецептор (FcR), например, CD16 и CD64; и рецепторы Ly49, например, LY49A, LY49C. Молекулы NKR-CAR, описанные в настоящем описании, могут взаимодействовать с адапторной молекулой или внеклеточным сигнальным доменом, например, DAP12. Примеры конфигураций и последовательностей молекул CAR, включающих компоненты NKR, описаны в публикации № WO2014/145252, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Стратегии регуляции химерных антигенных рецепторов
Существует много способов, которыми можно регулировать активности CAR. В некоторых воплощениях регулируемый CAR (RCAR), где активность CAR можно регулировать, желателен для оптимизации безопасности и эффективности CAR-терапии. Например, индукцию апоптоза с использованием, например, каспазы, слитой с димеризованным доменом (см., например, Di et al., N. Engl. J. Med., 2011, Nov. 3; 365(18): 1673-1683), можно использовать как переключатель безопасности в CAR-терапии по настоящему изобретению. В другом примере CAR-экспрессирующие клетки могут также экспрессировать индуцируемую молекулу каспазы-9 (и-каспаза-9), которая после введения лекарственного средства димеризатора (например, римидусида (также называемого АР1903 (Bellicum Pharmaceuticals) или АР20187 (Ariad) ведет к активации каспазы-9 и апоптозу клеток. Молекула каспазы-9 содержит домен, связывающий химический индуктор димеризации (CID), который опосредует димеризацию в присутствии CID. Это приводит к индуцируемому и селективному истощению CAR-экспрессирующих клеток. В некоторых случаях молекула и-каспазы-9 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты отдельно от CAR-кодирующего(их) вектора(ов). В некоторых случаях молекула и-каспазы-9 кодируется той же молекулой нуклеиновой кислоты, что и CAR-кодирующий ветор. Переключатель безопасности обеспечивает и-каспаза-9 для того, чтобы избежать какую-либо токсичность CAR-экспрессирующих клеток. См., например, Song et al. Cancer Gene Ther., 2008; 15(10): 667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963; и Di Stasi et al., N. Engl. J. Med., 2011; 365: 1673-83.
Альтернативные стратегии регулирования CAR-терапии по настоящему изобретению включают использование небольших молекул или антител, которые дезактивируют или заглушают активность CAR, например, путем делеции CAR-экспрессирующих клеток, например, путем индукции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АDCC). Например, CAR-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем описании, также могут экспрессировать антиген, который узнается молекулами, способными индуцировать гибель клетки, например, АDCC или коплементиндуцированную гибель клетки. Например, CAR-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем описании, также могут экспрессировать рецептор, способный нацеливаться антителом или фрагментом антитела. Примеры таких рецепторов включают EpCAM, VEGFR, интегрины (например, ανβ3, α4, αI¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), члены суперсемейства рецепторов TNF (например, TRAIL-R1, TRAIL-R2), рецептор PDGF, интерфероновый рецептор, фолатный рецептор, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, рецептор IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1, CD1 1 a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE рецептор, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/базигин, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7 и EGFR и их усеченные варианты (например, варианты, сохраняющие один или больше внеклеточных эпитопов, но утрачивающие один или больше участков в цитоплазматическом домене). Например, CAR-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем описании, также могут экспрессировать усеченный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), который утрачивает способность передавать сигнал, но сохраняет эпитоп, который узнается молекулой, способной индуцировать АDCC, например, цетуксимаб (ERBITUX®), так что введение цетуксимаба индуцирует АDCC и последующее истощение CAR-экспрессирующих клеток (см., например, WO2011/056894 и Jonnalagadda et al., Gene Ther., 2013; 20(8), 853-860). Другая стратегия включает экспрессию комплекса высококомпактный маркер/суицидный ген, который объединяет эпитопы-мишени из антигенов как CD32, так и CD20 в CAR-экспрессирующих клетках, описанных в настоящем описании, который связывает ритуксимаб, приводя к селективному истощению CAR-экспрессирующих клеток, например, путем ADCC (см., например, Philip et al., Blood, 2014; 124(8), 1277-1287). Другие способы истощения CAR-экспрессирующих клеток, описанных в настоящем описании, включают введение САМРАТН - моноклонального анти-CD52 антитела, которое селективно связывает и метит зрелые лимфоциты, например, CAR-экспрессирующие клетки, для деструкции, например, путем индукции ADCC. В других воплощениях CAR-экспрессирующая клетка может быть селективно таргетирована с использованием CAR-лиганда, например, антиидиотипического антитела. В некоторых воплощениях антиидиотипическое антитело может вызывать активность эффекторных клеток, например, активности ADCC или ADC, посредством чего уменьшается число CAR-экспрессирующих клеток. В других воплощениях CAR-лиганд, например, антиидиотипическое антитело, может быть соединено с агентом, который индуцирует киллинг клеток, например, токсином, посредством чего уменьшается число CAR-экспрессирующих клеток. С другой стороны, молекулы CAR сами могут иметь такую конфигурацию, что активность можно регулировать, например, включать и выключать, как описано ниже.
В некоторых воплощениях RCAR включает набор полипептидов, типично два в самых простых воплощениях, в которых компоненты стандартного CAR, описанного в настоящем описании, например, антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен, распределены по отдельным полипептидам или членам. В некоторых воплощениях набор полипептидов включает переключатель димеризации, который в присутствии димеризующей молекулы может соединять полипептиды один с другим, например, может соединять антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. Дополнительное описание и примеры конфигураций таких регулируемых CAR приводятся в настоящем описании и в международной публикации № WO 2015/090229, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном аспекте RCAR включает два полипептида или члена: 1) внутриклеточный сигнальный член, включающий внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, и первый переключающий домен; 2) антигенсвязывающий член, включающий антигенсвязывающий домен, например, который специфически связывает опухолевый антиген, описанный в настоящем описании, и второй переключающий домен. Необязательно RCAR включает трансмембранный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении трансмембранный домен может располагаться на внутриклеточном сигнальном домене, на антигенсвязывающем домене или на обоих. (Если не указано иное, когда члены или элементы RCAR описываются в настоящем описании, порядок может быть такой, как описан, но включены также другие порядки. Иными словами, в одном воплощении порядок представляет собой набор как из текста, но в других воплощениях порядок может быть иным. Например, порядок элементов на одной стороне трансмембранного участка может отличаться от примера, например, размещение переключающего домена относительно внутриклеточного сигнального домена может быть иным, например, обратным).
В одном воплощении первый и второй переключающие домены могут образовывать внутриклеточный или внеклеточный димеризующий переключатель. В одном воплощении димеризации переключатель может представлять собой гомодимеризующий переключатель, например, когда первый и второй переключающие домены являются одинаковыми, или гетеродимеризующий переключатель, например, когда первый и второй переключающие домены отличаются один от другого.
В одном воплощении RCAR может включать «мультипереключатель». Мультипереключатель может включать гетеродимеризующие переключающие домены или гомодимеризующие переключающие домены. Мультипереключатель включает несколько, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 переключающих доменов, независимо на первом члене, например, антигенсвязывающем члене, и втором члене, например, внутриклеточном сигнальном члене. В одном воплощении первый член может включать несколько первых переключающих доменов, например, переключающих доменов на основе FKBP, и второй член может включать несколько вторых переключающих доменов, например, переключающих доменов на основе FRB. В одном воплощении первый член может включать первый и второй переключающий домен, например, переключающий домен на основе FKBP и переключающий домен на основе FRB, и второй член может включать первый и второй переключающий домен, например, переключающий домен на основе FKBP и переключающий домен на основе FRB.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный член включает один или больше внутриклеточных сигнальных доменов, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен и один или больше костимулирующих сигнальных доменов.
В одном воплощении антигенсвязывающий член может включать один или больше внутриклеточных сигнальных доменов, например, один или больше костимулирующих сигнальных доменов. В одном воплощении антигенсвязывающий член включает несколько, например, 2 или 3 костимулирующих сигнальных домена, описанных в настоящем описании, например, выбранных из 4-1BB, CD28, CD27, ICOS и OX40, и в воплощениях, без первичного внутриклеточного сигнального домена. В одном воплощении антигенсвязывающий член включает следующие костимулирующие сигнальные домены из внеклеточной или внутриклеточной области: 4-1BB-CD27; 4-1BB-CD27; CD27-4-1BB; 4-1BB-CD28; CD28-4-1BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-4-1BB или 4-1BB-CD28. В одном таком воплощении RCAR включает (1) антигенсвязывающий член, включающий антигенсвязывающий домен и первый переключающий домен; и (2) внутриклеточный сигнальный домен, включающий трансмембранный домен или мембрансвязанный домен и по меньшей мере один первичный сигнальный домен, и второй переключающий домен.
Одно воплощение относится к RCAR, в котором антигенсвязывающий член не связан с поверхностью CAR-клетки. Это позволяет клетке, имеющей внутриклеточный сигнальный член, удобно образовывать пару с одним или несколькими антигенсвязывающими доменами без трансформации клетки последовательностью, которая кодирует антигенсвязывающий член. В таких воплощениях RCAR включает 1) внутриклеточный сигнальный член, включающий первый переключающий домен, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен, и первый переключающий домен; и 2) антигенсвязывающий член, включающий антигенсвязывающий домен и второй переключающий домен, причем антигенсвязывающий член не включает трансмембранный домен или мембрансвязанный домен, и, необязательно, не включает внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых воплощениях RCAR дополнительно может включать 3) второй антигенсвязывающий член, который связывает антиген иной, чем антиген, который связывается антигенсвязывающим доменом; и второй переключающий домен.
Также раскрываются RCAR, в которых антигенсвязывающий член включает способность к биспецифической активации и таргетингу. В таком воплощении антигенсвязывающий член может включать несколько, например, 2, 3, 4 или 5 антигенсвязывающих доменов, например, scFv, где каждый антигенсвязывающий домен связывается с антигеном-мишенью, например, различными антигенами или одним и тем же антигеном, например, одними и теми же или различными эпитопами на одном и том же антигене. В одном воплощении несколько антигенсвязывающих доменов находятся в тандеме, и необязательно, линкерный или шарнирный участок располагается между всеми антигенсвязывающими доменами. Подходящие линкерные и шарнирные участки описаны в настоящем описании.
Одно воплощение относится к RCAR, имеющим конфигурацию, которая допускает переключение пролиферации. В таком воплощении RCAR включает 1) внутриклеточный сигнальный член, включающий, необязательно, трансмембранный домен или мембрансвязанный домен; один или больше костимулирующих сигнальных доменов, например, выбранных из 4-1BB, CD28, CD27, ICOS и OX40, и переключающий домен; и 2) антигенсвязывающий член, включающий антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, домен CD3-дзета, причем антигенсвязывающий член не включает переключающий домен или не включает переключающий домен, который димеризуется с переключающим доменом на внутриклеточном сигнальном домене. В одном воплощении антигенсвязывающий член не включает костимулирующий сигнальный домен. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает переключающий домен из гомодимеризующего переключателя. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает первый переключающий домен гетеродимеризующего переключателя, и RCAR включает второй внутриклеточный сигнальный член, который включает второй переключающий домен гетеродимеризующего переключателя. В таких воплощениях второй внутриклеточный сигнальный член включает те же внутриклеточные сигнальные домены, что и внутриклеточный сигнальный член. В одном воплощении димеризующий переключатель является внутриклеточным. В одном воплощении димеризующий переключатель является внеклеточным.
В любой из конфигураций RCAR, описанных в настоящем описании, первый и второй переключающие домены включают переключатель на основе FKBP-FRB, как описано в настоящем описании.
Изобретение также относится к клеткам, включающим RCAR, описанный в настоящем описании. Любая клетка, которая сконструирована для экспрессии RCAR, может быть использована как RCARХ-клетка. В одном воплощении RCARХ-клетка представляет собой Т-клетку и называется RCARТ-клеткой. В одном воплощении RCARХ-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCARN-клеткой.
Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам и векторам, включающим RCAR-кодирующие последовательности. Последовательность, кодирующая различные элементы RCAR, может располагаться на одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты, например, одной и той же плазмиде или векторе, например, вирусном векторе, например, лентивирусном векторе. В одном воплощении (i) последовательность, кодирующая антигенсвязывающий член, и (ii) последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен, могут присутствовать в одной и той же нуклеиновой кислоте, например, векторе. Продуцирования соответствующих белков можно достигнуть, например, путем использования отдельных промоторов или путем использования бицистронного продукта транскрипции (который может привести к продуцированию двух белков путем расщепления одного продукта трансляции или путем трансляции двух отдельных белковых продуктов). В одном воплощении последовательность, кодирующая способный расщепляться пептид, например, последовательность Р2А или F2A, располагается между (i) и (ii). В одном воплощении последовательность, кодирующая IRES, например, EMCV или EV71 IRES, располагается между (i) и (ii). В таких воплощениях (i) и (ii) тарнскрибируются как одна РНК. В одном воплощении первый промотор операбельно связан с (i), и второй промотор операбельно связан с (ii), так что (i) и (ii) транслируются как отдельные мРНК.
С другой стороны, последовательность, кодирующая различные элементы RCAR, может располагаться на различных молекулах нуклеиновой кислоты, например, различных плазмидах или векторах, например, вирусном векторе, например, лентивирусном векторе. Например, (i) последовательность, кодирующая антигенсвязывающий член, может присутствовать в первой нуклеиновой кислоте, и (ii) последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен, может присутствовать во второй нуклеиновой кислоте, например, втором векторе.
Димеризирующие переключатели
Димеризирующие переключатели могут быть нековалентными или ковалентными. В нековалентном димеризирующем переключателе димеризующая молекула промотирует нековалентное взаимодействие между переключающими доменами. В ковалентном димеризирующем переключателе димеризующая молекула промотирует ковалентное взаимодействие между переключающими доменами.
В одном воплощении RCAR включает димеризирующий переключатель на основе FKBP/FRAP или FKBP/FRB. FKBP12 (связывающий белок FKBP или FK506) представляет собой распространенный цитоплазматический белок, который служит в качестве исходной внутриклеточной мишени для природного продукта иммуносупрессорного лекарственного средства рапамицина. Рапамицин связывается с FKBP и с крупным PI3K, гомологичным FKBP (RAFT, mTOR). FKB представляет собой часть FKBP в 93 аминокислоты, которая является достаточной для связывания комплекса FKBP-рапамицин (Chen J., Zheng X.F., Brown E.J. & Schreiber S.L. (1995), Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein и characterization of a critical serine residue. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 92: 4947-51).
В воплощениях в переключателе на основе FKBP/FRAP, например, FKBP/FRВ, можно использовать димеризующую молекулу, например, рапамицин или аналог рапамицина.
Аминокислотная последовательность FKBP следующая:
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y (SEQ ID NO: 205).
В воплощениях FKBP-переключающий домен может включать фрагмент FKBP, имеющий способность связываться с FRВ или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога, например, подчеркнутой частью SEQ ID NO: 205, которая представляет собой
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (SEQ ID NO: 206).
Аминокислотная последовательность FRB следующая:
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK (SEQ ID NO: 207).
«Переключатель на основе FKBP/FRAP, например, FKBP/FRВ» как термин, используемый в настоящем описании, относится к димеризующему переключателю, включающему первый переключающий домен, который включает фрагмент FKBP или его аналог, имеющий способность связываться с FRB или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога, например, RAD001, и имеет по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность или отличается не более, чем на 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотный остаток от последовательности FKBP SEQ ID NO: 54 или 55; и второй переключающий домен, который включает фрагмент FRB или его аналог, имеющий способность связываться с FRB или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога, и имеет по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность или отличается не более, чем на 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотный остаток от последовательности FRB SEQ ID NO: 56. В одном воплощении RCAR, описанный в настоящем описании, включает один переключающий домен, который включает аминокислотные остатки, раскрытые в SEQ ID NO: 205 (или SEQ ID NO: 206), и один переключающий домен, который включает аминокислотные остатки, раскрытые в SEQ ID NO: 207.
В воплощениях FKBP/FRAP димеризующий переключатель включает модифицированный FRB-переключающий домен, который показывает измененное, например, усиленное, комплексообразование между переключающим доменом на основе FRB, например, модифицированным FRB-переключающим доменом, переключающим доменом на основе FKBP, и димеризующей молекулой, например, рапамицином или рапалогом, например, RAD001. В одном воплощении модифицированный FRB-переключающий домен включает одну или больше мутаций, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше, выбранных из мутаций в аминокислотной(ых) позиции(ях) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 и F2108, где аминокислота дикого типа мутирована на любую другую встречающуюся в природе аминокислоту. В одном воплощении мутант FRB включает E2032, где E2032 мутирована на фенилаланин (E2032F), метионин (E2032M), аргинин (E2032R), валин (E2032V), тирозин (E2032Y), изолейцин (E2032I), например, SEQ ID NO: 208, или лейцин (E2032L), например, SEQ ID NO: 209. В одном воплощении мутант FRB включает мутацию в T2098, где T2098 мутирована на фенилаланин (T2098F) или лейцин (T2098L), например, SEQ ID NO: 210. В одном воплощении мутант FRB включает мутацию в E2032 и в T2098, где E2032 мутирована на любую аминокислоту, и где T2098 мутирована на любую аминокислоту, например, SEQ ID NO: 211. В одном воплощении мутант FRB включает мутацию E2032I и T2098L, например, SEQ ID NO: 212. В одном воплощении мутант FRB включает мутацию E2032L и T2098L, например, SEQ ID NO: 213.
Таблица 9. Примеры мутантного FRB, имеющего повышенную аффинность к димеризующей молекуле
Мутант FRB | Аминокислотная последовательность | SEQ ID NO: |
Мутант E2032I | ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS | 208 |
Мутант E2032L | ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS | 209 |
Мутант T2098L | ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS | 210 |
Мутант E2032, T2098 | ILWHEMWHEGLXEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLXQAWDLYYHVFRRISKTS | 211 |
Мутант Е2032I, T2098L | ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS | 212 |
Мутант E2032L, T2098L | ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS | 213 |
Другие подходящие димеризующие переключатели включают димеризующий переключатель на основе GyrB-GyrB, димеризующий переключатель на основе гиббереллина, димеризующий переключатель tag/связка и димеризующий переключатель галоген-tag/snap-tag. После указаний, приведенных в настоящем описании, такие переключатели и релевантные димеризующие молекулы будут очевидны для специалиста в данной области техники.
Димеризующая молекула
Ассоциация между двумя переключающими доменами промотируется димеризующей молекулой. В присутствии димеризующей молекулы взаимодействие или ассоциация между переключающими доменами допускает сигнальную трансдукцию между полипептидом, ассоциированным, например, слитым, с первым переключающим доменом, и полипептидом, ассоциированным, например, слитым, со вторым переключающим доменом. В присутствии димеризующей молекулы сигнальная трансдукция усиливается в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 раз, например, при измерении в системе, описанной в настоящем описании.
В качестве димеризующих молекул в димеризующем переключателе на основе FKBP/FRB, описанном в настоящем описании, можно использовать рапамицин и аналоги рапамицина (иногда называемые рапалогами), например, RАD001. В одном воплощении димеризующую молекулу можно выбрать из рапамицина (сиролимуса), RАD001 (эверолимуса), зотаролимуса, темсиролимуса, АР-23573 (ридафоролимуса), биолимуса и АР21967. Другие аналоги рапамицина, подходящие для применения с димеризующими переключателями на основе FKBP/FRB, описаны также в разделе, озаглавленном «Комбинированные терапии», или в разделе, озаглавленном «Комбинация с малой дозой ингибитора mTOR».
Расщепленный CAR
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующая клетка использует расщепленный CAR. Подход с расщеленным CAR описан подробнее в публикациях WO2014/055442 и WO2014/055657, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Коротко, система расщепленного CAR включает клетку, экспрессирующую первый CAR, имеющий первый антигенсвязывающий домен и костимулирующий домен (например, 41ВВ), и клетка также экспрессирует второй CAR, имеющий второй антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, CD3-дзета). Когда клетка сталкивается с первым антигеном, костимулирующий домен активируется, и клетка пролиферирует. Когда клетка сталкивается со вторым антигеном, активируется внутриклеточный сигнальный домен, и появляется активность убийства клеток. Таким образом, CAR-экспрессирующая клетка полностью активирована только в присутствии обоих антигенов. В воплощениях первый антигенсвязывающий домен узнает CLL-1, например, включает антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, и второй антигенсвязывающий домен узнает антиген, экспрессированный на клетках острого миелоидного лейкоза, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета. В воплощениях первый антигенсвязывающий домен узнает CLL-1, например, включает антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, и второй антигенсвязывающий домен узнает антиген, экспрессированный на В-клетках, например, CD19, CD20, CD22 или ROR1.
Устойчивость и мутации
Устойчивость CLL-1-связывающего домена, например, молекул scFv (например, растворимого scFv), можно оценить, обратившись к биофизическим свойствам (например, теплоустойчивости) общепринятой контрольной молекулы scFv или полноразмерного антитела. В одном воплощении человеческий scFv имеет теплоустойчивость, которая выше на примерно 0,1, примерно 0,25, примерно 0,5, примерно 0,75, примерно 1, примерно 1,25, примерно 1,5, примерно 1,75, примерно 2, примерно 2,5, примерно 3, примерно 3,5, примерно 4, примерно 4,5, примерно 5, примерно 5,5, примерно 6, примерно 6,5, примерно 7, примерно 7,5, примерно 8, примерно 8,5, примерно 9, примерно 9,5, примерно 10 градусов, примерно 11 градусов, примерно 12 градусов, примерно 13 градусов, примерно 14 градусов или примерно 15 градусов по Цельсию, чем у контрольной связывающей молекулы (например, общепринятой контрольной молекулы scFv) в описанных анализах.
Улучшенная теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, по существу присуща всей конструкции CLL-1-CAR, что ведет к улучшенным терапевтическим свойствам конструкции CLL-1-CAR. Теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, может быть улучшена по меньшей мере на примерно 2°С или 3°С по сравнению с обычным антителом. В другом воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, имеет улучшенную на 2°С теплоустойчивость по сравнению с обычным антителом. В другом воплощении scFv имеет теплоустойчивость, улучшенную на 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15°C по сравнению с обычным антителом. Сравнение можно осуществить, например, между молекулами scFv, описанными в настоящем описании, и полноразмерными антителами. Теплоустойчивость можно измерить с использованием способов, известных в технике. Например, в одном воплощении можно измерить Tm. Способы измерения Tm и другие способы определения устойчивости белков, описаны подробнее ниже.
Мутации в scFv изменяют устойчивость scFv и улучшают общую устойчивость scFv и конструкции CART-CLL-1. Устойчивость человеческого scFv определяют с использованием измерений, таких как Tm, температуры денатурации и температуры агрегации.
Связывающую способность мутантных scFv можно определить с использованием анализов, описанных в примерах.
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, включает по меньшей мере одну такую мутацию, что мутированный scFv приобретает улучшенную устойчивость для конструкции CART-CLL-1. В другом воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, включает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мутаций, появляющихся в процессе гуманизации, так что мутированный scFv приобретает улучшенную устойчивость для конструкции CART-CLL-1.
Способы оценки устойчивости белков
Устойчивость антигенсвязывающего домена можно оценить с использованием, например, способов, описанных ниже. Такие способы допускают определение нескольких переходов теплового развертывания, где наименее устойчивый домен или развртывется первым или ограничивает порог общей устойчивости многодоменной единицы, которая развертывается кооперативно (например, мультидоменный белок, который показывает один переход развертывания). Наименее устойчивый домен можно идентифицировать рядом дополнительных путей. Можно выполнить мутагенез для зондирования домена, который ограничивает общую устойчивость. Дополнительно можно определить протеазорезистентность мультидоменного белка в условиях, в которых, наименее устойчивый белок действительно развертывается, как известно из ДСК или других спектроскопических методов (Fontana et al., (1997), Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009), J. Mol. Biol., 393: 672-692). Как только наименее устойчивый белок идентифицирован, последовательность, кодирующую этот домен (или его часть), можно использовать как тестовую последовательность в других способах.
