Адъювант

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к препаратам, стимулирующим антителообразование, и может быть использовано в области медицины и ветеринарии для конструирования и производства высокоэффективных вакцин.

Современные вакцинные препараты в ряде случаев обладают недостаточной иммуногенностью из-за отсутствия в их составе патоген-ассоциированных молекулярных структур микроорганизмов, взаимодействующих с рецепторами клеток-эффекторов врожденного иммунитета [Семакова А.П., Микшис Н.И. Адъювантные технологии в создании современных вакцин // Проблемы особо опасных инфекций -2016. - №2. - С. 28-35]. Такие вакцины требуют включения в их состав современных природных или синтетических адъювантов, повышающих иммунный потенциал вакцин.

Адъюванты - вещества или смеси веществ, вызывающие усиление образования антител к сложным антигенам, таким как бактерии и вирусы. Адъюванты усиливают образование специфических антител, связывающих именно антигенные детерминанты возбудителя заболевания, тогда как иммуномодуляторы активизируют все компоненты иммунной системы.

Известно, что иммунный ответ к различным антигенам требует участия разных типов иммунных реакций. Реакция организма на различные антигены проходит двумя путями: (1) через гуморально-опосредованный иммунитет, который включает стимуляцию В-клеток и продукцию антител или иммуноглобулинов, индуцирование Т-клеток (Th1 и Th2), и (2) через клеточно-опосредованный иммунитет, который также вовлекает Т-клетки, включая цитотоксические Т-лимфоциты.

Так, ответ Th1 коррелирует с индукцией клеточного иммунитета, необходимого для защиты от внутриклеточных инфекционных агентов (бактерии, простейшие), и характеризуется продукцией цитокинов IL-2, IFN-γ, TNF-β и усиленной выработкой IgG2a, IgG2b, IgG3 у мышей [Seder R.A., Hill A.V. Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity. Nature. 2000. 406: 793-798.]. Ответ же Th2 контролирует гуморальный иммунитет, который эффективен для защиты от большинства бактериальных и ряда вирусных инфекций и характеризуется образованием цитокинов IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 и усиленной продукцией IgG1 [McKee A.S., Munks M.W., Marrack P. How do adjuvants work? Important considerations for new generation adjuvants. Immunity. 2007. 27: 687-690. Coffman R. L., Sher A. and Seder R.A. Vaccine Adjuvants: Putting Innate Immunity to Work. Immunity. 2010. 33(4): 492-503.].

В целом, иммунная реакция организма может упрощенно рассматриваться как реакция организма, основанная на специфичности В- и Т-клеток. Эти клетки могут приобретать специфическую реакционную способность после активации соответствующим специфическим антигеном и обладают механизмом памяти при возможном контакте с этим антигеном в будущем.

Поэтому вакцинация против патогенов, направленная на то, чтобы значительно облегчить и ускорить образование долгоживущих Т- и В-клеток памяти и, как следствие, индукцию циркулирующих специфических протективных антител, является важной профилактической мерой. В настоящее время предпочтение отдается модификаторам функций рецепторов врожденного иммунитета и их сигнальных путей.

Среди множества различных групп веществ, потенциально обладающих адьювантными свойствами, обращают на себя внимание адъюванты на основе углеводов, т.к. они совместимы с живыми векторными вакцинами, безопасны, хорошо переносятся, а их производство не отличается трудоемкостью. Это, например, глюкановые, маннановые. хитозановые, мурамилдипептидные адъюванты [Курашова С.С. и др. Адъюванты на основе углеводов для производства вакцин / БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2018, Т. 18, №2. - С. 81-91].

