Способ получения иммуногенного конъюгата капсульный полисахарид streptococcus pneumoniae-белок-носитель

Область изобретения

Данное изобретение относится к активированным полисахаридам Streptococcus pneumoniae серотипов 10А, 22F или 33F и к способам их получения. Изобретение также относится к иммуногенным конъюгатам, содержащим полисахариды Streptococcus pneumoniae серотипов 10А, 22F или 33F, ковалентно связанные с белком-носителем, к способам их получения и к иммуногенным композициям и вакцинам, содержащим их.

Предшествующий уровень техники

Streptococcus pneumoniae представляют собой грамположительные, ланцетовидные кокки, которые обычно наблюдаются в парах (диплококки), а также в виде коротких цепочек или в виде отдельных клеток. Они хорошо растут на чашках с кровяным агаром с образованием блестящих колоний и демонстрируют альфа-гемолиз, а в случае анаэробного выращивания они демонстрируют бета-гемолиз. Клетки большинства пневмококковых серотипов имеет капсулу, которая представляет собой полисахаридное покрытие, окружающее каждую клетку. Эта капсула представляет собой детерминанту вирулентности у людей, так как она препятствует фагоцитозу путем предотвращения прикрепления антител к бактериальным клеткам. В настоящее время существует более 90 известных идентифицированных пневмококковых капсульных серотипов, с 23 наиболее распространенными серотипами, составляющими примерно 90% инвазивных заболеваний во всем мире. В качестве вакцины пневмококковое полисахаридное покрытие может придать достаточную степень иммунитета к Streptococcus pneumonia субъектам с развитой и неослабленной иммунной системой, но капсульный полисахарид, конъюгированный с белком-носителем, обеспечивает иммунный ответ у детей раннего возраста и пожилых людей, которые также в большой степени рискуют быть инфицированными пневмококками.

С момента введения первой 7-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины (PCV7 или Превенар) в 2000 году, инвазивное заболевание, вызванное этими семи серотипами (4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F) почти исчезло. Добавление серотипов 1, 3, 5, 6А, 7F и 19А в Превенар 13 дополнительно снижало число инвазивных пневмококковых заболеваний.

Ни одна из имеющихся в настоящее время на рынке пневмококковых вакцин не обеспечивает надлежащей защиты против серотипов 10А, 22F или 33F Streptococcus pneumoniae у человека и, в частности у детей младше 2-х лет. Таким образом, существует потребность в иммуногенных композициях, которые можно использовать для индукции иммунного ответа против серотипов 10A, 22F или 33F Streptococcus pneumonia.

Краткое изложение сущности изобретения

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения активированного капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипов 10А, 22F или 33F, включающий следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного капсульного полисахарида серотипов 10А, 22F или 33F с окислителем; и;

(б) гашение реакции окисления путем добавления гасящего агента, что приводит к активированному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипов 10А, 22F или 33F.

В еще одном аспекте изобретение относится к активированному капсульному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипов 10А, 22F или 33F, полученному или получаемому посредством способа активации, раскрытого в данном описании изобретения.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения иммуногенного конъюгата, содержащего полисахарид Streptococcus pneumoniae серотипов 10А, 22F или 33F, ковалентно связанный с белком-носителем, включающий следующие стадии:

(а) смешивание активированного полисахарида серотипов 10А, 22F или 33F полученного или получаемого способом, раскрытым в данном описании изобретения, с белком-носителем; и,

(б) взаимодействие смеси активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F и белка-носителя с восстановителем с образованием конъюгата полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F : белок-носитель.

В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложен конъюгат полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F : белок-носитель, полученный или получаемый посредством способа, описанного в данном описании изобретения.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены иммуногенные композиции и вакцины, содержащие иммуногенный конъюгат, раскрытый в данном описании изобретения.

В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложен способ лечения или предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae, заболевания или состояния, ассоциированного с Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33F, у субъекта, включающий стадию введения терапевтически или профилактически эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины, раскрытых в данном описании изобретения.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показана структура повторяющейся единицы капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 10А.

На Фиг. 2 показана структура повторяющейся единицы капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 22F.

На Фиг. 3 показана структура повторяющейся единицы капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 33F.

На Фиг. 4 показана молекулярная масса активированного полисахарида серотипа 22F в зависимости от количества окислителя при 23°С с использованием стадии гашения или без нее.

На Фиг. 5 показана молекулярная масса активированного полисахарида серотипа 22F в зависимости от количества окислителя при 4°С с использованием стадии гашения или без нее.

На Фиг. 6 показана молекулярная масса активированного полисахарида серотипа 33F в зависимости от количества окислителя при 2-8°С с использованием стадии гашения или без нее или при 23°С без стадии гашения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение можно будет проще понять посредством ссылки на следующее подробное описание предпочтительных воплощений изобретения и на примеры, включенные в данное описание изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании изобретения, имеют такое же значение, как обычно понимает специалист в области техники, к которой относится изобретение. Хотя любые способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем описании изобретения, могут быть использованы в практическом воплощении или при тестировании настоящего изобретения, некоторые предпочтительные способы и вещества описаны в настоящем описании изобретения. В описанных воплощениях и формуле изобретения будет использоваться определенная терминология в соответствии с определениями, изложенными ниже.

При использовании в данном описании изобретения формы единственного числа "a", "an" и "the" включают ссылки на множественное число, если не указано иное. Таким образом, например, ссылки на "способ" включают один или более способов, и/или стадии описанного в данном описании изобретения типа и/или которые станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения этого описания.

При использовании в данном описании термин "молекулярная масса" полисахарида или конъюгата белок-носитель - полисахарид относится к молекулярной массе, рассчитанной посредством гель-фильтрационной хроматографии (SEC) в сочетании с многоугловым детектором рассеяния лазерного света (MALLS).

При использовании в данном описании термин "степень окисления" (DO) относится к числу повторяющихся единиц сахара на альдегидную группу, образованную при активации выделенного полисахарида окислителем. Степень окисления полисахарида можно определить, используя обычные методы, известные специалистам в данной области техники.

Следует отметить, что в данном описании изобретения такие термины, как "содержит", "содержал", "содержащий", "вмещает", "вмещающий" и подобные, могут иметь значение, приписываемое им в патентном законе США; например, они могут означать "включает в себя", "включал", "включающий" и подобное. Такие термины относятся к включению конкретных ингредиентов или набора ингредиентов без исключения любых других ингредиентов. Такие термины, как "по существу состоящий из" и " по существу состоит из" имеют значение, приписываемое им в патентном законе США, например, они позволяют включение дополнительных ингредиентов или стадий, которые не приуменьшают новые или основные характеристики изобретения, то есть они исключают дополнительные неописанные ингредиенты или стадии, которые приуменьшают новые или основные характеристики изобретения. Термины "состоит из" и "состоящий из" имеют значения, приписываемые им в патентном законе США; а именно то, что эти термины имеют закрытый тип. Соответственно, эти термины относятся к включению конкретного ингредиента или набора ингредиентов и исключению всех других ингредиентов.

При использовании в данном описании термин "конъюгаты" или "гликоконъюгаты" относится к полисахариду, ковалентно конъюгированному с белком-носителем. Гликоконъюгаты по изобретению и иммуногенные композиции, содержащие их, могут содержать некоторое количество свободного полисахарида.

При использовании в данном описании термин "гликоконъюгат серотипа 10А" или "конъюгат серотипа 10А" относится к выделенному капсульному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, ковалентно конъюгированному с белком-носителем.

При использовании в данном описании термин "гликоконъюгат серотипа 22F" или "конъюгат серотипа 22F" относится к выделенному капсульному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипа 22F, ковалентно конъюгированному с белком-носителем.

При использовании в данном описании термин "гликоконъюгат серотипа 33F" или "конъюгат серотипа 33F" относится к выделенному капсульному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, ковалентно конъюгированному с белком-носителем.

При использовании в данном описании термин "полисахарид серотипа 10А" относится к капсульному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипа 10А.

При использовании в данном описании термин "полисахарид серотипа 22F" относится к капсульному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипа 22F.

При использовании в данном описании термин "полисахарид серотипа 33F" относится к капсульному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипа 33F.

При использовании в данном описании термин "свободный полисахарид" означает капсульный полисахарид, который ковалентно не конъюгирован с белком-носителем, но тем не менее присутствует в композиции конъюгата капсульный полисахарид - белок-носитель. Свободный полисахарид может быть нековалентно ассоциирован с (то есть нековалентно связан с, адсорбирован или заключен в или с) конъюгатом полисахарид - белок-носитель.

Процент свободного полисахарида измеряют после конечной очистки конъюгата капсульный полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F - белок-носитель. Предпочтительно его измеряют в пределах 4 недель после конечной очистки. Его выражают как процент от общего полисахарида в образце.

При использовании в данном описании "конъюгировать", "конъюгированный" и "конъюгирующий" относится к процессу, посредством которого капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae ковалентно соединяется с белком-носителем.

Термин "субъект" относится к млекопитающему, в том числе к человеку, или к птице, рыбе, рептилии, амфибии или любому другому животному. Термин "субъект" дополнительно включает домашних животных или животных для исследования. Неограничивающие примеры домашних животных или животных для исследования включают: собак, кошек, свиней, кроликов, крыс, мышей, песчанок, хомяков, морских свинок, хорьков, обезьян, птиц, змей, ящериц, рыб, черепах и лягушек. Термин "субъект" также включает сельскохозяйственных животных. Неограничивающие примеры сельскохозяйственных животных включают: альпака, бизонов, верблюдов, крупный рогатый скот, оленей, свиней, лошадей, лам, мулов, ослов, овец, коз, кроликов, северных оленей, яков, кур, гусей и индюков.

При получении пневмококковых вакцин на основе мультивалентного конъюгата, направленных на предупреждение инвазивных заболеваний, вызванных организмом Streptococcus pneumoniae (также известного как пневмококк), выбранные серотипы Streptococcus pneumoniae выращивают, чтобы обеспечить полисахариды, необходимые для получения вакцины. Клетки выращивают в ферментаторах с лизисом, индуцированным в конце ферментации путем добавления дезоксихолата натрия или альтернативного лизирующего агента. Лизатный бульон затем собирают для последующей очистки и извлечения капсульного полисахарида, который окружает бактериальные клетки. После активации и конъюгирования с белком-носителем, полисахарид включают в конечный вакцинный продукт и обеспечивают иммунитет к выбранным серотипам Streptococcus pneumoniae в целевой для этой вакцины популяции.

Иммуногенность конъюгата полисахарид:белок-носитель зависит от нескольких факторов, в том числе от размера полисахарида. Размер полисахарида представляет собой характеристику качества, проанализированную для каждой партии препарата, и его следует надлежащим образом контролировать. Высокая молекулярная масса капсульных полисахаридов способна индуцировать иммунные ответы определенных антител из-за более высокой валентности эпитопов, присутствующих на антигенной поверхности. Как правило, предпочтительно предотвратить или ограничить нежелательное уменьшение размера полисахарида во время получения конъюгата для сохранения иммуногенности полисахарида. Кроме того, важно снизить вариабельность молекулярной массы полисахарида от партии к партии во время стадии активации и последующей конъюгирования для поддержания стабильности качественных характеристик конъюгата.

Химия восстановительного аминирования (RAC) была показана авторами изобретения как подходящий способ получения конъюгата белок-носитель - капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33F. RAC-подход включает активацию полисахарида путем окисления и последующую конъюгирование активированного полисахарида с белком-носителем путем восстановления. Полисахариды серотипа 10А, 33F и 22F оказались особенно чувствительными полисахаридами и подвержены разрушению и уменьшению размера во время стадии окисления при получении конъюгата. Кроме того, в результате применения известного до настоящего времени способа активации получают активированный полисахарид серотипа 10А, 33F и 22F с разными молекулярными массами.

Таким образом, существует значительная необходимость в способе получения активированных полисахаридов Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33F, имеющих контролируемую и стабильную молекулярную массу.

Объектом настоящего изобретения является способ получения активированных полисахаридов Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33. В частности, объектом изобретения является способ получения активированного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33F, включающий следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F с окислителем; и

(б) гашение реакции окисления путем добавления гасящего агента, приводящее к активированному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33F.

Выделение и очистка полисахарида серотипа 10А. 22F или 33F

Структуры полисахаридов серотипа 10А, 22F и 33F описаны в литературе (см, например, Kamerling JPC. Pneumococcal polysaccharides: a chemical view. In: Tomasz A, editor.Streptococcus pneumoniae, molecular biology and mechanisms of disease. New York, N.Y: Mary Ann Liebert, Inc.; 2000. pp. 81-114).

Как показано на Фиг. 1, повторяющаяся единица полисахарида серотипа 22F состоит из разветвленного пентасахаридного остова (одна глюкуроновая кислота (GlcpA), одна глюкопираноза (Glcp) и одна галактофураноза (Galf) и две рамнопиранозы (Rhap)) с участком αGlcp, соединенным с С3-гидроксильной группой βRhap 45. Примерно 80% С2-гидроксильных групп остатка βRhap в повторяющейся единице полисахарида О-ацетилированы.

Как показано на Фиг. 2, повторяющаяся единица полисахарида серотипа 10А состоит из двух D-галактофураноз, трех D-галактопираноз, одного N-ацетилгалактозамина и фосфатной связи, соединенной с сахаридной цепью через один D-рибитол.

Как показано на Фиг. 3, повторяющаяся единица полисахарида серотипа 33F состоит из трех D-галактопираноз, двух D-галактофураноз и одной D-глюкопиранозы. Следует отметить, что 5-D-галактофуранозильные остатки О-ацетилированы примерно в 90% повторяющихся единиц полисахарида 33F.

Капсульные полисахариды серотипа 10А, 22F и 33F могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методов выделения, известных специалистам в данной области техники (см., например, методы, описанные в публикациях патентных заявок США 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340 и 20080102498 или WO 2008118752). Кроме того, они могут быть получены с использованием протоколов синтеза.

Штаммы Streptococcus pneumoniae серотипа 10A, 22F и 33F, используемые для получения соответствующих полисахаридов, которые используются в иммуногенных конъюгатах по изобретению, могут быть получены из установленных коллекций культур или клинических образцов.