а) Термоустойчивость
Термоустойчивость композиций можно анализировать с использованием ряда не являющихся ограничительными биофизических или биохимических методов, известных в технике. В некоторых воплощениях термоустойчивость оценивают методами аналитической спетроскопии.
Примером методов аналитической спетроскопии является дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). В ДСК используют калориметр, который чувствителен к поглощению тепла, которое сопровождает развертывание большинства белков или белковых доменов (см., например, Sanchez-Ruiz et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988). Для того, чтобы определить термоустойчивость белка, образец белка вставляют в калориметр, и поднимают температуру до тех пор, пока Fab или scFv не развернется. Температура, при которой белок развертывается, является показателем общей устойчивости белка.
Другим примером методов аналитической спетроскопии является спектроскопия кругового дихроизма (КД). КД спектрометрией измеряют оптическую активность композиции как функцию возрастающей температуры. Спектроскопией кругового дихроизма (КД) измеряют различия в абсорбции левоциркулярно поляризованного света против правоциркулярно поляризованного света, которая появляется из-за структурной асимметрии. Разупорядоченная или развернутая структура приводит к КД-спектру, сильно отличающемуся от спектра упорядоченной или складчатой структуры. КД-спектр отражает чувствительность белков к денатурирующим действиям повышающейся температуры и поэтому явялется показателем термоустойчивости белков (см. van Mierlo и Steemsma, J. Biotechnol., 79(3): 281-98, 2000).
Другим примером методов аналитической спетроскопии для измерения термоустойчивости является флуоресцентная эмиссионная спектроскопия (см. van Mierlo и Steemsma, цит. выше). Еще одним примером методов аналитической спетроскопии для измерения термоустойчивости является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (см., например, van Mierlo и Steemsma, цит. выше).
Термоустойчивость композиции можно измерить биохимически. Примером биохимического метода оценки термоустойчивости является анализ с тепловой стимуляцией. В «анализе с тепловой стимуляцией» композицию подвергают воздействию интервала повышенных температур в течение установленного периода времени. Например, в одном воплощении испытываемые молекулы scFv или молекулы, включающие молекулы scFv, подвергают воздействию повышающихся температур, например, в течение 1-1,5 часов. Затем оценивают активность белка соответсвующим биохимическим анализом. Например, если белок является связывающим белком (например, scFv или scFv-содержащим полипептидом), связывающую активность связывающего белка можно определить функциональным или количественным ELISA.
Такой анализ можно выполнить в высокопроизводительном формате и форматах, раскрытых в примерах, с использованием E. сoli и высокопроизводительного скрининга. Можно создать библиотеку анти-CLL-1 связывающего домена, например, вариантов scFv, с использованием методов, известных в технике. Можно индуцировать экспрессию анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, и анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, можно подвергнуть тепловой стимуляции. Стимулированные испытываемые образцы можно анализировать на связывание, и те анти-CLL-1 связывающие домены, например, scFv, которые являются устойчивыми, можно размножить и охарактеризовать дополнительно.
Термоустойчивость оценивают путем измерения температуры плавления (Tm) композиции с использованием любого из вышеуказанных способов (например, методов аналитической спектроскопии). Температура плавления представляет собой температуру в средней точке кривой температурного перехода, где 50% молекул композиции находятся в свернутом состоянии (см. Dimasai et al. (2009), J. Mol. Biol., 393: 672-692). В одном воплощении величины Tm анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, составляют примерно 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C. В одном воплощении величины Tm для IgG составляют примерно 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C.
Термоустойчивость также оценивают путем измерения удельной теплоемкости или теплоемкости (Ср) композиции с использованием аналитического калориметрического метода (например, ДСК). Удельная теплоемкость композиции представляет собой энергию (например, в ккал/моль), которая требуется для повышения температуры на 1°C 1 моля воды. Большая Ср является признаком денатурированной или инактивированной белковой композиции. Изменение теплоемкости (ΔСр) композиции измеряют путем определения удельной теплоемкости композиции до и после ее теплового перехода. Термоустойчивость также можно оценить путем измерения или определения других параметров термоидинамической устойчивости, включая свободную энергию Гиббса развертывания (ΔG), энтальпию развертывания (ΔН) или энтропию развертывания (ΔS). Один или несколько из вышеуказанных биохимических анализов (например, анализ с тепловой стимуляцией) используют для определения температуры (т.е., величины Тс), при которой 50% композиции сохраняет свою активность (например, связывающую активность).
Кроме того, мутации в анти-CLL-1 связывающем домене, например, scFv, изменяют теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, по сравнению с немутированным анти-CLL-1 связывающим доменом, например, scFv. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, включает одну мутацию, которая придает теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающему домену, например, scFv. В другом воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, включает несколько мутаций, которые придают теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающему домену, например, scFv. В одном воплощении несколько мутаций в анти-CLL-1 связывающем домене, например, scFv, оказывают аддитивное действие на теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv.
b) Агрегация, %
Устойчивость композиции можно определить путем измерения ее склонности к агрегации. Агрегацию можно измерить рядом не являющихся ограничительными биохимических или биофизических методов. Например, агрегацию композиции можно оценить с использованием хроматографии, например, гель-проникающей хроматографии (ГПХ). ГПХ разделяет молекулы на основании их размера. Колонку заполняют полутвердыми гранулами полимерного геля, который будет вмещать в себе ионы и небольшие молекулы, но не крупные молекулы. Когда белковую композицию вносят в верхнюю часть колонки, компактно свернутые белки (т.е., неагрегированные белки) распределяются в большем объеме растворителя, чем объем, доступный для крупных агрегатов белков. В результате крупные агрегаты быстрее продвигаются по колонке, и таким образом смесь может быть разделена или фракционирована на ее компоненты. Каждую фракцию можно отдельно определить количественно (например, с помощью светорассеяния), когда она элюируется из геля. Соответственно, % агрегации композиции можно определить путем сравнения фракции с общей концентрацией белка, внесенного в гель. Устойчивая композиция элюируется из колонки по существу как одна фракция, и появляется по существу один пик на профиле элюции или хроматограмме.
с) Аффинность связывания
Устойчивость композиции можно оценить путем определения ее аффинность связывания с мишенью. В технике известен широкий ряд способов определения аффинности связывания. В примере способа определения аффинности связывания используется поверхностный плазмонный резонанс. Поверхностный плазмонный резонанс представляет собой оптическое явление, которое допускает анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени путем детекции изменений в концентрациях белка в биосенсорной матрице, например, с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden и Piscataway, N.J.). Дополнительное описание см. в Jonsson U. et al. (1993), Ann. Biol. Clin., 51: 19-26; Jonsson U. (1991), Biotechniques, 11: 620-627; Johnsson B. et al. (1995), J. Mol. Recognit., 8: 125-131; и Johnnson B. et al. (1991), Anal. Biochem., 198: 268-277.
В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR включает аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности антигенсвязывающего домена, описанного в настоящем описании, и антигенсвязывающий домен сохраняет нужные функциональные свойства фрагментов анти-CLL-1 антитела, описанного в настоящем описании. В одном конкретном аспекте композиция CAR по изобретению включает фрагмент антитела. В другом аспекте такой фрагмент антитела включает scFv.
В различных аспектах антигенсвязывающий домен CAR конструируют путем модификации одной или нескольких аминокислот в одном или обоих вариабельных участках (например, VH и/или VL), например, в одном или нескольких CDR участках и/или одном или нескольких каркасных участках. В одном конкретном аспекте композиция CAR по изобретению включает фрагмент антитела. В другом аспекте такой фрагмент антитела включает scFv.
Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что антитело или фрагмент антитела по изобретению можно дополнительно модифицировать таким образом, что изменяется аминокислотная последовательность (например, от дикого типа), но не нужная активность. Например, в белке можно сделать дополнительные замены нуклеотидов, ведущие к аминокислотным заменам «заменимых» аминокислотных остатков. Например, заменимый аминокислотный остаток в молекуле может быть заменен другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В другом воплощении ряд аминокислот может быть заменен структурно схожим рядом, который отличается порядком и/или составом членов семейства боковых цепей, например, можно осуществить консервативную замену, при которой аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь.
Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, определены в технике как включающие основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Процент идентичности в контексте двух или больше нуклеотидных или аминокислотных последовательностей относится к двум или больше одинаковым последовательностям. Две последовательности являются «по существу идентичными», если две последовательности имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, 60% идентичность, необязательно, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичность в определенном участке или, когда не конкретизировано, во всей последовательности), когда сравнивают и выравнивают для максимального соответствия в окне сравнения, или обозначенном участке при измерении с использованием одного или нескольких следующих далее алгоритмов сравнения последовательностей или выравнивания вручную и визуальной проверки. Необязательно идентичность существует в участке, который имеет по меньшей мере примерно 50 нуклеотидов (или 10 аминокислот) в длину, или предпочтительнее участке, который имеет по меньшей мере 100-500 или 1000 или больше нуклеотидов (или 20, 50, 200 или больше аминокислот) в длину.
Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность действует как эталонная последовательность, с которой сравнивают испытываемые последовательности. Когда используют алгоритм сравнения последовательностей, испытываемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости обозначают координаты последовательностей и создают параметры программы алгоритма последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию, или можно разработать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательностей для испытываемой последовательности относительно эталонной последовательности на основании параметров программы. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в технике. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно провести, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по Smith и Waterman (1970), Adv. Appl. Math., 2:482c, с помощью алгоритма гомологического выравнивания по Needleman и Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 48: 443, поиском методом подобия по Pearson и Lipman (1988), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85: 2444, с помощью компьютеризированных разработок таких алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или выравнивания вручную и визуальной проверки (см., например, Brent et al. (2003), Current Protocols in Molecular Biology).
Двумя примерами алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, являются алкгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1977), Nuc. Acids Res., 25: 3389-3402; и Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215: 403-410, соответственно.
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями также можно определить с использованием алгоритма в E. Meyers и W. Miller (1988), Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, который включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием весовой таблицы остатков PAM120, штрафа за удлинение гэпа 12 и штрафа за гэп 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с использованием алгоритма по Needleman и Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 48: 444-453, который включен в программу GAP в пакете программ GCG (доступен на www.gcg.com), с использованием или матрицы Blossom 62 или матрицы PAM250 и гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и удлинения гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к модификациям аминокислотной последовательности исходного антитела или фрагмента (например, scFv), которые генерируют функционально эквивалентные молекулы. Например, VH или VL анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, включенного в CAR, можно модифицировать для сохранения по меньшей мере примерно 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности исходных VH или VL каркасного участка анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv. Настоящее изобретение относится к модификациям всей конструкции CAR, например, модификациям в одной или нескольких аминокислотных последовательностях различных доменов конструкции CAR для того, чтобы генерировать функционально эквивалентные молекулы. Конструкцию CAR можно модифицировать для сохранения по меньшей мере примерно 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности исходной коснтрукции CAR.
Трансфекция РНК
В настоящем изобретении раскрываются способы получения in vitro CAR с транскрибированной РНК. Настоящее изобретение также включает CAR, кодирующий конструкцию РНК, которую можно непосредственно трансфицировать в клетку. Способ генерации мРНК для применения в трансфекции может включать in vitro транскрипцию (IVT) матрицы с помощью специально созданных праймеров с последующим добавлением полиА для получения конструкции, содержащей 3'- и 5'-нетранслируемую последовательность («UTR»), 5'-кэп и/или внутренний сайт входа рибосомы (IRES), нуклеиновую кислоту для экспрессии и хвост полиА, обычно длиной в 50-2000 оснований (SEQ ID NO: 35). Полученная таким образом РНК может эффективно трансфицировать различные виды клеток. В одном аспекте матрица включает последовательности для CAR.
В одном аспекте анти-CLL-1 CAR кодируется матричной РНК (мРНК). В одном аспекте мРНК, кодирущую анти-CLL-1 CAR, вводят в Т-клетку для получения клетки CART.
В одном воплощении in vitro CAR с транскрибированной РНК можно ввести в клетку как форму временной трансфекции. РНК получают транскрипцией in vitro с использованием матрицы, полученной полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Представляющую интерес ДНК из любого источника можно непосредственно конвертировать ПЦР в матрицу для синтеза мРНК in vitro с использованием соответствующих праймеров и РНК-полимеразы. Источником ДНК может являться, например, геномная ДНК, плазмидная ДНК, фаговая ДНК, кДНК, синтетическая ДНК-последовательность или любой другой соответствующий источник ДНК. Желательной матрицей для транскрипции in vitro является CAR по настоящему изобретению. Например, матрица для РНК CAR включает внеклеточный участок, включающий одноцепочечный вариабельный домен противоопухолевого антитела, шарнирный участок, трансмембранный домен (например, трансмембранный домен CD8a) и цитоплазматический участок, который включает внутриклеточный сигнальный домен, например, включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1ВВ.
В одном воплощении ДНК, используемая для ПЦР, содержит открытую рамку считывания. ДНК может быть из ДНК-последовательности, встречающейся в природе, из генома организма. В одном воплощении нуклеиновая кислота включает некоторые или все 5'- и/или 3'-нетранслируемые участки (UTR). Нуклеиновая кислота может включать экзоны и интроны. В одном воплощении ДНК, используемая для ПЦР, представляет собой человеческую нуклеотидную последовательность. В другом воплощении ДНК, используемая для ПЦР, представляет собой человеческую нуклеотидную последовательность, включающую 5'- и 3'-UTR. С другой стороны, ДНК может представлять собой искусственную ДНК-последовательность, которая по природе не экспрессируется во встречающемся в природе организме. Примером искусственной ДНК-последовательности является последовательность, которая содержит части генов, которые лигированы вместе с образованием открытой рамки считывания, которая кодирует слитый белок. Части ДНК, которые лигированы вместе, могут быть из одного организма или из более, чем одного организма.
ПЦР используют для генерации матрицы для тарнскрипции in vitro мРНК, которую используют для трансфекции. Способы выполнения ПЦР известны в технике. Праймеры для использования в ПЦР создают как имеющие участки, которые по существу комплементарны участкам ДНК, используемой в качестве матрицы для ПЦР. «По существу комплементарны», как используется в настоящем описании, относится к последовательностям нуклеотидов, где большинство или все основания в праймерной последовательности являются комплементарными, или одно или несколько оснований являются некомплементарными или ошибочными. По существу комплементарные последовательности способны отжигаться или гибридизировать с предполагаемой ДНК-мишенью в условиях отжига, используемых для ПЦР. Праймеры могут быть созданы как являющиеся по существу комплементарными любой части ДНК-матрицы. Например, праймеры могут быть созданы для амплификации части нуклеиновой кислоты, которая естественно транскрибирована в клетках (открытая рамка считывания), включающая 5'- и 3'-UTR. Праймеры также можно создать для амплификации части нуклеиновой кислоты, которая кодирует определенный представляющий интерес домен. В одном воплощении праймеры создают для амплификации кодирующего участка кДНК, включая все или части 5'- и 3'-UTR. Праймеры, применимые для ПЦР, можно получить методами синтеза, которые хорошо известны в технике. «Прямые праймеры» являются праймерами, которые содержат участок нуклеотидов, которые по существу комплементарны нуклеотидам ДНК-матрицы, которые находятся в обратном направлении последовательности ДНК, которую амплифицируют. «В обратным направлении» используется в настоящем описании как относящееся к местоположению 5 для последовательности ДНК, которую амплифицируют, относительно кодирующей цепи. «Обратные праймеры» являются праймерами, которые содержат участок нуклеотидов, которые по существу комплементарны двухцепочечной ДНК-матрице, которые находятся в прямом направлении последовательности ДНК, которую амплифицируют. «В прямом направлении» используется в настоящем описании как относящееся к местоположению 3' для последовательности ДНК, которую амплифицируют, относительно кодирующей цепи.
Любую ДНК-полимеразу, применимую для ПЦР, можно использовать в способах, раскрытых в настоящем описании. Реагенты и полимераза являются коммерчески доступными из ряда источников.
Также можно использвать химические структуры, способные промотировать устойчивость и/или эффективность трансляции. РНК предпочтительно имеет 5'- и 3'-UTR. В одном воплощении 5'-UTR составляет от одного до 3000 нуклеотидов в длину. Длину последовательностей 5'- и 3'-UTR, добавляемых к кодирующему участку, можно изменять различными способами, включая, но не ограничиваясь перечисленным, создание праймеров для ПЦР, которые отжигаются к различным участкам UTR. С использованием такого подхода специалист в данной области техники может модифицировать длину 5'- и 3'-UTR, требуемых для достижения оптимальной эффективности трансляции после трансфекции транскрибированной РНК.
5'- и 3'-UTR могут быть встречающимися в природе эндогенными 5'- и 3'-UTR для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. С другой стороны, последовательности UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, могут быть добавлены путем внедрения последовательностей UTR в прямые и обратные праймеры или путем других модификаций матрицы. Использование последовательностей UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, можно применить для модификации устойчивости и/или эффективности трансляции РНК. Например, известно, что богатые AU элементы в последовательностях 3'-UTR могут снизить устойчивость мРНК. Поэтому 3'-UTR можно выбрать или создать для повышения устойчивости транскрибированной РНК на основании свойств UTR, которые хорошо известны в технике.
В одном воплощении 5'-UTR может содержать последовательность Козак эндогенной нуклеиновой кислоты. С другой стороны, когда 5'-UTR, которая не является эндогенной для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, добавляют с помощью ПЦР, как описано выше, консенсусную последовательность Козак можно перепланировать путем добавления последовательности 5'-UTR. Последовательности Козак могут повышать эффективность трансляции некоторых транскриптов РНК, но не требуются для всех РНК для возможности эффективной трансляции. Требование последовательностей Козак для многих мРНК известно в технике. В других воплощениях 5'-UTR может представлять собой 5'-UTR РНК вируса, геном РНК которого устойчив в клетках. В других воплощениях в 3'- или 5'-UTR можно использовать различные нуклеотидные аналоги для препятствования разрушению мРНК эндонуклеазами.
Для возможности синтеза РНК из ДНК-матрицы без необходимости клонирования гена к ДНК-матрице необходимо присоединить промотор транскрипции в прямом направлении транскрибируемой последовательности. Когда последовательность, которая функционирует как промотор для РНК-полимераз, добавляют к 5'-концу прямого праймера, РНК-полимеразный промотор становится внедренным в продукт ПЦР в обратном направлении открытой рамки считывания, которую следует транскрибировать. В одном предпочтительном воплощении промотор представляет собой полимеразный промотор Т7, как описано в другом месте в настоящем описании. Другие применимые промоторы включают, но не ограничиваются пеерчисленным Т3 и SP6 РНК-полимеразные промоторы. Консенсусные нуклотидные последовательности для промоторов Т7, Т3 и SP6, известны в технике.
В предпочтительном воплощении мРНК имеет как кэп на 5'-конце, так и хвост 3'-поли(А), которые определяют связывание рибосомы, инициацию трансляции и устойчивость мРНК в клетке. На кольцевой ДНК-матрице, например, плазмидной ДНК, РНК-полимераза продуцирует длинный конкатамерный продукт, который не подходит для экспрессии в эукариотных клетках. Транскрипция плазмидной ДНК, линеаризованной в конце 3'-UTR, приводит к мРНК нормального размера, которая неэффективна в эукариотной транскрипции, даже если она полиаденилирована после транскрипции.
На линейной ДНК-матрице фаговая Т7 РНК-полимераза может наращивать 3'-конец транскрипта позади последнего основания матрицы (Schenborn и Mierendorf, Nuc. Acids Res., 13: 6223-36 (1985); Nacheva и Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: 1485-65 (2003).
Обычным способом интеграции отрезков полиА/Т в ДНК-матрицу является молекулярное клонирование. Однако последовательность полиА/Т, итегрированная в плазмидную ДНК, может вызвать неустойчивость плазмиды, в силу чего матрицы плазмидных ДНК, полученные из бактериальных клеток, часто являются весьма загрязненными делециями и другими отклонениями. Это делает процедуры клонирования не только трудоемкими и затратными по времни, но часто ненадежными. Вот почему весьма желателен способ, который допускает конструирование ДНК-матриц с отрезком полиА/Т без клонирования.
Сегмент полиА/Т транскрипционной ДНК-матрицы можно получить во время ПЦР путем использования обратного праймера, содержащего хвост полиТ, такой как хвост 100Т (SEQ ID NO: 31) (размер может составлять 50-5000 Т (SEQ ID NO: 32)), или после ПЦР любым другим способом, включая, но не ограничиваясь перечисленным, лигирование ДНК или рекомбинацию in vitro. Хвосты поли(А) также придают устойчивость РНК и снижают их разрушение. Как правило, длина хвоста поли(А) положительно коррелирует с устойчивостью транскрибированной РНК. В одном воплощении хвост поли(А) составляет от 100 до 5000 адкнозинов (SEQ ID NO: 33).
Хвосты поли(А) РНК можно дополнительно нарастить после транскрипции in vitro с использованием поли(А)-полимеразы, такой как полиА-полимераза E. cоli (Е-РАР). В одном воплощении увеличение длины хвоста поли(А) от 100 нуклеотидов до 300-400 нуклеотидов (SEQ ID NO: 34) приводит к примерно двукратному возрастанию эффективности трансляции РНК. Кроме того, присоединение различных химических групп к 3'-концу может увеличить устойчивость мРНК. Такое присоединение может содержать модифицированные/искусственные нуклеотиды, аптамеры и другие соединения. Например, в хвост поли(А) можно включить аналоги АТФ с использованием поли(А)-полимеразы. Аналоги АТФ могут дополнительно повышать устойчивость РНК.
Кэпы 5' также придают устойчивость молекулам РНК. В предпочтительном воплощении РНК, полученные способами, раскрытыми в настоящем описании, включают 5'-кэп. Кэп 5' обеспечивается с использованием методов, известных в технике, и описанных в настоящем описании (Cougot et al., Trends in Biochem. Sci., 29: 436-444 (2001); Stepinski et al., RNA, 7: 1468-95 (2001); Elango et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330: 958-966 (2005)).
РНК, полученные способами, раскрытыми в настоящем описании, также могут содержать внутренний сайт входа рибосомы IRES). Последовательность IRES может быть вирусной, хромосомной или искусственно созданной последовательностью, которая инициирует кэп-независимое связывание рибосомы с мРНК и облегчает инициацию транскрипции. Могут быть включены любые растворяемые вещества, подходящие для электропорации клеток, которые могут содержать факторы, облегчающие проницаемость и жизнеспособность клеток, такие как сахара, пептиды, липиды, белки, антиоксиданты и поверхностно-активные вещества.
РНК можно ввести в клетки-мишени с использованием любого из ряда различных способов, например, коммерчески доступных способов, которые включают, но не ограничиваются перечисленным, электропорацию (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) или Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.) мультипоратором (Eppendort, Hamburg Germany), трансфекцию, опосредованную катионными липосомами, с использованием липофекции, инкапсуляцию в полимерах, пептидопосредованную трансфекцию или системы доставки с биолистическими частицами, такие как «генные пушки» (см., например, Nishikawa et al. Hum. Gene Ther., 12(8): 861-70 (2001).
Невирусные способы доставки
В некоторых аспектах можно использовать невирусные способы для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в настоящем описании, в клетку или ткань или субъекту.