Известны адъювантные системы на основе сквалена (MF59), сапонина (ISCOMATRIX) и тому подобные, при использовании которых профиль иммунного ответа имеет смешанный Th1/Th2 тип [Nathalie Garcon et. al. Perspectives in Vaccinology. - 2011. - Vol. 1, №1. - P. 89-113; Sanders M.T. et al. ISCOMTM-based vaccines: The second decade. Immunol. Cell Biol. (2005).83, 119-128]. Однако с использованием в качестве адъюванта сквалена и минерального масла связывают развитие аутоиммунного и/или воспалительного синдрома [Vera-Lastra О. et. al. Autoimmune/inflammatory syndrome induced by adjuvants (Shoenfeld's syndrome): clinical and immunological spectrum // Expert review of clinical immunology. 2013. Vol.9(4). P. 361-373]. Вакцины с адъювантом MF59 повышают частоту местных реакций в виде припухлости в месте инъекции и миалгий [Schultze V. et al. Safety of MF59 adjuvant // Vaccine. - 2008. - V. 26(26). - P. 3209-3222].

В качестве перспективных адъювантов часто исследуются продукты бактериального происхождения, такие как липополисахариды (ЛПС) грамотрицательных бактерий. Известно, что бактериальный липополисахарид (ЛПС) является мощным стимулятором активации макрофагов и выработки провоспалительных цитокинов. Поскольку сам по себе ЛПС токсичен для человека, необходима модификация и/или комбинированное применение его с другими веществами в виде комплексов [US 2017326221 (А1), 16.11.2017; JP 2018131416 (А), 23.08.2018; WO 2004019975 (А2), 11.03.2004].

Адъювантная система AS04 представлена иммуномодулятором MPL -монофосфориллипидом А, профиль иммунного ответа которого имеет смешанный Th1/Th2 тип. Это очищенная, детоксицированная производная бактериальных липополисахаридов, адсорбированная на различных соединениях алюминия [Tino F. Schwarz, et al. Four-Year Follow-up of the Immunogenicity and Safety of the HPV-16/18 AS04-Adjuvanted Vaccine When Administered to Adolescent Girls Aged 10-14 Years // Journal of Adolescent Health. - 2012. - Vol. 50, №2. - P. 187-194].

Однако при использовании таких адъювантных систем часто возникают проблемы, вызванные их многокомпонентностью, трудностью унификации и невысокой стабильностью.

В настоящее время практически единственным коммерческим адъювантом, широко используемым при производстве вакцин, является гидроокись алюминия (и некоторые ее производные), применение которой обеспечивает интенсивную продукцию антител, практически независимую от вида антигена. Однако, как показали исследования, проведенные в последние годы, использование адъювантов на основе соединений алюминия, с которыми ассоциирован слабый антиген, приводит к индукции иммунитета по Th2-типу, и в итоге иммунитет направлен преимущественно против внеклеточных патогенов. Существенными недостатками адъювантов на основе соединений алюминия является то, что их использование в вакцинах может вызывать серьезные локальные и системные побочные эффекты, включая местные и системные реакции, риск развития болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных расстройств. Вследствие токсичности, соединения алюминия в составе вакцин способны провоцировать макрофагальный миозит, симптомы хронической усталости и др. [Christopher A., Shaw М., Aluminum hydroxide injections lead to motor deficits and motor neuron degeneration // Journal of Inorganic Biochemistry. 2009. Vol. 103. P. 1555-1562; Shaw C.A., Tomljenovic L. Aluminum in the central nervous system (CNS): toxicity in humans and animals, vaccine adjuvants, and autoimmunity // Immunol Res. 2013. Vol. 56(2-3). P. 304-316; Vera-Lastra O. et al. Autoimmune/inflammatory syndrome induced by adjuvants (Shoenfeld's syndrome): clinical and immunological spectrum // Expert review of clinical immunology. 2013. Vol. 9(4). P. 361-373; Gherardi RK et al. Macrophagic myofasciitis:an emerging entity. Groupe d'Etudes et Recherche sur les Maladies Musculaires Acquises etDysimmunitaires (GERMMAD) de 1' Association Francaise contre les Myopathies (AFM). Lancet. 1998 Aug 1; 352(9125):347-52].

С учетом того, что в случае вирусных и многих микробных инфекций наиболее эффективным является иммунный ответ по Th1-типу, существует очевидная необходимость создания новых эффективных и безопасных адъювантов или адъювантных систем, лишенных побочных эффектов, для слабых антигенов.