Очищенные полисахариды серотипа 10А, 22F и 33F получают с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Бактериальные клетки предпочтительно выращивают в среде на основе сои. После ферментации бактериальных клеток, которые продуцируют капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33F, бактериальные клетки лизируют с получением клеточного лизата. Бактериальные клетки можно лизировать с помощью любого лизирующего агента. "Лизирующий агент" представляет собой любой агент, который помогает разрушению клеточной оболочки и высвобождению аутолизина, который вызывает клеточный лизис, включающий, например, детергенты. При использовании в данном описании термин "детергент" относится к анионному или катионному детергенту, способному индуцировать лизис бактериальных клеток. Типичные примеры таких детергентов для применения в способах по настоящему изобретению включают дезоксихолат натрия (DOC), N-лауроилсаркозин, натриевую соль хенодезоксихолевой кислоты и сапонины.

В одном воплощении настоящего изобретения лизирующий агент, используемый для лизиса бактериальных клеток, представляет собой DOC. DOC представляет собой натриевую соль желчной дезоксихолевой кислоты, которую обычно получают из биологических источников, таких как коровы или волы. DOC активирует белок LytA, который представляет собой аутолизин, вовлеченный в рост клеточной стенки и деление в Streptococcus pneumoniae. Белок LytA имеет холинсвязывающие домены в своей С-концевой части и мутации гена lytA, как известно, продуцируют мутантов LytA, которые устойчивы к лизису, вызванному DOC.

В одном воплощении настоящего изобретения лизирующий агент, используемый для лизиса бактериальных клеток, представляет собой лизирующий агент неживотного происхождения. Лизирующие агенты неживотного происхождения для применения в способах по настоящему изобретению включают агенты из неживотных источников с механизмом действия, аналогичным DOC (то есть, которые влияют на функцию LytA и приводят к лизису клеток Streptococcus pneumoniae). Такие лизирующие агенты неживотного происхождения включают, без ограничения ими, аналоги DOC, поверхностно-активные вещества, детергенты и структурные аналоги холина. В одном воплощении лизирующий агент неживотного происхождения выбран из группы, состоящей из декансульфоновой кислоты, трет-октилфенокси-поли(оксиэтилен)этанолов (например Igepal® СА-630, CAS#: 9002-93-1, имеющиеся у Sigma Aldrich, St. Louis, МО), конденсатов октилфенол этиленоксида (например Triton® Х-100, имеющийся у Sigma Aldrich, St. Louis, МО), N-лауроилсаркозина натрия, лаурил-иминодипропионата, додецилсульфата натрия, хенодезоксихолата, гиодезоксихолата, гликодезоксихолата, тауродезоксихолата, таурохенодезоксихолата и холата. В другом воплощении лизирующий агент неживотного происхождения представляет собой N-лауроилсаркозин. В другом воплощении лизирующий агент представляет собой N-лауроилсаркозин натрия.

Капсульные полисахариды могут затем быть очищены из клеточного лизата с использованием методов очистки, известных в данной области техники, в том числе с использованием центрифугирования, глубинной фильтрации, осаждения, ультрафильтрации, обработки активированным углем, диафильтрации и/или хроматографии на колонке (см., например, публикации патентных заявок США 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340 и 20080102498 или WO 2008118752). Очищенные полисахариды серотипа 10А, 22F или 33F могут затем быть использованы для получения иммуногенных конъюгатов.

Предпочтительно, для того чтобы получить конъюгаты серотипа 22F или конъюгаты серотипа 33F с подходящими характеристиками фильтруемости и/или выходов, перед конъюгацией с белком-носителем выполняют доведение полисахаридов до диапазона более низкой молекулярной массы (MW). Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F или полисахарида серотипа 33F уменьшают при сохранении критических характеристик структуры полисахарида, таких как, например, присутствие О-ацетильных групп. Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F или полисахарида серотипа 33F уменьшают посредством механической гомогенизации.

В предпочтительном воплощении размер очищенного полисахарида уменьшают посредством гомогенизации под высоким давлением. При гомогенизации под высоким давлением достигаются высокие скорости сдвига посредством подачи технологического потока через проточный канал с достаточно малыми размерами. Скорость сдвига увеличивается посредством использования большего приложенного давления гомогенизации, и время экспозиции может быть увеличено путем рециркуляции потока вещества через гомогенизатор.

Способ гомогенизации под высоким давлением особенно подходит для уменьшения размера очищенного полисахарида серотипа 22F или полисахарида серотипа 33F при сохранении структурных характеристик полисахарида, таких как присутствие О-ацетильных групп.

Выделенный полисахарид серотипа 22F, полученный путем очистки капсульного полисахарида серотипа 22F из лизата Streptococcus pneumoniae и возможно доведения до нужного размера очищенного полисахарида, может быть охарактеризован разными параметрами, включая, например, молекулярную массу и мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении отделенный по размеру полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу в диапазоне от 400 до 700 кДа.

Выделенный полисахарид серотипа 33F, полученный путем очистки капсульного полисахарида из лизата Streptococcus pneumoniae серотипа 33F и возможно доведения до нужного размера очищенного полисахарида, может быть охарактеризован разными параметрами, включая, например, молекулярную массу и мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F.

Степень О-ацетилирования полисахарида может быть определена любым способом, известным в данной области техники, например посредством протонного ЯМР (Lemercinier and Jones (1996) Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones and Lemercinier (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247, WO 05/033148 или WO 00/56357). Другой обычно используемый метод описан в Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261. Предпочтительно, присутствие О-ацетильных групп определяют посредством анализа методом ионной HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии).

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 22F получен способом, включающим следующие стадии:

- получение ферментационной культуры бактериальных клеток Streptococcus pneumonia серотипа 22F;

- лизис бактериальных клеток в указанной ферментационной культуре; и

- очистка полисахарида серотипа 22F из ферментационной культуры.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 22F получен способом, включающим следующие стадии:

- получение ферментационной культуры бактериальных клеток Streptococcus pneumonia серотипа 22F;

- лизис бактериальных клеток в указанной ферментационной культуре;

- очистка полисахарида серотипа 22F из ферментационной культуры; и,

- доведение до нужного размера полисахарида серотипа 22F посредством механического доведения до нужного размера, предпочтительно посредством гомогенизации под высоким давлением.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 22F получен способом, включающим следующие стадии:

- получение ферментационной культуры бактериальных клеток Streptococcus pneumonia серотипа 22F;

- лизис бактериальных клеток в указанной ферментационной культуре;

- очистка полисахарида серотипа 22F из ферментационной культуры; и

- доведение до нужного размера полисахарида серотипа 22F посредством механического доведения до нужного размера, предпочтительно путем гомогенизации под высоким давлением,

где выделенный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу в диапазоне от 400 до 700 кДа.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 33F получен способом, включающим следующие стадии:

- получение ферментационной культуры бактериальных клеток Streptococcus pneumonia серотипа 33F;

- лизис бактериальных клеток в указанной ферментационной культуре; и

- очистка полисахарида серотипа 33F из ферментационной культуры.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 33F получен способом, включающим следующие стадии:

- получение ферментационной культуры бактериальных клеток Streptococcus pneumonia серотипа 33F;

- лизис бактериальных клеток в указанной ферментационной культуре;

- очистка полисахарида серотипа 33F из ферментационной культуры; и

- доведение до нужного размера полисахарида серотипа 33F посредством механического доведения до нужного размера, предпочтительно с помощью гомогенизации под высоким давлением.

Выделенный полисахарид серотипа 10А, полученный посредством очистки лизата капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 10А и возможно доведения до нужного размера очищенного полисахарида, может быть охарактеризован разными параметрами, включая, например, молекулярную массу. Предпочтительно, выделенный полисахарид серотипа 10A не доводят до нужного размера

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 10А получен способом, включающим следующие стадии:

- получение ферментационной культуры бактериальных клеток Streptococcus pneumonia серотипа 10А;

- лизис бактериальных клеток в указанной ферментационной культуре; и

- очистка полисахарида серотипа 10А из ферментационной культуры.

Активация полисахарида серотипа 10A, 22F или 33F

Выделенный полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F с окислителем; и

(б) гашение реакции окисления путем добавления гасящего агента, приводящее к активированному полисахариду Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33F.

В предпочтительном воплощении концентрация полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F на стадии (а) составляет от 0,1 до 10 мг/мл. В предпочтительном воплощении концентрация полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F на стадии (а) составляет от 0,5 до 5 мг/мл. В предпочтительном воплощении концентрация полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F на стадии (а) составляет от 1 до 3 мг/мл. В предпочтительном воплощении концентрация полисахарида серотипа 22F или 33F на стадии (а) составляет примерно 2 мг/мл. В предпочтительном воплощении концентрация полисахарида серотипа 10А на стадии (а) составляет примерно 2,5 мг/мл.

В предпочтительном воплощении окислитель представляет собой периодат. Периодат окисляет вицинальные гидроксильные группы с образованием карбонильных или альдегидных групп и вызывает расщепление связи С-С. Термин "периодат" включает как периодат, так и периодную кислоту. Этот термин также включает и метапериодат (IO₄^-), и ортопериодат (IO₆^5-). Термин "периодат" также включает различные периодатные соли, в том числе периодат натрия и периодат калия. В предпочтительном воплощении окислитель представляет собой периодат натрия. В предпочтительном воплощении периодат, используемый для окисления полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F, представляет собой метапериодат. В предпочтительном воплощении периодат, используемый для окисления полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F, представляет собой метапериодат натрия.

В предпочтительном воплощении полисахарид взаимодействует с 0,01-10, 0,05-5, 0,1-1, 0,5-1, 0,7-0,8, 0,01-0,2, 0,05-0,5, 0,05-0,2, 0,1-0,3 молярных эквивалентов окислителя. В предпочтительном воплощении полисахарид взаимодействует примерно с 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8. В предпочтительном воплощении полисахарид взаимодействует примерно с 0,10 молярного эквивалента окислителя. В предпочтительном воплощении полисахарид взаимодействует примерно с 0,15 молярного эквивалента окислителя. В предпочтительном воплощении полисахарид взаимодействует примерно с 0,25 молярного эквивалента окислителя. В предпочтительном воплощении полисахарид взаимодействует примерно с 0,5 молярного эквивалента окислителя. В предпочтительном воплощении полисахарид взаимодействует примерно с 0,8 молярного эквивалента окислителя.

В предпочтительном воплощении продолжительность реакции на стадии (а) составляет от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 10, от 10 до 50, от 10 до 40, от 10 до 30, от 10 до 20 часов. В предпочтительном воплощении, когда полисахарид представляет собой полисахарид серотипа 10А, продолжительность реакции на стадии (а) составляет от 1 до 10 часов. В предпочтительном воплощении, когда полисахарид представляет собой полисахарид серотипа 10А, продолжительность реакции на стадии (а) составляет примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 часов. В предпочтительном воплощении, когда полисахарид представляет собой полисахарид серотипа 10А, продолжительность реакции на стадии (а) составляет примерно 4 часа. В предпочтительном воплощении, когда полисахарид представляет собой полисахарид серотипа 22F, продолжительность реакции на стадии (а) составляет от 10 до 20 часов. В предпочтительном воплощении, когда полисахарид представляет собой полисахарид серотипа 22F, продолжительность реакции на стадии (а) составляет примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 часов. В предпочтительном воплощении, когда полисахарид представляет собой полисахарид серотипа 33F, продолжительность реакции на стадии (а) составляет от 15 до 25 часов. В предпочтительном воплощении, когда полисахарид представляет собой полисахарид серотипа 33F, продолжительность реакции на стадии (а) составляет примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 часов. В предпочтительном воплощении, когда полисахарид представляет собой полисахарид серотипа 33F, продолжительность реакции на стадии (а) составляет примерно 20 часов.

В предпочтительном воплощении температуру реакции на стадии (а) поддерживают от 1 до 30°С, от 1 до 10°С, от 10 до 20°С, от 20 до 30°С, от 2 до 8°С. В предпочтительном воплощении температуру реакции на стадии (а) поддерживают примерно при 5°С.

В предпочтительном воплощении стадию (а) проводят в буфере, выбранном из фосфата натрия, фосфата калия, 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) или Bis-Tris. В предпочтительном воплощении стадию (а) проводят в калий-фосфатном буфере. В предпочтительном воплощении стадию (а) проводят в натрий-фосфатном буфере.

В предпочтительном воплощении концентрация буфера составляет от 1 до 500 мМ, от 1 до 300 мМ, от 50 до 200 мМ. В предпочтительном воплощении концентрация буфера составляет примерно 100 мМ.

В предпочтительном воплощении значение рН на стадии (а) равно от 4 до 8, от 5 до 7, от 5,5 до 6,5. В предпочтительном воплощении значение рН на стадии (а) равно примерно 6. В предпочтительном воплощении значение рН на стадии (а) равно примерно 5,8.

В одном воплощении гасящий агент выбран из вицинальных диолов, 1,2-аминоспиртов, аминокислот, глутатиона, сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфорной кислоты.

В одном воплощении гасящий агент представляет собой 1,2-аминоспирты формулы

где R¹ выбран из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В одном воплощении гасящий агент выбран из натриевых и калиевых солей сульфита, бисульфита, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфорной кислоты.

В одном воплощении, гасящий агент представляет собой аминокислоту. В одном воплощении указанная аминокислота выбрана из серина, треонина, цистеина, цистина, метионина, пролина, гидроксипролина, триптофана, тирозина и гистидина.

В одном воплощении, гасящий агент представляет собой сульфит, такой как бисульфат, дитионит, метабисульфит, тиосульфат.

В одном воплощении, гасящий агент представляет собой соединение, содержащее две вицинальные гидроксильные группы (вицинальные диолы), то есть две гидроксильные группы, ковалентно связанные с двумя соседними атомами углерода.

Предпочтительно, гасящий агент представляет собой соединение формулы (II)

где каждый из R¹ и R² независимо выбран из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В предпочтительном воплощении гасящий агент представляет собой глицерин, этиленгликоль, пропан-1,2-диол, бутан-1,2-диол или бутан-2,3-диол, аскорбиновую кислоту. В предпочтительном воплощении гасящий агент представляет собой бутан-1,2-диол.