В некоторых воплощениях невирусный способ включает использование транспозона (также называемого транспозонным элементом). В некоторых воплощениях транспозон представляет собой часть ДНК, которая может сама встраиваться в местоположение в геноме, например, часть ДНК, которая способна к саморепликации и встраиванию своей копии в геном, или часть ДНК, которую можно сплайсировать из более длинной нуклеиновой кислоты и встроить в другое место в геноме. Например, транспозон включает ДНК-последовательность, полученную из генов, фланкирующих инвертированные повторы для транспозиции.
Примеры способов доставки нуклеиновой кислоты с использованием транспозона, включают транспозонную систему Sleeping Beauty (SBTS) и транспозонную систему piggyBac (PB). См., например, Aronovich et al., Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011): R14-20; Singh et al., Cancer Res., 15 (2008): 2961-2971; Huang et al., Mol. Ther., 16 (2008): 580-589; Grabundzija et al., Mol. Ther., 18 (2010): 1200-1209; Kebriaei et al., Blood, 122.21(2013): 166; Williams, Molecular Therapy, 16.9(2008): 1515-16; Bell et al., Nat. Protoc., 2.12(2007): 3153-65; и Ding et al., Cell, 122.3(2005): 473-83, которые все включены в настоящее описании в качестве ссылок.
SBTS включает два компонента: (1) транспозонсодержащий трансген и (2) источник фермента транспозазы. Транспозон может транспонировать транспозон из плазмиды-носителя (или другого донора ДНК) в ДНК-мишень, такую как хромосома/геном клетки-реципиента. Например, транспозаза связывается с плазмидой-носителем/донором ДНК, вырезает транспозон (включая трансген(ы)) из плазмиды и встраивает его в геном клетки-реципиента. См., например, Aronovich et al., цит. выше.
Примеры транспозонов включают транспозон на основе рТ2. См., например, работы Grabundzija et al., Nucleic Acids Res., 41.3(2013): 1829-47; и Singh et al., Cancer Res., 68.8(2008): 2961-2971, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок. Примеры транспозаз включают транспозазу типа Тс1/mariner, например, транспозазу SB10 или транспозазу SB11 (гиперактивная транспозаза, которая может быть экспрессирована, например, из цитомегаловирусного промотора). См., например, работы Aronovich et al.; Kebriaei et al.; и Grabundzija et al., которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Применение SBTS делает возможной эффективную интеграцию и экспрессию трансгена, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в настоящем описании. Предлагаются способы получения клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, которая устойчиво экспрессирует CAR, описанный в настоящем описании, например, с использованием транспозонной системы, такой как SBTS.
В соответствии со способами, описанными в настоящем описании, в некоторых воплощениях в клетку (например, Т- или NK-клетку) доставляют одну или больше нуклеиновых кислот, например, плазмид, содержащих компоненты SBTS. Например, нуклеиновую(ые) кислоту(ы) доставляют стандартными способами доставки нуклеиновой кислоты (например, плазмидной ДНК), например, способами, описанными в настоящем описании, например, электропорацией, трансфекцией или липофекцией. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота содержит транспозон, включающий трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в настоящем описании. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота содержит транспозон, включающий трансген (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в настоящем описании), а также нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент тарнспозазу. В других воплощениях предлагается система с двумя нуклеиновыми кислотами, например, двухплазмидная система, например, в которой первая плазмида содержит транспозон, включающий трансген, и вторая плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент тарнспозазу. Например, первая и вторая нуклеиновые кислоты доставляются в клетку совместно.
В некоторых воплощениях получают клетки, например, Т- или NK-клетки, которые экспрессируют CAR, описанный в настоящем описании, путем использования комбинации встраивания гена с использованием SBTS и генетического редактирования с использованием нуклеазы (например, нуклеаз «цинковый палец» (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), системы CRISPR/Cas или хоминг-эндонуклеаз, повторно сконструированных сконструированными мегануклеазами.
В некоторых воплощениях применение невирусного метода доставки делает возможным перепрограммирование клеток, например, Т- или NK-клеток, и прямую инфузию клеток субъекту. Преимущества невирусных векторов включают, но не ограничиваются перечисленным, простоту и относительно низкую стоимость получения достаточных количеств, необходимых для удовлетворения популяции пациентов, устойчивость при хранении и отсутствие иммуногенности.
Конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим одну или несколько конструкций CAR, описанных в настоящем описании. В одном аспекте молекула нуклеиновой кислоты предоставляется как транскрипт матричной РНК. В одном аспекте молекула нуклеиновой кислоты предоставляется как конструкция ДНК.
Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR включает анти-CLL-1 связывающий домен (например, человеческий анти-CLL-1 связывающий домен), транмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий стимулирующий домен, например, костимулирующий сигнальный домен и/или первичный сигнальный домен, например, дзета-цепь. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, например, анти-CLL-1 связывающий домен, который включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен белка, описанный в настоящем описании, например, выбранный из группы, включающей альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном воплощении трансмембранный домен включает SEQ ID NO: 6 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен соединяется с трансмембранным доменом шарнирным участком, например, шарниром, описанным в настоящем описании. В одном воплощении шарнирный участок включает SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает последовательность, кодирующую костимулирующий домен. В одном воплощении костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен белка, описанный в настоящем описании, например, выбранный из группы, включающей молекулу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается CD83.
В одном воплощении костимулирующий домен включает последовательность SEQ ID NO: 7 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен 4-1ВВ и функциональный домен CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8 или последовательность с 95-99% идентичностью им, и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или последовательность с 95-99% идентичностью им, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде одной полипептидной цепи.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей конструкцию CAR, включающую лидерную последовательность SEQ ID NO: 1, домен scFv, имеющий последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51 (или последовательность с 95-99% идентичностью им), шарнирный участок SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 (или последовательность с 95-99% идентичностью им), трансмембранный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6 (или последовательность с 95-99% идентичностью ей), костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7, или костимулирующий домен CD27, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8 (или последовательность с 95-99% идентичностью ей), или костимулирующий домен CD28, имеющий последовательность SEQ ID NO: 482 (или последовательность с 95-99% идентичностью ей), или костимулирующий домен ICOS, имеющий последовательность SEQ ID NO: 483 (или последовательность с 95-99% идентичностью ей), и стимулирующий домен CD3-дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 (или последовательность с 95-99% идентичностью им).
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле полипептида, кодированной молекулой нуклеиновой кислоты. В одном воплощении изолированная молекула полипептида включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 91-103, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В другом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу химерного антигенного рецептора (CAR), которая включает анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий стимулирующий домен, и где указанный анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированная молекула CAR дополнительно включает последовательность, кодирующую костимулирующий домен. В одном воплощении костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен белка, выбранного из группы, включающей молекулу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается CD83. В одном воплощении костимулирующий домен 4-1ВВ включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном воплощении костимулирующий домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном воплощении костимулирующий домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482. В одном воплощении костимулирующий домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484.
В одном воплощении трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен белка, выбранного из группы, включающей альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, молеклу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается CD83. В одном воплощении трансмембранный домен включает последовательность SEQ ID NO: 6. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен 4-1ВВ и функциональный сигнальный домен дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 9, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде одной полипептидной цепи. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен соединен с трансмембранным доменом шарнирным участком. В одном воплощении шарнирный участок включает SEQ ID NO: 2. В одном воплощении шарнирный участок включает SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
В другом аспекте изобретение относится к кодированной молекуле CAR, включающей лидерную последовательность SEQ ID NO: 1, домен scFv, имеющий последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, или последовательность с 95-99% идентичностью им, шарнирный участок SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, трансмембранный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7, или костимулирующий домен CD27, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, и стимулирующий домен CD3-дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированная молекула CAR включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 91-93, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие нужные молекулы, можно получить с использованием способов, известных в технике, например, путем скрининга библиотек из клеток, экспрессирующих ген, путем дериватизации гена из вектора, известного как включающего их, или путем выделения прямо из клеток и тканей, содержащих их, с использованием стандартных методов. С другой стороны, ген, представляющий интерес, можно получить синтетически, а не клонированием.
Настоящее изобретение также относится к векторам, в которые встроена ДНК по настоящему изобретению. Векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для достижения долговременного переноса гена, устойчивой интеграции трансгена и его размножения в дочерних клетках. Лентивирусные векторы имеют дополнительное преимущество перед векторами, полученными из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мыши, в том, что они могут трансдуцировать непрофилирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также имеют дополнительное преимущество низкой иммуногенности. Ретровирусный вектор также может представлять собой, например, гамма-ретровирусный вектор. Гамма-ретровирусный вектор может включать, например, промотор, сигнал упаковки (ψ), сайт связывания праймера (PBS), один или больше (например, два) длинных концевых повторов (PBS) и трансген, представляющий интерес, например, ген, кодирующий CAR. Гамма-ретровирусный вектор может утратить вирусные структурные гены, такие как gag, pol и env. Примеры гамма-ретровирусных векторов включают вирус лейкоза мыши (MLV), вирус, формирующий фокус на селезенке (SFFV), и вирус миелопролиферативной саркомы (MPSV), и векторы, полученные из них. Другие гамма-ретровирусные векторы описаны, например, в Tobias Maetzig et al., «Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology и Application», Viruses», 2011 Jun; 3(6): 677-713.
В другом воплощении вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую нужный CAR, представляет собой аденовирусный вектор (А5/35). В другом воплощении экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, можно выполнить с использованием трнаспазонов, таких как sleeping beauty, crisper, CAS9 и нуклеазы «цинковые пальцы». См. ниже работу June et al., 2009, Nature Reviews Immunology, 9.10: 704-716, включеченную в настоящее описание в качестве ссылки.
Как краткий итог, экспрессии природных или синтетических нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, обычно достигают путем операбельного соединения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CAR или его части, с промотором и включения конструкции в экспрессирующий вектор. Векторы могут подходить для репликации и интеграции эукариот. Типичные клонирующие векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, инициирующие последовательности и промоторы, применимые для регуляции экспрессии нужной нуклеотидной последовательности.
Экспрссирующие конструкции по настоящему изобретению также можно использовать для иммунизации нуклеиновой кислотой и генной терапии с использованием стандартных протоколов доставки генов. Способы доставки генов известны в технике. См., например, пат. США №№ 5399346, 5580859, 5589466, полностью включенные в насоящее описание в качестве ссылок. В другом воплощении изобретение относится к вектору для генной терапии.
Нуклеиновую кислоту можно клонировать в ряд типов векторов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включая, но не ограничиваясь перечисленным, плазмиду, фагемид, производное фага, зоовирус и космиду. Векторы, представляющие определенный интерес, включают экспрессирующие векторы, векторы для репликации, векторы для получения зондов и векторы для секвенирования.
Кроме того, экспрессирующий вектор может быть предоствлен клетке в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна в технике и описана, например, в Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY, и других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые применимы в качестве векторов, включают, но не ограничиваются перечисленным, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. Как правило, подходящий вектор содержит ориджин репликации, функциональный по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, удобные сайты для рестрикционных эндонуклеаз и один или несколько селектируемых маркеров (см., например, WO 01/96584; WO 01/29058 и пат. США № 6326193).
Разработан ряд систем на основе вирусов для переноса генов в клетки млекопитающих. Например, удобную платформу для систем доставки генов обеспечивают ретровирусы. Выбранный ген можно встроить в вектор и упаковать в ретровирусные частицы с использованием методов, известных в технике. Затем рекомбинантный вирус можно выделить и доставить в клетки субъекта или in vivo или ex vivo. В технике известен ряд ретровирусных систем. В некоторых воплощениях используются аденовирусные векторы. В технике известен ряд аденовирусных векторов. В одном воплощении используются лентивирусные векторы.
Дополнительные промоторные элементы, например, энхансеры, регулируют частоту инициации транскрипции. Обычно они локализуются в участке 30-110 п.о. в обратном направлении от стартового сайта, хотя показано, что ряд промоторов также содержат функциональные элементы в прямом направлении от стартового сайта. Спейсинг между промоторными элементами часто является жестким, так что промоторная функция сохраняется, когда элементы инвертированы или сдвинуты относительно друг друга. В тимидинкиназном (tk) промоторе спейсинг между промоторными элементами может быть увеличен до 50 п.о. до того, как активность начинает снижаться. В зависимости от промотора оказывается, что отдельные элементы могут функционировать или кооперативно или независимо, активируя транскрипцию.
Примером промотора, который способен экспрессировать трансген CAR в Т-клетке млекопитающего, является промотор EF1a. Нативный промотор EF1a управляет экспрессией альфа-субъединицы комплекса фактора элонгации 1, который ответственен за ферментную доставку аминоацил-тРНК в рибосому. Промотор широко используется в экспрессирующих плазмидах млекопитающих, и как показано, эффективен при управлении экспрессии СAR от трансгенов, клонированных в лентивирусный вектор. См., например, Milone et al., Mol. Ther., 17(8): 1453-1464 (2009). В одном аспекте промотор EF1a включает последовательность, предоставленную как SEQ ID NO: 11.
Другим примером промотора является последовательность немедленно раннего цитомегаловирусного (CMV) промотора. Такая промоторная последовательность представляет собой сильную конститутивную промоторную последовательность, способную запустить высокие уровни экспрессии любой нуклеотидной последовательности, оперативно соединенной с нею. Однако также можно использовать другие конститутивные промоторные последовательности, включая, но не ограничиваясь перечисленным, ранний промотор обезьянего вируса 40 (SV40), вирус опухоли мышиной молочной железы (MMTV), промотор длинного концевого повтора вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор MoMuLV, промотор вируса лейкоза птиц, немедленно ранний промотор вируса Эпштейна-Барра, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, но без ограничения, актиновый промотор, миозиновый промотор, промотор фактора элонгации 1α, гемоглобиновый промотор и креатинкиназный промотор. Кроме того, изобретение не должно ограничиваться применением конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также рассматриваются как часть изобретения. Применение индуцируемого промотора обеспечивает молекулярный переключатель, способный запускать экспрессию нуклеотидной последовательности, которая оперативно соединена с ним, когда такая экспрессия желательна, или выключать экспрессию, когда такая экспрессия нежелательна. Примеры индуцируемых промоторов включают, но не ограничиваются перечисленным, металлотиониновый промотор, глюкокортикоидный промотор, прогестероновый промотор и тетрациклиновый промотор.
Другим примером промотора является фосфоглицераткиназный (PGK) промотор. В воплощениях может быть желателен усеченный PGK промотор (например, PGK промотор с одной или несколькими, например, 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 или 400 делециями нуклеотидов, при сравнении с последовательностью PGK промотора дикого типа). Нуклеотидные последовательности примеров PGK промоторов приводятся ниже.
Промотор WT PGK
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
(SEQ ID NO: 487)
Примеры усеченных PGK промоторов
PGK100:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
(SEQ ID NO: 488)
PGK200:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
(SEQ ID NO: 489)
PGK300:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
(SEQ ID NO: 490)
PGK400:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
(SEQ ID NO: 491)
Также может быть включен вектор, например, сигнальная последовательность, для облегчения секреции, сигнал полиаденилирования и терминатор транскрипции (например, из гена бычьего гормона роста (BGH)), элемент, делающий возможной эписомальную репликацию и репликацию в прокариотах (например, ориджин SV40 и ColE1, или другие, известные в технике), и/или элементы для возможности селекции (например, ген устойчивости к ампициллину и/или зеоциновый маркер).
Для того, чтобы оценить экспрессию полипептида CAR или его частей, экспрессирующий вектор, который вводят в клетку, также может содержать или ген селектируемый маркер или репортерный ген или тот и другой для облегчения идентификации и селекции экспрессирующих клеток из популяции клеток, найденных как трансфицированные или инфицированные через вирусные векторы. В других аспектах селектируемый маркер может находиться на отдельной части ДНК и использоваться в процедуре котрансфекции. Как селектируемые маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для возможности экспрессии в клетках-реципиентах. Применимые селектируемые маркеры включают, например, гены устойчивости к антибиоткам, такие как neo, и подобные.
Репортерные гены используются для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. Вообще репортерный ген представляет собой ген, который не присутствует или не экспрессируется организмом или тканью реципиента, и который кодирует полипептид, экспрессия которого обнаруживается по легко детектируемому свойству, например, ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена проверяют в подходящее время после того, как ДНК введена в клетки реципиента. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретированную щелочную фосфатазу, или ген зеленого флуоресцентного белка (см., например, Ui-Tei et al., 2000, FEBS Letters, 479: 79-82). Подходящие системы для экспрессии хорошо известны и могут быть получены с использованием известных методов или получены коммерчески. Как правило, конструкцию с минимальным 5'-фланкирующим участком, показывающую наивысший уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируют как промотор. Такие промоторные участки могут быть соединены с репортерным геном и использованы для оценки агентов на способность модулировать транскрипцию, управляемую промотором.
В одном воплощении вектор доаолнительно может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR. В одном воплощении второй СAR включает антигенсвязывающий домен для мишени, экспрессированной на клетках острого миелоидного лейкоза, такой как, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета. В одном воплощении вектор включает нуклеотидную последовательность, кодирующую первый CAR, который специфически связывает первый антиген, и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, но не первичный сигнальный домен, и нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR, который специфически связывает второй отличный от первого антиген, и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, но не костимулирующий сигнальный домен. В одном воплощении вектор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую первый CLL-1-CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и костимулирующий домен, и нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR, который специфически связывает второй антиген иной, чем CLL-1 (например, антиген, экспрессированный на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета), и включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В другом воплощении вектор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую первый CLL-1-CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR, который специфически связывает второй антиген иной, чем CLL-1 (например, антиген, экспрессированный на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета), и включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и костимулирующий сигнальный домен.
В одном воплощении вектор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую CLL-1-CAR, описанный в настоящем описании, и нуклеиновую кислоту, кодирующую ингибирующий CAR. В одном воплощении ингибирующий CAR включает антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, обнаруженный на здоровых клетках, но не на раковых клетках, например, здоровых клетках, которые также экспрессируют CLL. В одном воплощении ингибирующий CAR включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен ингибирующей молекулы. Например, внутриклеточный сигнальный домен ингибирующего CAR может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета.
В воплощениях вектор может включать две или больше нуклеотидных последовательностей, кодирующих CAR, например, CLL-1-CAR, описанный в настоящем описании, и второй CAR, например, ингибирующий CAR, который специфически связывается с антигеном иным, чем CLL-1 (например, антигеном, экспрессированным на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатным рецептором бета). В таких воплощениях две или более нуклеотидных последовательностей кодирующих CAR, кодированы одной нуклеиновой молекулой в той же рамке считывания, что и одна полипептидная цепь. В таком аспекте два или больше CAR могут, например, разделяться одним или несколькими сайтами расщепления пептида (например, сайтом ауторасщепления или субстрата для внутриклеточной протеазы). Примеры сайтов расщепления пептидов включают указанные далее, где остатки GSG являются необязательными.
T2A: (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 492)
P2A: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 493)
E2A: (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 494)
F2A: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 495)
Способы введения и экспрессии генов в клетке известны в технике. В контексте экспрессирующего вектора вектор можно легко ввести в клетку-реципиента, например, млекопитающего, бактериальную, дрожжевую клетку или клетку насекомого, любым способом, известным в технике. Например, экспрессирующий вектор можно перенести в клетку-реципиента физическими, химическими или биологическими способами.
Физические способы введения полинуклеотида в клетку-реципиента включают кальцийфосфатную преципитацию, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и подобные способы. Способы получения клеток, включающих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны в технике. См., например, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY. Предпочтительным способом введения полинуклеотида в клетку-реципиента является кальцийфосфатная трансфекция.
Биологические способы введения полинуклеотида в клетку-реципиента включают использование ДНК- и РНК-векторов. Вирусные векторы, в особенности, ретровирусные векторы, стали наиболее широко используемым способом встраивания генов в клетки млекопитающих, например, клетки человека. Другие вирусные векторы можно получить из лентивируса, поксвирусов, вируса простого герпеса I, аденовирусов, аденоассациированных вирусов и т.п. См., например, пат. США №№ 5350674 и 5585362.
Химические средства введения полинуклеотида в клетку-реципиента включают коллоидные дисперсные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Примером коллоидной системы для применения в качестве среды для доставки in vitro и in vivo является липосома (например, искусственная мембранная везикула). Доступны другие способы искусственной таргетной доставки нуклеиновых кислот, такие как доставка полинуклеотидов таргетными наночастицами, или другая подходящая система доставки субмикронного размера.
В случае, когда используют невирусную систему доставки, примером среды для доставки является липосома. Предполагается применение липидных композиций для введения нуклеиновых кислот в клетку-реципиента (in vitro, ех vitro или in vivo). В другом аспекте нуклеиновая кислота может быть ассоциирована с липидом. Нуклеиновая кислота, ассоциированная с липидом, может быть инкапсулирована в водную внутреннюю часть липосомы, помещена в липидный бислой липосомы, присоединена к липосоме через молекулу, которая ассоциирована как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, захвачена в липосому, включена в комплекс с липосомой, диспергирована в растворе, содержащем липид, смешана с липидом, объединена с липидом, содержаться в виде суспензии в липиде, содержаться или образовывать комплекс с мицеллой или иначе ассоциирована с липидом. Липидные, липидные/ДНК или ассоциированные липидные/экспрессирующий вектор композиции не ограничиваются какой-либо определенной структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в двухслойной структуре, в виде мицелл или «сплющенной» структуры. Они также могут быть помещены в раствор, возможно, с образованием агрегатов, которые неоднородны по размеру или форме. Липиды представляют собой жировые вещества, которые могут встречаться в природе, или синтетические липиды. Например, липиды включают жировые капли, которые встречаются в природе в цитоплазме, а также класс соединений, которые содержат длинноцепные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды.
Липиды, подходящие для применения, можно получить из коммерческих источников. Например, димиристилфосфатидилхолин («DMPC») можно получить от Sigma, St. Louis, MO; дицетилфосфат («DCP») можно получить от K & K Laboratories (Plainview, NY); холестерин («Choi») можно получить от Calbiochem-Behring; димеристилфосфатидилглицерол («DMPG») и другие липиды можно получить от Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Исходные растворы липидов в хлороформе или смеси хлороформ/метанол можно хранить при примерно -20°С. Хлороформ используют как единственный растворитель, так как его легче выпарить, чем метанол. «Липосома» является общим термином, включающим различные одно- и многослойные липидные везикулы, образованные путем получения замкнутых липидных бислоев или агрегатов. Липосомы можно охарактеризовать как имеющие везикулярные структуры с фосфолипидной двуслойной мембраной и внутренней водной средой. Многослойные липосомы имеют несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они образуются спонтанно, когда фосфолипиды суспендируют в избытке водного раствора. Липидные компоненты претерпевают самоперегруппировку перед образованием закрытых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh et al., 1991, Glycobiology, 5: 505-10). Однако композиции, которые имеют в растворе структуры иные, чем обычная везикулярная структура, также охватываются. Например, липиды могут принимать мицеллярную структуру или существовать только в виде неоднородных агрегатов липидных молекул. Также рассматриваются комплексы липофектамин-нуклеиновая кислота.
Независимо от способа, используемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку-реципиента, или иного представления клетки ингибитору по настоящему изобретению, для того, чтобы подтвердить присутствие последовтельности рекомбинантной ДНК в клетке-реципиенте, можно выполнить ряд анализов. Такие анализы включают, например, «молекулярные биологические» анализы, хорошо известные специалистам в данной области техники, такие как саузерн- или нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; «биохимические» анализы, такие как обнаружение присутствия или отсутствия определенного пептида, например, иммунологическими средствами (ELISA и вестерн-блоттинг), или анализами, описанными в настоящем описании для идентификации агентов, попадающих в объем изобретения.