Морские грамотрицательные бактерии представляют собой богатый источник биологически активных веществ, которые могут быть использованы для разработки новых классов лекарственных субстанций, в т.ч. адъювантов вакцин. Адаптация микроорганизмов к морской среде была осуществлена путем разработки сложной серии процессов зарядки биомолекул, составляющих клетку, с тем, чтобы обеспечить правильную физиологию и функциональность в этих условиях. Молекулы липополисахаридов (ЛПС), составляющие огромную часть внешней мембраны грамотрицательных бактерий, представляют собой контакт между бактериальной клеткой и окружающей средой и играют существенную роль в адаптации организмов к специфическим условиям окружающей среды. ЛПС морских грамотрицательных бактерий в отличие от ЛПС наземных бактерий, часто проявляют низкую токсичность.

Задачей изобретения является расширение арсенала адъювантов, обладающих низкой токсичностью и способных стимулировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ.

Поставленная задача достигается применением О-специфического полисахарида морской грамотрицательной бактерии Cobetia litoralis KMM 3890^T (ОПС 1) или О-специфического полисахарида морской грамотрицательной бактерии Idiomarina abyssalis KMM 227^T (ОПС 2) в качестве адъюванта для вакцин.

Описание применения ОПС 1 или ОПС 2 в качестве адъюванта для вакцин в доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено.

О-специфические полисахариды у каждого вида микроорганизмов обладают уникальными структурными особенностями, определяющими их специфичность, вследствие чего адъювантное действие ОПС 1 и ОПС 2 не является очевидным фактом и обнаружено авторами впервые.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в способности ОПС 1 и ОПС 2 при введении антигена индуцировать в организме млекопитающего Т- и В-клетки с профилем иммунного ответа Th1/Th2 типа. Причем важнейшим преимуществом новых адъювантов заключается в отсутствии у них токсичности.

Предлагаемые в качестве адъювантов О-специфические полисахариды из липополисахаридов морских грамотрицательных бактерий отличаются наличием необычных кислых и N-ациламиносахаров, а также заместителей неуглеводной природы.

Бактериальные штаммы взяты из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН (KMM).

ОПС 1 получен путем деградации ЛПС морской грамотрицательной бактерии Cobetia litoralis KMM 3890^T и состоит из разветвленных трисахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из D-глюкозы (D-Glcp), D-маннозы (D-Manp) и сульфатированной по положению O-5 3-дезокси-D-манноокт-2-улозоновой кислоты (Kdop5S) [Kokoulin M.S. et al. Structure and anticancer activity of sulfated O-polysaccharide from marine bacterium Cobetia litoralis KMM 3880T // Carbohydrate Polymers. - 2016. - Vol. 154. - P 55-61]. Показано, что ОПС 1 ингибируют колониеобразование клеток меланомы человека SK-MEL-28 и колоректальной карциномы НТС-116.

ОПС 2 получен путем деградации ЛПС морской грамотрицательной бактерии Idiomarina abyssalis KMM 227^T и характеризуется уникальной структурой. Он состоит из сульфатированных пентасахаридных повторяющихся звеньев и содержит два остатка 2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкуроновой кислоты (D-GlcpNAcA), L-рамнозы (L-Rhap), 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезокси-D-глюкозы (D-QuipNAc4NAc), а также сульфатированный по положению O-2 остаток 3,6-дидезокси-3-(4-гидроксибутирамидо)-D-глюкозы [D-Quip2S3N(4Hb)] [Kokoulin M.S. et. al. Idiomarina abyssalis KMM 227T containing a 2-O-sulfate-3-N-(4-hydroxybutanoyl)-3,6-dideoxy-d-glucose // Carbohydrate Research. - 2015. -Vol. 41. - P. 100-106]. Описание утилитарных свойств этого О-специфического полисахарида в доступной литературе отсутствует.

Оценка токсичности ОПС 1 и ОПС 2 in vitro и in vivo

Цитотоксичность ОПС в экспериментах in vitro оценивали методом суправитальной окраски лимфоцитов периферической крови человека 0,2% раствором трипанового синего с последующим микроскопическим подсчетом в камере Горяева числа живых (неокрашенных) и погибших (синих) клеток из 100. Долю жизнеспособных клеток (N) определяют по формуле: N=1-(число окрашенных клеток/общее число клеток) х 100%.