В предпочтительном воплощении окислитель нейтрализуют добавлением от 0,1 до 10, от 0,5 до 5, от 0,5 до 3, от 0,5 до 2 молярных эквивалентов гасящего агента. В предпочтительном воплощении окислитель нейтрализуют добавлением примерно 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 молярных эквивалентов гасящего агента. В предпочтительном воплощении окислитель нейтрализуют добавлением примерно 2 молярных эквивалентов гасящего агента.

В предпочтительном воплощении продолжительность стадии (б) составляет от 0,1 до 10, от 0,5 до 5 или от 0,5 до 2 часов. В предпочтительном воплощении продолжительность стадии (б) составляет примерно 0,5, 1, 1,5, 2,5 или 3 часа.

В предпочтительном воплощении температуру реакции на стадии (б) поддерживают от 1 до 30°С, от 1 до 25°С, от 1 до 20°С, от 1 до 10°С, от 10 до 20°С, от 2 до 8°С. В предпочтительном воплощении температуру реакции на стадии (б) поддерживают примерно при 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8°С.

В предпочтительном воплощении значение рН на стадии (б) составляет от 4 до 8, от 5 до 7, от 5,5 до 6,5. В предпочтительном воплощении рН на стадии (б) равно примерно 6.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F очищают. Активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F можно очищать способами, известными специалистам в данной области техники, такими как гель-проникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный полисахарид очищают путем концентрирования и диафильтрации с использованием устройства для ультрафильтрации.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 10А активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 10А с периодатом; и

(б) гашение реакции окисления путем добавления бутан-2,3-диола, приводящее к активированному полисахариду у серотипа 10А.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 10А активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 10А с периодатом при температуре от 2 до 8°С; и

(б) гашение реакции окисления путем добавления бутан-2,3-диола при температуре от 2 до 8°С, приводящее к активированному полисахариду серотипа 10А.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 10А активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 10А с 0,2-0,3 молярного эквивалента периодата при температуре от 2 до 8°С; и

(б) гашение реакции окисления путем добавления от 0,5 до 2 молярных эквивалентов бутан-2,3-диола при температуре от 2 до 8°С, приводящее к активированному полисахариду у серотипа 10А.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 22F активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 22F с периодатом; и

(б) гашение реакции окисления путем добавления бутан-2,3-диола, приводящее к активированному полисахариду серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 22F активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 22F с периодатом при температуре от 2 до 8°С; и

(б) гашение реакции окисления путем добавления бутан-2,3-диола при температуре от 2 до 8°С, приводящее к активированному полисахариду серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 22F активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 22F с 0,05-0,2 молярного эквивалента периодата при температуре от 2 до 8°С; и

(б) гашение реакции окисления путем добавления 2-3, предпочтительно 2 молярных эквивалентов бутан-2,3-диола при температуре от 2 до 8°С, приводящее к активированному полисахариду серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 33F активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 33F с периодатом; и,

(б) гашение реакции окисления путем добавления бутан-2,3-диола, приводящее к активированному полисахариду серотипа 33F.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 33F активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 33F с периодатом при температуре от 2 до 8°С; и,

(б) гашение реакции окисления путем добавления бутан-2,3-диола при температуре от 2 до 8°С, приводящее к активированному полисахариду серотипа 33F.

В предпочтительном воплощении выделенный полисахарид серотипа 33F активируют способом, включающим следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 33F с 0,05-0,2 молярного эквивалента периодата при температуре от 2 до 8°С; и

(б) гашение реакции окисления путем добавления 0,5-1,5 молярных эквивалентов бутан-2,3-диола при температуре от 2 до 8°С, приводящее к активированному полисахариду серотипа 33F.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к активированному капсульному полисахариду серотипа 10А, полученному или получаемому посредством вышеописанного способа.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к активированному капсульному полисахариду серотипа 22F, полученному или получаемому посредством вышеописанного способа.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к активированному капсульному полисахариду серотипа 33F, полученному или получаемому посредством вышеописанного способа.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, полученный на стадии (б), имеет молекулярную массу, составляющую от 20 до 100%, от 30 до 95%, от 40 до 95%, от 60 до 95%, от 85 до 95%, или примерно 90% молекулярной массы выделенного полисахарида, используемого на стадии (а).

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, полученный на стадии (б), имеет молекулярную массу, составляющую по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40 или 45% молекулярной массы выделенного полисахарида, используемого на стадии (а). В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, полученный на стадии (б), имеет молекулярную массу, составляющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99% молекулярной массы выделенного полисахарида, используемого на стадии (а).

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F, полученный на стадии (б), имеет молекулярную массу от 50 до 100%, от 60 до 95%, от 85 до 95%, или примерно 90% молекулярной массы выделенного полисахарида, используемого на стадии (а).

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F, полученный на стадии (б), имеет молекулярную массу, составляющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% молекулярной массы выделенного полисахарида, используемого на стадии (а).

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F, полученный на стадии (б), имеет молекулярную массу от 50 до 100%, от 60 до 95%, от 85 до 95%, или примерно 90% молекулярной массы выделенного полисахарида, используемого на стадии (а).

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F, полученный на стадии (б), имеет молекулярную массу, составляющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% молекулярной массы выделенного полисахарида, используемого на стадии (а).

В предпочтительном воплощении степень окисления активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F составляет от 2 до 30, от 2 до 25, от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 30, от 10 до 25, от 10 до 20, от 10 до 15, от 5 до 25, от 10 до 30, от 15 до 30, от 15 до 25, от 15 до 20, от 20 до 30, от 20 до 25. В предпочтительном воплощении степень окисления активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 14, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18, от 18 до 22, от 18 до 20.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 до 400, от 50 до 350, от 50 до 300, от 50 до 250, от 50 до 200, от 100 до 300, от 100 до 250 или от 100 до 200 кДа. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 до 300 кДа. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 до 200 кДа. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 до 200 кДа и степень окисления от 5 до 20, от 5 до 15, от 8 до 14, от 8 до 12 или от 9 до 11. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 до 200 кДа и степень окисления от 9 до 11.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 25 до 1000, от 100 до 1000, от 300 до 800, от 300 до 700, от 300 до 600, от 400 до 1000, от 400 до 800, от 400 до 700 или от 400 до 600 кДа. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 300 до 800 кДа. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 до 800 кДа. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 до 600 «Да. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 до 800 кДа и степень окисления от 10 до 25, от 10 до 20, от 12 до 20 или от 14 до 18. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 до 800 кДа и степень окисления от 10 до 20.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7 или примерно 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 до 800 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 до 800 кДа, степень окисления от 12 до 20 и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F имеет молекулярную массу от 50 до 1250, от 200 до 1200, от 500 до 1200, от 500 до 1000, от 700 до 1200, от 800 до 1200, от 800 до 1100, от 900 до 1200, от 800 до 1000 кДа. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F имеет молекулярную массу от 500 до 1000 кДа. В другом предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F имеет молекулярную массу от 50 до 600, от 50 до 500 или от 50 до 400 кДа.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 или примерно 0,9 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F содержит по меньшей мере 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F имеет молекулярную массу от 800 до 1200 кДа и содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F имеет молекулярную массу от 800 до 1200 кДа, содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F и имеет степень окисления от 10 до 20.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F имеет молекулярную массу от 50 до 200 кДа и содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 33F имеет молекулярную массу от 50 до 200 кДа и содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F и имеет степень окисления от 10 до 20.

В одном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F лиофилизируют, возможно в присутствии криопротектора/лиопротектора. В предпочтительном воплощении криопротектор/лиопротектор выбран из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелезитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном воплощении криопротектор/лиопротектор представляет собой сахарозу. Лиофилизированный активированный полисахарид затем может быть смешан с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F смешивают с белком-носителем и лиофилизируют, возможно в присутствии криопротектора/лиопротектора. В предпочтительном воплощении криопротектор/лиопротектор выбран из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелезитозу, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном воплощении криопротектор/лиопротектор представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированные полисахарид и белок-носитель затем могут быть ресуспендированы в растворе и взаимодействовать с восстановителем.

В одном воплощении изобретение относится к лиофилизированному активированному полисахариду серотипа 10А. В одном воплощении изобретение относится к лиофилизированному активированному полисахариду серотипа 22F. В одном воплощении изобретение относится к лиофилизированному активированному полисахариду серотипа 33F.

В одном воплощении изобретение относится к совместно лиофилизированному активированному полисахариду серотипа 10А и белку-носителю. В предпочтительном воплощении белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном воплощении изобретение относится к совместно лиофилизированному активированному полисахариду серотипа 22F и белку-носителю. В предпочтительном воплощении белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном воплощении изобретение относится к совместно лиофилизированному активированному полисахариду серотипа 33F и белку-носителю. В предпочтительном воплощении белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Конъюгирование активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F с белком-носителем

Активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F, раскрытый в данном описании изобретения, может быть конъюгирован с белком-носителем способом, включающим следующие стадии:

(а) смешивание активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F с белком-носителем; и

(б) взаимодействие смеси активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F и белка-носителя с восстановителем с образованием конъюгата полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F:белок-носитель.

Конъюгирование активированного полисахарида серотипа 22F или 33F с белком-носителем посредством восстановительного аминирования в диметилсульфоксиде (DMSO) пригодно для сохранения содержания О-ацетила полисахарида по сравнению, например, с восстановительным аминированием в водной фазе, где уровень О-ацетилирования полисахарида значительно снижается. В предпочтительном воплощении стадию (а) и стадию (б) выполняют в DMSO.

В предпочтительном воплощении стадия (а) включает растворение лиофилизированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F в водном растворе, содержащем белок-носитель, или в растворе, содержащем белок-носитель и DMSO. В предпочтительном воплощении стадия (а) включает растворение совместно лиофилизированных полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F и белка-носителя в водном растворе или в DMSO.

Когда стадию (а) и (б) выполняют в водном растворе, указанный раствор содержит буфер, предпочтительно выбранный из буфера, предпочтительно выбранный из PBS (фосфатно-солевого буфера), MES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота), HEPES (2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-этансульфоновая кислота), Bis-tris, ADA (N-(2-ацетамидо)иминодиуксусная кислота), PIPES (1,4-пиперазиндиэтансульфоновая кислота), MOPSO (3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновая кислота), BES (N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), DIPSO (3-(N,N-бис[2-гидроксиэтил]амино)-2-гидроксипропансульфоновая кислота), MOBS (4-(N-морфолино)бутансульфоновая кислота), HEPPSO (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), POPSO (пиперазин-N,N'-бис(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), TEA (триэтиламин), EPPS (4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинпропансульфоновая кислота), Бицин или НЕРВ (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(4-бутансульфоновая кислота)), при рН от 6,0 до 8,5, от 7 до 8, или от 7 до 7,5. В предпочтительном воплощении буфер представляет собой PBS. В предпочтительном воплощении значение рН составляет примерно 7,3.

В предпочтительном воплощении концентрация активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F на стадии (а) составляет от 0,1 до 10 мг/мл, от 0,5 до 5 мг/мл, от 0,5 до 2 мг/мл. В предпочтительном воплощении концентрация активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F на стадии (а) составляет примерно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3 мг/мл.

В предпочтительном воплощении исходное соотношение (масса/масса) активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F к белку-носителю составляет от 5:1 до 0,1:1, от 2:1 до 0,1:1, от 2:1 до 1:1, от 1,5:1 до 1:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,3:1 до 1:1, от 0,6:1 до 1:1,2. В предпочтительном воплощении исходное соотношение активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F к белку-носителю составляет примерно от 0,6:1 до 1:1,2. В предпочтительном воплощении исходное соотношение активированного полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F к белку-носителю составляет примерно 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1, 2:1.

В предпочтительном воплощении на стадии (б), активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F взаимодействует с 0,1-10 молярными эквивалентами, 0,5-5 молярными эквивалентами, 0,5-2,5 молярными эквивалентами восстанавливающего агента. В предпочтительном воплощении, на стадии (б) активированный полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F взаимодействует примерно с 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 или 2,5 молярными эквивалентами восстанавливающего агента.

В одном воплощении восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия, триацетоксиборгидрид натрия, боргидрид натрия или цинка в присутствии кислоты Брэнстеда или Льюиса, аминобораны, такие как пиридинборан, 2-пиколинборан, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, трет-BuMeⁱPrN-ВН₃, бензиламин-ВН₃ или 5-этил-2-метилпиридинборан (РЕМВ). В предпочтительном воплощении восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия.

В предпочтительном воплощении продолжительность стадии (б) составляет от 1 до 50, от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 5 до 25, 10 до 25, 15 до 25 часов. В предпочтительном воплощении продолжительность стадии (б) составляет примерно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 часов.

В предпочтительном воплощении на стадии (б) поддерживают температуру реакции от 10 до 40°С, от 15 до 30°С, от 20 до 26°С, от 21 до 25°С. В предпочтительном воплощении на стадии (б) температуру реакции поддерживают примерно при 21, 22, 23, 24 или 25°С.

В предпочтительном воплощении способ получения иммуногенного конъюгата, содержащего полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F, ковалентно связанный с белком-носителем, дополнительно включает стадию (стадия в) блокирования непрореагировавшего альдегида (гашение) посредством добавления NaBH₄.

В предпочтительном воплощении на стадии (в) непрореагировавшие альдегиды блокировали добавлением от 0,1 до 10 молярных эквивалентов, от 0,5 до 5 молярных эквивалентов или от 1 до 3 молярных эквивалентов NaBH₄. В предпочтительном воплощении на стадии (в) непрореагировавшие альдегиды блокировали добавлением примерно 2 молярных эквивалентов NaBH₄.

В предпочтительном воплощении продолжительность стадии (в) составляет от 0,1 до 10, от 0,5 до 5 или от 2 до 4 часов. В предпочтительном воплощении продолжительность стадии (в) составляет примерно 3 часа.

В предпочтительном воплощении температуру реакции на стадии (в) поддерживают от 10 до 40°С, от 15 до 30°С или от 20 до 26°С. В предпочтительном воплощении температуру реакции на стадии (в) поддерживают примерно при 23°С.