Настоящее изобретение также относится к вектору, включающему кодирующую CAR молекулу нуклеиновой кислоты. В одном аспекте вектор CAR может быть непосредственно введен в клетку, например, иммунную эффекторную клетку, например, Т- иил NK-клетку. В одном аспекте вектор является клонирующим или экспрессирующим вектором, например, вектором, включающим, но без ограничения, одну или несколько плазмид (например, экспрессирующие плазмиды, клонирующие векторы, миникруги, минивекторы, двойные микрохромосомы), ретровирусные и лентивирусные векторные конструкции. В одном аспекте вектор способен к экспрессии конструкции CAR в Т-клетках млекопитающего. В одном аспекте Т-клетки млекопитающего являются Т-клетками человека.
Источники клеток
Перед экспансией и генетической модификацией получают у субъекта источник клеток (например, иммунных эффекторных клеток, например, Т- или NK-клеток). Термин «субъект», как предполагается, включает живые организмы, у которых можно вызывать иммунную реакцию (например, млекопитающих). Примеры субъектов включают людей, собак, мышей, крыс и их трансгенные виды. Получить Т-клетки можно из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатического узла, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из места инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли.
В некоторых аспектах настоящего изобретения можно использовать любой ряд линий эффекторных клеток (например, Т- иил NK-клеток), доступных в технике. В некоторых аспектах настоящего изобретения Т-клетки можно получить из порции крови, собранной у субъекта, с использованием любого из ряда методов, известных специалистам в данной области техники, таких как сепарация с фиколлом™. В одном предпочтительном аспекте клетки из кровотока индивидуума получают аферезом. Продукт афереза обычно содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие белые клетки крови, красные клетки крови и тромбоциты. В одном аспекте клетки, собранные аферезом, можно промыть для удаления фракции плазмы и поместить клетки в соответствующий буфер или среды для последующих стадий обработки. В одном аспекте изобретения клетки промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS). В альтернативном аспекте раствор для промывки не содержит кальций и может не содержать магний, или может быть лишен многих, если не всех, двухвалентных катионов. Начальные стадии активации в отсутствие кальция могут привести к увеличенной активации. Как легко признать специалистам в данной области техники, стадию промывки можно выполнять способами, известными в технике, такими как с использованием полуавтоматизированной «проточной» центрифуги (например, процессора клеток Cobe 2991, Baxter CytoMate или Haemonetics Cell Saver 5), согласно инструкциям изготовителя. После промывки клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах, таких как, например, PBS без Са и без Mg, PlasmaLyte A или другой солевой раствор с буфером или без. С другой стороны, нежелательные компоненты образца после афереза можно удалить, и непосредственно ресуспендировать клетки в культуральных средах.
Выяснено, что в способах по заявке можно использовать условия выращивания в средах, включающие 5% или меньше, например, 2%, человеческой сыворотки АВ и использовать известные условия выращивания в средах и композиции, например, описанные в работе Smith et al., «Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement», Clinical & Translational Immunology (2015), 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31.
В одном аспекте Т-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови путем лизиса красных клеток крови и деплеции моноцитов, например, путем центрифугирования в градиенте PERCOLLTM или путем отстаивания в противоточной центрифуге. Специфическую субпопуляцию Т-клеток, такую как клетки CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ и CD45RO+T, можно выделить дополнительно методами положительной или отрицательной селекции. Например, в одном аспекте Т-клетки выделяют путем инкубации с анти-CD3/анти-CD28 (например, 3×28) конъюгированными гранулами, такими как DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, в течение времени, достаточного для положительной селекции нужных Т-клеток. В одном аспекте период времени составляет примерно 30 минут. В другом аспекте период времени колеблется от 30 минут до 36 часов или долее, и все промежуточные величины. В еще одном предпочтительном аспекте период времени составялет 10-24 часа. В одном аспекте время инкубации составляет 24 часа. Более длительное время инкубации можно использовать для выделения Т-клеток в любой ситуации, где имеется несколько Т-клеток, которые стравнивают с другими типами клеток, таких как при выделении опухолевых инфильтрующихся лимфоцитов (TIL) из опухолевой ткани или от индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Кроме того, использование более длительного времени инкубации может повысить эффективность захвата CD8+ Т-клеток. Таким образом, просто за счет сокращения или удлинения времени, Т-клеткам дают возможность связываться с CD3/CD28-гранулами, и/или путем уменьшения или увеличения отношения гранул к Т-клеткам (как описано в настоящем описании далее), можно преимущественно отобрать субпопуляции Т-клеток для или против инициации культивирования или в другие моменты времени во время процесса. Кроме того, путем уменьшения или увеличения отношения анти-CD3/анти-CD28 антител на гранулах или другой поверхности можно преимущественно отобрать субпопуляции Т-клеток для или против инициации культивирования или в другие нужные моменты времени. Специалисты в данной области техники поймут, что в контексте настоящего изобретения также можно использовать несколько циклов селекции. В некоторых аспектах может быть желательно выполнение процедуры селекции и использование «невыделенных» клеток в процессе активации и экспансии. «Невыделенные» клетки также можно подвергнуть дополнительным циклам селекции.
Обогащение Т-клеточной популяции путем отрицательной селекции можно выполнить с помощью комбинации антител, направленных на маркеры поверхности, уникальные для отрицательно выделенных клеток. Одним из способов является сортинг клеток и/или селекция через отрицательную магнитную иммуноадгезию или проточную цитометрию, в которых используется коктейль из моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на отрицательно выделенных клетках. Например, для обогащения в отношении CD4+ клеток путем отрицательной селекции коктейль из моноклональных антител типично включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых аспектах может быть желательно обогащение в отношении положительно выделенных регуляторных Т-клеток, которые типично экспрессируют CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ и FoxP3+. С другой стороны, в некоторых аспектах регуляторные Т-клетки истощаются гранулами, конъюгированными с анти-C25, или другим подобным способом селекции.
Способы, описанные в настоящем описании, могут включать, например, селекцию специфической субпопуляции иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, которые представляют собой популяцию, истощенную регуляторными Т-клетками, клетки, истощенные CD25+, с использованием, например, метода отрицательной селекции, например, описанного в настоящем описании. Предпочтительно популяция, истощенная регуляторными Т-клетками, содержит менее 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток.
В одном воплощении регуляторные Т-клетки, например, CD25+ Т-клетки, удаляют из популяции с использованием анти-CD25 антитела или его фрагментов, или CD25-связывающего лиганда IL-2. В одном воплощении анти-CD25 антитело или его фрагмент или CD25-связывающий лиганд конъюгированы с субстратом, например, гранулой, или иначе нанесены на субстрат, например, гранулу. В одном воплощении анти-CD25 антитело или его фрагмент конъюгированы с субстратом, как описано в настоящем описании.
В одном воплощении регуляторные Т-клетки, например, CD25+ Т-клетки, удаляют из популяции с использованием CD25-истощающего реагента от Miltenyi™. В одном воплощении отношение клеток к CD25-истощающему реагенту составляет 1e7 клеток к 20 мкл, или 1e7 клеток к 15 мкл, или 1e7 клеток к 10 мкл, или 1e7 клеток к 5 мкл, или 1e7 клеток к 2,5 мкл, или 1e7 клеток к 1,25 мкл. В одном воплощении, например, для регуляторных Т-клеток, например, деплеции CD25+, используют более 500 миллионов клеток на мл. В другом аспекте используют концентрацию клеток 600, 700, 800 или 900 миллионов клеток на мл.
В одном воплощении популяция иммунных эффекторных клеток, которые истощаются, включает примерно 6×109 CD25+ Т-клеток. В других аспектах популяция иммунных эффекторных клеток, которые истощаются, включает примерно 1×109-1×1010 CD25+ Т-клеток и любую целую величину в промежутке. В одном воплощении полученная популяция истощенных регуляторных Т-клеток имеет 2×109 регуляторных Т-клеток, например, CD25+ клеток, или меньше (например, 1×109, 5×108, 1×108, 5×107, 1×107 CD25+ клеток).
В одном воплощении регуляторные Т-клетки, например, CD25+ клетки, удаляют из популяции с использованием системы CliniMAC с тюбинг-набором для истощения клеток, таким как тюбинг 162-01. В одном воплощении система CliniMAC представляет серию для настройки на истощение, такую как, например, DEPLETION2.1.
Без желания привязываться к какой-либо определенной теории, снижение уровня отрицательных регуляторов иммунных клеток (например, снижение числа нежелательных иммунных клеток, например, TREG-клеток) у субъекта перед аферезом или во время изгтовления продукта CAR-экспрессирующих клеток может уменьшить опасность рецидива у субъекта. Например, способы истощения TREG-клеток известны в технике. Способы уменьшения TREG-клеток включают, но не ограничиваются перечисленным, циклофосфамид, анти-GITR антитела (анти-GITR антитела, описанные в настоящем описании), истощение CD25 и их комбинации.
В некоторых воплощениях способы изготовления включают уменьшение числа (например, истощение) TREG-клеток перед изготовлением CAR-экспрессирующей клетки. Например, способы изготовления включают контактирование образца, например, аферезного образца, с анти-GITR антителом и/или анти-CD25 антителом (или их фрагментом, или CD25-связывающим лигандом), например, для истощения TREG-клеток перед изготовлением CAR-экспрессирующего клеточного продукта (например, Т-клеток, NK-клеток).
В одном воплощении субъекта предварительно лечат одной или несколькими терапиями, которые уменьшают число TREG-клеток, перед сбором клеток для изготовления CAR-экспрессирующего клеточного продукта, посредством чего у субъекта снижается опасность рецидива на лечение CAR-экспрессирующими клетками. В одном воплощении способы уменьшения числа TREG-клеток включают, но не ограничиваются перечисленным, введение субъекту одной или нескольких позиций из циклофосфамида, анти-GITR антитела, истощения CD25 или их комбинации. Введение одной или нескольких позиций из циклофосфамида, анти-GITR антитела, истощения CD25 или их комбинации может иметь место до, во время или после инфузии CAR-экспрессирующего клеточного продукта.
В одном воплощении субъекта предварительно лечат циклофосфамидом перед сбором клеток для CAR-экспрессирующего клеточного продукта, посредством чего у субъекта снижается опасность рецидива на лечение CAR-экспрессирующими клетками. В одном воплощении субъекта предварительно лечат анти-GITR антителами перед сбором клеток для CAR-экспрессирующего клеточного продукта, посредством чего у субъекта снижается опасность рецидива на лечение CAR-экспрессирующими клетками.
В одном воплощении популяция клеток, которые удаляют, не представляет ни регуляторные Т-клетки, ни опухолевые клетки, но клетки, которые иначе отрицательно влияют на экспансию и/или функцию CART-клеток, например, клетки, экспрессирующие CD14, CD11b, CD33, CD15 или другие маркеры, экспрессируемые возможно иммуносупрессивными клетками. В одном воплощении такие клетки намечают для удаления вместе с регуляторными Т-клетками и/или опухолевыми клетками или после указанного истощения или в другом порядке.
Способы, описанные в настоящем описании, могут включать более одной стадии селекции, например, более одной стадии истощения. Обогащение Т-клеточной популяции путем отрицательной селекции можно выполнить, например, с помощью комбинации антител, направленных на маркеры поверхности, уникальные для отрицательно выделяемых клеток. Одним из способов является сортинг клеток и/или селекция через отрицательную магнитную иммуноадгезию или проточную цитометрию, в которых используется коктейль из моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на отрицательно выделенных клетках. Например, для обогащения в отношении CD4+ клеток путем отрицательной селекции коктейль из моноклональных антител может включать антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8.
Способы, описанные в настоящем описании, также могут включать удаление клеток из популяции, которая экспрессирует опухолевый антиген, например, опухолевый антиген, который не включает CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 или CD11b, посредством чего получают популяцию, истощенную регуляторными Т-клетками, например, истощенную CD25+, и с клетками, истощенными опухолевым антигеном, которые подходят для экспрессии CAR, например, CAR, описанного в настоящем описании. В одном воплощении экспрессирующие опухолевый антиген клетки удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками, например, CD25+ клетками. Например, анти-CD25 антитело или его фрагмент и антитело против опухолевого антигена или его фрагмент можно присоединить к одному и тому же субстрату, например, грануле, который можно использовать для удаления клеток, или анти-CD25 антитело или его фрагмент или антитело против опухолевого антигена или его фрагмент можно присоединить к отдельным гранулам, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других воплощениях удаление регуляторных Т-клеток, например, CD25+ клеток, и удаление экспрессирующих опухолевый антиген клеток следуют одно за другим и могут происходить, например, в любом порядке.
Также предлагаются способы, которые включают удаление клеток из популяции, которая экспрессирует реперный ингибитор, например, реперный ингибитор, описанный в настоящем описании, например, один или несколько из PD1+ клеток, LAG3+ клеток и TIM3+ клеток, посредством чего получают популяцию истощенных Т-регуляторных, например, истощенных CD25+ клеток, и клетки, истощенные реперным ингибитором, например, PD1+, LAG3+ и/или TIM3+. Примеры реперных ингибиторов включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (e.g., CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В одном воплощении клетки, экспрессирующие реперный ингибитор, удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками, например, CD25+ клетками. Например, анти-CD25 антитело или его фрагмент и антитело против реперного ингбитора или его фрагмент можно присоединить к одной и той же грануле, которую можно использовать для удаления клеток, или анти-CD25 антитело или его фрагмент или антитело против реперного ингбитора или его фрагмент можно присоединить к отдельным гранулам, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других воплощениях удаление регуляторных Т-клеток, например, CD25+ клеток, и удаление экспрессирующих реперный ингибитор клеток следуют одно за другим и могут происходить, например, в любом порядке.
В одном воплощении можно выбрать популяцию Т-клеток, которая экспрессирует один или несколько из IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, гранзима B и перфорина, или другие соответствующие молекулы, например, другие цитокины. Способы скрининга на экспрессию клеток можно определить, например, способами, описанными в публикации РСТ № WO 2013/126712.
Для выделения нужной популяции клеток путем положительной или отрицательной селекции концентрация клеток и поверхность (например, частиц, таких как гранулы) могут изменяться. В некоторых аспектах может быть желательно существенно уменьшить объем, в котором гранулы и клетки смешиваются вместе (например, увеличить концентрацию клеток), для гарантии максимального контакта клеток и гранул. Например, в одном аспекте используют концентрацию клеток 1 миллиард на мл. В другом аспекте используют свыше 100 миллионов клеток на мл. В другом аспекте используют концентрацию клеток 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, или 50 миллионов клеток на мл. В еще одном аспекте используют концентрацию клеток 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток на мл. В других аспектах используют концентрации 125 или 150 миллионов клеток. Использование высоких концентраций может привести к повышенному выходу, активации клеток и экспансии клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток дает возможность более эффективного захвата клеток, которые могут слабо экспрессировать антигены-мишени, представляющие интерес, таких как CD28-отрицательные Т-клетки, или из образцов, где присутствует много опухолевых клеток (например, лейкозной крови, опухолевой ткани и т.д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и может быть желательно их получение. Например, использование высоких концентраций клеток дает возможность более эффективной селекции CD8+ T-клеток, которые обычно имеют слабую экспрессию CD8.
В родственном аспекте может быть желательно использовать меньшие концентрации клеток. Путем значительного разбавления смеси Т-клеток и поверхностных частиц (например, частиц, таких как гранулы) взаимодействия между частицами и клетками сводят к минимуму. Это выбор для клеток, которые экспрессируют большие количества нужных антигенов, которые связываются с частицами. Например, CD4+ Т-клетки экспрессируют высокие уровни CD28 и захватываются более эффективно, чем CD8+ клетки в меньших концентрациях. В одном аспекте концентрация используемых клеток составляет 5×10е6/мл. В других аспектах используемая концентрация может составлять от примерно 1×105/мл до 1×106/мл и любую целую величину в промежутке.
В других аспектах клетки могут быть ингибированы во вращательном устройстве для изменения длительности при различных скоростях или при 2-10°С или при комнатной температуре.
Для стимуляции Т-клетки также можно заморозить после стадии промывки. Без связи с какой-либо теорией, замораживание и последующая стадия оттаивания дают более однородный продукт за счет удаления из клеточной популяции гранулоцитов и до некоторой степени моноцитов. После стадии промывки, которая удаляет плазму и тромбоциты, клетки можно суспендировать в растворе для замораживания. Хотя в технике известны и будут применяться в настоящем контексте многие растворы для замораживания и параметры, один из способов включает использование PBS, содержащего 20% ДМСО и 8% человеческого сывороточного альбумина, или среды для выращивания, содержащие 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% человеческого сывороточного альбумина и 7,5% ДМСО, или 31,25% плазмалита-А, 31,25% декстрозы, 0,45% NaCl, 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% человеческого сывороточного альбумина и 7,5% ДМСО, или другие подходящие среды для замораживания клеток, содержащие, например, геспан и ПлазмаЛит А, затем клетки замораживают при -80°С со скоростью 1° в минуту и хранят в емкости для хранения в парах жидкого азота. Можно использовать другие способы управляемого замораживания, а также неуправляемого замораживания сразу до -20°С или в жидком азоте.
В некоторых аспектах криоконсервированные клетки оттаивают и промывают, как описано в настоящем описании, и оставляют на один час при комнатной температуре перед активацией с использованием способов по настоящему изобретению.
В контексте изобретения также рассматривается взятие образцов крови или продукта афереза у субъекта в период времени до того, когда размноженные клетки, описанные в настоящем описании, могут понадобиться. Как таковой, источник клеток для размножения может быть собран в любой необходимый момент времени, и нужные клетки, такие как иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, выделяют и замораживают для более позднего использования в клеточной терапии, например, Т-клеточной терапии, для любого ряда заболеваний или состояний, которые могут получить благоприятный эффект от клеточной терапии, например, Т-клеточной терапии, такие, как описанные в настоящем описании. В одном аспекте образец крови или афереза берут у генетически здорового субъекта. В некоторых воплощениях образец крови или афереза берут у вообще здорового субъекта, который имеет опасность развития у него заболевания, но у которго заболевание еще не развилось, и клетки, представляющие интерес, выделяют и замораживают для более позднего использования. В некоторых аспектах иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, могут быть размножены, заморожены и использованы позднее. В некоторых аспектах образцы берут у пациента вскоре после диагноза определенного заболевания, описанного в настоящем описании, но до какого-либо лечения. В другом аспекте клетки выделяют из образца крови или афереза субъекта перед любым числом релевантных способов лечения, включая, но не ограничиваясь перечисленным, лечение такими средствами, как натализумаб, эфализумаб, антивирусные средства, химиотерапию, облучение, лечение иммуносупрессивными средствами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммуноаблативными средствами, такими как САМРАТН, анти-CD3-антитела, цитоксан, флударбин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228, и облучение.
В другом аспекте настоящего изобретения Т-клетки получают от пациента непосредственно после лечения, после которого у субъекта остаются функциональные Т-клетки. В этом отношении отмечено, что после некоторых видов лечения рака, в частности, лечения лекарственными средствами, которые причиняют вред иммунной системе, вскоре после лечения в течение периода, когда пациенты могут естественно восстанавливаться от лечения, качество полученных Т-клеток может быть оптимальным или улучшенным в отношении их способности размножаться ex vivo. Подобным образом, после манипуляции ex vivo с использованием способов, описанных в настоящем описании, такие клетки могут находиться в предпочтительном состоянии для усиленной прививки и экспансии in vivo. Таким образом, в контексте настоящего изобретения рассматривается собирание клеток крови, включая Т-клетки, дендритные клетки или другие клетки гемопоэтической линии дифференцировки, во время такой фазы восстановления. Далее, в некоторых аспектах мобилизацию (например, с GM-CSF) и установление режимов можно использовать для создания состояния у субъекта, которое содействует репопуляции, рециркуляции, регенерации и/или экспансии определенных типов клеток, в особенности, во время определенного временного окна после терапии. Характерные типы клеток включают Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.
В одном воплощении иммунные эффекторные клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, получают от субъекта, который получил малую усиливающую иммунитет дозу ингибитора mTOR. В одном воплощении популяцию иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, сконструированных для экспрессии CAR, харвестируют через достаточный промежуток времени или после достаточной дозировки малой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, так что уровень PD1 отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или отношение PD1 отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD1 положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки, у субъекта или харвестированных у субъекта, возрастает, по меньшей мере временно.
В других воплощениях популяцию иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, которые сконструированы или будут сконструированы для экспрессии CAR, можно обработать ex vivo посредством контакта с количеством ингибитора mTOR, которое повышает число PD1 отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или повышает отношение PD1 отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD1 положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки.
В одном воплощении популяция Т-клеток является дефицитной по диаглицеролкиназе (DGK). Дефицитные по DGK клетки включают клетки, которые не экспрессируют РНК или белок DGK или имеют сниженную или подавленную DGK-активность. Дефицитные по DGK клетки можно получить с помощью генетических подходов, например, введением интерферирующих РНК агентов, например, мРНК, shРНК, миРНК, для снижения или предотвращения экспансии DGK. С другой стороны, DGK-дефицитные клетки можно получить путем обработки ингибиторами DGK, описанными в настоящем описании.
В одном воплощении популяция Т-клеток является дефицитной по Ikaros. Дефицитные по Ikaros клетки включают клетки, которые не экспрессируют РНК или белок Ikaros или имеют сниженную или подавленную активность Ikaros. Дефицитные по Ikaros клетки можно получить с помощью генетических подходов, например, введением интерферирующих РНК агентов, например, мРНК, shРНК, миРНК, для снижения или предотвращения экспрессии Ikaros. С другой стороны, Ikaros-дефицитные клетки можно получить путем обработки ингибиторами Ikaros, например, леналидомидом.
В воплощениях популяция Т-клеток является дефицитной по DGK и дефицитной по Ikaros, например, не экспрессирует DGK и Ikaros или имеет сниженную или подавленную DGK и Ikaros активность. Такие DGK- и Ikaros-дефицитные клетки можно получить любыми способами, описанными в настоящем описании.
В одном воплощении NK-клетки получают от субъекта. В другом воплощении NK-клетки представляют собой NK-клеточную линию, например, клеточную линию NK-92 (Conkwest).
Аллогенный CAR
В воплощениях, описанных в настоящем описании, иммунная эффекторная клетка может быть аллогенной иммунной эффекторной клеткой, например, Т-клеткой или NK-клеткой. Например, клетка может представлять собой аллогенную Т-клетку, например, аллогенную Т-клетку, утратившую экспрессию функционального Т-клеточного рецептора (TCR) и/или человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), например, HLA класса I и/или HLA класса II.
Утратившую функциональный TCR Т-клетку можно, например, сконструировать так, что она не экспрессирует какой-либо функциональный TCR на своей поверхности, сконструировать так, что она не экспрессирует одну или больше субъединиц, которые включают функциональный TCR (например, сконструировать так, что она не экспрессирует (или показывает ослабленную экспрессию) TCR-альфа, TCR-бета, TCR-гамма, TCR-дельта, TCR-эпсилон или TCR-дзета), или сконструировать так, что она продуцирует очень мало функционального TCR на своей поверхности. С другой стороны, Т-клетка может экспрессировать по существу ухудшенный TCR, например, экспрессируя мутированные или усеченные формы одной или нескольких субъединиц TCR. Термин «по существу ухудшенный TCR» означает, что такой TCR не будет вызывать вредную иммунную реакцию у реципиента.