При оценке цитотоксической активности ОПС по отношению к лимфоцитам периферической крови человека in vitro установлено, что исследованные ОПС 1 и ОПС 2 не оказывают токсического действия в диапазоне концентраций от 0,01 до 100 мкг/мл. Результаты представлены в таблице 1.

Токсичность ОПС в экспериментах in vivo оценивали на неинбредных мышах при внутрибрюшинном введении ОПС 1 и ОПС 2 в дозах от 5 мг/кг до 500 мг/кг с определением ЛД₅₀ по формуле Кербера в модификации [Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. 1962. 234 с.]. Животным контрольной группы вводили 0,85% раствор NaCl. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 суток. Ежедневной регистрации подлежали гибель животных, данные осмотра, вес тела. По окончании срока наблюдения производилось вскрытие животных для оценки состояния внутренних органов.

При оценке токсичности ОПС in vivo установлено, что однократное внутрибрюшинное введение мышам ОПС 1 и ОПС 2 в дозах до 500 мг/кг в течение 2-х недель эксперимента не вызывало гибели экспериментальных животных. Существенных отклонений в поведении мышей, в потреблении корма, воды, приросте массы тела не отмечено. Животные опытных групп нормально развивались и прибавляли в массе наравне с контрольными. Мыши были подвижны, шерстный покров и видимые слизистые чисты. Не наблюдалось нарушений координации движений, поведенческих реакций, угнетения дыхания, нарушений мышечного тонуса.

Показатели массы тела опытных мышей не имели статистически значимых отличий от аналогичных показателей у интактных животных. При вскрытии установлено, что внутренние органы, региональные лимфатические узлы у опытных мышей в пределах физиологической нормы. Результаты представлены в таблице 2.

Таким образом, введение экспериментальным животным образцов ОПС 1 и ОПС 2 в диапазоне доз от 5 до 500 мг/кг не вызывает видимых клинических проявлений интоксикации в течение всего периода наблюдения. При внутрибрюшинном введении срединная летальная доза (ЛД₅₀) ОПС 1 и ОПС 2 для мышей превышает 500 мг/кг.

Изучение закономерности формирования иммунного ответа на вакцинную композицию с овальбумином (ОВА) под влиянием ОПС морских бактерий

Проведена оценка специфического гуморального иммунного ответа (интенсивность и продолжительность) по уровню специфических сывороточных антител к овальбумину (ОВА) (стандартный антиген) у мышей под влиянием ОПС по сравнению с известным адъювантом (гидроксид алюминия).

Мышей-самцов BALB/c рандомизировали на 4 группы, иммунизированных соответственно: 1 группа - композицией ОВА с ОПС из морской бактерии Cobetialitoralis KMM 3890Т (образец 1); 2 группа - ОВА с ОПС из морской бактерии Idiomarinaabyssalis KMM 227Т (образец 2); 3 группа - ОВА с гидроокисью алюминия (лицензированный адъювант); 4 группа - ОВА с фосфатно-буферным раствором (ФБР). Суспензию ОВА с ОПС или с гидроксидом алюминия готовили путем смешивания или адсорбции на геле гидроксида алюминия в течение 1 часа. В качестве растворителя использовали ФБР рН 7,2. Животных иммунизировали внутрибрюшинно 3-х-кратно с интервалом 2 недели (0, 14, 28 дни) овальбумином (EndoFitTMOvalbumin, InvivoGenEuropa, USA) в дозе 100 мкг/мышь. Через 33-35 дней от начала иммунизации производили тотальный отбор крови из сонных артерий. В сыворотке крови определяли IgG, IgG1 and IgG2a антитела с применением тест-системы MouseAnti-OBA IgG, IgG1 and IgG2a AntibodyAssayKit (Chodrex, Inc) и выражали в log мкг/мл. Уровень цитокинов (IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-10) в сыворотке крови мышей определяли с применением тест-систем MousePlatinum ELISA (eBioscience, Австрия). Результаты измеряли на микропланшетном ридере Multiscan RC (Labsystems, Финляндия) при 450 нм.