После конъюгирования полисахарида серотипа 10А, 22F, 33F с белком-носителем, конъюгат полисахарид-белок-носитель может быть очищен (обогащен в отношении количества конъюгата полисахарид-белок-носитель) посредством различных методов, известных специалисту. Эти методы включают диализ, процедуры концентрирования/диафильтрации, осаждение при фильтрации тангенциальным потоком/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE ((диэтиламиноэтил)-декстран) или гидрофобная хроматография) и глубинную фильтрацию.

В предпочтительном воплощении белок-носитель является нетоксичным и нереактогенным и может быть получен в достаточном количестве и с достаточной чистотой. Белки-носители должны поддаваться стандартным процедурам конъюгирования.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F конъюгирован с белком-носителем, который выбран из группы, состоящей из: DT (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин) или фрагмента С из ТТ, CRM197 (нетоксичный, но антигенно идентичный вариант дифтерийного токсина) другие точечные мутанты DT, такие как CRM 176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 102, CRM 103 и CRM 107 и другие мутации, описанные Nicholls and Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делеция или мутация по типу замены Glu-148 на Asp, Gln или Ser, и/или Ala 158 на Gly, и другие мутации, описанные в US 4709017 или US 4950740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534, и другие мутации, описанные в US 5917017 или US 6455673; или фрагмент, описанный в US 5843711, пневмококковый пневмолизин (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), включая детоксифицированный в некоторой степени ply (пневмолизин), например dPLY-GMBS (WO 04081515, РСТ/ЕР 2005/010258) или dPLY-формол, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (последовательности PhtA, PhtB, PhtD или PhtE описаны в WO 00/37105 или WO 00/39299) и слияния белков Pht, например слияния PhtDE, слияния PhtBE, Pht А-Е (WO 01/98334, WO 03/54007, WO 2009/000826), OMPC (менингококковый белок наружной мембраны - обычно извлекается из N. meningitidis серогруппы В – ЕР 0372501), PorB (из N. meningitidis), PD (белок D Haemophilus influenza - см., например, ЕР 0594610 В) или их иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), белки коклюша (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста и гормоны (WO 1091/01146), искусственные белки, содержащие множественные эпитопы CD4+ Т-клеток человека из различных антигенов, полученных из патогенов (Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824), такие как белок N19 (Baraldoi et al. (2004) Infect Immun 72; 4884-7) пневмококковый поверхностный белок PspA (WO 02/091998), белки захвата железа (WO 01/72337), токсин А или В С. difficile (WO 00/61761). В одном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F конъюгирован с DT (дифтерийный анатоксин). В другом воплощении, активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F конъюгирован с ТТ (столбнячный анатоксин). В другом воплощении, активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F конъюгирован с фрагментом С из ТТ. В другом воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F конъюгирован с PD (белок D Haemophilus influenza - см., например, ЕР 0594610 В).

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F, 33F конъюгирован с белком CRM₁₉₇. Белок CRM₁₉₇ представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но иммунологически неотличим от дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ производится дифтерийной палочкой, инфицированной нетоксигенным фагом β197^tox-, созданным посредством нитрозогуанидинового мутагенеза токсикогенного коринофага-бета (Uchida, Т. et al. 1971, Nature New Biology 233:8-11). CRM₁₉₇ очищали посредством ультрафильтрации, осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. Белок CRM₁₉₇ имеет такую же молекулярную массу как дифтерийный токсин, но отличается от него изменением одного основания (гуанин на аденин) в структурном гене. Это единственное изменение основания вызывает замену аминокислоты тутами новая кислота на глицин в зрелом белке и устраняет токсические свойства дифтерийного токсина. Белок CRM₁₉₇ является безопасным и эффективным Т-клеточно-зависимым носителем сахаридов. Более подробную информацию о CMR₁₉₇ и его получении можно найти, например, в US 5614382.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F, раскрытый в данном описании изобретения, конъюгирован с CRM₁₉₇ способом, включающим следующие стадии:

(а) смешивание активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F с CRM₁₉₇;

(б) взаимодействие смеси активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F и CRM₁₉₇ с цианоборгидридом натрия с образованием конъюгата полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F:CRM₁₉₇.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F, раскрытый в данном описании изобретения, конъюгирован с CRM₁₉₇ способом, включающим следующие стадии:

(а) смешивание активированного полисахарида серотипа 10A, 22F или 33F с CRM₁₉₇;

(б) взаимодействие смеси активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F и CRM₁₉₇ с цианоборгидридом натрия с образованием конъюгата полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F: CRM₁₉₇;

где стадии (а) и (б) выполняют в DMSO.

В предпочтительном воплощении активированный полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F, раскрытый в данном описании изобретения, конъюгирован с CRM₁₉₇ способом, включающим следующие стадии:

(а) смешивание активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F с CRM₁₉₇;

(б) взаимодействие смеси активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F и CRM₁₉₇ с 0,5-2 молярными эквивалентами цианоборгидрида натрия с образованием конъюгата полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F: CRM₁₉₇;

где стадии (а) и (б) выполняют в DMSO.

В одном воплощении изобретение относится к иммуногенному конъюгату, полученному или получаемому способом, раскрытым в данном описании изобретения. В предпочтительном воплощении изобретение относится к иммуногенному конъюгату, полученному или получаемому посредством конъюгирования активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F, раскрытого в данном описании изобретения, с белком-носителем посредством восстановительного аминирования. В предпочтительном воплощении изобретение относится к иммуногенному конъюгату, полученному или получаемому посредством конъюгирования активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F, раскрытого в данном описании изобретения, с белком-носителем посредством восстановительного аминирования в DMSO. В предпочтительном воплощении белок-носитель представляет собой CRM CRM₁₉₇.

Иммуногенный конъюгат серотипа 10А

В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 500 до 15000; от 500 до 10000; от 2000 до 10000; или от 3000 до 8000 кДа. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 3000 and 8000 кДа. Молекулярную массу иммуногенного конъюгата определяют посредством SEC-MALLS.

В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 10А содержит менее чем примерно 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 или 15% свободного полисахарида серотипа 10А по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 10А. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 10А содержит менее чем примерно 25% свободного полисахарида серотипа 10А по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 10А. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 10А содержит менее чем примерно 20% свободного полисахарида серотипа 10А по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 10А. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 10А содержит менее чем примерно 15% свободного полисахарида серотипа 10А по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 10А.

В предпочтительном воплощении соотношение (масса/масса) полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 3. В предпочтительном воплощении соотношение полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 2, от 0,5 до 1,5, от 0,5 до 1, от 1 до 1,5, от 1 до 2. В предпочтительном воплощении соотношение полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,8 до 1,4. В предпочтительном воплощении соотношение капсульного полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,8 до 1,2.

Среду гель-фильтрационной хроматографии (CL-4B) можно использовать для определения относительного распределения размера молекул конъюгата. Для гель-фильтрационной хроматографии (SEC) используют колонки с подачей самотеком для построения профиля распределения размера молекул конъюгатов. Большие молекулы, вытесненные из пор в среду, элюируются быстрее, чем небольшие молекулы. Коллекторы фракций используют для сбора элюата с колонки. Фракции тестируют колориметрически посредством анализа сахаридов. Для определения Kd, колонки калибруют, чтобы установить фракцию, в которой молекулы полностью вытеснены (V₀), (Kd=0) и фракцию, представляющую максимальное удерживание (V_i), (Kd=1). Фракция, в которой достигается определенное свойство образца (V_e), соотносят с Kd посредством выражения Kd=(V_e-V₀)/ (V_i-V₀).

В предпочтительном воплощении по меньшей мере 30% иммуногенного конъюгата серотипа 10А имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 40% иммуногенного конъюгата имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% иммуногенного конъюгата серотипа 10А имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 60% иммуногенного конъюгата серотипа 10А имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении от 50% до 80% иммуногенного конъюгата серотипа 10А имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B.

Степень конъюгирования определяется количеством остатков лизина в белке-носителе, который конъюгирован с представляющим интерес полисахаридом. Доказательство модификации лизина в белке-носителе в результате ковалентных связей с полисахаридами получают посредством аминокислотного анализа с использованием стандартных способов, известных специалистам в данной области техники. Конъюгирование приводит к уменьшению количества восстановленных остатков лизина по сравнению с белком CRM₁₉₇ исходного вещества, используемого для получения конъюгированных веществ.

В предпочтительном воплощении степень конъюгирования иммуногенного конъюгата составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В предпочтительном воплощении степень конъюгирования иммуногенного конъюгата составляет от 6 до 8.

Иммуногенный конъюгат серотипа 22F

В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7, или примерно 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 до 15000; от 500 до 10000; от 2000 до 10000 кДа; от 3000 до 8000 кДа; или от 3000 до 5000 кДа. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 3000 до 5000 кДа. Молекулярную массу иммуногенного конъюгата измеряют посредством SEC-MALLS (гель-хроматография с детекцией многоуглового лазерного рассеивания).

В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 22F содержит менее чем примерно 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 или 15% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 22F содержит менее чем примерно 40% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 22F содержит менее чем примерно 25% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 22F содержит менее чем примерно 20% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 22F содержит менее чем примерно 15% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении соотношение (масса/масса) полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 3. В предпочтительном воплощении соотношение полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 2, от 0,5 до 1,5, от 0,8 до 1,2, от 0,5 до 1, от 1 до 1,5 или от 1 до 2. В предпочтительном воплощении соотношение полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,8 до 1,2. В предпочтительном воплощении соотношение капсульного полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,9 до 1,1.

В предпочтительном воплощении по меньшей мере 30% иммуногенного конъюгата серотипа 22F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 40% иммуногенного конъюгата имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% иммуногенного конъюгата серотипа 22F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 60% иммуногенного конъюгата серотипа 22F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении от 50% до 80% иммуногенного конъюгата серотипа 22F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении от 65% до 80% иммуногенного конъюгата серотипа 22F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B.

В предпочтительном воплощении степень конъюгирования иммуногенного конъюгата составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 4 до 7, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В предпочтительном воплощении степень конъюгирования иммуногенного конъюгата составляет от 4 до 7.

Иммуногенный конъюгат серотипа 33F

В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7 или примерно 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F.

В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в иммуногенном конъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 3F имеет молекулярную массу от 500 до 30000; 500 до 25000; 500 до 20000; 500 до 15000; 500 до 10000; 1000 до 10000; 1000 до 8000; 1000 до 5000; 2000 до 10000 кДа; 2000 до 8000; или 2000 до 5000 кДа. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 3F имеет молекулярную массу от 1000 до 5000 кДа. Молекулярную массу иммуногенного конъюгата определяют посредством SEC-MALLS.

В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 3F содержит менее чем примерно 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 или 15% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 3F содержит менее чем примерно 25% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 3F содержит менее чем примерно 20% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении иммуногенный конъюгат серотипа 3F содержит менее чем примерно 15% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F.

В предпочтительном воплощении соотношение (масса/масса) полисахарида серотипа 33F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,4 до 3. В предпочтительном воплощении соотношение полисахарида серотипа 33F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 2, от 0,5 до 1,5, от 0,5 до 1, от 1 до 1,5, от 1 до 2. В предпочтительном воплощении соотношение полисахарида серотипа 33F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 1,5. В предпочтительном воплощении соотношение капсульного полисахарида серотипа 33F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 1,2.

В предпочтительном воплощении по меньшей мере 30% иммуногенного конъюгата серотипа 3F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 40% иммуногенного конъюгата имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65% иммуногенного конъюгата серотипа 3F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении по меньшей мере 60% иммуногенного конъюгата серотипа 3F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении от 40% до 80% иммуногенного конъюгата серотипа 3F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении от 45% до 65% иммуногенного конъюгата серотипа 3F имеет значение Kd, которое ниже или равно 0,3 на колонке CL-4B.

В предпочтительном воплощении степень конъюгирования иммуногенного конъюгата составляет от 1 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В предпочтительном воплощении степень конъюгирования иммуногенного конъюгата составляет от 3 до 6.

Иммуногенная композиция

Термин "иммуногенная композиция" относится к любой фармацевтической композиции, содержащий антиген, например микроорганизм или его компонент, где указанная композиция может быть использована, чтобы вызвать иммунный ответ у субъекта.

При использовании в данном описании "иммуногенный" означает способность антигена (или эпитопа антигена), такого как бактериальный капсульный полисахарид, или гликоконъюгат, или иммуногенная композиция, содержащая антиген, вызывать иммунный ответ у хозяина, такого как млекопитающее, опосредованный либо гуморально, либо клеточно, либо обоими способами.

В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция содержит конъюгат серотипа 10А, 22F или 33F, полученный способом, раскрытым в данном описании изобретения. В предпочтительном воплощении иммуногенную композицию, содержащую конъюгат серотипа 10А, 22F или 33F, получают способом, раскрытым в данном описании изобретения.

В одном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, при введении субъекту индуцирует образование антител, способных связываться с Streptococcus pneumonia серотипа 10А. В одном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, при введении субъекту индуцирует образование антител, способных связываться с Streptococcus pneumonia серотипа 10А, как измерено с помощью стандартного анализа ELISA.

В одном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, при введении субъекту, индуцирует образование антител, способных уничтожать Streptococcus pneumonia серотипа 10А в опсоно-фагоцитарном анализе, раскрытом в данном описании изобретения.

В одном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, при введении субъекту индуцирует образование антител, способных связываться с Streptococcus pneumonia серотипа 22F. В одном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, при введении субъекту индуцирует образование антител, способных связываться с Streptococcus pneumonia серотипа 22F, как измерено с помощью стандартного анализа ELISA.

В одном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, при введении субъекту индуцирует образование антител, способных уничтожать Streptococcus pneumonia серотипа 22F в опсоно-фагоцитарном анализе, раскрытом в данном описании изобретения.

В одном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, при введении субъекту индуцирует образование антител, способных связываться с Streptococcus pneumonia серотипа 33F. В одном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, при введении субъекту индуцирует образование антител, способных связываться с Streptococcus pneumonia серотипа 33F, как измерено с помощью стандартного анализа ELISA.

В одном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, при введении субъекту индуцирует образование антител, способных уничтожать Streptococcus pneumonia серотипа 33F в опсоно-фагоцитарном анализе, раскрытом в данном описании изобретения.

Образование иммуногенной композиции по настоящему изобретению может быть осуществлено с использованием известных в данной области методов. Например, конъюгаты серотипа 10А, 22F или 33F могут быть приготовлены с физиологически приемлемым носителем с получением композиции. Примеры таких носителей включают, без ограничения ими, воду, буферный солевой раствор, многоатомные спирты (например глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы.

В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция может содержать по меньшей мере один дополнительный антиген. В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция может содержать по меньшей мере один дополнительный капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae.

В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция может содержать по меньшей мере один дополнительный капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae, конъюгированный с белком-носителем. В предпочтительном воплощении указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит один или более адъювантов. Как определено в настоящем описании, "адъювант" представляет собой вещество, которое служит для увеличения иммуногенности иммуногенной композиции по изобретению. Таким образом, адъюванты способствуют повышению иммунного ответа и хорошо известны специалистам в данной области. Подходящие адъюванты для повышения эффективности композиции включают, без ограничения ими:

(1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.п.;

(2) композиции эмульсии масло в воде (с другими специфическими иммуностимулирующими агентами, такими как мурамилпептиды (определенные ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки, или без них), такие как, например,

(а) MF59 (РСТ публикация WO 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5%5 Tween 80 и 0,5% Span 85 (возможно содержащий различные количества МТР-РЕ (см. ниже, хотя не обязательно)), приготовленный в виде субмикронных частиц с использованием микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор Модель 11OY (Microfluidics, Newton, MA),

(б) SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% Tween 80, 5% плюроник-блокированного полимера L121 и thr-MDP (см. ниже), либо микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный с образованием эмульсии с частицами большего размера, и

(в) Ribi™ адъювантная система (RAS), (Corixa, Hamilton, МТ), содержащая 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или более компонентов клеточной стенки бактерий из группы, состоящей из 3-О-дезацилированного монофосфориллипида A (MPL™), описанный в патенте US 4912094 (Corixa), трегалозы димиколата (TDM) и остова клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detox™);

(3) могут быть использованы адъюванты-сапонины, такие как Quil А или STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (патент US 5057540), или частицы, образованные из них, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы);

(4) бактериальные липополисахариды, синтетические аналоги липида А, такие как аминоалкил-глюкозамин-фосфатные соединения (AGP) или их производные или аналоги, которые имеются в Corixa, и которые описаны в патенте US 6113918; одно из таких AGP представляет собой 2-[(R)-3-тетрадеканоилоксотетрадеканоиламино]этил 2-Дезокси-4-офосфоно-3-O-[(R)-3-тетрадеканоилоксотетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилоксотетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид. который также известен как 529 (ранее известный как RC529), который приготовлен в виде водной формы или в виде стабильной эмульсии, синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие CpG-мотив(ы) (патент US 6207646);

(5) цитокины, такие как интерлейкины (например IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и т.д.), интерфероны (например гамма-интерферон), гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухоли (TNF), костимуляторные молекулы 87-1 и 87-2, и т.д.;

(6) детоксифицированные мутанты бактериального АДФ-рибозилирующего токсина, такие как холерный токсин (СТ), либо дикого типа, либо в мутантной форме, например, где глутаминовая кислота в аминокислотном положении 29 заменена другой аминокислотой, предпочтительно гистидином, в соответствии с международной заявкой на патент, опубликованной как международная публикация WO 00/18434 (см. также WO 02/098368 и WO 02/098369), коклюшный токсин (РТ) или термолабильный токсин Е. coli (LT), в частности LT-K63, LT-R72, CT-S109, РТ-K9/G129 (см., например, WO 93/13302 и WO 92/19265); и

(7) другие вещества, которые действуют в качестве иммуностимулирующих агентов для повышения эффективности композиции.

Мурамил-пептиды включают, без ограничения ими, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-L-нормурамил-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ) и т.д.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в данном описании изобретения, содержат CpG-олигонуклеотид в качестве адъюванта. CpG-олигонуклеотид, при использовании в данном описании, относится к иммуностимулирующему CpG-олигодезоксинуклеотиду (CpG-ODN) и соответственно, эти термины используются взаимозаменяемо, если не указано иное. Иммуностимулирующие CpG-олигодезоксинуклеотиды содержат один или более иммуностимулирующих CpG-мотивов, которые являются неметилированными цитозин-гуанин динуклеотидами, возможно в окружении определенных предпочтительных оснований. Статус метилирования иммуностимулирующего CpG-мотива обычно относится к остатку цитозина в динуклеотиде. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один неметилированным CpG-динуклеотид, представляет собой олигонуклеотид, который содержит 5'-неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с 3'-гуанином, и который активирует иммунную систему посредством связывания с Toll-подобным рецептором 9 (TLR-9). В другом воплощении иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать один или более метилированных CpG-динуклеотидов, которые активируют иммунную систему посредством TLR9, но не так сильно, как если бы CpG-мотив(ы) был/были неметилированы. Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут содержать один или более палиндромов, которые в свою очередь могут окружать CpG-динуклеотид. CpG-олигонуклеотиды были описаны в ряде выданных патентов, опубликованных патентных заявок и других публикаций, включая патенты US 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; и 6339068.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в данном описании изобретения, содержат любой CpG-олигонуклеотид, описанный на с. 3 (строка 22) - с. 12 (строка 36) в WO 2010/125480.

Были идентифицированы разные классы иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов. Они упоминаются как А, В, С и Р класс и описаны более подробно на с. 3 (строка 22) - с. 12 (строка 36) в WO 2010/125480. Способы по изобретению охватывают использование таких разных классов иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в данном описании изобретения, содержат CpG-олигонуклеотид класса А. Предпочтительно, CpG-олигонуклеотид "класса А" по изобретению имеет следующую нуклеиновокислотную последовательность: 5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 1). Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов А-класса включают: 5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3' (SEQ ID NO: 2); где * относится к фосфоротиоатной связи и _ относится к фосфодиэфирной связи.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в данном описании изобретения, содержат CpG-олигонуклеотид класса В. В одном воплощении CpG-олигонуклеотид для применения в настоящем изобретении представляет собой CpG-олигонуклеотид класса В, представленный по меньшей мере формулой:

5' X₁X₂CGX₃X₄ 3', где X₁, Х₂, Х₃, и Х₄ представляют собой нуклеотиды. В одном воплощении Х₂ представляет собой аденин, гуанин или тимин. В другом воплощении, Х₃ представляет собой цитозин, аденин или тимин.

Последовательности CpG-олигонуклеотидов класса В по изобретению являются такими, которые подробно описаны выше в патентах US 6194388, 6207646, 6214806, 6218371, 6239116 и 6339068. Типичные последовательности включают последовательности, описанные в этих последних заявках и патентах, но не ограничиваются ими.

В одном воплощении CpG-олигонуклеотид "класса В" по изобретению имеет следующую нуклеиновокислотную последовательность:

или

или

или

или

В любой из этих последовательностей все связи могут быть фосфоротиоатными связями. В другом воплощении в любой из этих последовательностей одна или более связей может быть фосфодиэфирной, предпочтительно между "С" и "G" CpG-мотива, делая CpG-олигонуклеотид полугибким. В любой из этих последовательностей этил-уридин или галоген может заменить 5'-Т; примеры замен галогенами включают, без ограничения ими, замены бром-уридином или йод-уридином.

Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов В-класса включают:

или

или

или

или

где * относится к фосфоротиоатной связи.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в данном описании изобретения, содержат CpG-олигонуклеотид класса С. В одном воплощении CpG-олигонуклеотиды "класса С" по изобретению имеют следующие нуклеиновокислотные последовательности:

или

или

или

или

или

или

или

или

или

или

или

или

В любой из этих последовательностей все связи могут быть фосфоротиоатными связями. В другом воплощении в любой из этих последовательностей одна или более связей может быть фосфодиэфирной, предпочтительно между "С" и "G" CpG-мотива, делая CpG-олигонуклеотид полугибким.

Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов С-класса включают:

или

или

или

или

или

или

или

или

или или

или

или

где * относится к фосфоротиоатной связи и _ относится к фосфодиэфирной связи.

В любой из этих последовательностей этил-уридин или галоген может заменить 5' Т; примеры замен галогенами включают, без ограничения ими, замены бром-уридином или йод-уридином.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в данном описании изобретения, содержат CpG-олигонуклеотид класса Р. В одном воплощении CpG-олигонуклеотид для применения в настоящем изобретении представляет собой CpG-олигонуклеотид класса Р, содержащий домен активации 5'-TLR и по меньшей мере две палиндромные области, одну палиндромную область, являющуюся 5'-палиндромной областью длиной по меньшей мере 6 нуклеотидов и соединенную с 3'-палиндромной областью длиной по меньшей мере 8 нуклеотидов либо непосредственно, либо с помощью спейсера, где олигонуклеотид включает по меньшей мере один динуклеотид YpR. В одном воплощении указанный олигонуклеотид не является В одном воплощении CpG-олигонуклеотид класса Р включает по меньшей мере один неметилированный CpG-динуклеотид. В другом воплощении домен активации TLR представляет собой TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT или мм. В еще одном воплощении домен активации TLR находится в пределах 5'-палиндромной области. В другом воплощении домен активации TLR расположен непосредственно в направлении 5' к 5'-палиндромной области.

В одном воплощении CpG-олигонуклеотиды "класса Р" по изобретению имеют следующую нуклеиновокислотную последовательность:

В указанных последовательностях все связи могут быть фосфоротиоатными связями. В другом воплощении в любой из этих последовательностей одна или более связей может быть фосфодиэфирной, предпочтительно между "С" и "G" CpG-мотива, делая CpG-олигонуклеотид полугибким. В любой из этих последовательностей этил-уридин или галоген может заменить 5' Т; примеры замен галогенами включают, без ограничения ими, замены бром-уридином или йод-уридином.

Неограничивающий пример олигонуклеотидов Р-класса включает: где * относится к фосфоротиоатной связи и _ относится к фосфодиэфирной связи.

В одном воплощении олигонуклеотид включает по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь. В другом воплощении все межнуклеотидные связи олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи. В другом воплощении олигонуклеотид включает по меньшей мере одну связь, подобную фосфодиэфирной. В другом воплощении связь, подобная фосфодиэфирной, представляет собой фосфодиэфирную связь. В другом воплощении липофильная группа конъюгирована с олигонуклеотидом. В одном воплощении липофильная группа представляют собой холестерин.

В одном воплощении все межнуклеотидные связи CpG-олигонуклеотидов, раскрытых в данном описании изобретения, представляют собой фосфодиэфирные связи ("гибкие" олигонуклеотиды, описанные в РСТ заявке WO 2007/026190). В другом воплощении CpG-олигонуклеотиды по изобретению становятся устойчивыми к деградации (например стабилизированы). "Стабилизированный олигонуклеотид" относится к олигонуклеотиду, который относительно устойчив к деградации in vivo (например с помощью экзо- или эндонуклеазы). Стабилизация нуклеиновой кислоты может быть осуществлена посредством модификации остова. Олигонуклеотиды, имеющие фосфоротиоатные связи, обеспечивают максимальную активность и защищают олигонуклеотид от деградации внутриклеточными экзо- и эндонуклеазами.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут иметь химерный остов, который содержит комбинации фосфодиэфирных и фосфоротиоатных связей. В контексте настоящего изобретения химерный остов относится к частично стабилизированному остову, где по меньшей мере одна межнуклеотидная связь представляет собой фосфодиэфирную связь или связь, подобную фосфодиэфирной, и где по меньшей мере одна другая межнуклеотидная связь представляет собой стабилизированную межнуклеотидную связь, где по меньшей мере одна фосфодиэфирная или подобная фосфодиэфирной связь и по меньшей мере одна стабилизированная связь являются различными. Когда фосфодиэфирная связь преимущественно расположена в пределах мотива CpG, тогда такие молекулы называются "полугибкими", как описано в заявке РСТ WO 2007/026190.

Размер CpG-олигонуклеотида (т.е. число нуклеотидных остатков по всей длине олигонуклеотида) также может вносить свой вклад в стимулирующую активность олигонуклеотида. Для облегчения захвата клетками, CpG-олигонуклеотид по изобретению предпочтительно имеет минимальную длину 6 нуклеотидных остатков. Олигонуклеотиды любого размера более 6 нуклеотидов (даже длиной много т.н.) способны индуцировать иммунный ответ при наличии достаточных иммуностимулирующих мотивов, так как более крупные олигонуклеотиды разрушаются внутри клеток. В некоторых воплощениях CpG-олигонуклеотиды имеют длину от 6 до 100 нуклеотидов, предпочтительно от 8 до 30 нуклеотидов. В важных воплощениях нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды по изобретению не являются плазмидами или экспрессирующими векторами.

В одном воплощении CpG-олигонуклеотиды, раскрытые в данном описании изобретения, содержат замены или модификации, например в основаниях и/или сахарах, как описано в абзацах 134-147 в WO 2007/026190.

В одном воплощении CpG-олигонуклеотид по настоящему изобретению химически модифицирован. Примеры химических модификаций известны специалистам в данной области и описаны, например, в Uhlmann Е. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke, ST. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129; и Hunziker J. et al., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417. Олигонуклеотид по изобретению может иметь одну или более модификаций, где каждая модификация находится на определенном межнуклеозидном мостике, и/или на определенном элементе β-D-рибозы, и/или в определенном положении природного нуклеозидного основания по сравнению с олигонуклеотидом с той же самой последовательностью, которая состоит из природной ДНК или РНК.

В некоторых воплощениях изобретения CpG-содержащие нуклеиновые кислоты можно просто смешивать с иммуногенными носителями в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники (см., например, WO 03/024480).

В конкретном воплощении настоящего изобретения любая из иммуногенных композиции, раскрытых в данном описании изобретения, содержит от 2 мкг до 100 мг CpG-олигонуклеотида, предпочтительно от 0,1 мг до 50 мг CpG-олигонуклеотида, предпочтительно от 0,2 мг до 10 мг CpG-олигонуклеотида, предпочтительно от 0,3 мг до 5 мг CpG-олигонуклеотида, еще более предпочтительно от 0,5 до 2 мг CpG-олигонуклеотида, еще более предпочтительно от 0,75 до 1,5 мг CpG-олигонуклеотида. В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция, раскрытая в данном описании изобретения, содержит примерно 1 мг CpG-олигонуклеотида.

В предпочтительном воплощении адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия. В одном воплощении иммуногенные композиции, описанные в данном описании изобретения, содержат в качестве адъюванта фосфат алюминия.

В предпочтительных воплощениях иммуногенные композиции по изобретению дополнительно содержат по меньшей мере один компонент из буфера, криопротектора, соли, двухвалентного катиона, неионогенного детергента, ингибитора свободнорадикального окисления, разбавителя или носителя.

Иммуногенная композиция при необходимости может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители включают носители, одобренные регулирующим органом федерального, государственного правительства или другим регулирующим органом, или перечислены в Фармакопеи США и других общепризнанных фармакопеях для использования у животных, включая людей, а также у животных, не являющихся людьми. Термин "носитель" может быть использован для обозначения разбавителя, адъюванта, наполнителя или носителя, с которым вводится фармацевтическая композиция. Вода, солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности для инъекционных растворов. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences", Е.W. Martin. Композиция должна соответствовать способу введения.

Иммуногенная композиция возможно может содержать один или более физиологически приемлемых буферов, выбранных, без ограничения ими, из Tris (триметиламин), фосфатного, ацетатного, боратног Иммуногенная композиция возможно может содержать один или более физиологически приемлемых буферов, выбранных, без ограничения ими, из Tris (триметиламин), фосфатного, ацетатного, боратного, цитратного, глицинового, гистидинового и сукцинатного. В некоторых воплощениях композицию забуферивают до диапазона рН от примерно 5,0 до примерно 7,0, предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,5.

Иммуногенная композиция возможно может содержать один или более неионных поверхностно-активных веществ, включая, но без ограничения ими, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, Полисорбат-80 (Tween 80), Полисорбат-60 (Tween 60), Полисорбат-40 (Tween 40) и Полисорбат-20 (Tween 20), алкиловые эфиры полиоксиэтилена, включая, но без ограничения ими, Бридж 58, Бридж 35, а также другие, такие как Triton X-100; Triton Х-114, NP40, Span 85 и ряд неионных поверхностно-активных веществ плюроников (например Плюроник 121), с предпочтительными компонентами Полисорбата-80 в концентрации от примерно 0,001% до примерно 2% (вплоть до примерно 0,25%, являющейся предпочтительной) или Полисорбата-40 в концентрации от примерно 0,001% до 1% (вплоть до примерно 0,5%, являющейся предпочтительной).

Изобретение также относится к вакцинам, содержащим иммуногенную композицию по изобретению

цитратный, глициновый, гистидиновый и сукцинатный. В некоторых воплощениях композицию забуферивают до диапазона рН от примерно 5,0 до примерно 7,0, предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,5.

Иммуногенная композиция возможно может содержать один или более неионных поверхностно-активных веществ, включая, но без ограничения ими, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, Полисорбат-80 (Tween 80), Полисорбат-60 (Tween 60), Полисорбат-40 (Tween 40) и Полисорбат-20 (Tween 20), алкиловые эфиры полиоксиэтилена, включая, но без ограничения ими, Бридж 58, Бридж 35, а также другие, такие как Triton X-100; Triton Х-114, NP40, Span 85 и ряд неионных поверхностно-активных веществ плюроников (например Плюроник 121), с предпочтительными компонентами Полисорбата-80 в концентрации от примерно 0,001% до примерно 2% (вплоть до примерно 0,25%, являющейся предпочтительной) или Полисорбата-40 в концентрации от примерно 0,001% до 1% (вплоть до примерно 0,5%, являющейся предпочтительной).

Изобретение также относится к вакцинам, содержащим иммуногенную композицию по изобретению

Способы индукции иммунного ответа и защиты от инфекции

Настоящее изобретение также включает способы применения иммуногенных композиций, описанных в данном описании изобретения. Например, в одном воплощении изобретения предложен способ индукции иммунного ответа против Streptococcus pneumoniae, включающий введение субъекту иммуногенного количества любой иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения.

В одном воплощении изобретения предложен способ защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumonia, или способ предупреждения инфекции Streptococcus pneumonia, или способ уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumoniae, где указанные способы включают введение субъекту иммуногенного количества любой иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения.

В одном воплощении изобретения предложен способ защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, или способ предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, или способ уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, где способы включают введение субъекту иммуногенного количества любой иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения.

В одном воплощении изобретения предложен способ лечения или предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae, заболевания или состояния, ассоциированного с Streptococcus pneumoniae серотипа 10А у субъекта, включающий стадию введения субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения. В другом воплощении предложен способ лечения или предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae, заболевания или состояния, ассоциированного с Streptococcus pneumoniae серотипа 10А у субъекта, включающий получение препарата поликлональных или моноклональных антител из иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения, и применение указанного препарата антител для обеспечения субъекта пассивным иммунитетом.

В одном воплощении изобретение относится к применению иммуногенного конъюгата или иммуногенной композиции, раскрытых в данном описании изобретения, для изготовления лекарственного средства для защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, и/или для предупреждения инфекции Streptococcus pneumonia серотипа 10А, и/или для уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, и/или для защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, и/или для предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, и/или для уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumoniae серотипа 10А.

В одном воплощении изобретения предложен способ защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 22F, или способ предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 22F, или способ уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumoniae серотипа 22F, где указанные способы включают введение субъекту иммуногенного количества любой иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения.

В одном воплощении изобретения предложен способ лечения или предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 22F, заболевания или состояния, ассоциированного с Streptococcus pneumoniae серотипа 22F у субъекта, включающий стадию введения субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения. В другом воплощении предложен способ лечения или предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 22F, заболевания или состояния, ассоциированного с Streptococcus pneumoniae серотипа 22F, у субъекта, включающий получение препарата поликлональных или моноклональных антител из иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения, и применение указанного препарата антител для обеспечения субъекта пассивным иммунитетом.

В одном воплощении изобретение относится к применению иммуногенного конъюгата или иммуногенной композиции, раскрытых в данном описании изобретения, для изготовления лекарственного средства для защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumonia серотипа 22F, и/или для предупреждения инфекции Streptococcus pneumonia серотипа 22F, и/или для уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumonia серотипа 22F, и/или для защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 22F, и/или для предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 22F, и/или для уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumoniae серотипа 22F.

В одном воплощении изобретения предложен способ защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, или способ предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, или способ уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, где указанные способы включают введение субъекту иммуногенного количества любой иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения.

В одном воплощении изобретения предложен способ лечения или предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, заболевания или состояния, ассоциированного с Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, у субъекта, включающий стадию введения субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения. В другом воплощении предложен способ лечения или предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, заболевания или состояния, ассоциированного с Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, у субъекта, включающий получение препарата поликлональных или моноклональных антител из иммуногенной композиции, описанной в данном описании изобретения, и применение указанного препарата антител для обеспечения субъекта пассивным иммунитетом.

В одном воплощении изобретение относится к применению иммуногенного конъюгата или иммуногенной композиции, раскрытых в данном описании изобретения, для изготовления лекарственного средства для защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, и/или для предупреждения инфекции Streptococcus pneumonia серотипа 33F, и/или для уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumonia серотипа 33F, и/или для защиты субъекта против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 33F и/или для предупреждения инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 33F, и/или для уменьшения тяжести или задержки появления по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus pneumoniae серотипа 33F.

"Иммунный ответ" на иммуногенную композицию заключается в развитии у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа на молекулы, присутствующие в иммуногенной композиции или вакцинной композиции, представляющей интерес. В контексте настоящего изобретения "гуморальный иммунный ответ" представляет собой антитело-опосредованный иммунный ответ и включает индукцию и образование антител, которые распознают и связывают с некоторой аффинностью антиген в иммуногенной композиции или вакцине по изобретению, в то время как "клеточный иммунный ответ" представляет собой ответ, опосредованный Т-клетками и/или другими лейкоцитами. "Клеточный иммунный ответ" вызывается посредством презентации антигенных эпитопов в ассоциации с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I или класса II, CD1 или другими неклассическими МНС-подобными молекулами. Это активирует антиген-специфические CD4+ Т-хелперные клетки или CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты ("CTL"). CTL обладают специфичностью к пептидным антигенам, которые представлены в ассоциации с белками, кодируемыми классическим или неклассическим МНС и экспрессируемыми на поверхности клеток. CTL помогают индуцировать и стимулировать внутриклеточное разрушение внутриклеточных микробов или лизис клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета включает антиген-специфический ответ хелперными Т-клетками. Хелперные Т-клетки действуют так, чтобы помочь стимулированию функции и фокусированию активности неспецифических эффекторных клеток против клеток, презентирующих пептид или другие антигены в ассоциации с классическими или неклассическими молекулами МНС на своей поверхности. "Клеточный иммунный ответ" также относится к продуцированию цитокинов, хемокинов и других подобных молекул, продуцируемых активированными Т-клетками и/или другими лейкоцитами, включая полученные из CD4+ и CD8+ Т-клеток. Способность конкретного антигена или композиции стимулировать клеточный иммунологический ответ может быть определена с помощью ряда анализов, таких как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), CTL цитотоксические клеточные анализы, путем анализа Т-лимфоцитов, специфичных к антигену у сенсибилизированного субъекта или путем измерение продуцирования цитокинов Т-клетками в ответ на повторную стимуляцию антигеном. Такие анализы хорошо известны в данной области. См., например, Erickson et al. (1993) J. Immunol. 151:4189-4199; и Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376.

Используемое в данном описании "лечение" (включая его варианты, например "лечить" или "подвергнутый лечению") означает любое одно или более из следующих значений: (1) предупреждение инфекции или повторной инфекции, как в случае традиционной вакцины, (2) снижение тяжести или ликвидация симптомов, и (3) существенная или полная ликвидация патогена или расстройства, представляющего интерес. Следовательно, лечение может быть выполнено профилактически (до инфицирования) или терапевтически (после инфицирования). В настоящем описании профилактическое лечение является предпочтительным способом. В соответствии с конкретным воплощением настоящего изобретения предложены композиции и способы для лечения, включая профилактическую и/или терапевтическую иммунизацию, животного-хозяина против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 10А. В соответствии с конкретным воплощением настоящего изобретения предложены композиции и способы для лечения, включая профилактическую и/или терапевтическую иммунизацию, животного-хозяина против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 22F. В соответствии с конкретным воплощением настоящего изобретения, предложены композиции и способы для лечения, включая профилактическую и/или терапевтическую иммунизацию, животного-хозяина против инфекции Streptococcus pneumoniae серотипа 33F. Способы по настоящему изобретению пригодны для придания субъекту профилактического и/или терапевтического иммунитета. Способы по настоящему изобретению могут также быть реализованы на практике на субъектах для биомедицинских исследований.

Термины "иммуногенное количество" и "иммунологически эффективное количество", оба из которых используют взаимозаменяемо в данном описании изобретения, относятся к количеству антигена или иммуногенной композиции, достаточному для того, чтобы вызывать иммунный ответ, либо клеточный (Т-клетки), либо гуморальный (В-клетки или антитела) ответ, либо оба, измеренный посредством стандартных анализов, известных специалистам в данной области техники.

В предпочтительном воплощении указанный субъект представляет собой человека. В наиболее предпочтительном воплощении указанный субъект представляет собой новорожденного (т.е. в возрасте до трех месяцев), младенца (от 3 месяцев до одного года)) или маленького ребенка (т.е. от одного года до четырех лет).

В одном воплощении иммуногенные композиции, раскрытые в данном описании изобретения, предназначены для использования в качестве вакцины.

В таком воплощении возраст субъекта, который должен быть вакцинирован, может составлять менее 1 года. Например, возраст субъекта, который должен быть вакцинирован, может составлять примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В одном воплощении возраст субъекта, который должен быть вакцинирован, составляет примерно 2, 4 или 6 месяцев. В другом воплощении возраст субъекта, который должен быть вакцинирован, может составлять менее 2 лет. Например, возраст субъекта, который должен быть вакцинирован, может быть примерно 12-15 месяцев. В некоторых случаях требуется всего лишь одна доза иммуногенной композиции по настоящему изобретению, но в некоторых случаях должна быть введена вторая, третья или четвертая доза (см. раздел схемы приема лекарства).

В одном воплощении настоящего изобретения субъект, которого следует вакцинировать, представляет собой взрослого человека в возрасте 50 лет или старше, более предпочтительно взрослого человека в возрасте 55 лет или старше. В одном воплощении субъект, которого следует вакцинировать, представляет собой взрослого человека в возрасте 65 лет или старше, 70 лет или старше, 75 лет или старше, или 80 лет или старше.

В одном воплощении субъект, которого следует вакцинировать, представляет собой субъекта с пониженным иммунитетом, в частности человека. Субъект с пониженным иммунитетом, как правило, определяется как человек, который проявляет ослабенную или пониженную способность усиливать нормальную гуморальную или клеточную защиту в ответ на провокацию инфекционными агентами.

В одном воплощении настоящего изобретения субъект с пониженным иммунитетом, которого следует вакцинировать, страдает от заболевания или состояния, которое ухудшает иммунную систему и вызывает иммунный ответ, который недостаточен для защиты от пневмококкового заболевания или его лечения.

В одном воплощении указанное заболевание представляет собой первичное иммунодефицитное расстройство. Предпочтительно, указанное первичное иммунодефицитное расстройство выбрано из группы, состоящей из: комбинированных Т- и В-клеточных иммунодефицитов, недостаточного образования антител, явно выраженных синдромов, заболеваний дизрегуляции иммунной системы, нарушения фагоцитоза, врожденного иммунодефицита, аутовоспалительных заболеваний и недостаточности комплемента. В одном воплощении указанное первичное иммунодефицитное расстройство выбрано из расстройств, представленных на с. 24, строка 11 - с. 25, строка 19 РСТ заявки WO 2010/125480.

В конкретном воплощении настоящего изобретения субъект с пониженным иммунитетом, которого следует вакцинировать, страдает от заболевания, выбранного из группы, состоящей из: ВИЧ-инфекции, синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), рака, хронического сердечного или легочного расстройства, застойной сердечной недостаточности, сахарного диабета, хронической печеночной недостаточности, алкоголизма, цирроза печени, утечки спинномозговой жидкости, кардиомиопатии, хронического бронхита, эмфиземы, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), дисфункции селезенки (например серповидно-клеточной анемии), отсутствия функции селезенки (аспления), злокачественных заболеваний крови, лейкемии, множественной миеломы, болезни Ходжкина, лимфомы, почечной недостаточности, нефротического синдрома и астмы.

В одном воплощении настоящего изобретения субъект с пониженным иммунитетом, которого следует вакцинировать, страдает от недостаточного питания.

В конкретном воплощении настоящего изобретения субъект с пониженным иммунитетом, которого следует вакцинировать, принимает лекарство или получает лечение, которое снижает сопротивляемость организма к инфекции. В одном воплощении указанное лекарственное средство выбрано из лекарственных средств, представленных на с. 26, строка 33 - с. 26, строка 40 в РСТ заявке WO 2010/125480.

В конкретном воплощении настоящего изобретения субъект с пониженным иммунитетом, которого следует вакцинировать, является курильщиком.

В конкретном воплощении настоящего изобретения субъект с пониженным иммунитетом, которого следует вакцинировать, имеет количество лейкоцитов (лейкоцитарная формула) ниже 5×10⁹ клеток на литр, или ниже 4×10⁹ клеток на литр, или ниже 3×10⁹ клеток на литр, или ниже 2×10⁹ клеток на литр, или ниже 1×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,5×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,3×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,1×10⁹ клеток на литр.

Количество лейкоцитов (лейкоцитарная формула): Количество белых кровяных телец (WBC) в крови. WBC обычно измеряют в рамках СВС (полный анализ крови). Лейкоциты являются борющимися с инфекцией клетками крови и отличаются от красных (переносящих кислород) клеток крови, известных как эритроциты. Существуют разные типы лейкоцитов, включающие нейтрофилы (полиморфоядерные лейкоциты; PMN), ленточные клетки (слегка незрелые нейтрофилы), лимфоциты Т-типа (Т-клетки), лимфоциты В-типа (В-клетки), моноциты, эозинофилы и базофилы. Все типы лейкоцитов отражены в количестве лейкоцитов в крови. Нормальный диапазон количества лейкоцитов в крови обычно составляет от 4300 до 10800 клеток на кубический миллиметр крови. Это также может относиться к лейкоцитарной формуле и может быть выражено в международных единицах, как 4,3-10,8×10⁹ клеток на литр.

В конкретном воплощении настоящего изобретения субъект с пониженным иммунитетом, которого следует вакцинировать, страдает от нейтропении. В конкретном воплощении настоящего изобретения субъект с пониженным иммунитетом, которого следует вакцинировать, имеет количество нейтрофилов ниже 2×10⁹ клеток на литр, или ниже 1×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,5×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,1×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,05×10⁹ клеток на литр.

Низкое количество лейкоцитов в крови или "нейтропения" является состоянием, которое характеризуется аномально низкими уровнями нейтрофилов в циркулирующей крови. Нейтрофилы представляют собой специфический вид лейкоцитов, которые помогают предотвратить инфекции и бороться с ними. Наиболее распространенной причиной того, что больные раком имеют нейтропению, является побочный эффект химиотерапии. Нейтропения, индуцированная химиотерапией, увеличивает риск инфицирования пациента и нарушает лечение рака.

В конкретном воплощении настоящего изобретения субъект с пониженным иммунитетом, которого следует вакцинировать, имеет число клеток CD4+ ниже 500/мм³, или число клеток CD4+ ниже 300/мм³, или число клеток CD4+ ниже 200/мм³, число клеток CD4+ ниже 100/мм³, число клеток CD4+ ниже 75/мм³, или число клеток CD4+ ниже 50/мм³.

Анализы клеток CD4 как правило представляют, как число клеток в мм³. Нормальное количество CD4 составляет от 500 до 1600, а количество CD8 составляет от 375 до 1100. Количества CD4 резко снижаются у людей с ВИЧ.

В одном воплощении изобретения любой субъект с пониженным иммунитетом, раскрытый в данном описании изобретения, представляет собой человека мужского или женского пола.

Количество конъюгата в композиции, как правило, рассчитывается на основе общего полисахарида, конъюгированного и неконъюгированного, для данного конъюгата. Например, конъюгат с 20% свободного полисахарида имеет примерно 80 мкг конъюгированного полисахарида и примерно 20 мкг неконъюгированного полисахарида в дозе 100 мкг полисахарида. Вклад белка в конъюгат, как правило, не учитывают при расчете дозы конъюгата. Как правило, каждая доза содержит от 0,1 до 100 мкг полисахарида, в частности от 0,1 до 10 мкг, более конкретно от 1 до 10 мкг и еще более конкретно от 1 до 5 мкг. Предпочтительно каждая доза содержит примерно 1,1, 2, 2,2, 3, 3,3, 4, 4,4 мкг полисахарида.

Оптимальные количества компонентов для конкретной иммуногенной композиции или вакцины могут быть установлены при помощи стандартных исследований, включающих наблюдения соответствующих иммунных ответов у субъектов. После первичной вакцинации субъекты могут получить одну или несколько бустерных иммунизаций с подходящими интервалами между ними.

Эффективность антигена в качестве иммуногена может быть измерена либо посредством пролиферационных анализов, посредством цитолитических анализов, таких как анализы высвобождения хрома для измерения способности Т-клеток лизировать свои специфические клетки-мишени, или путем измерения уровней активности В-клеток путем измерения уровней циркулирующих антител, специфичных к антигену, в сыворотке. Иммунный ответ также может быть определен путем измерения сывороточных уровней антиген-специфического антитела, индуцированного введением антигена, и более конкретно путем измерения способности антител, индуцированных таким образом, увеличивать опсоно-фагоцитирующую способность определенных лейкоцитов, описанных в данном описании изобретения. Уровень защиты иммунного ответа может быть измерен путем провокации иммунизированного хозяина антигеном, который был введен. Например, если антиген, к которому требуется иммунный ответ, представляет собой бактерии, измеряют уровень защиты, вызванный иммуногенным количеством антигена путем определения процента выживаемости или процента смертности после контрольного заражения животных бактериальными клетками. В одном воплощении величину защиты можно измерять путем измерения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с бактериальной инфекцией, например лихорадки, ассоциированной с инфекцией. Количество каждого антигена в мультиантигенной или в мультикомпонентной вакцине, или в иммуногенных композициях варьируется относительно каждого из других компонентов и может быть определено методами, известными специалистам. Такие методы включают процедуры измерения иммуногенности и/или эффективности in vivo.

В изобретении также предложены антитела и композиции антител, которые специфически и селективно связываются с капсульными полисахаридами или гликоконъюгатами по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях антитела получают при введении субъекту капсульных полисахаридов или гликоконъюгатов по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях в изобретении предлагаются очищенные или выделенные антитела, направленные против одного или более капсульных полисахаридов или гликоконъюгатов по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению являются функциональными, при измерении посредством киллинга бактерий либо в модели эффективности на животных или посредством киллинг-анализа опсоно-фагоцитирующей активности. В некоторых воплощениях антитела по изобретению придают пассивный иммунитет субъекту. В настоящем изобретении предложены полинуклеотидные молекулы, кодирующие антитело или фрагмент антитела по изобретению, и клетки, клеточные линии (такие как клетки гибридомы или других сконструированных клеточных линий для рекомбинантного продуцирования антител) или трансгенные животные, которые продуцируют антитело или композицию антител по изобретению, с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.

Примеры

Пример 1: получение конъюгата полисахарида серотипа 22F-CRM₁₉₇

1.1. Получение выделенного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 22F

Капсульные полисахариды серотипа 22F можно получить непосредственно из бактерий, используя способы выделения, известные специалистам в данной области техники (см., например, способы, описанные в публикациях патентных заявок US 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340 и 20080102498 или в WO 2008118752). Streptococcus pneumonia серотипа 22F выращивали в бутыли для посевного материала и затем переносили в ферментатор для посевного материала. При достижении необходимой оптической плотности клетки переносили в производственный ферментатор. Ферментационный бульон инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и очищали посредством ультрафильтрации и диафильтрации.

Очищенный полисахарид Streptococcus pneumoniae серотипа 22F был доведен до нужного размера с помощью гомогенизации под высоким давлением с использованием гомогенизатора PANDA 2K homogenizer® (GEA Niro Soavi) с получением выделенного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 22F.

1.2. Окисление выделенного капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 22F

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ буфере на основе фосфата калия (рН 5,8±0,2), полученного путем последовательного добавления рассчитанного количества 500 мМ калий-фосфатного буфера (рН 5,8) и WFI (вода для инъекций) с получением конечной концентрации полисахарида 2,0 г/л. При необходимости рН реакционной смеси доводили до примерно 5,8. После коррекции рН температуру реакции снижали до 5±3°С. Окисление инициировали путем добавления 0,10±0,02 молярных эквивалентов (м-экв) периодата натрия. Время реакции целевого окисления составляет 16±1 ч при 5±3°С.

Реакцию окисления гасили с помощью 2 мг-экв 2,3-бутандиола при непрерывном перемешивании при 5±3°С в течение 1-2 ч.

Концентрирование и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с использованием 100К MWCO (с отсечением по молекулярной массе) ультрафильтрационных кассет. Диафильтрацию проводили против 35-кратного диаобъема WFI. Очищенный активированный полисахарид хранили при 5±3°С. Очищенный активированный сахарид характеризуют, среди прочего, (1) молекулярной массой, определенной с помощью SEC-MALLS (2) наличием О-ацетила и (3) степенью окисления.

SEC-MALLS используют для определения молекулярной массы полисахаридов и конъюгатов полисахарид-белок. SEC используют для разделения полисахаридов по гидродинамическому объему. Детекторы показателя преломления (RI) и многоугловые детекторы рассеивания лазерного света (MALLS) используют для определения молекулярной массы. Когда свет взаимодействует с веществом, он рассеивается, и количество рассеянного света связано с концентрацией, квадратом dn/dc (удельные инкременты показателя преломления) и молярной массой вещества. Измерение молекулярной массы рассчитывают на основании показаний рассеянного светового сигнала с детектора MALLS и сигнала концентрации с детектора RI.

Степень окисления (DO = моли повторяющейся единицы сахара/моли альдегида) активированного полисахарида определяли следующим образом:

Моли повторяющейся единицы сахара определяют различными колориметрическими методами, такими как, например, антроновый метод. Полисахарид сначала разрушают до моносахаридов под действием серной кислоты и тепла. Антроновый реагент вступает во взаимодействие с гексозами с образованием желто-зеленого комплекса, поглощение которого считывают спектрофотометрически при 625 нм. В рамках анализа поглощение прямо пропорционально количеству присутствующей гексозы.

Моли альдегида также определяют одновременно, используя колориметрический метод МВТН. МВТН-анализ включает образование азинового соединения путем взаимодействие альдегидных групп (из данного образца) с 3-метил-2-бензотиазолон-гидразоном (реагент МВТН-анализа). Избыток 3-метил-2-бензотиазолин-гидразона окисляется с образованием реакционноспособного катиона. Реакционноспособный катион и азид реагируют с образованием синего хромофора. Образовавшийся хромофор затем считывают спектроскопически при 650 нм.

1.3. Конъюгирование активированного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 22F с CRM₁₉₇

Способ конъюгирования состоит из следующих стадий:

а. Смешивание с сахарозным эксципиентом и лиофилизация;

б. Восстановление лиофилизированного полисахарида и CRM_197;

в. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование;

г. Очистка конъюгата.

а. Смешивание с сахарозой и лиофилизация

Активированный полисахарид смешивали с сахарозой (50% масса/объем в WFI) в соотношении 25 г сахарозы на грамм активированного полисахарида. Бутыль смеси затем лиофилизировали. После лиофилизации бутыли, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20±5°С. Рассчитанное количество белка CRM₁₉₇ (целевое соотношение S/P на входе = 1) было поверхностно заморожено и лиофилизировано отдельно. Лиофилизированный CRM₁₉₇ хранили при -20±5°С.

б. Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). После полного растворения полисахарида равное количество безводного DMSO добавляли к лиофилизированному CRM₁₉₇ для восстановления.

в. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование

Растворенный CRM₁₉₇ (в DMSO) объединяли в сосуде для конъюгирования с восстановленным активированным полисахаридом. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляла 1 г/л. Конъюгирование инициировали добавлением 1,5±0,1 мг-экв цианоборгидрида натрия к реакционной смеси и реакционную смесь инкубировали при 23±2°С в течение 20±2 ч. Прекращение реакции конъюгирования осуществляли путем добавления 2 мг-экв боргидрида натрия. Блокирующую реакционную смесь инкубировали при 23±2°С в течение 3±1 ч.

г. Очистка конъюгата

Раствор конъюгата разбавляли 1:5 охлажденным раствором 5 мМ сукцината-0,9% раствора хлорида натрия (рН 6,0) при подготовке к очистке посредством тангенциальной проточной фильтрации с использованием 100К MWCO мембран и 20Х диафильтрацию выполняли, используя раствор 5 мМ сукцината-0,9% раствора хлорида натрия (рН 6,0) в качестве среды. После завершения диафильтрации ретентат конъюгата дополнительно разбавляли, фильтровали через фильтр 0,22 мкм и хранили при 2-8°С.

В Таблице 1 представлены характеристические данные для конъюгатов полисахарид серотипа 22F-CRM₁₉₇, полученных способом по изобретению. В частности, конъюгаты 5 и 6 из таблицы были получены, как описано в примере 1.

Конъюгаты полисахарид серотипа 22F-CRM₁₉₇, полученные посредством способа RAC-DMSO обеспечивают лучшие выходы и демонстрируют лучшую воспроизводимость от партии к партии по MW (молекулярная масса) наряду со значительно более низкими %-ными уровнями свободных сахаридов и более высокой модификацией белка-носителя (лизин) по сравнению с конъюгатами, полученными посредством RAC-водного способа, как показано в Таблице 1.

% выхода конъюгата рассчитывают следующим образом: (количество полисахарида в конъюгате×100)/количество активированного полисахарида.

Пример 2: Получение конъюгата полисахарид серотипа 10A-CRM₁₉₇

2.1. Получение выделенного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 10А

Выделенный полисахарид серотипа 10А получали, как описано в примере 1.1, за исключением того, что очищенный полисахарид не был доведен до нужного размера.

2.2. Окисление выделенного капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 10А

Рассчитанный объем 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 6,0) и воды для инъекций (WFI) добавляли к раствору полисахарида с получением конечной концентрации полисахарида 2,5 г/л и конечной концентрации калий-фосфатного буфера 25 мМ, при необходимости рН доводили примерно до 6,0. Разбавленный полисахарид затем охлаждали до 5±3°С. Окисление инициировали путем добавления 0,25±0,02 молярных эквивалентов (мг-экв) раствора периодата натрия. Время реакции окисления составляло примерно 4 часа при 5±3°С. Реакцию окисления гасили с помощью 1 мг-экв 2,3-бутандиола при непрерывном перемешивании при 5±3°С в течение 1-2 часов.

После достижения целевого времени реакции активированный полисахарид концентрировали, используя кассеты для ультрафильтрации 30K MWCO Millipore. Затем выполняли диафильтрацию против 20-кратного диаобъема WFI. Очищенный активированный полисахарид хранили при 5±3°С. Очищенный активированный сахарид характеризуется, среди прочего, (1) молекулярной массой, определенной с помощью SEC-MALLS и (2) степенью окисления.

2.3 Конъюгирование активированного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 10А с CRM₁₉₇

Способ конъюгирования состоит из следующих стадий:

а. Смешивание с сахарозным эксципиентом и лиофилизация;

б. Восстановление лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

в. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование;

г. Очистка конъюгата.

а) Смешивание с сахарозой

Активированный полисахарид смешивали с сахарозой в соотношении 25±2,5 грамм сахарозы на грамм активированного полисахарида. Бутыль смеси затем лиофилизировали. После лиофилизации бутыли, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20±5°С.

б) Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇.

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). После полного растворения полисахарида такое же количество безводного DMSO добавляли к рассчитанному CRM₁₉₇ для восстановления.

в) Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в DMSO) добавляли к востановленному активированному полисахариду в реакторе для конъюгирования. Конечная концентрация полисахарида составляла 1 г/л. Конъюгирование выполняли путем добавления 1,2±0,1 мг-экв цианоборгидрида натрия к реакционной смеси. Реакционную смесь инкубировали при 23±2°С в течение 24±2 часов. Прекращение реакции конъюгирования осуществляли путем добавления 2 мг-экв боргидрида натрия. Блокирующую реакционную смесь инкубировали при 23±2°С в течение 3±1 ч.

Прекращение реакции конъюгирования осуществляли путем добавления 2 мг-экв боргидрида натрия. Эта реакция блокирования продолжалась в течение 3±1 часов при 23±2°С.

г) Очистка конъюгата

Затем раствор конъюгата разбавляли в 5х (по объему) охлажденном растворе 5 мМ сукцинат-0,9% раствор хлорида натрия (рН 6,0 и 20Х диафильтрацию выполняли, используя 5 мМ сукцинат-0,9% раствор хлорида натрия (рН 6,0). После завершения начальной диафильтрации ретентат конъюгата пропускали через фильтр 0,22 мкм. Конъюгат дополнительно разбавляли смесью 5 мМ сукцинат/0,9% раствор хлорида натрия (рН 6) и, после конечной стадии фильтрации через фильтр 0,22 мкм, хранили при 2-8°С.

В Таблице 2 представлены данные для конъюгатов полисахарида серотипа 10A-CRM₁₉₇, полученных посредством способа по изобретению. В частности, конъюгаты 4-6 в таблице 2 были получены, как описано в примере 2.

Конъюгаты полисахарид серотипа 10A-CRM₁₉₇, полученные посредством способа RAC-DMSO, обеспечивают лучшие выходы и демонстрируют лучшую воспроизводимость от партии к партии по MW наряду со значительно более низким %-ными уровнями свободных сахаридов и более высоким уровнем модификации белка-носителя (лизин) по сравнению с конъюгатами, полученными посредством RAC-водного способа, как показано в Таблице 2.

Пример 3: Получение конъюгата полисахарид серотипа 33F-CRM₁₉₇

3.1. Получение выделенного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 33F

Выделенный полисахарид серотипа 33F получали, как описано в примере 1.1.

3.2. Окисление выделенного капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 33F

Рассчитанный объем 0,1 М натрий-фосфатного буфера (рН 6,0) и воды для инъекций (WFI) добавляли к раствору полисахарида с получением конечной концентрации полисахарида 2 г/л. Если необходимо, рН доводили до примерно 6,0. Разбавленный полисахарид затем охлаждали до 5±3°С. Окисление инициировали добавлением 0,1 молярного эквивалента (мг-экв) раствора периодата натрия. Время реакции окисления составляло примерно 20 часов при 5±3°С. Реакцию окисления гасили с помощью 1 мг-экв 2,3-бутандиола при непрерывном помешивании при 5±3°С в течение примерно 1 часа. После достижения целевого времени реакции активированный полисахарид концентрировали, используя кассеты для ультрафильтрации 100K MWCO Millipore. Диафильтрацию затем выполняли против 40-кратного диаобъема WFI. Очищенный активированный полисахарид хранили при 5±3°С. Очищенный активированный сахарид характеризуют, среди прочего, (1) молекулярной массой согласно SEC-MALLS и (2) степенью окисления.

3.3 Конъюгирование активированного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 33F с CRM₁₉₇

Конъюгат полисахарид серотипа 33F-CRM197 получали посредством способа, аналогичного способу из примера 1.3, используя активированный полисахарид 33F, полученный в примере 3.2.

Конъюгаты полисахарид серотипа 33F-CRM₁₉₇ получали посредством способа RAC-DMSO, обеспечивающего лучшие выходы и демонстрирующего лучшую воспроизводимость от партии к партии в отношении сохранения уровней О-ацетила наряду с более низкими %-ными уровнями свободных сахаридов и более высоким уровнем модификации белка-носителя (лизин) по сравнению с конъюгатами, полученными посредством RAC-водного способа, как показано в Таблице 3.

Пример 4: Влияние гашения на молекулярную массу активированных полисахаридов серотипа 22F и 33F

Активацию полисахаридов 22F и 33F выполняли при 4°С или 22°С. Обе температуры обеспечивали аналогичные значения DO. Тем не менее, благодаря тому, что повышенная температура приводила к более быстрому разрушению активированного полисахарида, таким образом снижая MW активированного полисахарида (как показано, например, на фиг. 4 (22°С) и на фиг. 5 (4°С)), температура 4°С, как правило, является предпочтительной для реакции активации. Кроме того, данные по активации показали, что гашение непрореагировавшего NaIO₄ после окисления, является важной стадией активации, особенно активации с использованием большего количества NaIO₄. График, представленный на Фиг. 6, показывает, что MW активированного полисахарида 33F является относительно стабильной при использовании для активации (с гашением) повышенных концентраций периодата, в то время как такая MW является высоковариабельной, когда не используется стадия гашения. В определенных условиях, установленных для получения целевой степени окисления, молекулярная масса активированного полисахарида является менее вариабельной при использовании стадии гашения. Добавление гасителя после окисления помогает сохранить структурную целостность активированного полисахарида вплоть до завершения очистки, например, посредством ультрафильтрации и диафильтрации.

Пример 5: Анализ опсоно-фагоцитирующей активности (ОРА)

Иммуногенность конъюгатов, полученных посредством способов, раскрытых в данном описании изобретения, можно оценить с использованием опсоно-фагоцитирующего анализа (ОРА), описанного ниже.

Группы из тридцати 6-7 недельных самок-мышей Swiss Webster иммунизировали 0,001 мкг, 0,01 мкг или 0,1 мкг тестируемых конъюгатов посредством подкожного введения в неделю 0. Мышам дополнительно вводили такую же дозу конъюгата в неделю 3 и затем выпускали кровь в неделю 4. Серотип-специфические ОРА выполняли на образцах сыворотки 4 недели.

Утвержденные анализы опсоно-фагоцитирующей активности (ОРА) используют для измерения функциональных антител в сыворотке крови мышей, специфичных к S. pneumonia серотипа 10А, 22F или 33F. Тестируемую сыворотку помещают в анализируемые реакционные смеси, которые измеряют способность иммуноглобулина, специфичного к капсульному полисахариду, опсонизировать бактерии, запускать осаждение комплемента, тем самым способствуя фагоцитозу и уничтожению бактерий фагоцитами. Титр ОРА определяют как обратное разведение, которое приводит к 50%-ному уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без тестируемой сыворотки. Титр ОРА интерполируют из двух разведений, которые включают эту границу 50%-ного уничтожения.

Процедуры ОРА были основаны на методах, описанных в Hu et al., Clin Diagn Lab Immunol, 2005; 12 (February (2)):287-95 со следующими модификациями. Тестируемую сыворотку серийно разводили в 2,5 раза и добавляли к планшетам для микротитрования. Живые целевые бактериальные штаммы серотипа 10А, 22F и 33F добавляли в лунки и планшеты встряхивали при 25°С (серотип 22F) или при 37°С (серотип 10А и 33F) в течение 30 минут. Сыворотку дифференцированных клеток HL-60 (фагоциты) и крольчат (в возрасте от 3 до 4 недель, Pel-Freez®, 12,5% конечная концентрация) добавляли в лунки и планшеты встряхивали при 37°С в течение 45 минут (серотип 22F и 33F) или 60 минут (серотип 10А). Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, смешивали, и 10 мкл аликвоту переносили в лунки Multiscreen HTS HV фильтрующих планшетов (Millipore®), содержащих 200 мкл воды. Жидкость фильтровали через планшеты под вакуумом и 150 мкл среды HySoy добавляли в каждую лунку и фильтровали через нее. Фильтрующие планшеты затем инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение ночи и затем фиксировали с помощью обесцвечивающего раствора Destain Solution (Bio-Rad). Затем планшеты окрашивали кумасси синим и один раз обесцвечивали. Колонии визуализировали и подсчитывали на Cellular Technology Limited (CTL) ImmunoSpot Analyzer®. Подсчеты необработанных колоний использовали для построения кривых гибели и определения титров ОРА.

Конъюгаты полисахарид серотипа 10A-CRM₁₉₇, конъюгаты полисахарид серотипа 22F-CRM₁₉₇ и конъюгаты полисахарид серотипа 33F-CRM₁₉₇, полученные как описано в примерах 1-3, тестировали в анализе ОРА, описанном выше, и было обнаружено, что они являются иммуногенными.

1. Способ получения иммуногенного конъюгата, содержащего полисахарид Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33F, ковалентно связанный с белком-носителем, включающий следующие стадии:

(а) взаимодействие выделенного капсульного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F с окислителем, представляющим собой периодат или метапериодат натрия;

(б) гашение реакции окисления путем добавления гасящего агента, представляющего собой соединение формулы (II)

где каждый из R¹ и R² независимо выбран из Н, метила, этила, пропила или изопропила, с получением активированного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 10А, 22F или 33F;

(в) смешивание указанного активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F с белком-носителем; и

(г) взаимодействие смеси активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F и белка-носителя с восстановителем с образованием конъюгата полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F : белок-носитель.

2. Способ по п. 1, где концентрация полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F на стадии (а) составляет от 0,5 до 5 мг/мл.

3. Способ по п. 1, где указанный полисахарид взаимодействует с 0,01-10, 0,05-5, 0,1-1, 0,5-1, 0,7-0,8, 0,01-0,2, 0,05-0,5, 0,05-0,2, 0,1-0,3 молярных эквивалентов окислителя на стадии (а).

4. Способ по п. 1, где гасящий агент выбран из глицерина, этиленгликоля, пропан-1,2-диола, бутан-1,2-диола или бутан-2,3-диола.

5. Способ по п. 1, где гасящий агент представляет собой бутан-2,3-диол.

6. Способ по п. 1, где реакцию окисления гасят путем добавления 0,1-10, 0,5-5, 0,5-3 или 0,5-2 молярных эквивалентов гасящего агента.

7. Способ по п. 1, где реакцию окисления гасят путем добавления 0,5-2 молярных эквивалентов гасящего агента.

8. Способ по п. 1, где температуру реакции на стадии (б) поддерживают от 1 до 10°С.

9. Способ по п. 1, где продолжительность стадии (б) составляет от 0,5 до 2 часов.

10. Способ по п. 1, где активированный полисахарид очищают после стадии (б).

11. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию

(д) блокирования непрореагировавших альдегидов в конъюгате полисахарид серотипа 10А, 22F или 33F : белок-носитель.

12. Способ по п. 1, где стадии (а) и (б) выполняют в DMSO (диметилсульфоксид) или в водном растворе.

13. Способ по п. 1, где концентрация активированного полисахарида на стадии (б) составляет от 0,1 до 10 мг/мл, от 0,5 до 5 мг/мл или от 0,5 до 2 мг/мл.

14. Способ по п. 1, где исходное соотношение активированного полисахарида серотипа 10А, 22F или 33F к белку-носителю составляет от 5:1 до 0,1:1, от 2:1 до 0,1:1, от 2:1 до 1:1, от 1,5:1 до 1:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,3:1 до 1:1 или от 0,6:1 до 1,2:1.

15. Способ по п. 1, где на стадии (г) активированный полисахарид взаимодействует с 0,5-2,5 молярными эквивалентами цианоборгидрида натрия.

16. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию очистки конъюгата полисахарид : белок-носитель.

17. Способ по п. 1, где белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

18. Способ по любому из пп. 1-17, где указанный выделенный полисахарид представляет собой выделенный полисахарид Streptococcus pneumoniae серотипа 22F.

19. Способ по любому из пп. 1-17, где указанный выделенный полисахарид представляет собой выделенный полисахарид Streptococcus pneumoniae серотипа 10А.

20. Способ по любому из пп. 1-17, где указанный выделенный полисахарид представляет собой выделенный полисахарид Streptococcus pneumoniae серотипа 33F.

21. Способ по любому из пп. 1-17, который дополнительно включает стадию приготовления конъюгата в поливалентной вакцине.