Описанная в настоящем описании Т-клетка может быть, например, сконструирована так, что она не экспрессирует HLA на своей поверхности. Например, Т-клетка, описанная в настоящем описании, может быть сконструирована так, что экспрессия HLA на поверхности клетки, например, HLA класса I и/или HLA класса II, регулируется отрицательно. В некоторых аспектах отрицательную регуляцию HLA можно выполнить путем уменьшения или устранения экспрессии бета-2-микроглобулина (В2М).
В некоторых воплощениях Т-клетка может утратить функциональный TCR и функциональный HLA, например, HLA класса I и/или HLA класса II.
Модифицированные Т-клетки, которые утратили экспрессию функционального TCR и/или HLA, можно получить любым подходящим способом, включая нокаут или нокдаун одной или нескольких субъединиц TCR или HLA. Например, Т-клетка может включать нокдаун TCR и/или HLA с использованием мРНК, shРНК, регулярно расположенных группами коротких палиндромных повторов (CRISP), эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), или эндонуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN).
В некоторых воплощениях аллогенная клетка может представлять собой клетку, которая не экспрессирует или экспрессирует на низких уровнях ингибирующую молекулу, например, клетку, сконструированную любым способом, описанным в настоящем описании. Например, клетка может представлять собой клетку, которая не экспрессирует или экспрессирует на низких уровнях ингибирующую молекулу, например, которая может снижать способность CAR-экспрессирующей клетки поддерживать иммунную эффекторную реакцию. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. Подавление ингибирующих молекул, например, путем ингибирования на уровне ДНК, РНК или белка, может оптимизировать производительность CAR-экспрессирующей клетки. В воплощениях можно использовать ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, дцРНК, например, мРНК или shРНК, регулярно расположенные группами короткие палиндромные повторы (CRISP), эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN), или эндонуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN).
мРНК и shРНК для ингибирования TCR или HLA
В некоторых воплощениях экспрессию TCR и/или экспрессию HLA в клетке можно ингибировать с использованием мРНК или shРНК, которые таргетируют нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR и/или HLA, и/или ингибирующей молекулы, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
Экспрессии мРНК и shРНК в Т-клетках можно добиться с использованием любой обычной экспрессирующей системы, например, такой, как лентивирусная экспрессирующая система.
Примеры shРНК, которые отрицательно регулируют экспрессию компонентов TCR, описаны, например, в публикации US № 2012/0321667. Примеры мРНК и shРНК, которые отрицательно регулируют экспрессию генов HLA класса I и/или HLA класса II, описаны, например, в публикации US № 2007/0036773.
CRISPR для ингибирования TCR или HLA
«CRISPR» или «CRISPR для TCR и/или HLA» при использовании в настоящем описании относятся к набору регулярно расположенных группами коротких палиндромных повторов или системе, включающей такой набор повторов. «Cas» при использовании в настоящем описании относится CRISPR-ассоциированному белку. Системой «CRISPR/Cas» называют систему, полученную из CRISPR и Cas, которую можно использовать для сайленсинга или мутирования гена TCR и/или HLA и/или ингибирующей молекулы, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
Встречающиеся в природе системы CRISPR/Cas обнаружены в приблизительно 40% секвенированных геномах эубактерий и 90% секвенированных архей. Grissa et al. (2007), BMC Bioinformatics, 8: 172. Такая система представляет собой тип иммунной системы прокариот, которая предоставляет устойчивость к чужеродным генетическим элементам, таким как плазмиды и фаги, и обеспечивает форму приобретенного иммунитета. Barrangou et al. (2007), Science, 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008), Science, 322: 1843-1845.
Система CRISPR/Cas модифицирована для применения при редактивровании гена (сайленсинге, усилении или изменении специфических генов) в эукариотах, таких как мыши или приматы. Wiedenheft et al. (2012), Nature, 482: 331-8. Это осуществляют путем введения в эукариотную клетку плазмиды, содержащей специфически созданный CRISPR и один или несколько соответствующих Cas.
Последовательность CRISPR, иногда называемая локусом CRISPR, включает изменяющиеся повторы и спейсеры. В CRISPR, встречающемся в природе, спейсеры обычно включают последовательности, чужеродные для бактерии, такие как плазмидная или фаговая последовательность; в CRISPR/Cas системе TCR и/или HLA спейсеры получают из генной последовательности TCR или HLA.
РНК из локуса CRISPR конститутивно экспрессируется и процессируется белками Cas в малые РНК. Они включают спейсер, фланкированный повторяющейся последовательностью РНК, направляют другие белки Cas к молчащим экзогенным генетическим элементам на уровне ДНК или РНК. Horvath et al. (2010), Science, 327: 167-170; Makarova et al. (2006), Biology Direct., 1: 7. Таким образом, спейсеры служат в качестве матриц для молекул РНК аналогично мРНК. Pennisi (2013), Science, 341: 833-836.
Так как они встречаются в природе во многих различных типах бактерий, точные порядки CRISPR и структура, функция и ряд генов Cas и их продукт иногда отличаются от вида к виду. Haft et al. (2005), PLoS Comput. Biol., 1: e60; Kunin et al. (2007), Genome Biol., 8: R61; Mojica et al. (2005), J. Mol. Evol., 60: 174-182; Bolotin et al. (2005), Microbiol., 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005), Microbiol., 151: 653-663; и Stern et al. (2010), Trends. Genet., 28: 335-340. Например, белки Cse (подтип Cas, E. coli) (например, CasA) образуют функциональный комплекс Cascade, который процессирует РНК-транскрипты CRISPR в единицы повтор-спейсер, которые Cascade сохраняет. Brouns et al. (2008), Science, 321: 960-964. В других прокариотах Cas6 процессирует транскрипт CRISPR. Фаговой активации на основе CRISPR в E. coli требуется Cascade и Cas3, но не Cas1 или Cas2. Белки Cmr (модуль Cas RAMP) в Pyrococcus furiosus и других прокариотах образуют функциональный комплекс CRISPR с малыми РНК, который узнает и расщепляет комплементарные РНК-мишени. Более простая система с CRISPR основана на белке Cas9, который представляет собой нуклеазу с двумя активнми сайтами разрезания по одному на каждой нити двойной спирали. Комбинирование Cas9 и модифицированной РНК локуса CRISPR можно использовать в системе для редактирования гена. Pennisi (2013), Science, 341: 833-836.
Таким образом, систему CRISPR/Cas можно использовать для редактирования гена TCR и/или HLA (добавления или делеции пары оснований) или введения преждевременного прекращения, которое таким образом снижает экспрессию TCR и/или HLA. С другой стороны, систему CRISPR/Cas можно использовать подобно интерференции РНК, выключая ген TCR и/или HLA по обратимому типу. В клетке млекопитающего, например, РНК может направлять белок Cas к промотоу TCR и/или HLA, пространственно блокируя РНК-полимеразы.
Можно получить искусственные системы CRISPR/Cas, которые ингибируют TCR и/или HLA, с использованием технологии, известной в технике, например, описанной в публикации US № 20140068797 и в Cong (2013), Science, 339: 819-823. Также можно получить другие искусственные системы CRISPR/Cas, которые известны в технике, и которые ингибируют TCR и/или HLA, например, описанные в Tsai (2014), Nature Biotechnol., 32:6, 569-576, и патентах США №№ 8871445, 8865406, 8795965, 8771945 и 8697359.
TALEN для ингибирования TCR и/или HLA
«TALEN» или «TALEN для HLA и/или TCR» или «TALEN для ингибирования HLA и/или TCR» относятся к эффекторной нуклеазе, подобной активатору транскрипции, искусственной нуклеазе, которую можно использовать для редактирования гена HLA и/или TCR, и/или ингибирующей молекуле, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
TALEN получают искусственно путем слияния ДНК-связывающего домена TAL-эффектора с доменом расщепления ДНК. Эффекторы, подобные активатору транскрипции (TALE), можно сконструировать для связывания любой нужной ДНК-последовательности, включая часть гена HLA или TCR. Путем объединения сконструированный TALE с доменом расщепления ДНК можно получить рестрикционный фермент, который является специфическим для любой нужной ДНК-последовательности, включая последовательность HLA или TCR. Затем их можно ввести в клетку, в которой их можно использовать для редактирования генома. Boch (2011), Nature Biotech., 29: 135-6; и Boch et al. (2009), Science, 326: 1509-12; Moscou et al. (2009), Science, 326: 3501.
TALE представляют собой белки, секретированные бактериями Xanthomonas. Связывающий домен ДНК содержит повторяющуюся высоко консервативную последовательность 33-34 аминокислот, за исключением 12-ой и 13-ой аминокислот. Эти две позиции являются весьма изменчивыми, показывая высокую корреляцию с узнаванием специфического нуклеотида. Таким образом, их можно сконструировать для связывания с нужной ДНК-последовательностью.
Для того, чтобы получить TALEN, белок TALE гибридизируют с нуклеазой (N), которая представляет собой эндонуклеазу дикого типа или мутированную FokI. Сделано несколько мутаций FokI для ее применения в TALEN; они, например, улучшают специфичность или активность расщепления. Cermak et al. (2011), Nucl. Acids Res., 39: e82; Miller et al. (2011), Nature Biotech., 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011), Nature Biotech., 29: 731-734; Wood et al. (2011), Science, 333: 307; Doyon et al. (2010), Nature Methods, 8: 74-79; Szczepek et al. (2007), Nature Biotech., 25: 786-793; и Guo et al. (2010), J. Mol. Biol., 200: 96.
Домен FokI функционирует как димер, требующий две конструкции с уникальными ДНК-связывающими доменами для сайтов в геноме мишени с надлежащей ориентацией и размещением. Оказывается, что как число аминокислотных остатков между ДНК-связывающим доменом TALE и доменом расщепления FokI, так и число оснований между двумя отдельными сайтами связывания TALEN являются важными параметрами для достижения высоких уровней активности. Miller et al. (2011), Nature Biotech., 29: 143-8.
TALEN HLA или TCR можно использвать в клетке для получения двухнитевого разрыва (DSB). Можно ввести мутацию в сайт разрыва, если механизмы репарации ошибочно восстанавливают разрыв через соединение с негомологичным концом. Например, ошибочная репарация может ввести мутацию сдвига рамки. С другой стороны, чужеродную ДНК можно ввести в клетку вместе с TALEN; в зависимости от последовательностей чужеродной ДНК и хромосомной последовательности, этот процесс можно использовать для исправления дефекта в гене HLA или TCR или введения такого дефекта в wt ген HLA или TCR, снижая таким образом экспрессию HLA или TCR.
TALEN, специфические для последовательностей в HLA или TCR, можно сконструировать с использованием любого способа, известного в технике, включая различные схемы с использованием модульных компонентов. Zhang et al. (2011), Nature Biotech., 29: 149-53; Geibler et al. (2011), PLoS ONE, 6: e19509.
Нуклеаза с цинковыми пальцами для ингибирования HLA и/или TCR
«ZFN» или «нуклеаза с цинковыми пальцами» или «ZFN для HLA и/или TCR» или «ZFN для ингибирования HLA и/или TCR» относятся к нуклеазе с цинковычми пальцами - искусственной нуклеазе, которую можно использовать для редактирования гена HLA и/или TCR, и/или ингибирующей молекуле, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
Подобно TALEN, ZFN включает домен нуклеазы FokI (или его производное), слитый с ДНК-связывающим доменом. В случае ZFN ДНК-связывающий домен включает один или несколько цинковых пальцев. Carroll et al. (2011), Genetics Society of America, 188: 773-782; и Kim et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1156-1160.
Цинковый палец представляет собой небольшой мотив белковой структуры, стаблизированный одним или несколькими ионами цинка. Цинковый палец может включать, например, Cys2His2, и может узнавать последовательность в приблизительно 3 п.о. Различные цинковые пальцы известной специфичности можно объединить и получить полипептиды с несколькими пальцами, которые узнают последовательности в примерно 6, 9, 12, 15 или 18 п.о. Доступны различные методы селекции и модульной сборки для получения цинковых пальцев (и их комбинаций), узнающих специфические последовательности, включающие фаговый дисплей, дрожжевые одногибридные системы, бактериальные одногибридные и двугибридные системы и клетки млекопитающих.
Подобно TALEN, ZFN следует димеризовать для расщепления ДНК. Таким образом, требуется пара ZFN для нацеливания на сайты непалиндромной ДНК. Два отдельных ZFN должны связывать противоположные нити ДНК с их нуклеазами должным образом обособленно. Bitinaite et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 10570-5.
Также подобно TALEN, ZFN может создавать двухнитевой разрыв в ДНК, который может создать мутацию сдвига рамки, если восстановлен ошибочно, что ведет к снижению экспрессии и количества HLA и/или TCR в клетке. ZFN также можно использовать с гомологичной рекомбинацией для мутирования в гене HLA или TCR.
ZFN, специфические для последовательностей в HLA или TCR, можно сконструировать с использованием любого способа, известного в технике. См., например, Provasi (2011), Nature Med., 18: 807-815; Torikai (2013), Blood, 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008), Mol. Ther., 16: 1200-7; Guo et al. (2010), J. Mol. Biol., 400: 96; публикация патента США 2011/0158957; и публикация патента США 2012/0060230.
Экспрессия теломеразы
Без желания привязываться к какой-либо теории, в некоторых воплощениях терапевтическая Т-клетка имеет краткосрочное существование у пациента из-за укороченных теломер в Т-клетке; соответственно, трансфекция геном теломеразы может удлинить теломеры Т-клетки и улучшить продолжительность существования Т-клетки у пациента. См. Carl June, «Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic», Journal of Clinical Investigation, 117: 1466-1476 (2007). Так, в одном воплощении иммунная эффекторная клетка, например, Т-клетка, экспрессирует со смещением субъединицу теломеразы, например, каталитическую субъединицу теломеразы, например, TERT, например, hTERT. В некоторых аспектах такое раскрытие дает способ получения CAR-экспрессирующей клетки, включающий контактирование клетки с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, каталитическую субъединицу теломеразы, например, TERT, например, hTERT. Клетку можно ввести в контакт с нуклеиновой кислотой до, одновременно или после контактирования с конструкцией, кодирующей CAR.
В одном аспекте раскрытие показывает способ получения популяции иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток). В одном воплощении способ включает предоставление популяции иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток), контактирование популяции иммунных эффекторных клеток с нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, и контактирование популяции иммунных эффекторных клеток с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, hTERT, в условиях, которые допускают экспрессию CAR и теломеразы.
В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицу теломеразы, представляет собой ДНК. В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицу теломеразы, включает промотор, способный вести экспрессию субъединицы теломеразы.
В одном воплощении hTERT представляет собой аминокислотную последовательность белка GenBank Protein ID AAC51724.1 (Meyerson et al., «hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells и during Immortalization», Cell, Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795), которая приводится далее:
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD (SEQ ID NO: 214).
В одном воплощении hTERT имеет последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96^, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 214. В одном воплощении hTERT имеет последовательность SEQ ID NO: 214. В одном воплощении hTERT включает делецию (например, не более 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) в N-конце, С-конце или обоих концах. В одном воплощении hTERT включает трансгенную аминокислотную последовательность (например, из не более 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) в N-конце, С-конце или обоих концах.
В одном воплощении hTERT кодирован нуклеотидной последовательностью GenBank, инвентарный № AF018167 (Meyerson et al., «hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells и during Immortalization», Cell, Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795):
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg
661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga
721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg
781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga
841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag
901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc
961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc
1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc
1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg
1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc
1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc
1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag
1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg
1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt
1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc
1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca
1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca
1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg
1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt
1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga
1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt
1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa (SEQ ID NO: 215).
В одном воплощении hTERT кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности SEQ ID NO: 215. В одном воплощении hTERT кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 215.
Активация и экспансия Т-клеток
Как правило, Т-клетки можно активировать и размножить с использованием способов, описанных, например, в патентах США 6352694, 6534055, 6905680, 6692964, 5858358, 6887466, 6905681, 7144575, 7067318, 7172869, 7232566, 7175843, 5883223, 6905874, 6797514, 6867041 и публикации заявки на патент США № 20060121005.
Как правило, Т-клетки по изобретению можно размножить путем контактирования с поверхностью, имеющий присоединенный к ней агент, который стимулирует сигнал, ассоциированный с комплексом CD3/TCR, и лиганд, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток. В частности, популяции Т-клеток можно стимулировать так, как описано в настоящем описании, например, путем контакта с анти-CD3 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, или анти-CD2 антителом, иммобилизованным на поверхности, или путем контакта с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в конъюгации с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток используют лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяцию Т-клеток можно ввести в контакт с анти-CD3 антителом и анти-CD28 антителом в условиях, соответствующих стимуляции пролиферации Т-клеток. Для того, чтобы стимулировать пролиферацию или CD4+ Т-клеток или CD8+ Т-клеток, можно использовать анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело. Примеры анти-CD28 антитела включают 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besançon, France), которые можно использовать как и другие способы, обычно известные в технике (Berg et al., Transplant Proc., 30(8): 3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med., 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth., 227(1-2): 53-63, 1999).
В некоторых аспектах первичный стимулирующий сигнал и костимулирующий сигнал для Т-клетки могут быть обеспечены различными протоколами. Например, агенты, предоставляющие каждый сигнал, могут находиться в растворе или соединены на поверхности. При соединении на поверхности агенты могут соединяться с одной и той же поверхностью (т.е., в «цис» формации) или с отдельными поверхностями (т.е., в «транс» формации). С другой стороны, один агент может быть соединен с поверхностью, а другой агент может находиться в растворе. В одном аспекте агент, обеспечивающий костимулирующий сигнал, связан с поверхностью клетки, и агент, обеспечивающий первичный сигнал активации, находится в растворе или соединен с поверхностью. В некоторых аспектах оба агента могут находится в растворе. В одном аспекте агенты могут находиться в растворимой форме и затем сшиты с поверхностью, такие как клеточные экспрессирующие Fc-рецепторы или антитело или другой связывающий агент, который будет связываться с агентами. В этом отношении см., например, публикации заявок на патент США №№ 20040101519 и 20060034810 для искусственных антигенпрезентирующая клеток (aAPC), которые в настоящем изобретении рассматриваются для применения при активации и экспансии Т-клеток.
В одном аспекте два агента иммобилизованы на гранулах: или на одной грануле, т.е., «цис», или на отдельных гранулах, т.е., «транс». Например, агент, обеспечивающий первичный сигнал активации, представляет собой анти-CD3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и агент, обеспечивающий костимулирующий сигнал, представляет собой анти-CD28 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент; и оба агента соиммобилизованы на одной и той же грануле в эквивалентных молекулярных количествах. В одном аспекте используют отношение 1:1 каждого антитела, связанного с гранулами, для экспансии CD4+ T-клеток и роста T-клеток. В некоторых аспектах настоящего изобретения используют такое отношение анти-CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, что наблюдают повышение экспансии Т-клеток по сравнению с экспансией, наблюдаемой с использованием отношения 1:1. В одном частном аспекте наблюдают повышение от примерно 1 до примерно 3 раз по сравнению с экспансией, наблюдаемой с использованием отношения 1:1. В одном аспекте отношение анти-CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, колеблется от 100:1 до 1:100 со всеми целыми величинами в промежутке. В одном аспекте настоящего изобретения с частицами связано больше анти-CD28 антител, чем анти-CD3 антител, т.е., отношение CD3:CD28 меньше единицы. В некоторых аспектах изобретения отношение анти-CD28 антител к анти-CD3 антителам, связанным с гранулами, превышает 2:1. В одном частном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:100. В одном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:75. В другом аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:50. В одном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:30. В одном предпочтительном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:10. В одном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:3. В еще одном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 3:1.
Отношения частиц к клеткам от 1:500 до 500:1 и любые целые величины в промежутке могут использоваться для стимуляции Т-клеток или других клеток-мишеней. Как могут легко признать специалисты в данной области техники, отношение частиц к клеткам может зависеть от размера частиц относительно клетки-мишени. Например, гранулы небольшого размера могут связывать только несколько клеток, в то время как более крупные гранулы могут связывать много клеток. В некоторых аспектах отношение клеток к частицам колеблется от 1:100 до 100:1 и любой целой величины в промежутке, и в других аспектах отношение включает значения 1:9-9:1 и любые целые величины в промежутке, которые также могут использоваться для стимуляции Т-клеток. Отношение анти-CD3- и анти-CD28-соединенных частиц к Т-клеткам, которое приводит к стимуляции Т-клеток, может изменяться, как отмечалось выше, однако некоторые предпочтительные значения включают 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 и 15:1, причем одно предпочтительное отношение составляет по меньшей мере 1:1 на Т-клетку. В одном аспекте используют отношение частиц к клеткам 1:1 или меньше. В одном отдельном аспекте предпочтительное отношение частицы:клетки составляет 1:5. В других аспектах отношение частиц к клеткам может изменяться в зависимости от дня стимуляции. Например, в одном аспекте отношение частиц к клеткам составляет от 1:1 до 10:1 в первый день, и затем к клеткам добавляют дополнительные частицы каждый день или через день в течение до 10 дней до конечных отношений от 1:1 до 1:10 (на основании числа клеток в день добавления). В одном отдельном аспекте отношение частиц к клеткам составляет 1:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:5 к третьему и пятому дню стимуляции. В одном аспекте частицы добавляют ежедневно или через день, основываясь на конечном отношении 1:1 в первый день и 1:5 на третий и пятый дни стимуляции. В одном аспекте отношение частиц к клеткам составляет 2:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:10 на третий и пятый дни стимуляции. В одном аспекте частицы добавляют ежедневно или через день, основываясь на конечном отношении 1:1 в первый день и 1:10 на третий и пятый дни стимуляции. Специалисты в данной области техники признают, что множество других отношений могут подходить для применения в настоящем изобретении. В частности, отношения будут изменяться в зависимости от размера частиц и размера и типа клеток. В одном аспекте наиболее типичные отношения для использования составляют приблизительно 1:1, 2:1 и 3:1 в первый день.
В других аспектах настоящего изобретения клетки, такие как Т-клетки, комбинируют с гранулами с нанесенным агентом, затем гранулы и клетки разделяют, и затем клетки культивируют. В другом аспекте перед культивированием гранулы с нанесенным агентом и клетки не разделяют, а культивируют вместе. В другом аспекте гранулы и клетки сначала концентрируют путем применения силы, такой как магнитная сила, что приводит к повышенному лигированию маркеров клеточной поверхности, посредством чего вызывается стимуляция клеток.
Как пример, белки клеточной поверхности можно лигировать, допуская парамагнитные гранулы, к которым присоединены анти-CD3 и анти-CD28 (3×28 гранул), к контакту с Т-клетками. В одном аспекте клетки (например, 104-109 Т-клеток) и гранулы (например, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T парамагнитные гранулы в отношении 1:1) объединяют в буфере, например, PBS (без двухвалентных катионов, таких как катионы кальция и магния). Снова специалисты в данной области техники легко поймут, что можно использовать любую концентрацию клеток. Например, клетка-мишень может быть очень редкой в образце и составлять только 0,01% в образце, или образец полностью может включать клетку-мишень, представляющую интерес (т.е., 100%). Соответственно, любое число клеток находится в контексте настоящего изобретения. В некоторых аспектах может быть желательно существенное уменьшение объема, в котором частицы и клетки смешивают вместе (т.е., повышение концентрации клеток), для гарантии макимального контакта клеток и частиц. Например, в одном аспекте используют концентрацию клеток примерно 10 миллиардов клеток/мл, 9 миллиардов/мл, 8 миллиардов/мл, 7 миллиардов/мл, 6 миллиардов/мл, 5 миллиардов/мл или 2 миллиарда клеток/мл. В одном аспекте используют концентрацию клеток свыше 100 миллионов клеток/мл. В другом аспекте используют концентрацию клеток 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В еще одном аспекте используют концентрацию клеток 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В других аспектах можно использовать концентрации 125 или 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может привести к повышенному выходу клеток, активации клеток и экспансии клеток. Дополнительно использование высоких концентраций дает возможность более эффективного захвата клеток, которые могут слабо экспрессировать антигены-мишени, представляющие интерес, таких как CD28-отрицательные Т-клетки. Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность и могут быть желательны для получения в некоторых аспектах. Например, использование высоких концентраций дает возможность более эффективной селекции CD28+ Т-клеток, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.