Анализ специфического иммунного ответа in vivo показал, что при иммунизации мышей ОВА под влиянием ОПС 1 и ОПС 2, содержание как общего иммуноглобулина (IgG), так и его изотипов (IgG1 и IgG2a) увеличивалось (р<0,01) по сравнению с контролем. Индекс стимуляции (ИС) иммунного ответа по общему IgG под влиянием ОПС 1 составил 25, под влиянием ОПС 2 - 65,9. Результаты представлены в таблице 3.

Под влиянием гидроокиси алюминия также выявлено значительное увеличение продукции IgG и его изотипов IgG1 и IgG2a (р<0,01). ИС иммунного ответа по общему IgG составил 33,8.

Сравнение адъювантной активности ОПС 1 и гидроокиси алюминия показало, что эффект ОПС 1 по общему IgG и IgG1 аналогичен эффекту гидроокиси алюминия (р>0,05), а по IgG2a значимо превосходил таковой (р<0,01). Эффект ОПС 2 превосходил таковой гидроокиси алюминия по уровню общего IgG в 1,95 раза (р<0,05), также значимо превышал по уровню IgG1 (р<0,05) и по уровню IgG2a (р<0,01).

Таким образом, как следует из таблицы 3, ОПС 1 и ОПС 2 проявляют адъювантную активность, усиливая специфический иммунный ответ к ОВА. Наибольший эффект оказывает ОПС 2.

Для уточнения преимущественного типа ответа (тенденции к развитию Th1 или Th2) было рассчитано соотношение IgG1/IgG2a. Соотношение изотипов IgG1/IgG2a (мкг/мл) под влиянием исследуемых образцов ОПС 1 и ОПС 2 составляет соответственно 2,5 и 1,3, что свидетельствует об активации обеих эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Th1 и Th2).

Под влиянием гидроокиси алюминия этот показатель составил 23,3, что свидетельствует о преимущественной продукции IgG1, т.е. об активации Th2, и, следовательно, о преимущественной стимуляции гуморального иммунного ответа.

Также изучено влияние ОПС на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов - интерлейкинов-2, 10, 12 и интерферона-γ (IL-2, IL-10, IL-12, IFN-γ) у мышей, иммунизированных ОВА, по сравнению с гидроксидом алюминия.

У животных, иммунизированных вакцинными композициями ОВА с образцами ОПС 1 и ОПС 2, наблюдалось усиление продукции Th1-ассоциированного цитокина IFN-γ (р<0,05), применение гидроокиси алюминия в качестве адъюванта не оказывало влияния на уровень IFN-γ по сравнению с контролем (р>0,05). Такая же тенденция выявлена в отношении регуляторного цитокина IL-12. В отношении Th2-ассоциированного цитокина IL-10 ОПС 1 и ОПС 2, а также гидроокись алюминия оказывали стимулирующее влияние на его продукцию (р<0,05). Результаты представлены в таблице 4.

В итоге, под влиянием ОПС 1 и ОПС 2 выявлены повышенные уровни Th1-ассоциированных цитокинов (INF-γ, IL-2) и Th2-цитокина (IL-10), а также регуляторного цитокина IL-12, что свидетельствует об активации обеих эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Th1 и Th2). Под влиянием гидроксида алюминия выявлено усиление продукции только Th2-цитокина (IL-10).

Таким образом, исследуемые ОПС из морских бактерий Cobetialitoralis KMM 3890Т и Idiomarinaabyssalis KMM 227Т нетоксичны, действуют как адъюванты, стимулируя смешанный Th1 (IgG2a, INF-γ, IL-2) и Th2 (IgG1, IL-10) иммунный ответ, т.е. обладают значительным потенциалом для усиления как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Предлагаемые О-специфические полисахариды из морских грамотрицательных бактерий можно считать эффективными и безопасными кандидатами в адъюванты для вакцин.

Применение О-специфического полисахарида морской грамотрицательной бактерии Cobetia litoralis KMM 3890^T или О-специфического полисахарида морской грамотрицательной бактерии Idiomarina abyssalis КММ 227^T в качестве адъюванта для вакцин.