Способ получения экспериментальной модели пародонтита
Владельцы патента RU 2676649:
Быкова Наталья Ильинична (RU)
Сирак Сергей Владимирович (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Ставропольский государственный медицинский университет (ФГБОУ ВО Ставропольский государственный медицинский университет) Минздрава РФ (RU)
Щетинин Евгений Вячеславович (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной стоматологии, и может быть использовано для получения экспериментальной модели пародонтита. Помещают половозрелых крыс в общую клетку площадью 0,018 м2 на особь. Перед помещением в клетку каждому животному под наркозом внутримышечно вводят линкомицина гидрохлорид дозой 30 мг на 100 г веса. Производят аппликацию суспензии пчелиного яда в области десен и преддверия рта в дозе 2 мг на 100 г веса животного. При этом для ускорения моделирования дополнительно к стандартному рациону питания крыс добавляют 2 мл подсолнечного масла на одного животного, которое нагревают в присутствии 2% сульфата меди в течение 24 часов до достижения перекисного числа выше 40 ед. Способ позволяет просто и надежно получить экспериментальную модель пародонтита, повысить достоверность создания патологического процесса воспаления пародонта, сходного по патоморфологическим проявлениям с пародонтитом у человека, за счет наиболее оптимального комплекса мероприятий. 2 ил., 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, в частности, экспериментальной медицины и стоматологии и может быть использовано для изучения этиологии и патогенеза пародонтита.
Воспалительные заболевания пародонта остаются одной из наиболее актуальных проблем современной стоматологии. В настоящее время наблюдается увеличение числа больных с воспалением тканей пародонта с преобладанием в их структуре генерализованных форм гингивита и пародонтита [1]. По данным ВОЗ более 80% населения в возрасте от 60 лет и старше страдают воспалительными и воспалительно-деструктивными заболеваниями пародонта, приводящими к потере зубов, появлению очагов хронической инфекции в полости рта, микробной сенсибилизации и другим расстройствам [2].
Заболевание особенно опасно в пожилом возрасте, на фоне снижения общего иммунитета и реактивности организма, зачастую при прогрессирующей потере плотности костной ткани.
Для практического использования новых передовых методов терапии и новых препаратов при лечении пародонтита требуется отработка всех параметров внедряемых средств в эксперименте на живых организмах.
Наиболее эффективными показали себя экспериментальные модели пародонтита, воспроизведенные на животных [3].
Известен способ моделирования пародонтита, согласно которому экспериментальным животным - крысам, вводят хлористый аммоний в дозе 3,5-4,5 мг на 1 г массы тела один раз в сутки в течение не менее 30 дней [4].
Преимущества способа: быстрое получение искомой модели пародонтита.
Недостатком известного способа является то, что пародонтит моделируется метаболическим ацидозом, что дает недостаточно полную морфологическую картину моделируемой патологии, в этиологии которого ведущее место занимает острое или хроническое воспаление. Кроме этого, процесс моделирования требует ежедневных введений в пищу строго дозированного количества хлористого аммония.
Известен способ получения модели воспаления пародонта у крыс, вызванного острой механической травмой мягких тканей десны, в котором авторы под легким эфирным наркозом вводили крысам металлический крючок так, чтобы животные не могли его уронить, с губной стороны параллельно зубному ряду на глубину 1,5 мм в зубодесневую борозду в области верхних резцов [5].
Преимущества метода: простота выполнения.
Недостатком известного способа является его ненадежность и повышенная травматичность, поскольку крепление крючка в десне ничем не фиксируется и может быть нарушено животным.
Известен способ получения модели пародонтита, принятый в качестве прототипа, включающий помещение половозрелых крыс в общую клетку площадью 0,018 м на особь, в котором перед помещением в клетку под эфирным наркозом, используя стоматологический цемент, создают искусственную зубную бляшку вокруг шейки верхних и нижних резцов с шероховатой поверхностью, заходящую под десну на 0,1-0,5 мм, при этом в процессе моделирования животные получают кашицеобразную пищу [6].
Преимущества метода: сочетанное воздействие эмоционального стресса, использование механического раздражителя (стоматологический цемент) и кашицеобразной пищи, способствующей, как известно, формированию микробной бляшки на поверхности зубов и десен, относительно короткий процесс моделирования пародонтита (не более месяца).