В одном воплощении клетки, трансдуцированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании, размножают, например, способом, описанным в настоящем описании. В одном воплощении клетки размножают в культуре в течение периода от нескольких часов (например, примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 час) до примерно 14 дней (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней). В одном воплощении клетки размножают в течение периода 4-9 дней. В одном воплощении клетки размножают в течение периода 8 дней или меньше, например, 7, 6 или 5 дней. В одном воплощении клетки, например, CLL-1-CAR клетки, описанные в настоящем описании, размножают в культуре в течение 5 дней, и полученные клетки являются более эффективными, чем такие же клетки, выращенные в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования. Эффективность можно определить, например, по различным функциям Т-клеток, например, пролиферации, киллинге клеток-мишеней, продуцированию цитокинов, активации, миграции или их комбинациям. В одном воплощении клетки, например, CLL-1-CAR клетки, описанные в настоящем описании, размноженные в течение 5 дней, показывают по меньшей мере одно-, дву-, трех- или четырехкратное повышение удвоения клеток после антигенной стимуляции по сравнению с такими же клетками, выращенными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования. В одном воплощении клетки, например, CLL-1-CAR клетки, описанные в настоящем описании, размножают в культуре в течение 5 дней, и полученные клетки показывают более высокое продуцирование провоспалительных цитокинов, например, уровней IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с такими же клетками, выращенными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования. В одном воплощении клетки, например, CLL-1-CAR клетки, описанные в настоящем описании, размноженные в течение 5 дней, показывают по меньшей мере одно-, дву-, трех-, четырех-, пяти-, десятикратное или большее повышение, в пг/мл, продуцирования провоспалительных цитокинов, например, уровней IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с такими же клетками, выращенными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования.
В одном аспекте настоящего изобретения смесь можно культивировать в течение от нескольких часов (например, 3 часов) до примерно 14 дней или любой целой величины в прмежутке. В одном аспекте смесь можно культивировать в течение 21 дня. В одном аспекте изобретения гранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение примерно восьми дней. В одном аспекте изобретения гранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение примерно 2-3 дней. Также могут быть желательны несколько циклов стимуляции, так что время культивирования Т-клеток может составлять 60 дней или долее. Условия, соответствующие культиврованию Т-клеток, включают соответствующие среды (например, минимальные поддерживающие среды или среды RPMI 1640 или X-vivo 15, (Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнестойкости, включая сыворотку (например, плода коровы или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF-β, и TNF-α или любые другие добавки для роста клеток, известные специалистам в данной области техники. Другие добавки для роста клеток включают, но не ограничиваюся перечисленным, поверхностно-активные вещества, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, и X-Vivo 20, Optimizer, с добавлением аминокислот, пирувата натрия и витаминов, или бессыворотчные или с добавлением соответствующего количества сыворотки (или плазмы) или определенного набора гормонов, и/или некоего количества цитокина(ов), достаточного для роста и экспансии Т-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры, которые должны вводиться субъекту. Клетки-мишени поддерживаются в условиях, необходимых для поддержания роста, например, соответствующей температуре (например, 37°С) и атмосфере (например, с добавлением 5% СО2).
В одном воплощении клетки размножают в соответствующих средах (например, средах, описанных в настоящем описании), которые включают один или несколько интерлейкинов, что приводит к по меньшей мере 200-кратному (например, 200-кратному, 250-кратному, 300-кратному, 350-кратному) увеличению числа клеток за 14-дневный период экспансии, например, при измерении способом, описанным в настоящем описании, таким как проточная цитометрия. В одном воплощении клетки размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7 (например, IL-15 и IL-7).
В воплощениях способы, описанные в настоящем описании, например, способы получения CAR-экспрессирующих клеток, включают удаление регуляторных Т-клеток, например, CD25+ Т-клеток, из клеточной популяции, например, с использованием анти-CD25 антитела или его фрагментов, или CD25-связывающего лиганда IL-2. Способы удаления регуляторных Т-клеток, например, CD25+ Т-клеток, из клеточной популяции описаны в настоящем описании. В воплощениях способы, например, способы получения, дополнительно включают контактирование клеточной популяции (например, популяции, в которой регуляторные Т-клетки, такие как CD25+ Т-клетки, истощены; или клеточной популяции, которая предварительно контактировала с анти-CD25 антителом, его фрагментом или CD25-связывающим лигандом) с IL-15 и/или IL-7. Например, клеточную популяцию (например, которая предварительно контактировала с анти-CD25 антителом, его фрагментом или CD25-связывающим лигандом) размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7.
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид интерлейкин-15 (IL-15), полипептид рецептор альфа интерлейкина-15 (IL-15Ra) или комбинацией как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, например, hetIL-15, во время получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид IL-15, во время получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей комбинацию как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, во время получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид hetIL-15, во время получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo.
В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид hetIL-15, во время экспансии ex vivo. В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид IL-15, во время экспансии ex vivo. В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей как полипептид IL-15, так и полипептида IL-15Ra, во время экспансии ex vivo. В одном воплощении контактирование приводит к выживанию и пролиферации субпопуляции лимфоцитов, например, CD8+ Т-клеток.
Подвергавшиеся стимуляции в течение различного времени Т-клетки могут показывать различные свойства. Например, типичные образцы крови или аферезные продукты мононуклеарных клеток периферической крови имеют популяцию хелперных Т-клеток (ТН, CD4+), которая больше популяции цитотоксических или супрессорных Т-клеток (ТС, CD8+). Экспансия Т-клеток ex vivo путем стимуляции рецепторов CD3 и CD28 продуцирует популяцию Т-клеток, которая априорно до примерно дней 8-9 состоит преимущественно из ТН-клеток, в то время как после примерно дня 8-9 популяция Т-клеток включает значительно большую популяцию ТС-клеток. Соответственно, в зависимости от цели лечения может быть выгодна инфузия субъекту Т-клеточной популяции, включающей преимущественно ТН-клетки. Подобным образом, если выделено антигенспецифические подмножество ТС-клеток, может быть благопрятным размножение этого подмножества до более высокой степени.
Далее, кроме маркеров CD4 и CD8 существенно изменяются другие фенотипические маркеры, но по большей части, воспроизводимо в ходе процесса экспансии клеток. Таким образом, такая воспроизводимость дает возможность получать продукт активированные Т-клетки для конкретных целей.
Как только CLL-1-CAR сконструирована, можно использовать различные анализы для оценки активности молекулы, такой как, но без ограничения, способность размножать Т-клетки после антигенной стимуляции, продолжать экспансию Т-клеток в отсутствие рестимуляции и противораковая активность на соответствующих животных моделях in vitro. Анализы для оценки действий CLL-1-CAR описаны более подробно ниже.
Анализ методом вестерн-блоттинга экспрессии CAR в первичных Т-клетках можно использовать для обнаружения присутствия мономеров и димеров. См., например, Milone et al., Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009). Очень коротко, Т-клетки (смесь 1:1 CD4+ и CD8+ Т-клеток), экспрессируюищх CAR, размножают in vitro в течение долее 10 дней с последующим лизисом и SDS-PAGE в условиях восстановления. Содержащий CAR полноразмерный цитоплазматический домен TCR-ζ и цепь эндогенного TCR-ζ обнаруживают вестерн-блоттингом с использованием антитела к цепи TCR-ζ. Те же подмножества Т-клеток используют для анализа SDS-PAGE в условиях без восстановления для возможности оценки образования ковалентных димеров.
Экспансию CAR+ Т-клеток in vitro после антигенной стимуляции можно измерить проточной цитометрией. Например, смесь CD4+ и CD28+ Т-клеток стимулируют αCD3/αCD28 aAPC с последующей трансдукцией лентивирусными векторами, экспрессирующими GFP под контролем анализируемых промоторов. Примеры промоторов включают ген CMV IE, EF-1α, убиквитин C или фосфоглицерокиназные (PGK) промоторы. Флуоресценцию GFP оценивают проточной цитометрией в день 6 культивирования в подмножествах CD4+ и/или CD8+ T-клеток. См., например, Milone et al., Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009). С другой стороны, смесь CD4+ и CD8+ T-клеток стимулируют покрытыми αCD3/αCD28 магнитными гранулами в день 0, и трансдуцируют CAR в день 1 с использованием бицистронного лентивирусного вектора, экспрессирующего CAR вместе с eGFP, с использованием последовательности 2A рибосомного перепрыгивания. Культуры можно повторно стимулировать CLL-1-экспрессирующими клетками.
Также можно оценить длительную экспансию CAR+ Т-клеток в отсутствие повторной стимуляции. См., например, Milone et al., Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009). Коротко, средний объем Т-клеток (f1) измеряют в день 8 культивирования с использованием счетчика частиц Coulter Multisizer III, Nexcelom Cellometer Vision или Millipore Scepter, после стимуляции покрытыми αCD3/αCD28 магнитными гранулами в день 0 и трансдукции указанным CAR в день 1.
Также можно использовать животные модели для измерения активности CART. Например, можно использовать модель с ксенотрансплантатом с использованием человеческих CLL-1-специфических CAR+ Т-клеток для лечения первичного AML человека у иммунодефицитных мышей. Очень коротко, после установления опухолей мышей рандомизируют по группам лечения. CLL-1-CARТ клетки инъецируют иммунодефицитным мышам, например, внутривенно. Животных оценивают на раковые клетки с недельными интервалами. Число CLL-1-экспрессирующих клеток AML периферической крови измеряют у мышей, которым инъецировали CLL-1-CARТ клетки или mock-трансдуцированные Т-клетки. Кривые выживания для групп сравнивают с использованием log рангового критерия.
Цитотоксичность можно оценить стандартным анализом на высвобождение 51Cr. См., например, Milone et al., Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009). Коротко, клетки-мишени нагружают 51Cr (в виде NaCrO4, New England Nuclear, Boston, MA) при 37°С в течение 2 часов при быстром перемешивании, дважды промывают полной RPMI и высевают в титрационные микропалншеты. Эффекторные Т-клетки смешивают с клетками-мишенями в лунках в полной RPMI при различных отношениях эффекторная клетка:клетка-мишень (Е:Т). Также готовят дополнительные лунки, содержащие только среды (спонтанное высвобождение, SR) или 1% раствор детергента тритона-Х 100 (общее высвобождение, TR). После 4-часовой инкубации при 37°С собирают супернатант из каждой лунки. Затем измеряют высвобожденный 51Cr с использованием счетчика гамма-частиц (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Каждое условие выполняют по меньшей мере трижды, и процент лизиса вычисляют с использованием формулы % лизиса=(ER-SR)/(TR-SR), где ER представляет среднее высвобожденного 51Cr для каждого условия эксперимента.
Технологию визуализации изображений можно использовать для оценки специфического сосредоточения и пролиферации CAR на животных моделях с опухолями. Такие анализы описаны, например, в Barrett et al., Human Gene Therapy, 22: 1575-1586 (2011). Кортко, мышам NOD/SCID/γc-/- (NSG) инъецируют IV клетки Nalm-6, и через 7 дней Т-клетки через 4 часа после электропорации конструкций CAR. Т-Клетки устойчиво трансфицируют лентивирусной конструкцией для экспрессии люциферазы светляка, и мышей визуализируют в случае биолюминесценции. С другой стороны, терапевтическую эффективность и специфичность одной инъекции CAR+ Т-клеток на модели с ксенотрансплантатом Nalm-6 можно измерить следующим образом: мышам NSG инъецируют Nalm-6, трансдуцированные для устойчивой экспрессии люциферазы светляка, с последующей одной инъекцией Т-клеток, электропорированных CLL-1-CAR, через 7 дней. Животных визуализируют в различные моменты времени после инъекции. Например, можно получить карты плотности тепловых фотонов с люциферазой светляка при лейкозе у представленных мышей в день 5 (за 2 дня до лечения) и день 8 (24 часа после CAR+ PBL).
Другие анализы, включая анализы, описанные в настоящем описании в резделе «Примеры», а также анализы, известные в технике, также можно использовать для оценки конструкций CLL-1-CAR по изобретению.
С другой стороны или в комбинации со способами, описанными в настоящем описании, раскрываются одна или больше позиций из следующих: детекция и/или количественное определение CAR-экспрессирующих клеток (например, in vitro или in vivo (например, клинический мониторинг)); экспансия и/или активация иммунных клеток и/или CAR-специфическая селекция, которые включают применение лиганда CAR. В одном примере воплощения лиганд CAR представляет собой антитело, которое связывается с молекулой CAR, например, связывается с антигенсвязывающим доменом CAR (например, антителом, которое связывается с антигенсвязывающим доменом, например, антиидотипическое антитело; или антитело, которое связывается с константным участком внеклеточного связывающего домена). В других воплощениях лиганд CAR представляет собой молекулу антигена CAR (например, молекулу антигена CAR, описанную в настоящем описании).
В одном аспекте раскрывается способ детекции и/или количественного определения CAR-экспрессирующих клеток. Например, можно использовать лиганд CAR для детекции и/или количественного определения CAR-экспрессирующих клеток in vitro или in vivo (например, клинический мониторинг CAR-экспрессирующих клеток у пациента или дозируемых пациенту). Способ включает
предоставление лиганда CAR (необязательно, меченного лиганда CAR, например, лиганда CAR, который включает метку, гранулу, радиоактивную или флуоресцентную метку);
приобретение CAR-экспрессирующей клетки (например, приобретение образца, содержащего CAR-экспрессирующие клетки, такого как изготовленный образец или клинический образец);
контактирование CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR в условиях, в которых происходит связывание, посредством чего детектируется уровень (например, количество) присутствующих CAR-экспрессирующих клеток. Связывание CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR можно обнаружить с использованием стандартных методов, таких как FACS, ELISA и т.п.
В другом аспекте раскрывается способ экспансии и/или активации клеток (например, иммунных эффекторных клеток). Способ включает
предоставление CAR-экспрессирующей клетки (например, первой CAR-экспрессирующей клетки или временно экспрессирующей CAR клетки);
контактирование указанной CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR, например, лигандом CAR, описанным в настоящем описании, в условиях, в которых происходит экспансия и/или пролиферация иммунных клеток, посредством чего продуцируется популяция активированных и/или размноженных клеток.
В некоторых воплощениях лиганд CAR находится сверху (например, иммобилизован или присоединен к субстрату, например, субстрату, невстречающемуся в природе). В некоторых воплощениях субстрат представялет собой неклеточный сусбстрат. Неклеточный сусбстрат может представлять собой твердый носитель, выбранный из, например, планшета (титрационного микропланшета), мембраны (например, нитроцеллюлозной мембраны), матрицы, чипа или гранулы. В воплощениях лиганд CAR присутствует в субстрате (например, на поверхности субстрата). Лиганд CAR может быть иммобилизован, присоединен или связан ковалентно или нековалентно (например, сшит) с субстратом. В одном воплощении лиганд CAR присоединен (например, ковалентно присоединен) к грануле. В вышеуказанных воплощениях популяцию иммунных клеток можно размножить in vitro или ex vivo. Способ также может включать культивирование популяции иммунных клеток в присутствии лиганада молекулы CAR, например, с использование любого из способов, описанных в настоящем описании.
В других воплощениях способ экспансии и/или активации клеток дополнительно включает добавление второй стимулирующей молекулы, например, CD28. Например, лиганд CAR и вторую стимулирующую молкулу можно иммобилизовать на субстрате, например, одной или нескольких гранулах, посредством чего получают повышенную экспансию и/или активацию клеток.
В еще одном аспекте предлагается способ селекции или обогащения в отношении CAR-экспрессирующей клетки. Способ включает контактирование CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR, как описано в настоящем описании; и селекцию клетки на основе связывания лиганда CAR.
В еще других воплощениях предлагается способ истощения, уменьшения и/или киллинга CAR-экспрессирующей клетки. Способ включает контактирование CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR, как описано в настоящем описании; и таргетинг клетки на основе связывания лиганда CAR, посредством чего уменьшается число CAR-экспрессирующих клеток и/или происходит киллинг CAR-экспрессирующей клетки. В одном воплощении лиганд CAR соединяют с токсичным агентом (например, токсином или клеточно-аблативным лекарственным средством). В другом воплощении антиидиотипическое антитело может вызвать активность эффекторной клетки, например, активность ADCC или ADC.
Примеры анти-CAR антител, которые можно использовать в способах, описанных в настоящем описании, описаны, например, в WO 2014/190273 и в Jena et al., «Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials», PLOS, March, 2013, 8: 3 e57838, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. В одном воплощении молекула антиидиотипического антитела узнает молекулу анти-CD19 антитела, например, анти-CD19 scFv. Например, молекула антиидиотипического антитела может конкурировать за связывание с CD19-специфическим клоном CAR mAb № 136.20.1, описанным в Jena et al., PLOS, March 2013, 8: 3 e57838; может иметь такие же CDR (например, один или больше, например, все, VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, используя определение по Кабату, определение по Чотиа или комбинацию определений по Кабату и Чотиа), как CD19-специфический клон CAR mAb № 136.20.1; может иметь один или больше (например, 2) вариабельных участка как CD19-специфический клон CAR mAb № 136.20.1, или может включать CD19-специфический клон CAR mAb № 136.20.1. В некоторых воплощениях антиидиотипическое антитело получают согласно способу, описанному Jena et al. В другом воплощении молекула антиидиотипического антитела представляет собой молекулу антиидиотипического антитела, описанную в WO 2014/190273. В некоторых воплощениях молекула антиидиотипического антитела имеет такие же CDR (например, один или больше, например, все, VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3), как молекула антитела в WO 2014/190273, такая как 136.20.1; может иметь один или больше (например, 2) вариабельных участка молекулы антитела в WO 2014/190273, или может включать CD19- молекулу антитела в WO 2014/190273, такую как 136.20.1. В других воплощениях анти-CAR антитело связывается с константным участком внеклеточного связывающего домена молекулы CAR, например, как описано в WO 2014/190273. В некоторых воплощениях анти-CAR антитело связывается с константным участком внеклеточного связывающего домена молекулы CAR, например, константным участком тяжелой цепи (например, шарнирным участком СН2-СН3) или константным участком легкой цепи. Например, в некоторых воплощениях анти-CAR антитело конкурирует за связывание с моноклональным антителом 2D3, описанным в WO 2014/190273, имеет такие же CDR (например, один или больше, например, все, VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3), как 2D3, или имеет один или больше (например, 2) вариабельных участка 2D3, или включает 2D3, как описано в WO 2014/190273.
В некоторых аспектах и воплощениях композиции и способы по настоящему изобретению оптимизированы для специфического подмножества Т-клеток, например, как описано в US, регистрационный № 62/031699, поданной 31 июля 2014, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых воплощениях оптимизированные подмножества Т-клеток отображают повышенную продолжительность существования по сравнению с контрольной Т-клеткой, например, Т-клеткой другого типа (например, CD8+ или CD4+), экспрессирующей такую же конструкцию.
В некоторых воплощениях CD4+ Т-клетка включает CAR, описанный в настоящем описании, и такой CAR включает внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для (например, оптимизированный для, например, ведущий к повышенной продолжительности существования в) CD4+ Т-клетки, например, домен ICOS. В некоторых воплощениях CD8+ Т-клетка включает CAR, описанный в настоящем описании, и такой CAR включает внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для (например, оптимизированный для, например, ведущий к повышенной продолжительности существования в) CD8+ Т-клетки, например, домен 4-1ВВ, домен CD28 или другой костимулирующий домен иной, чем домен ICOS. В некоторых воплощениях CAR, описанный в настоящем описании, включает антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, например, CAR, включающий антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, например, CAR из таблицы 2.
В одном аспекте в настоящем описании описывается способ лечения субъекта, например, субъекта, у которого рак. Способ включает введение указанному субъекту эффективного количества
1) CD4+ Т-клетки, включающей CAR (CARCD4+),
включающей
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, например, антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, например, антигенсвязывающий домен из таблицы 2;
трансмембранный домен и
внутриклеточный сигнальный домен, например, первый костимулирующий домен, например, домен ICOS; и
2) CD8+ Т-клетки, включающей CAR (CARCD8+), включающий
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, например, антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, например, антигенсвязывающий домен из таблицы 2;
трансмембранный домен и
внутриклеточный сигнальный домен, например, второй костимулирующий домен, например, домен 4-1ВВ, домен CD28 или другой костимулирующий домен иной чем домен ICOS;
где CARCD4+ и CARCD8+ отличаются друг от друга.
Необязательно способ также включает введение
3) второй CD8+ Т-клетки, включающей CAR (второй CARCD8+), включающией
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, например, антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, например, антигенсвязывающий домен из таблицы 2;
трансмембранный домен и
внутриклеточный сигнальный домен, причем второй CARCD8+ включает внутриклеточный сигнальный домен, например, костимулирующий сигнальный домен, отсутствующий в CARCD8+, и, необязательно, не включает сигнальный домен ICOS.
Терапевтическое применение
Ассоциированные с CLL-1 заболевания и/или расстройства
Настоящее изобретение относится, среди прочего, к композициям и способам лечения рака. В одном аспекте рак представляет собой гематологический рак, включая, но не ограничиваясь перечисленным, лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз, острый лимфобластный В-клеточный лейкоз (В-клеточный острый лимфоидный лейкоз, BALL), острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз (Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз (ТALL), В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, плазмоцитарная миелома и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная лимфома).
Терапевтические применения
В одном аспекте изобретение относится к способам лечения заболевания, связанного с экспрессией CLL-1. В одном аспекте изобретение относится к способам лечения заболевания, при котором часть опухоли является отрицательной в отношении CLL-1, и часть опухоли является положительной в отношении CLL-1. Например, CAR по изобретению применим для лечения субъектов, которые подвергались лечению от заболевания, связанного с повышенной экспрессией CLL-1, причем субъект, который подвергался лечению в случае повышенных уровней CLL-1, показывал заболевание, связанное с повышенными уровнями CLL-1. В воплощениях CAR по изобретению применим для лечения субъектов, которые подвергались лечению от заболевания, связанного с повышенной экспрессией CLL-1, причем субъект, который подвергался лечению, связанному с экспрессией CLL-1, показывал заболевание, связанное с экспрессией CLL-1.
В одном аспекте изобретение относится к вектору, включающему CLL-1-CAR, операбельно связанный с промотором для экспрессии у млекопитающего иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток или NK-клеток. В одном аспекте изобретение относится к рекомбинантным иммунным эффекторным клеткам, например, Т-клеткам или NK-клеткам, экспрессирующим CLL-1-CAR для применения при лечении CLL-1-экспрессирующих опухолей, причем рекомбинантные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, экспрессирующие CLL-1-CAR, называются CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой). В одном аспекте CLL-1-CAR-экспрессирующая клетка (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующая NK-клетка) по изобретению способна контактировать с опухолевой клеткой по меньшей мере одним CLL-1-CAR по изобретению, экспрессированным на ее поверхности, так что CLL-1-CAR-экспрессирующая клетка (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующая NK-клетка) таргетирует опухолевую клетку, и рост опухоли подавляется.
В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста CLL-1-экспрессирующей опухоллевой клетки, включающему контактирование опухолевой клетки с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по настоящему изобретению, так что CLL-1-CAR-экспрессирующая клетка (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующая NK-клетка) активируется в ответ на антиген и таргетирует раковую клетку, причем рост опухоли подавляется.
В одном аспекте изобретение относится к способу лечения рака у субъекта. Способ включает введение субъекту CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки) по настоящему изобретению, так что субъект лечится от рака. Примером рака, который поддается лечению CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по изобретению является рак, ассоциированный с экспрессией CLL-1. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией CLL-1, представляет собой гематологический рак. В одном аспекте гематологический рак включает, но не ограничивается перечисленным, лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная лимфома). В других воплощениях гематологический рак может включать минимальное остаточное заболевание MRD, например, лейкоза, например, AML или MDS.
Изобретение включает тип клеточной терапии, где иммунную эффекторную клетку, например, Т-клетку или NK-клетку, генетически модифицируют для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), и CLL-1-CAR-экспрессирующую клетку (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующую NK-клетку) вводят инфузией реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная инфузией клетка способна убивать опухолевые клетки у реципиента. В отличие от терапий с применением антител CAR-модифицированные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) способны к репликации in vivo, приводящей к длительной персистенции, которая может привести к стабильному регулированию опухоли. В различных аспектах иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки), введенные пациенту, или их потомство сохраняются у пациента в течение по меньшей мере четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одинадцати месяцев, двенадцати месяцев, тринадцати месяцев, четырнадцати месяцев, пятнадцати месяцев, шестнадцати месяцев, семнадцати месяцев, восемнадцати месяцев, девятнадцати месяцев, двадцати месяцев, двадцати одного месяца, двадцати двух месяцев, двадцати трех месяцев, двух лет, трех лет, четырех лет или пяти лет после введения пациенту иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток).
Изобретение также включает тип клеточной терапии, где иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) модифицируют, например, с помощью in vitro транскрибированной РНК для временной экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), и CLL-1-CAR-экспрессирующую клетку (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующую NK-клетку) вводят инфузией реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная инфузией клетка способна убивать опухолевые клетки у реципиента. Таким образом, в различных аспектах иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки), введенные пациенту, присутствуют в течение менее одного месца, например, три недели, две недели, одну неделю, после введения пациенту иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток).
Без желания привязываться к какой-либо определенной теории, противоопухолевая иммунная реакция, вызванная CAR-модифицированными иммунными эффекторными клетками (например, Т-клетками или NK-клетками), может представлять собой активную или пассивную иммунную реакцию, или с другой стороны, может происходить вследствие прямой против косвенной иммунной реакции. В одном аспекте CAR-трансдуцированные иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) проявляют специфическую секрецию провоспалительных цитокинов и сильную цитолитическую активность в ответ на экспрессию CLL-1 раковых клеток человека, сопротивление ингибированию растворимого CLL-1, опосредование сочувствия киллингу и умеренную регрессию установленной опухоли человека. Например, безантигенные опухолевые клетки в гетерогенной области CLL-1-экспрессирующей опухоли могут быть чувствительны к косвенной деструкции CLL-1-перенацеленными иммунными эффекторными клетками (например, Т-клетками или NK-клетками), которые ранее прореагировали против соседних антигенположительных раковых клеток.
В одном аспекте полностью человеческие CAR-модифицированные иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) по изобретению могут представлять собой тип вацины для иммунизации ex vivo и/или терапии in vivo для млекопитающего. В одном аспекте млекопитающим является человек.
Что касается иммунизации ex vivo, перед введением клетки млекопитающему происходит по меньшей мере одно из следующего: i) экспансия клеток, ii) введение в клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, или iii) криоконсервация клеток.
Процедуры ex vivo хорошо известны в технике и полнее обсуждаются ниже. Коротко, клетки берут у млекопитающего (например, человека) и генетически модифицируют (т.е., трансдуцируют или трансфицируют in vitro) вектором, экспрессирующим CAR, раскрытый в настоящем описании. CAR-Модифицированную клетку можно ввести реципиенту-млекопитающему для предоставления терапевтической пользы. Реципиент-млекопитающее может представлять собой человека, и CAR-модифицированная клетка может быть аутологична в отношении реципиента. С другой стороны, клетки могут быть аллогенными, сингенными или ксеногенными в отношении реципиента.
Процедура экпансии ex vivo кроветворных стволовых клеток и клеток-предшественников описана в пат. США № 5199942, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, и может быть применена к клеткам по настоящему изобретению. В технике известны другие подходящие способы, поэтому настоящее изобретение не ограничивается каким-либо определенным способом экспансии клеток ex vivo. Коротко, культивирование и экспансия клеток ex vivo включают (1) собирание CD34+ кроветворных стволовых клеток и клеток-предшественников из забора периферической крови млекопитающего или эксплантатов костного мозга; и (2) размножение таких клеток ex vivo. Кроме клеточных факторов роста, описанных в пат. США № 5199942, для культивирования и экспансии клеток можно использовать другие факторы, такие как flt3 L, IL-1, IL-3 и лиганд c-kit.
Кроме применения вакцины на основе клеток в смысле иммунизации ex vivo, настоящее изобретение также относится к композициям и способам для иммунизации in vivo для вызывания иммунной реакции, направленной против антигена у пациента.
Как правило, клетки, активированные и размноженные так, как описано в настоящем описании, можно использовать при лечении и предупреждении заболеваний, которые появляются у индивидуумов, которые являются индивидуумами с ослабленным иммунитетом. В частности, CAR-модифицированные иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) по изобретению используют при лечении заболеваний, расстройств и состояний, связанных с экспрессией CLL-1. В некоторых аспектах клетки по изобретению используют при лечении пациентов в опасности развития заболеваний, расстройств и состояний, связанных с экспрессией CLL-1. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения заболеваний, расстройств и состояний, связанных с экспрессией CLL-1, включающим введение субъекту, наждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества CAR-модифицированных иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток) по изобретению. В одном аспекте CAR-экспрессирующие клетки, например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки, по изобретению можно использовать для лечения пролиферативного заболевания, такого как рак или злокачественность, или предракового состояния, такого как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или прелейкозное гиперпролиферативное расстройство, гиперплазия или дисплазия, которые характеризуются анормальным ростом клеток.
В одном аспекте CAR-экспрессирующие клетки (например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки) по изобретению используют для лечения рака, причем рак представляет собой гематологический рак. Гематологические раковые состояния являются типами рака, такого как лейкоз и злокачественные лимфопролиферативные состояния, которые поражают кровь, костный мозг и лимфатическую систему.
В одном аспекте композиции и CAR-экспрессирующие клетки (например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки) по настоящему изобретению особенно применимы для лечения миелоидных лейкозов, AML и его подтипов, хронического миелоидного лейкоза (CML) и миелодиспластического синдрома (MDS).
Лейкоз можно классифицировать как острый лейкоз и хронический лейкоз. Острый лейкоз можно дополнительно классифицироать как острый миелогенный лейкоз (AML) и острый лимфоидный лейкоз (ALL). Хронический лейкоз включает хронический миелогенный лейкоз (CML) и хронический лимфоидный лейкоз (CLL). Другие родственные состояния включают миелодиспластический синдром (MDS, раньше известный как «предлейкоз»), которые составляют разнотипную коллекцию гематологических состояний, объединенных неэффективным продуцированием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и опасностью трансформации в AML.
Лимфомы представляют собой группу опухолей клеток крови, которые развиваются из лимфоцитов. Примеры лимфом включают неходжкинскую лимфому и ходжкинскую лимфому.
AML - злокачественная трансформация и нерегулируемая пролиферация анормально дифференцированных долгоживущих миелоидных клеток-предшественников приводит к высокому числу незрелых форм клеток крови в кровотоке и замещению здорового костного мозга злокачественными клетками. Симптомы включают усталость, бледность, слабые гематомы и кровотечение, лихордку и инфекцию; симтомы лейкозной инфильтрации присутствуют только у 5% пациентов (часто в виде кожных проявлений). Диагностической является проверка мазка периферической крови и костного мозга. Существующее лечение включает индукционную химиотерапию для достижения ремиссии и постремисионную химиотерапию (с трансплантацией стволовых клеток или без нее) для того, чтобы избежать рецидива.
AML имеет ряд подтипов, которые отличаются друг от друга морфологией, иммунофенотипом и цитохимией. Описано пять классов на основании превалирующего типа клеток, включающих классы миелоидный, миелоидмоноцитарный, моноцитарный, эритроидный и мегакариоцитарный.
Степени индукции ремиссии колеблются от 50 до 85%. Длительное выживание без болезни, как сообщается, имеет место у 20-40% пациентов и повышается до 40-50% у более молодых пациентов с трансплантацией стволовых клеток.
Прогностические факторы помогают определить протокол и интенсивность лечения; пациентам с сильно отрицательными прогностическими особенностями обычно дают более интенсивные формы терапии, поскольку возможное благоприятное действие, как полагают, оправдывает повышенную токсичность лечения. Наиболее важным прогностическим фактором является кариотип лейкозных клеток; благоприятные кариотипы включают t(15;17), t(8;21) и inv16 (p13;q22). Негативные факторы включают возраст, предшествующую миелодиспластическую фазу, вторичный лейкоз, высокое число WBC и отсутствие телец Ауэра.
Начальная терапия пытается вызвать ремиссию и отличается больше всего в случае ALL тем, что AML реагирует на немногие лекарственные средства. Основная схема индукции включает цитарабин непрерывной IV инфузией или в высоких дозах в течение 5-7 дней; в это же время дают даунорубицин или идарубицин IV в течение 3 дней. Некоторые схемы включают 6-тиогуанин, этопозид, винкристин и преднизон, но их вклад неясен. Лечение обычно приводит к существенной миелосупрессии с инфекцией или кровотечением; существует значительная латентность перед извлечением костного мозга. В это время жизненно важным является тщательное превентивное и поддерживающее лечение.
Хронический миелогенный (или миелоидный) лейкоз (CML) также известен как хронический гранулоцитарный лейкоз и характеризуется как рак белых клеток крови. Обычные схемы лечения CML включают ингибиторы тирозинкиназ Ber-Abl, иматиниб (Gleevec®), дазатиниб и нилотиниб. Ингибиторы тирозинкиназ Ber-Abl специфически применимы для больных CML с транслокацией филадельфийской хромосомы.
Миелодиспластические синдромы (MDS) представляют собой гематологические клинические состояния, характеризующиеся нарушенным и неэффективным гемопоэзом или продуцированием крови. Так, необратимо снижается число и качество кровеобразующих клеток. У некоторых пациентов с MDS может развиться тяжелая анемия, в то время как другие являются бессимптомными.
Схема классификации MDS известна в технике, причем критерии обозначают отношение или частоту встречаемости определенных типов клеток крови, например, миелобластов, моноцитов и предшественников красных клеток. MDS включает рефрактерную анемию, рефрактерную анемию с кольцевыми сидеробластами, рефрактерную анемию с избыточными бластами, рефрактерную анемию с избыточными бластами при трансформации, хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML).
Лечение MDS изменяется в связи с тяжестью симптомов. Агрессивные формы лечения для пациентов, испытывающих тяжелые симптомы, включают трансплантаты костного мозга и поддерживающее лечение с поддержкой продуктами крови (например, переливаниями крови) и гемопоэтическими факторами роста (например, эритропоэтином). Часто используют другие средства для лечения MDS: 5-азацитидин, децитабин и леналидомид. В некоторых случаях также можно вводить хелаторы железа (десферал®) и деферазирокс (Exjade®).
В другом воплощении CAR-экспрессирующие клетки (например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки) по настоящему изобретению используют для лечения раковых заболеваний или лейкозов лейкозными стволовыми клетками. Например, лейкозными стволовыми клетками являются CD34+/CD38+ лейкозные клетки.
Настоящее изобретение относится, среди прочего, к композициям и способам лечения рака. В одном аспекте рак представляет собой гематологический рак включающий, но не ограничивающийся перечисленным, лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная лимфома).
В одном аспекте CAR-экспрессирующие клетки (например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки) по изобретению можно использовать для лечения других раковых заболеваний и злокачественностей, таких как, но без ограничения, напримет, острый лейкоз, включая, но не ограничиваясь перечисленным, В-клеточный острый лимфоидный лейкоз («BALL»), Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз («ТALL»), острый лимфоидный лейкоз (ALL); один или больше хронических лейкозов, включая, но не ограничиваясь перечисленным, например, хронический миелогенный лейкоз (CLL); другие гематологические раковые заболевания или гематологические состояния, включая, но не ограничиваясь перечисленным, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, неоплазму бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфому Беркетта, диффузную крупно-В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волсковоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT-лимфому, лимфому из клеток мантии, лимфому маргинальной зоны, множественную лимфому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластную лимфому, неоплазму плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и «предлейкоз», которые представляют собой разнотипную коллекцию гематологических состояний, объединенных неэффективным продуцированием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и т.п.. CAR-модифицированные иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) по настоящему изобретению можно вводить или одни или в виде фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины, или клеточные популяции.
Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования пролиферации или уменьшения популяции CLL-1-экспрессирующих клеток, включающим контактирование популяции клеток, включающей CLL-1-экспрессирующую клетку, с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, клеткой CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации или уменьшения популяции CLL-1-экспрессирующих клеток, включающим контактирование популяции CLL-1-экспрессирующих раковых клеток с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, клеткой CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации или уменьшения популяции раковых CLL-1-экспрессирующих клеток, включающим контактирование популяции CLL-1-экспрессирующих раковых клеток с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, клеткой CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В некоторых аспектах CLL-1-CAR-экспрессирующая клетка (например, клетка CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующая NK-клетка) по изобретению уменьшает количество, число, количество или процент клеток и/или раковых клеток по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%, у субъекта с или животной модели миелоидного лейкоза или другого рака, ассоциированного с CLL-1-экспрессирующими клетками, относительно отрицательного контроля. В одном аспекте субъектом является человек.
Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, лечения и/или оказания помощи при заболевании, ассоциированном с CLL-1-экспрессирующими клетками (например, гематологическом раке или атипичном раке с экспрессией CLL-1), включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, клетки CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте субъектом является человек. Неограничительные примеры расстройств, связанных с CLL-1-экспрессирующими клетками, включают аутоиммунные расстройства (такие как волчанка), воспалительные расстройства (такие как аллергии и астма) и раковые заболевания (такие как гематологические раковые заболевания или атипичные раковые заболевания с экспрессией CLL-1).
Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, лечения и/или оказания помощи при заболевании, ассоциированном с CLL-1-экспрессирующими клетками, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, клетки CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте субъектом является человек.
Настоящее изобретение относится к способам предупреждения рецидива рака, ассоциированного с CLL-1-экспрессирующими клетками, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, клетки CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, клетки CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки), описанной в настоящем описании, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой, в комбинации с эффективным количеством другого лечения лекарственными средствами.
Комбинированные терапии
CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в комбинации с другими известными средствами и терапиями. Вводимое «в комбинации» при использовании в настоящем описании означает, что субъекту доставляют два (или больше) различных лечения в ходе недуга субъекта от расстройства, например, два или больше лечения доставляют субъекту после того, как у субъекта диагностировано расстройство, и до того, как расстройство вылечили или устранили, или лечение прекратили по другим причинам. В некоторых воплощениях все еще происходит доставка одного лечения, когда начинается доставка второго лечения, так что имеет место перекрывание в смысле введения. Иногда в настоящем описании это называется «совместной» или «одновременной доставкой». В некоторых воплощениях любого случая лечение является более эффективным из-за комбинированного введения. Например, второе лечение является более эффективным, например, равнозначный эффект виден с менее значительным вторым лечением, или второе лечение ослабляет симптомы в большей степени, чем это можно видеть, если второе лечение дают в отсутствие первого лечения, или аналогичную ситуацию видят с первым лечением. В некоторых воплощениях доставка такова, что ослабление симптома или другого параметра, связанного с расстройствам, большее, чем можно было бы наблюдать с одним лечением, доставленным в отсутствие другого. Эффект двух лечений может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или большим, чем аддитивный. Доставка может быть такой, что эффект от первого доставленного лечения все еще обнаруживается, когда доставляют второе лечение.
CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство можно вводить совместно в одной или в отдельных композициях, или последовательно. В случае последовательного введения CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно вводить первой, и дополнительное средство можно вводить вторым, или порядок введения может быть обратным.
CAR-терапию и/или другие терапевтические средства, процедуры или способы воздействия можно назначать в периоды активного расстройства или в период ремиссии или менее активной болезни. CAR-терапию можно назначать до другого лечения, одновременно с лечением, после лечения или во время ремиссии расстройства.
При назначении в комбинации CAR-терапию и дополнительное средство (например, второе или третье средство) или все можно вводить в количестве или дозе, которая выше, ниже или такая же, как количество или дозировка каждого средства, используемого отдельно, например, как монотерапию. В некоторых воплощениях количество или дозировка CAR-терапии, дополнительного средства (например, второго или третьего средства) или всех ниже (например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50%), чем количество или дозировка каждого средства, используемого отдельно, например, как монотерапию. В других воплощениях количество или дозировка CAR-терапии, дополнительного средства (например, второго или третьего средства) или всех, которые приводят к желательному эффекту (например, лечению рака), ниже (например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50%), чем количество или дозировка каждого средства, используемого отдельно, например, как монотерапию, требуемое для достижения такого же терапевтического эффекта.
В других аспектах CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в схеме лечения в комбинации с операцией, химиотерапией, облучением, иммуносупрессивными средствами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антитела или другие иммунологические средства, такие как САМРАТН, анти-CD3-антитела или другие терапии антителами, цитоксин, флударабин, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228, цитокины, и излучением, пептидной вакциной, такой как описанная в Izumoto et al., 2008, J. Neurosurg., 108: 963-971.
В некоторых случаях соединения по настоящему изобретению комбинируют с другими терапевтическими средствами, такими как другие противораковые средства, противоаллергические средства, средства от тошноты (или противорвотные средства), средства от боли, цитопротекторы и их комбинации.
В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в комбинации с химиотерапевтическим средством. Примеры химиотерапевтических средств включают антрациклин (например, доксорубицин (например, липосомальный доксорубицин)), винкаалкалоид (например, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин), алкилирующее средство (например, циклофосфамид, декарбазин, мелфалан, ифосфамид, темозоллмид), антитело к иммунной клетке (например, алемтузамаб, гемтузумаб, ритуксимаб, офатумумаб, тозитумомаб, брентуксимаб), антиметаболит (включая, например, антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина и ингибиторы аденозиндеаминазы (например, флударабин), ингибитор mTOR, агонист белка, родственного TNFR, индуцированного гликокортикоидом TNFR (GITR), ингибитор протеасом (например, аклациномицин А, глитотоксин или бортезомиб), иммуномодулятор, такой как талидомид или производное талидомида (например, леналидомид).
Основные химиотерапевтические средства, рассматриваемые для применения в комбинированных терапиях, включают анастрозол (аримидекс®), бикалутамид (касодекс®), блеомицина сульфат (блеоксан®), бусульфан (милеран®), инъекцию бисульфана (бусуфлекс®), капецитабин (кселода®), N4-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (параплатин®), кармустин (BiCNU®), хлорамбуцил (лейкеран®), цисплатин (платинол®), кладрибин (лейстатин®), циклофосфамид (цитоксан® или неозар®), цитарабин, цитозин-арабинозид (цитозар-U®), цитарабина липосомами инъекцию (DepoCyr®), дакарбазин (DTIC-Dome®), дактиномицин (актиномицин D, космеган), даунорубицина гидрохлорид (церубицин®), даунорубицина цитрата липосомами инъекцию (DaunoXome®), дексаметазон, доцетаксел (таксотер®), доксорубицина гидрохлорид (адриамицин®, рубекс®), этопозид (вепезид®), флударабина фосфат (флудара®), 5-фторурацил (адруцил®, эфудекс®), флутамид (эулексин®), тезактибин, гемцитабин (дифтордезоксицитидин), гидроксимочевину (гидреа®), идарубицин (идамицин®), ифосфамид (IPEX®), иринотекан (камптосар®), L-аспарагиназу (ELSPAR®), лейковорин кальция, мелфалан (алкеран®), 6-меркаптопурин (пуринэтол®), метотрексат (фолекс®), митоксантрон (новантрон®), милотарг, паклитаксел (таксол®), фоеникс (иттрий90/МХ-DTPA), пентостатин, полифепрозан с кармустином имплантат (глиадел®), тамоксифена цитрат (нолвадекс®), тенипозид (вумон®), 6-тиогуанин, тиотепу, тирапазамин (тиразон®), топотекана гидрохлорид для инъекции (гикамтин®), винбластин (велбан®), винкристин (онковин®) и винорелбин (навелбин®).
Лечение комбинацией химиотерапевтического средства и клетки, экспрессирующей молекулу CLL-1-CAR, описанную в настоящем описании, можно использовать для лечения гематологического рака, описанного в настоящем описании, например, AML. В воплощениях комбинация химиотерапевтического средства и клетки, экспрессирующей CLL-1-CAR, применима для таргетинга, например, киллинга, раковых стволовых клеток, например, лейкозных стволовых клеток, например, у субъектов с AML. В воплощениях комбинация химиотерапевтического средства и клетки, экспрессирующей CLL-1-CAR, применима для лечения минимального остаточного заболевания (MRD). MRD соотносится с небольшмм числом раковых клеток, которые остаются у субъекта во время лечения, например, химиотерапии, или после лечения. MRD часто является основной причиной рецидива. Настоящее изобретение относится к способу лечения рака, например, MRD, включающему введение химиотерапевтического средства в комбинации с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой, например, описанной в настоящем описании.
В одном воплощении химиотерапевтическое средство вводят до введения клетки, экспрессирующей молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В схемах приема химиотерапевтического средства, где желательно более одного введения химиотерапевтического средства, схема приема химиотерапевтического средства начинается или завершается до введения клетки, экспрессирующей молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В воплощениях химиотерапевтическое средство вводят по меньшей мере за 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней, 15 дней, 20 дней, 25 дней или 30 дней до введения клетки, экспрессирующей молекулу CAR. В воплощениях схема приема химиотерапевтического средства начинается или завершается по меньшей мере за 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней, 15 дней, 20 дней, 25 дней или 30 дней до введения клетки, экспрессирующей молекулу CAR. В воплощениях химиотерапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство, которое усиливает экспрессию CLL-1 на раковых клетках, например, опухолевых клетках, например, по сравнению с экспрессией CLL-1 на здоровых или нераковых клетках. Экспрессию CLL-1 можно определить, например, анализом методом иммуногистохимического окрашивания или проточной цитометрии. Например, химиотерапевтическое средство представляет собой цитарабин (Ara-C).
Противораковые средства, особенно интересные для комбинаций с соединениями по настоящему изобретению, включают антиметаболиты; лекарственные средства, которые ингибируют или кальций-зависимую фосфатазу кальцинеурин или киназу р7056 (FK506), или ингибирует киназу р7056; алкилирующие средства; ингибиторы mTOR; иммуномодуляторы; антрациклины; винкаалкалоиды; ингибиторы протеосом; агонисты GIFR; ингибиторы протеинтирозинфосфатазы; ингибитор киназы CDK4; ингибитор киназы ВТК; ингибитор киназы MKN; ингибитор киназы DGK или онколитический вирус.