Недостатком способа получения модели пародонтита по методу прототипа является его высокая трудоемкость, операционная травма краевой десны, сложность, обусловленная использованием специального цемента и необходимостью формирования искусственных зубных бляшек в полости рта животных для создания модели воспалительного процесса. Проявления воспаления десен, полученное с помощью методики прототипа, не типичны по своим морфологическим свойствам для пародонтита у человека.
Поставлена задача: разработать простой и надежный способ получения модели хронического пародонтита у крыс, исключающий операционную травму пародонта, обеспечивающий повышение достоверности патологического процесса, путем моделирования у подопытных животных воспаления пародонта, сходного по патоморфологическим проявлениям с пародонтитом у человека.
Поставленная задача решена за счет сочетания воздействия местных и общих факторов на фоне изменения реактивности организма, что полностью соответствует современному взгляду на этиологию пародонтита.
В заявляемом способе получения экспериментальной модели пародонтита путем воздействия эмоциональным стрессом на экспериментальных животных, например, половозрелых крыс, за счет помещения 10-11 особей в клетку при площади 0,018 м2/особь, в отличие от прототипа перед помещением в клетку каждой экспериментальной особи под общей анестезией на фоне внутрибрюшинного тиопенталового наркоза из расчета 0,1 мл 5% тиопентала натрия на 100 грамм веса животного, создают дисбактериоз ротовой полости путем внутримышечного введения линкомицина гидрохлорида дозой 30 мг 100 грамм веса животного и локального поражения десен и тканей преддверия рта аппликацией суспензии пчелиного яда в дозе 2 мг на 100 грамм веса животного. Для ускорения моделирования дополнительно к стандартному рациону питания крыс добавляют подсолнечное масло (2 мл на одного животного), которое нагревают в присутствии 2% сульфата меди в течение 24 часов до достижения перекисного числа выше 40 ед.
Аппликации проводятся в двух участках преддверия рта между нижней губой и резцами нижней челюсти и между молярами верхней и нижней челюстей и щекой справа.
Заявляемый способ создания экспериментального пародонтита отличает простота выполнения, хорошая выживаемость подопытных животных, достоверность патологического воспалительного процесса тканей пародонта, сходного по патоморфологическим проявлениям с пародонтитом у человека.
Экспериментальные исследования выполнены на 140 белых половозрелых крысах массой 220-250 г, которые находились на стандартном пищевом и водном рационе в соответствии с санитарно-гигиеническими нормами. Опыты проводили с соблюдением Международных принципов Европейской конвенции о «Защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей» (Страсбург, 1986), «Общими этическими принципами экспериментов на животных» (Россия, 2011), в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт «Принципы надлежащей лабораторной практики» ГОСТ Р 53434-2009) и положительным заключением этического комитета СтГМУ №32 от 12.02.2014. Исследование осуществлено в рамках Государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации для ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по осуществлению научных исследований и разработок по теме: «Стволовые клетки пульпы зуба в регенерации и иммуномодуляции» от 14.01.2014 №302/08 совместно с Всероссийским НИИ овцеводства и козоводства и Ставропольским государственным аграрным университетом (Ставрополь).
Все животные были разделены на 2 группы: основную и контрольную (по 70 животных в каждой группе).
В основной группе проводили моделирование экспериментального пародонтита по разработанному способу, в контрольной группе - по методу прототипа.
Пример 1 (основная группа): Брали 70 особей половозрелых крыс. Под внутрибрюшинным тиопенталовым наркозом из расчета 0,1 мл 5% тиопентала натрия на 100 грамм веса животного, создавали дисбактериоз ротовой полости путем внутримышечного введения линкомицина гидрохлорида дозой 30 мг 100 грамм веса животного. Затем проводили локальное поражение десен и тканей преддверия рта аппликацией суспензии пчелиного яда в дозе 2 мг на 100 грамм веса животного. Далее животных помещали в общую клетку при площади 0,018 м2 на особь. В течение всего времени моделирования к стандартному рациону питания крыс добавляли подсолнечное масло в количестве 2 мл на одного животного, которое нагревали в присутствии 2% сульфата меди в течение 24 часов до достижения перекисного числа выше 40 ед. Признаки воспаления десны в основной группе наблюдали на 3 день эксперимента. На 14-е сутки наблюдали отечность и цианоз десны, в области резцов наблюдали появление пародонтальных карманов глубиной до 2 мм, подвижность резцов 2-3 степени. На 21-е сутки рентгенологически определяли все признаки деструкции вершины межзубной перегородки, включая лизис последней.
При микроскопическом анализе гистологических препаратов визуально отмечено появление инфильтрата стадии установившегося воспаления на 14-е сутки, что соответствует острой фазе воспаления. Появление в поле зрения плазматических клеток выявлено также на 14-е сутки, а значительное их увеличение на 21-е сутки исследования.
На фиг. 1 изображен гистологический срез зубоальвеолярного сегмента экспериментального животного на 14-е сутки исследования, на котором в поле зрения видно большое количество плазматических клеток (до 40% от всех клеток экссудата), что подтверждает наличие острого воспалительного процесса.
На фиг. 2 изображен гистологический срез альвеолярного отростка экспериментального животного на 21-е сутки исследования, на котором видна фаза прогрессирующего воспаления, плазматические клетки составляют до 80% всех клеток экссудата.
Исследованная гистологическая картина свидетельствует о хронизации воспаления и активном вовлечении иммунных механизмов воспаления от 14-х к 21-м суткам эксперимента. Количество плазматических клеток нарастает пропорционально тяжести процесса и степени разрушения тканей. Глубокие поражения претерпевают сосуды пародонта, его кровоснабжение нарушается. Прогрессирует разрушение коллагеновых тканей элементов и активная резорбция кости.
Пример 2 (контрольная группа): Брали 70 особей половозрелых крыс.
Проводили формирование модели пародонтита по методу прототипа, включающее помещение половозрелых крыс в общую клетку площадью 0,018 м2 на особь, в котором перед помещением в клетку под эфирным наркозом, используя стоматологический цемент, создавали искусственную зубную бляшку вокруг шейки верхних и нижних резцов с шероховатой поверхностью, заходящую под десну на 0,1-0,5 мм. В течение всего времени моделирования животные получали кашицеобразную пищу, исключающую самоочищение зубов. Признаки начального воспаления десны (гингивита) в контрольной группе наблюдали на 20-30 день эксперимента. На 40-е сутки у части животных наблюдали отечность и цианоз десны, в области резцов наблюдали появление пародонтальных карманов глубиной 1-2 мм, появление подвижности резцов первой степени. Рентгенологических признаков деструкции вершины межзубной перегородки не установлено.
Поражение пародонта у животных контрольной группы (прототип) наблюдается лишь через 30-40 дней после начала эксперимента, однако воспалительный процесс носит характер гингивита (начальное воспаление десен) и не позволяет добиться полноценной картины пародонтита (воспаление всех тканей пародонта, подвижность зубов 2-3 степени, деструкция вершин межзубных перегородок).
Таким образом, при использовании разработанного способа моделирования экспериментального пародонтита создается изолированное поражение пародонта у каждого животного, не отягощенное какой-либо другой патологией и имеющее в своей основе как местные (локальное поражение десен, диета), так и общие (стресс) патогенетические факторы. По своим патоморфологическим проявлениям моделируемое у животных основной группы поражение аналогично картине пародонтита у человека и воспроизводится с высокой степенью надежности.
Разработанный способ позволяет изучать вопросы этиологии и патогенеза пародонтита, что является необходимым для разработки профилактических мероприятий и лечения указанной патологии.
Способ получения экспериментальной модели пародонтита, включающий помещение половозрелых крыс в общую клетку площадью 0,018 м2 на особь, отличающийся тем, что перед помещением в клетку каждому животному под наркозом внутримышечно вводят линкомицина гидрохлорид дозой 30 мг на 100 г веса, производят аппликацию суспензии пчелиного яда в области десен и преддверия рта в дозе 2 мг на 100 г веса животного, при этом для ускорения моделирования дополнительно к стандартному рациону питания крыс добавляют 2 мл подсолнечного масла на одного животного, которое нагревают в присутствии 2% сульфата меди в течение 24 часов до достижения перекисного числа выше 40 ед.