Примеры антиметаболитов включают, без ограничения, антагонисты фолиевой кислоты (также называемые в настоящем описании антифолатами), аналоги пиримидина, аналоги пурина и ингибиторы аденозиндеаминазы; метотрексан (ревматрекс®, трексал®), 5-фторурацил (адруцил®, эфудекс®, флюороплекс®), флоксуридин (FUDF®), цитарабин (цитозар-U®, тарабин PFS®), 6-меркаптопурин (пуринетол®)), 6-тиогуанидин (тиогуанин таблоид®), флударабина фосфат (флудара®), пентостатин (нипент®), пеметрексед (алимта®), ралтитрексед (томудекс®), кладрибин (клофарекс®, клолар®), капецетабин (кселода®), неларабин (арранон®), азацитидин (видаза®) и гемцитабин (гемзар®). Предпочтительные антиметаболиты включают, например, 5-фторурацил (адруцил®, эфудекс®, флюороплекс®), флоксуридин (FUDF®), капецетабин (кселода®), пеметрексед (алимта®), ралтитрексед (томудекс®) и гемцитабин (гемзар®).
Примеры алкилирующих средств включают, без ограничения, азотные аналоги горчичного газа, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазины; урацилмустард (аминоурацилмустард®, хлорэтаминацил®, деметилдопан®, десметилдопан®, Haemanthamine®, нордопан®, Uracil nitrogene mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, урамустин®), хлорметил (мустарген®), циклофосфамид (цитоксан®, неозар®, клафен®, эндоксан®, процитокс®, ревиммун™), ифосфамид (митоксана®), мелфалан (алкеран®), хлорамбуцил (лейкеран®), пипоброман (амедел®, верцит®), триэтиленмеламин (Hemel®, гексален®, гексастат®), триэтилентиофосфорамин, темозоломид (темодар®), тиотепу (тиоплекс®), бусульфан (бусилвекс®, милеран®), кармустин (BiCNU®), ломустин (CeeNU®), стрептозоцин (заносар®) и дакарбазин (DTIC-Dome®). Дополнительные примеры алкилирующих средств включают, без ограничения, оксалиплатин (элоксатин®), темозоломид (темодар® и темодал®), дактиномицин (также известный как актиномицин-D, космеген®), мелфалан (также известный как L-PAM, L-сарколизин и фенилаланин мустард, алкеран®), алтретамин (также известный как гексаметилмеламин (НММ), гексален®) кармустин (BiCNU®), бендамустин (треанда®), бусульфан (бусуфлекс® и милеран®), карбоплатин (параплатин®), ломустин (также известный как CCNU, CeeNU®), цисплатин (также известный как CDDP, платинол® и платинол®-AQ), хлорамбуцил (лейкеран®), циклофосфамид (цитоксан® и неозар®), дакарбазин (также известный как DTIC, DIC и карбоксамид имидазола, DTIC-Dome®), ифосфамид (ифекс®), преднумустин, прокарбазин (матулан®), мехлорэтамин (также известный как азотистый иприт, мкстин и мехлорэтамина гидрохлорид, мустарген®), стрептозоцин (заносар®), тиотепу (также известную как тиофосфамид, TESPA и TSPA, тиоплекс®), циклофосфамид (эндоксан®, цитоксан®, неозар®, процитокс®, ревиммун®) и бендамустин HCl (треанда®).
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с флударабином, циклофосфамидом и/или ритуксимабом. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с флударабином, циклофосфамидом и ритуксимабом (FCR). В воплощениях субъект имеет CLL. Например, субъект имеет делецию в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах субъект не имеет del(17p). В воплощениях у субъекта имеется лейкозная клетка, включающая мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (IgVH). В других воплощениях у субъекта не имеется лейкозной клетки, включающей мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (IgVH). В воплощениях флударабин вводят в дозировке примерно 10-15 мг/м2 (например, примерно 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 или 45-50 мг/м2), например, внутривенно. В воплощениях циклофосфамид вводят в дозировке примерно 200-300 мг/м2 (например, примерно 200-225, 225-250, 250-275 или 275-300 мг/м2), например, внутривенно. В воплощениях ритуксимаб вводят в дозировке примерно 400-600 мг/м2 (например, примерно 400-450, 450-500, 500-550 или 550-600 мг/м2), например, внутривенно.
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с бендамустином и ритуксимабом. В воплощениях субъект имеет CLL. Например, субъект имеет делецию в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах субъект не имеет del(17p). В воплощениях у субъекта имеется лейкозная клетка, включающая мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (IgVH). В других воплощениях у субъекта не имеется лейкозной клетки, включающей мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (IgVH). В воплощениях бендамустин вводят в дозировке примерно 70-110 мг/м2 (например, примерно 70-80, 80-90, 90-100 или 100-110 мг/м2), например, внутривенно. В воплощениях ритуксимаб вводят в дозировке примерно 400-600 мг/м2 (например, примерно 400-450, 450-500, 500-550 или 550-600 мг/м2), например, внутривенно.
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом, циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и/или кортикостероидом (например, преднизоном). В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом, циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизоном (R-CHOP). В воплощениях субъект имеет диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL). В воплощениях субъект имеет необъемную ограниченную стадию диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (например, включаеющую опухоль, имеющую размер/диаметр менее 7 см). В воплощениях субъекта лечат облучением в комбинации с R-CHOP. Например, субъекту вводят R-CHOP (например, 1-6 циклов, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 циклов R-CHOP) с последующим облучением. В некоторых случаях субъекту вводят R-CHOP (например, 1-6 циклов, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 циклов R-CHOP) после облучения.
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с этопозидом, преднизоном, винкристином, циклофосфамидом, доксорубицином и/или ритуксимабом. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с этопозидом, преднизоном, винкристином, циклофосфамидом, доксорубицином и ритуксимабом (EPOCH-R). В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с подобранной дозой EPOCH-R (DA-EPOCH-R). В воплощениях субъект имеет В-клеточную лимфому, например, агрессивную В-клеточную лимфому с реаранжированным Myc.
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом и/или леналидомидом. Леналидомид ((RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) является иммуномодулятором. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом и леналидомидом. В воплощениях субъект имеет фолликулярную лимфому (FL) или лимфому из клеток мантии (MCL). В воплощениях субъект имеет FL и предварительно не лечился противораковой терапией. В воплощениях леналидомид вводят в дозировке примерно 10-20 мг (например, 10-15 или 15-20 мг), например, ежедневно. В воплощениях ритуксимаб вводят в дозировке примерно 350-550 мг/м2 (например, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 или 475-500 мг/м2), например, внутривенно.
Примеры ингибитора mTOR включают, например, темсиролимус, ридафоролимус (формально известный как деферолимус (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2-[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-дигидрокси-19,30-диметокси-15,17,21,23,29,35-гексаметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36-диокса-4-азатрицикло[30.3.1.04,9] гексатираконта-16,24,26,28-тетраен-12-ил]пропил]-2-метоксициклогексилдиметилфосфинат, также известный как AP23573 и MK8669, и описанный в публикации PCT № WO 03/064383); эверолимус (афинитор® или RAD001); рапамицин (AY22989, сиролимус®); симапимод (CAS 164301-51-3); эмсиролимус, (5-{2,4-бис[(3S)-3-метилморфолин-4-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-7-ил}-2-метоксифенил)метанол (AZD8055); 2-амино-8-[транс-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3-пиридинил)-4-метилпиридо[2,3-d]пиримидин-7(8H)-он (PF04691502, CAS 1013101-36-4); и N2-[1,4-диоксо-4-[[4-(4-оксо-8-фенил-4H-1-бензопиран-2-ил)морфолиний-4-ил]метокси]бутил]-L-аргинилглицин-L-α-аспартил-L-серин (SEQ ID NO: 313), внутреннюю соль (SF1126, CAS 936487-67-1) и XL765.
Примеры иммуномодуляторов включают, например, афутузумаб (доступный от Roche®); пегфилграстим (Neulasta®); леналидомид (CC-5013, ревимид®); талидомид (таломид®), актимид (CC4047) и IRX-2 (смесь цитокинов человека, включающая интерлейкин 1, интерлейкин 2 и интерферон γ, CAS 951209-71-5, доступный от IRX Therapeutics).
Примеры антрациклинов включают, например, доксорубицин (адриамицин® и Rubex®); блеомицин (леноксан®); даунорубицин (даунорубицина гидрохлорид, дауномицин и рубидомицина гидрохлорид, церубидин®); даунорубицин липосомальный (липосомальная форма даунорубицина цитрата, DaunoXome®); митоксантрон (DHAD, новантрон®); эпирубицин (елленце™; идарубицин (идамицин®, идамицин PFS®); митомицин C (мутамицин®); гелданамицин; гербимицин; равидомицин и дезацетилраыидомицин.
Примеры винкаалкалоидов включают, например, винорелбина тартрат (навелбин®), винкристин (онковин®) и виндезин (элдизин®)), винбластин (также известный как винбластина сульфат, винкалейкобластин и VLB, алкабан-AQ® и велбан®) и винорелбин (навелбин®).
Примеры ингибиторов протеосом включают бортезомиб (велкад®), карфизомиб (PX-171-007, (S)-4-метил-N-((S)-1-(((S)-4-метил-1-((R)-2-метилоксиран-2-ил)-1-оксопентан-2-ил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)-2-((S)-2-(2-морфолиноацетамидо)-4-фенилбутанамидо)пентанамид); маризомиб (NPI-0052); иксазомиба цитрат (MLN-9708); деланзомиб (CEP-18770) и O-метил-N-[(2-метил-5-тиазолил)карбонил]-L-серил-O-метил-N-[(1S)-2-[(2R)-2-метил-2-оксиранил]-2-оксо-1-(фенилметил)этил]-L-серинамид (ONX-0912).
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с брентуксимабом. Брентуксимаб представляет собой антителосодержащее лекарственное средство - конъюгат анти-CD30 антитела и монометилауристатина Е. В воплощениях субъект имеет ходжкинсую лимфому (HL), например, рецидивную или рефрактерную HL. В воплощениях у субъекта имеется CD30+ HL. В воплощениях субъект претерпел трансплантацию аутологичных стволовых клеток (ASCT). В воплощениях субъект не подвергался ASCT. В воплощениях брентуксимаб вводят в дозировке примерно 1-3 мг/кг (например, примерно 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 или 2,5-3 мг/кг), например, внутривенно, например, каждые 3 недели.
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с брентуксимабом и дакарбазином или в комбинации с брентуксимабом и бендамустином. Дакарбазин представляет собой алкилирующее средство с химическим названием 5-(3,3-диметил-1-триазенил)имидазол-4-карбоксамид. Бендамустин представляет собой алкилирующее средство с химическим названием 4-[5-[бис(2-хлорэтил)амино]-1-метилбензимидазол-2-ил]бутановая кислота. В воплощениях субъект имеет ходжкинсую лимфому (HL). В воплощениях субъекта ранее не лечили противораковой терапией. В воплощениях субъект в возрасте по меньшей мере 60 лет, например, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или старше. В воплощениях дакарбазин вводят в дозировке примерно 300-450 мг/м2 (например, примерно 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425 или 425-450 мг/м2), например, внутривенно. В воплощениях бендамустин вводят в дозировке примерно 75-125 мг/м2 (например, примерно 75-100 или 100-125 мг/м2, например, примерно 90 мг/м2), например, внутривенно. В воплощениях брентуксимаб вводят в дозировке примерно 1-3 мг/м2 (например, примерно 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 или 2,5-3 мг/м2), например, внутривенно, например, каждые 3 недели.
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором CD20, например, анти-CD20 антителом (например, анти-CD20 моно- или биспецифическим антителом) или его фрагментом. Примеры анти-CD20 антител включают, но не ограничиваются перечисленным, ритуксимаб, офатумумаб, окрелизумаб, велтузумаб, обинутузумаб, TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals), окаратузумаб и Pro131921 (Genentech). См., например, Lim et al., Haematologica, 95.1(2010): 135-43).
В некоторых воплощениях анти-CD20 антитело включает ритуксимаб. Ритуксимаб представляет собой химерное мышиное/человеческое антитело IgG1-каппа, которое связывается с CD20 и вызывает цитолиз CD20-экспрессирующей клетки, например, как описано в www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом. В воплощениях субъект имеет CLL или SLL.
В некоторых воплощениях ритуксимаб вводят внутривенно, например, внутривенной инфузией. Например, каждая инфузия предоставляет 500-2000 мг (например, примерно 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900 или 1900-2000 мг) ритуксимаба. В некоторых воплощениях ритуксимаб вводят в дозе 150 мг/м2-750 мг/м2, например, примерно 150 мг/м2-750 мг/м2, e.g., about 150-175 мг/м2, 175-200 мг/м2, 200-225 мг/м2, 225-250 мг/м2, 250-300 мг/м2, 300-325 мг/м2, 325-350 мг/м2, 350-375 мг/м2, 375-400 мг/м2, 400-425 мг/м2, 425-450 мг/м2, 450-475 мг/м2, 475-500 мг/м2, 500-525 мг/м2, 525-550 мг/м2, 550-575 мг/м2, 575-600 мг/м2, 600-625 мг/м2, 625-650 мг/м2, 650-675 мг/м2 или 675-700 мг/м2, где м2 показывает площадь поверхности тела субъекта. В некоторых воплощениях ритуксимаб вводят с интервалами между дозами в по меньшей мере 4 дня, например, 4, 7, 14, 21, 28, 35 дней, или большими. Например, ритуксимаб вводят с интервалом между дозами в по меньшей мере 0,5 недели, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 недель, или большим. В некоторых воплощениях ритуксимаб вводят в дозе и интервалом между дозами, описанными в настоящем описании, в течение периода времени, например, по меньшей мере 2 недели, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 недель или дольше. Например, ритуксимаб вводят в дозе и интервалом между дозами, описанными в настоящем описании, в целом по меньшей мере 4 дозы на цикл лечения (например, по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или больше доз на цикл лечения).
В некоторых воплощениях анти-CD20 антитело включает офатумумаб. Офатумумаб представляет собой анти-CD20 IgG1-κ человеческое моноклональное антитело с молекулярной массой приблизительно 149 кД. Например, офатумумаб получают с использованием технологии с трансгенными мышами и гибридомной технологии, и экспрессируют и очищают из рекомбинантной муриновой клеточной линии (NSO). См., например, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf, и идентификатор клинического испытания номер NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352 и NCT01397591. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с офатумумабом. В воплощениях субъект имеет CLL или SLL.
В некоторых воплощениях офатумумаб вводят внутривенной инфузией. Например, каждая инфузия предоставляет примерно 150-3000 мг (например, примерно 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800 или 2800-3000 мг) офатумумаба. В воплощениях офатумумаб вводят в начальной дозировке примерно 300 мг, затем 2000 мг, например, примерно 11 доз, например, в течение 24 недель. В некоторых воплощениях офатумумаб вводят с интервалом между дозами в по меньшей мере 4 дня, например, 4, 7, 14, 21, 28, 35 дней или больше. Например, офатумумаб вводят с интервалом между дозами в по меньшей мере 1 неделю, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30 недель или больше. В некоторых воплощениях офатумумаб вводят в дозе и интервалом между дозами, описанными в настоящем описании, в течение периода времени, например, по меньшей мере 1 неделю, например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 недель или дольше, или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 меяцев или дольше, или 1, 2, 3, 4, 5 лет или дольше. Например, офатумумаб вводят в дозе и интервалом между дозами, описанными в настоящем описании, в целом по меньшей мере 2 дозы на цикл лечения (например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 или больше доз на цикл лечения).
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает окрелизумаб. Окрелизумаб представляет собой гуманизированное анти-CD20 моноклональное антитело, например, описанное в идентификаторе клинического испытания №№ NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, и в Kappos et al., Lancet, 19.378(2011): 1779-87.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает велтузумаб. Велтузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против CD20. См., например, идентификатор клинического испытания №№ NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, и Goldenberg et al., Leuk. Lymphoma, 51(5)(2010): 747-55.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает GA101. GA101 (также называемый обинутузумабом или RO5072759) представляет собой гуманизированное гликоинженерное анти-CD20 моноклональное антитело. См., например, Robak, Curr. Opin. Investig. Drugs, 10.6(2009): 588-96; идентификатор клинического испытания №№ NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422 и NCT01414205; и www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает АМЕ-133v. АМЕ-133v (также называемый LY2469298 или окаратузумабом) представляет собой гуманизированное IgG1 моноклональное антитело против CD20 с повышенной аффинностью в отношении рецептора FcγRIIIa, и усиленной антителозависмой клеточной цитотоксической (ADCC) активностью по сравнению с ритуксимабом. См., например, Robak et al., BioDrugs, 25.1(2011): 13-25; и Forero-Torres et al., Clin Cancer Res., 18.5(2012): 1395-403.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает PRO131921. PRO131921 представляет собой гуманизированное анти-CD20 моноклональное антитело, сконструированное как имеющее более хорошее связывание с FcγRIIIa и усиленной ADCC по сравнению с ритуксимабом. См., например, Robak et al., BioDrugs, 25.1(2011): 13-25; и Casulo et al., Clin. Immunol., 154.1(2014): 37-46; и идентификатор клинического испытания № NCT00452127.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает TRU-015. TRU-015 представляет собой анти-CD20 слитый белок, полученный из доменов антитела против CD20. TRU-015 меньше, чем монокллональные антитела, но сохраняет Fc-опосредуемые эффекторные функции. См., например, Robak et al., BioDrugs, 25.1(2011): 13-25. TRU-015 содержит анти-CD20 одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), соединенный с шарниром человеческого IgG1, доменами CH2 и CH3, но утрачивает домены CH1 и CL.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело, описанное в настоящем описании, конъюгировано или иначе связано с терапевтическим средством, например, химиотерапевтическим средством (например, цитоксаном, флударабином, ингибитором гистондеацтилазы, деметилирующим средством, пептидной вакциной, противоопухолевым антибиотиком, ингибитором тирозинкиназы, алкилирующим агентом, антимикротубулярным средством или антимитотическим средством), противоаллергическим средством, средством от тошноты (или противорвотным средством), средстовм от боли или цитопротектором, описанными в настоящем описании.
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором В-клеточной лимфомы 2 (BCL-2) (например, венетоклаксом, также называемым АВТ-199 или GDC-0199) и/или ритуксимабом. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с венетоклаксом и ритуксимабом. Венетоклакс является небоьшой молекулой, которая ингибирует антиапоптозный белок BCL-2. Структура венетоклакса (4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил]метил}пиперазин-1-ил)-N-({3-нитро-4-[(тетрагидро-2H-пиран-4-илметил)амино]фенил}сульфонил)-2-(1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-илокси)бензамида) показана ниже.
В воплощениях субъект имеет CLL. В воплощениях субъект имеет рецидивный CLL, например, субъект ранее получал противораковую терапию. В воплощениях венетоклакс вводят в дозировке примерно 15-600 мг (например, 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500 или 500-600 мг), например, ежедневно. В воплощениях ритуксимаб вводят в дозировке примерно 350-550 мг/м2 (например, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 или 475-500 мг/м2), например, внтуривенно, например, ежемесячно.
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с онколитическим вирусом. В воплощениях онколитические вирусы способны селективно реплицироваться в и запускать гибель или ослабление роста раковой клетки. В некоторых случаях онколитические вирусы не оказывают действия или минмально действуют на нераковые клетки. Онколитический вирус включает, но не ограничивается перечисленным, онколитический аденовирус, онколитический вирус простого герпеса, онколитический ретровирус, онколитический парвовирус, онколитический вирус коровьей оспы, онколитический вирус Синбис, онколитический вирус гриппа или онколитический РНК-вирус (например, онколитический реовирус, онколитический вирус ньюкаслской болезни (NDV), онколитический вирус кори или онколитический вирус везикулярного стоматита (VSV)).
В некоторых воплощениях онколитический вирус представляет собой вирус, например, рекомбинантный онколитический вирус, описанный в US 2010/0178684 А1, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых воплощениях рекомбинантный онколитический вирус включает нуклеотидную последовательность (например, гетерологичную нуклеотидную последовательность), кодирующую ингибитор иммунной или воспалительной реакции, например, как описано в US 2010/0178684 А1, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В воплощенях рекомбинантный онколитический вирус, например, онколитический NDV, включает проапоптозный белок (например, апоптин), цитокин (например, GM-CSF, интерферон-гамма, интерлейкин 2 (IL-2), фактор некроза опухоли альфа), иммуноглобулин (например, антитело против ED-B фибронектина), опухольассоциированный антиген, биспецифический адаптерный белок (например, биспецифическое антитело или фрагмент антитела, направленные против белка NDV HN, и Т-клеточный костимулирующий рецептор, такой как CD3 или CD28; или слитый белок человеческого IL-2 и одноцепочечного антитела, направленного против белка NDV HN). См., например, работу Zamarin et al., Future Microbiol., 7.3(2012): 347-67, полностью включенную в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых воплощениях онколитический вирус представляет собой химерный онколитический NDV, описанный в US 8591881 B2, US 2012/0122185 A1 или US 2014/0271677 A1, которые все полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок.
В некоторых воплощениях онколитический вирус включает условно реплицирующийся аденовирус (CRAd), который создан для репликации исключительно в раковых клетках. См., например, Alemany et al., Nature Biotechnol., 18 (2000): 732-27. В некоторых воплощениях онколитический аденовирус включает вирус, описанный в таблице 1 на с.725 в работе Alemany et al., полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Примеры онколитических вирусов включают, но не ограничиваются перечисленным, следующее:
онколитический аденовирус группы В (ColoAd1) (PsiOxus Therapeutics Ltd.) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT02053220);
ONCOS-102 (называвшийся прежде CGTG-102), который представляет собой аденовирус, включающий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (Oncos Therapeutics) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT01598129);
VCN-01, который представляет собой генетически модифицированный онколитический аденовирус человека, кодирующий гиалуронидазу PH20 человека (VCN Biosciences, S.L.) (см., например, идентификаторы клинического испытания NCT02045602 и NCT02045589);
условно реплицирующийся аденовирус ICOVIR-5, который представляет собой вирус, полученный из серотипа 5 аденовируса человека (Had5), который модифицирован для селективной репликации в раковых клетках с разрегулированным путем ретинобластома/E2F (Institut Català d'Oncologia) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT01864759);
Celyvir, который включает полученные из костного мозга аутологичные мезинхимальные стволовые клетки (MSC), инфицированные ICOVIR5, онколитический аденовирус (Hospital Infantil Universitario Niño Jesús, Madrid, Spain/Ramon Alemany) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT01844661);
CG0070, который представляет собой условно реплицирующийся онколитический аденовирус серотипа 5 (Ad5), в котором человеческий промотор E2F-1 управляет экспрессией незаменимых вирусных генов E1a, посредством чего ограничивается репликация вируса и цитотоксичность для опухолевых клеток с дефицитом пути Rb (Cold Genesys, Inc.) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT02143804); или
DNX-2401 (официальное название Delta-24-RGD), который представляет собой аденовирус, сконструированный для селективной репликации в ретинобластомных клетках с дефицитом пути (Rb) и для инифицирования клеток, которые экспрессируют некоторые RGD-связывающие интегрины более эффективно (Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/ DNAtrix, Inc.) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT01956734).
В некоторых воплощениях онколитический вирус, описанный в настоящем описании, вводят инъекцией, например, подкожной, интраартериальной, внутривенной, внутримышечной, интратекальной или интраперитонеальной инъекцией. В воплощениях онколитический вирус, описанный в настоящем описании, вводят интратуморально, интрадермально, трансмукозально, перорально, интраназально или путем легочного введения.
В одном воплощении клетки, экспрессирующие CAR, описанный в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с молекулой, которая уменьшает клеточную популяцию Treg. Способы уменьшения числа (например, истощения) клеток Treg известны в технике и включают, например, деплецию CD25, введение циклофосфамида, модуляцию функции GITR. Без желания привязываться к какой-либо теории, полагают, что уменьшение числа клеток Treg у субъекта перед аферезом или перед введением CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем о