Способы модуляции гомеостаза желчных кислот и лечение расстройств и заболеваний, ассоциированных с желчными кислотами

Авторы патента:

G01N33/92 - с использованием жиров, например холестерина

C12Q1/6883 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

C12P21/02 - с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона

C07K14/50 - фактор роста фибропласта (ФРФ)

A61K38/1825 - Лекарственные препараты, содержащие пептиды (пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца A61K 31/00; циклические дипептиды, не имеющие в молекуле какой-либо другой пептидной связи кроме формирующей их ядро, наприме

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот, включающий введение пептида. При этом пептид содержит: a) N-концевую область, включающую по меньшей мере семь аминокислотных остатков, и b) C-концевую область. При этом N-концевая область содержит DSSPL (SEQ ID NO:121) или DASPH (SEQ ID NO:122). C-концевая область содержит: (i) первую последовательность С-концевой области, содержащую WGDPIRLRHLYTSG (аминокислотные остатки 16-29 последовательности SEQ ID NO:99 [FGF19]), где остаток W соответствует положению первой аминокислоты указанной С-концевой области, или (ii) вторую последовательность С-концевой области, содержащую PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (аминокислотные остатки 30-194 последовательности SEQ ID NO: 99 [FGF19]), или последовательность, содержащую от 1 до 5 аминокислотных замен, делеций или инсерций. Пептид (i) связывается с рецептором фактора роста фибробластов 4 (FGFR4) c аффинностью, равной или большей, чем аффинность связывания FGF19 с FGFR4; (ii) активирует FGFR4 в степени или количестве, равном или большем, чем FGF19; (iii) обладает одним из пониженного образования гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), повышенной активности в отношении снижения уровня глюкозы, пониженной активности в отношении увеличения уровня липидов, пониженной активности в отношении увеличения уровня триглицеридов, пониженной активности в отношении увеличения уровня холестерина, пониженной активности в отношении увеличения уровня не-ЛВП или ЛВП по сравнению с FGF19 или по сравнению с последовательностью варианта FGF19, где последовательность WGDPI в положениях аминокислот 16-20 FGF19 (SEQ ID NO:99) заменена любыми из GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP; и/или (iv) имеет низкую активность в отношении снижения мышечной массы по сравнению с FGF21. Также представлен способ модуляции гомеостаза желчных кислот. 4 н. и 146 з.п. ф-лы, 7 ил., 14 табл., 12 пр.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается преимущество заявки на патент США рег. No. 61/746499, поданной 27 декабря, 2012; заявки на патент США рег. No. 61/779604, поданной 13 марта 2013; и заявки на патент США рег. No. 61/887129, поданной 4 октября 2013, каждая из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вариантам (и пептидомиметикам) белковых и пептидных последовательностей фактора роста фибробластов 19 (FGF19), к гибридам (и пептидомиметикам) белковых и пептидных последовательностей FGF19 и/или фактора роста фибробластов 21 (FGF21) и к вариантам гибридов (и пептидомиметиков) белковых и пептидных последовательностей FGF19 и/или FGF21, которые модулируют гомеостаз желчных кислот, а также к способам и применениям этих вариантов и гибридов для лечения расстройств, связанных и ассоциированных с желчными кислотами.

Введение

Желчные кислоты, то есть, стероидные кислоты, которые преобладают в желчи млекопитающих, регулируют гомеостаз холестерина, триглицеридов, глюкозы и энергии, и облегчают гидролиз и абсорбцию липидов в тонком кишечнике. Эмульгирование липидов и жирорастворимых витаминов в кишечнике способствует образованию мицелл, которые затем могут транспортироваться через систему млечных сосудов. Другими функциями желчных кислот являются запуск потока желчи, способствующей элиминации катаболитов из печени и снижению уровня бактериальной флоры, присутствующей в тонком кишечнике и в желчных путях. Желчные кислоты также участвуют в регуляции своего собственного синтеза и циркуляции веществ в кишечнике и печени. См., например, Staels et al, Diabetes Care (2009) vol. 32 no. suppl 2 S237-S245.

У человека, продуцирование желчных кислот происходит, главным образом, в перивенозных гепатоцитах посредством серии ферментативных реакций, которые обеспечивают превращение холестерина в желчные кислоты двух основных видов, такие как холевая кислота и хенодезоксихолевая кислота. Первичные желчные кислоты синтезируются по двум различным путям. В «классическом» или «нейтральном» пути, первичные желчные кислоты продуцируются посредством гидроксилирования холестерина в результате катализа под действием фермента цитохрома, то есть, холестерин-7α-гидроксилазы (cyp7a1), которая катализирует первую и скорость-ограничивающую стадию классического пути синтеза желчных кислот. (см., например, Inagaki et al., Cell Metabolism 2:217-25 (Oct. 2005)).

Как описано ниже, активность cyp7a1 ингибируется холевой кислотой и усиливается под действием холестерина, и таким образом, cyp7a1 регулируется самими желчными кислотами. Превращение холестерина в желчные кислоты осуществляется, главным образом, по этому пути. Кроме того, у большинства индивидуумов, приблизительно 6% желчных кислот синтезируется по «альтернативному» или «кислотному» пути. Этот путь регулируется ферментом cyp27al, который превращает оксистеролы в желчные кислоты. В отличие от cyp7a1, cyp27al не регулируется самими желчными кислотами.

Если холевая кислота и хенодезоксихолевая кислота секретируются в просвет кишечника, то кишечные бактерии осуществляют дегидроксилирование части каждой из этих кислот с образованием вторичных желчных кислот, таких как дезоксихолевая кислота (происходящая от холевой кислоты) и литохолевая кислота (происходящая от хенодезоксихолевой кислоты). В клетках печени может происходить конъюгирование этих четырех желчных кислот с одной из двух аминокислот, таких как глицин или таурин, с образованием всего восьми возможных конъюгированных желчных кислот, называемых солями желчных кислот. Таким образом, в целом, первичными желчными кислотами являются холевая кислота, хенодезоксихолевая кислота, гликохолевая кислота, таурохолевая кислота, дезоксихолевая кислота и литохолевая кислота. Все четыре этих желчных кислоты могут снова транспортироваться в кровоток, а затем возвращаться в печень и повторно секретироваться посредством циркуляции веществ в кишечнике и печени. См., например, Staels et al, Diabetes Care (2009) vol. 32 suppl. 2 S237-S245.

Первичные желчные кислоты (холевая кислота и хенодезоксихолевая кислота) синтезируются в печени, а вторичные желчные кислоты (дезоксихолевая кислота и литохолевая кислота) образуются под действием бактерий. Эти четыре желчных кислоты секретируются в просвет желчного канальца и аккумулируются в желчном пузыре в виде смешанных мицелл с фосфолипидами и холестерином. После приема пищи, холецистокинин стимулирует сокращение желчного пузыря, что приводит к высвобождению мицеллярных желчных кислот в просвет кишечника и стимуляции пищеварения. Циркуляция веществ в кишечнике и печени позволяет приблизительно 90-95%-ам желчных кислот реабсорбироваться из дистального отдела подвздошной кишки и транспортироваться обратно в печень, и такое поглощение и транспорт желчных кислот осуществляется, главным образом, перицентральными гепатоцитами. Приблизительно 5% желчных кислот, которые не реабсорбируются, выводятся через фекалии, а потеря определенного количества этих желчных кислот в дальнейшем будет восполняться благодаря синтезу желчных кислот в печени de novo. См., например, Rose et al, Cell Metabolism, 14:1, pp 123-130 (6 июля 2011).

Первичные желчные кислоты (хенодезоксихолевая кислота и холевая кислота) представляют собой физиологические лиганды/активаторы фарнезоид-X-рецептора (FXR), прегнан-X-рецептора (PXR) и конститутивного рецептора андростина (CAR), а литохолевая кислота представляет собой лиганд для рецептора витамина D (VDR) и рецептора TGR5, сопряженного с G-белком. FXR обнаруживает высокую селективность к желчным кислотам, и наоборот, PXR и CAR действуют на ряд рецепторов, осуществляющих гомеостаз липидов в комбинации с метаболизмом ксенобиотиков. FXR, PXR, CAR и TGR5 обладают синергической активностью, направленной на регуляцию гомеостаза липидов и глюкозы, и на расход энергии, а также на регуляцию чувствительности к инсулину в печени и в периферических органах. Желчные кислоты, если они используются в качестве поверхностно-активных веществ или детергентов, могут быть токсичными по отношению к клеткам, а размер пула желчных кислот строго регулируется в печени и в кишечнике, что способствует предупреждению аккумуляции цитотоксических веществ. При увеличении размера пула желчных кислот активируется механизм обратной связи, участвующий во взаимодействии некоторых ядерных рецепторов, включая FXR, что приводит к ингибированию синтеза желчных кислот de novo. См., например, Fiorucci et al, Prog. Lipid Res. 2010 Apr; 49(2): 171-85. Epub 2009 Dec 2.

Синтез желчных кислот в печени ингибируется гормоном FGF19. FGF19 секретируется из кишечника и передает сигналы в печень, направленные на подавление Cyp7a1. Для сравнения, активация FXR в кишечнике, обусловленная потоком желчных кислот через кишечник после приема пищи, также индуцирует экспрессию FGF19, который высвобождается эпителиальными клетками тонкого кишечника и попадает в кровоток, где он связывается с рецепторами FGF4 (FGFR4) гепатоцитов; и сигнал, передаваемый этими рецепторами FGFR4, подавляет синтез желчных кислот посредством активации пути NH₂-терминальной киназы с-Jun (JNK). Подавление CYP7A1 приводит к снижению уровня синтеза желчных кислот из холестерина печени в соответствии с суточным циклом приема пищи.

Терапевтические показания

Как описано в настоящей заявке, нарушение гомеостаза желчных кислот может приводить к развитию или обострению ряда расстройств, включая холестаз, портосистемный анастомоз, болезнь Крона и микроваскулярную дисплазию печени. Кроме того, желчные кислоты играют определенную роль в модуляции метаболического синдрома, то есть, группы факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, которая включает ожирение внутренних органов, инсулинорезистентность, дислипидемию, повышение кровяного давления и гиперкоагуляцию. Таким образом, модуляция активности желчных кислот может давать ряд благоприятных терапевтических эффектов.

Расстройства, ассоциированные с действием липидов и глюкозы

Активация FXR под действием желчных кислот (или нестероидных синтетических агонистов FXR) приводит к снижению уровня триглицеридов в плазме и, как было показано, к снижению уровня глюкозы в крови у мышей с диабетом. Желчные кислоты могут также регулировать расход энергии по FXR-независимому пути у мышей благодаря активации рецептора TGR5, сопряженного с G-белком. Таким образом, модуляция активности FXR и метаболизма желчных кислот может давать терапевтический эффект при лечении, например, метаболического синдрома и диабета типа 2. См., например, Lefebvre et al, Physiol Rev. 2009 Jan;89(l): 147-91.

Синтез желчных кислот (наряду к резекцией подвздошной кишки) приводит к нарушению циркуляции желчных кислот в кишечнике и печени, к снижению уровня общего холестерина и холестерина ЛНП в плазме и к повышению уровней холестерина ЛВП, аполипопротеина (apo)-AI и триглицеридов. В результате прерывания возвращения желчных кислот в печень начинает активироваться экспрессия cyp7a1, что приводит к стимуляции превращения холестерина в желчные кислоты. Таким образом, агенты, которые секвестрируют желчные кислоты в кишечнике (например, холестирамин), предотвращают их реабсорбцию, что приводит, в качестве механизма компенсации, к переключению продуцирования большего количества эндогенного холестерина на продуцирование желчных кислот, что, в свою очередь, приводит к снижению уровня холестерина.

Истощение холестерина печени, обусловленное повышенной вариабельностью синтеза желчных кислот, приводит к повышению уровня экспрессии рецептора ЛНП в печени, что, в свою очередь, приводит к экспрессии рецептора ЛНП, ответственного за снижение уровня общего холестерина и холестерина ЛНП, продуцируемых посредством синтеза желчных кислот или в результате резекции подвздошной кишки. При этом считается, что FXR независимо регулирует метаболизм холестерина ЛВП и триглицеридов.

Как уже указывалось, было также обнаружено, что синтез желчных кислот ассоциируется с диабетом типа 2. На регуляцию уровня глюкозы может влиять ряд факторов, включая размер и состав пула желчных кислот, FXR-опосредуемые изменения уровня продуцирования глюкозы в печени и абсорбции глюкозы в кишечнике, эффекты, влияющие на периферическую чувствительность к инсулину, инкретиновые эффекты и расход энергии. Модуляция систеза желчных кислот может быть применена не только для лечения диабета, но также и для лечения преддиабета.

Малабсорбция желчных кислот и диарея

Избыточная концентрация желчных кислот в толстом кишечнике, вызываемая, например, малабсорбцией желчных кислот, является причиной развития хронической диареи. При поступлении большого количества желчных кислот в толстый кишечник, эти желчные кислоты стимулируют секрецию воды и подвижность тонкого кишечника, что приводит к развитию хронической диареи, то есть, состояния, которое называется диареей, вызываемой желчными кислотами (BAD). Более конкретно, при снижении уровней экспрессии веществ-переносчиков желчных кислот, тонкий кишечник функционирует менее эффективно в отношении реабсорбции желчных кислот (малабсорбция желчных кислот типа 1). Аналогичнным образом, если перистальтика кишечника нарушается в результате хирургической операции на органах желудочно-кишечного тракта, или если желчные кислоты подвергаются деконъюгированию в результате избыточного размножения бактерий в тонком кишечнике, то абсорбция становится менее эффективной (малабсорбция желчных кислот типа 3). Также существует очень небольшая группа пациентов, у которых не наблюдается каких-либо явных признаков заболевания (малабсорбция желчных кислот типа 2). (В общих чертах см., Walters et al, Clin. Gastroenterol Hepatol. 7: 1 189-94 (Nov 2009)).

Холестаз и первичный билиарный цирроз

Состояние холестаза вызывается острым или хроническим прерыванием экскреции желчи (например, в результате обструкции) в печень или из печени. Нарушение образования желчи приводит к прогрессирующему холестатическому поражению печени и к летальному исходу. Обструкция приводит к аккумуляции солей желчных кислот, пигмента билирубина желчи и липидов в кровотоке, вместо их обычной элиминации. Симптомами хронического холестаза являются изменение цвета кожи, рубцы или повреждения кожи, вызываемые расчесыванием, боли в костях, ксантома или ксантелазма. Пациенты с прогрессирующим холестазом чувствуют недомогания, быстро устают и часто ощущают тошноту. Абдоминальная боль и такие системные симптомы, как анорексия, рвота и высокая температура обычно обусловлены сопутствующим заболеванием, вызываемым холестазом.

Внутрипеченочный холестаз обычно вызывается гепатитом или лекарственными препаратами, которые дают симптомы, напоминающие гепатит. Агенты, которые являются производными фенотиазина, включая хлорпромазин, могут внезапно вызывать высокую температуру и воспаление, хотя после прекращения приема этих средств, такие симптомы обычно исчезают. В редких случаях, состояние, напоминающее хронический билиарный цирроз печени, обсуждаемый ниже, сохраняется даже после прекращения приема этих лекарственных средств. У некоторых пациентов наблюдается аналогичная реакция, например, в ответ на прием трициклических антидепрессантов (например, амитриптилина и имипрамина) и фенилбутазона. Внутрипеченочный холестаз может также вызываться другими причинами, включая алкогольное поражение печени, первичный билиарный цирроз и метастазы рака.

Для сравнения можно отметить, что имеется несколько причин развития внепеченочного холестаза, включая побочный эффект некоторых лекарственных препаратов, осложнения после хирургической операции, серьезные повреждения, инфекция, разрушающая ткань, или внутривенное (искусственное) питание. Внепеченочный холестаз может быть вызван такими состояниями, как опухоли и образование желчных камней, которые блокируют поток желчи из желчного пузыря в двенадцатиперстную кишку (например, желчных камней, закупоривающих общий желчный проток). Внепеченочный холестаз может также вызываться раком поджелудочной железы, а реже не-раковыми сужениями общего протока, карциномой протоков или расстройствами поджелудочной железы.

Симптомами внутрипеченочного и внепеченочного холестаза являются желтуха, темная моча и бледный стул. При прогрессировании такого состояния может наблюдаться сильный кожный зуд.

Внутрипеченочный холестаз беременных (ICP) часто развивается во втором и в третьем триместрах беременности и является второй самой распространенной причиной желтухи во время беременности. Хотя такие симптомы обычно исчезают через 2-4 недели после рождения ребенка, однако, они могут появляться снова при повторной беременности. Аналогичное состояние возникает у некоторых женщин, которые принимают пероральные контрацептивы, однако, после прекращения приема таких пероральных контрацептивов, эти симптомы исчезают.

Врожденное нарушение синтеза желчных кислот представляет собой редкое генетическое заболевание, которое иногда проявляется как холестаз новорожденных. Это заболевание характеризуется недостаточным продуцированием обычных желчных кислот и аккумуляцией редко встречающихся желчных кислот и промежуточных соединений желчных кислот. Такое врожденное нарушение синтеза, если оно не было диагностировано или было диагностировано ошибочно, может приводить к печеночной недостаточности или к прогрессирующему хроническому заболеванию печени.

Холестаз, индуцируемый лекарственными средствами, может возникать как осложнение при химиотерапии или при лечении другими лекарственными средствами. Индуцированный лекарственными средствами холестаз двух основных типов представляет собой идиосинкратические реакции и прямое токсическое поражение. Идиосинкратические реакции могут возникать в начале лечения или после лечения. Аллергические реакции могут варьироваться и не ассоциируются с количеством вводимого лекарственного препарата.

В случае прямого токсического поражения, тяжесть симптомов непосредственно зависит от количества вводимого лекарственного средства. Такое состояние развивается за короткий промежуток времени после начала лечения, имеет предсказуемый характер и обычно приводит к поражению печени. Прямые токсические реакции наблюдаются у 1% от всех пациентов, которые принимают хлорпромазин.

Редко встречающееся состояние, такое как доброкачественный наследственный рецидивирующий холестаз, характеризуется кратковременными повторяющимися приступами зуда и желтухи, однако, эти симптомы часто исчезают, а поэтому такое состояние не вызывает цирроз. (В общих чертах см., Rose et al, Cell Metabolism 14(1): 123-30 (July 2011).

Первичный билиарный цирроз печени (ПБЦ) представляет собой прогрессирующее заболевание печени, обусловленное, главным образом, аутоиммунной деструкцией желчных протоков, по которым желчные кислоты переносятся из печени, и такая деструкция приводит к холестазу. По мере прогрессирования заболевания, непрерывное образование токсических желчных кислот приводит к прогрессирующему поражению печени, характеризующемуся хроническим воспалением и фиброзом.

Хотя ПБЦ встречается редко, однако, он является наиболее распространенным холестатическим заболеванием печени и занимает пятое место среди всех заболеваний, при которых требуется трансплантация печени в США. У большинства пациентов с ПБЦ, при первоначальной диагностике, это заболевание протекает бессимптомно, но со временем, у них часто появляются такие симптомы, как усталость и зуд. При прогрессировании заболевания может возникать желтуха. Для подтверждения диагноза ПБЦ может быть проведена, но необязательно, биопсия печени, а для определения функции печени часто проводят мониторинг на билирубин. Повышение уровней ALP в сыворотке, то есть, фермента, высвобождаемого клетками печени в ответ на токсическое действие желчных кислот, обычно при тщательном наблюдении пациентов, является показателем ответа на лечение и прогностическим критерием.

Несмотря на прием урсодиола, то есть, стандартного средства для терапии ПБЦ, у значительного числа пациентов с запущенной формой ПБЦ наблюдается прогрессирующая печеночная недостаточность, требующая трансплантации печени, или приводящая к летальному исходу через 5-10 лет. В результате этого, в настоящее время требуется разработка альтернативных методов терапии. Одним из перспективных средств является OCA, то есть, аналог желчной кислоты и агонист FXR, происходящий от первичной человеческой желчной кислоты, а именно, хенодезоксихолевой кислоты, или CDCA. OCA обнаруживается у пациентов, у которых вырабатывается неадекватный терапевтический ответ на урсодиол, или у которых наблюдается непереносимость урсодиола (Intercept Pharmaceuticals, New York).

Первичный склерозирующий холангит

Первичный склерозирующий холангит представляет собой хронический фиброзирующий воспалительный процесс, который приводит к деструкции общей системы желчных протоков и к билиарному циррозу. Стриктуры (резкое сужение) наблюдаются как во внутрипеченочном, так и во внепеченочном протоках у более 80% пациентов, однако, приблизительно у 10% этих пациентов наблюдаются только внутрипеченочные стриктуры, а у менее 5% пациентов наблюдаются только внепеченочные стриктуры. Течение такого заболевания характеризуется ремиссиями и рецидивами. Хотя причина возникновения первичного склерозирующего холангита пока не ясна, однако, считается, что поражение желчных путей обусловлено одним или более генетическими нарушениями регуляции иммунной системы, вирусной инфекцией, токсинами, вырабатываемыми кишечными бактериями, присутствием бактерий в системе воротной вены, ишемическим повреждением сосудов и присутствием токсических желчных кислот, продуцируемых кишечными бактериями.

У большинства пациентов с первичным склерозирующим холангитом наблюдается сопутствующее воспалительное заболевание кишечника (язвенный колит или болезнь Крона). У таких пациентов чаще наблюдается язвенный колит, чем болезнь Крона (85% и 15%, соответственно), при этом, приблизительно 2,5-7,5% всех пациентов с язвенным колитом страдают первичным склерозирующим холангитом. У некоторых пациентов, первичный склерозирующий холангит может не проявляться в течение длительного периода времени, однако, в большенстве случаев, такое заболевание является прогрессирующим.

Заболеваемость первичным склерозирующим холангитом в США составляет приблизительно 1-6 случаев на 100000 человек, и чаще всего это заболевание встречается у людей индоевропейской расы. Приблизительно 75% пациентов с первичным склерозирующим холангитом являются мужчины, средний возраст которых на время установления диагноза составляет приблизительно 40 лет. Лечение этого заболевания на ранних стадиях включает назначение лекарственных средств для предупреждения прогрессирования заболевания. Эндоскопия и хирургическое вмешательство применяются лишь при появлении симптомов. В конечном счете, может потребоваться трансплантация печени, которая дает лишь шанс на полное выздоровление. У пациентов с первичным склерозирующим холангитом имеется высокий риск развития холангиокарциномы (10-15%).

У большинства пациентов с первичным склерозирующим холангитом отсутствуют какие-либо симптомы, и обычно такое заболевание диагностируется при обнаружении нарушения функций печени путем проведения биохимических анализов или рутинных анализов крови. Появление симптомов указывает на обструкцию потока желчи, и такими симптомами являются желтуха, зуд, боли в правом верхнем квадранте брюшной полости, высокая температура и озноб. Такими симптомами могут быть также потеря веса и усталость. У таких пациентов, данное заболевание даже в запущенной форме может протекать бессимптомно в течение многих лет, и появление симптомов обычно указывает на наличие у этих пациентов запущенного заболевания.

Диагноз

Малабсорбция желчных кислот может быть легко диагностирована путем проведения медицинского теста на наличие в ядре SeHCAT (23-селено-25-гомотаурохолевой кислоты (селен-содержащей гомохолевой кислоты, таурина или тауроселхолевой кислоты). Альтернативный диагностический тест включает измерение уровня 7-альфа-гидрокси-4-холестен-3-она, то есть, предшественника желчной кислоты в сыворотке.

Лечение

Секвестранты желчных кислот (например, холестирамин и колестипол в порошкообразной форме) являются основными средствами, используемыми для лечения малабсорбции желчных кислот. К сожалению, у многих пациентов наблюдается непероносимость холестирамина и колестипола, что часто обусловлено грубой структурой и неприятным вкусом полимерного порошка. К счастью, секвестрант желчных кислот, а именно, колесевелам, выпускается в форме таблеток, а поэтому, в большинстве случаев, он переносится гораздо лучше.

Все секвестранты желчных кислот способны связываться с другими соединениями, при этом также возможно, что при дефиците жирорастворимых витаминов (A, D, E и K) может потребоваться введение витаминных добавок.

Было также подтверждено, что заместительная и восстановительная терапия может быть применена для лечения некоторых расстройств, ассоциированных с гомеостазом желчных кислот. В случае заместительной терапии, состав желчных кислот в кровотоке заменяют либо для снижения цитотоксичности эндогенных желчных кислот, либо для модуляции метаболизма холестерина в целях снижения уровня секреции билиарного холестерина. И наоборот, восполнение желчных кислот осуществляют для компенсации дефицита желчных кислот.

Заместительная терапия

Было показано, что введение первичных желчных кислот, таких как хенодезоксихолевая кислота (CDCA), приводит к снижению уровня секреции билиарного холестерина и к постепенному растворению желчных камней. CDCA постепенно заменяют урсодезоксихолевой кислотой (UDCA), поскольку эта кислота не вызывает какой-либо гепатотоксичности. Хенодезоксихолевая кислота обладает слабой гепатотоксичностью у человека, но она обладает высокой гепатотоксичностью у некоторых животных. Несмотря на эффективность и безопасность введения UDCA, которая способствует растворению холестерина желчных камней, эта кислота в настоящее время используется не часто, благодаря успеху лапароскопической холецистэктомии, которая обеспечивает быстрое устранение симптоматического заболевания. В противоположность этому, для успешной медикаментозной терапии требуются месяцы, и при этом, она не всегда приводит к растворению камней, а у некоторых пациентов может даже периодически вызывать рецидивы.

Было показано, что UDCA-терапия улучшает результаты печеночных тестов у пациентов с первичным билиарным циррозом, и этот эффект, очевидно, обусловлен множеством механизмов. Было также показано, что UDCA-терапия дает благоприятные эффекты при лечении других холестатических состояний, таких как холестаз, ассоциированный с беременностью, и холестаз, ассоциированный с общим парентеральным питанием.

Восстановительная терапия

Восполнение желчных кислот осуществляют в случае врожденного нарушения биосинтеза желчных кислот, обычно путем введения смеси хенодезоксихолевой кислоты (CDCA) или урсодезоксихолевой кислоты (UDCA) и холевой кислоты, в целях подавления синтеза цитотоксических предшественников желчных кислот и восстановления подачи первичных желчных кислот в кишечнопеченочный кровоток.

У пациентов с синдромом укороченной тонкой кишки, дефицит желчных кислот наблюдается в проксимальном отделе тонкой кишки, что приводит к нарушению мицеллярной солюбилизации. Такой дефицит, наряду с уменьшенной площадью поверхности и быстрым прохождением через кишечник, приводит к тяжелой малабсорбции жира. Было показано, что холилсаркозин (холил-N-метилглицин), то есть, синтетичесий аналог желчных кислот, способствует повышению уровня абсорбции липидов у пациента с синдромом укороченной тонкой кишки и является резистентным к деконъюгированию и к дегидроксилированию.

Пациенты с диареей, вызываемой желчными кислотами и возникающей на фоне илеита Крона, нуждаются в лечении глюкокортикоидами, причем, стероидами также лечат микроскопический колит. В некоторых случаях может оказаться эффективным введение будезонида и других агентов, включая антибиотики.

Как подробно описано выше, лечение ПБЦ, в основном, включает введение урсадиола, хотя пациентам, у которых наблюдается неадекватный терапевтический ответ на урсодиол, или у которых наблюдается непероносимость урсодиола, может быть проведена альтернативная терапия.

В соответствии с этим, необходимо разработать способ лечения расстройств, вызываемых желчными кислотами, таких как вышеупомянутые расстройства, которыми являются, но не ограничиваются ими, метаболический синдром; расстройство, ассоциированное с метаболизмом липидов или глюкозы; расстройство, ассоциированное с нарушением метаболизма холестерина или триглицеридов; диабет типа 2; холестаз, включая, например, внутрипеченочный холестаз (например, первичный билиарный цирроз (ПБЦ); первичный наследственный внутрипеченочный холестаз (ПНВХ) (например, прогрессирующий ПНВХ); первичный склерозирующий холангит (ПСХ); внутрипеченочный холестаз беременных (ВХБ); холестаз новорожденных; холестаз, индуцированный лекарственными средствами (например, эстрогеном); заболевания, ассоциированные с внепеченочным холестазом (например, прерывание поступления желчи, ассоциированное со сдавливанием опухолью, блокада желчных протоков желчными камнями); малабсорбция желчных кислот и другие расстройства, поражающие дистальный отдел тонкой кишки, включая поражения, связанные с резекцией подвздошной кишки; воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона и язвенный колит); расстройства, связанные с нарушением абсорбции желчных кислот неясной этиологии (идиопатические) и вызывающие диарею (например, диарею, ассоциированную с действием желчных кислот (ДЖК)) и симптомы заболеваний ЖКТ, а также рак ЖКТ, рак печени, и/или рак желчного пузыря (например, рак толстой кишки и гепатоцеллюлярный рак); и/или патологии, связанные с нарушением синтеза желчных кислот, такие как патологии, приводящие к развитию не-алкогольного стеатогепатита (НАСГ), цирроза печени и гипертензии воротной вены, например, у млекопитающих, таких как человек. Настоящее изобретение удовлетворяет указанным требованиям и позволяет достичь соответствующих благоприятных эффектов.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение частично основано на использовании вариантов пептидных последовательностей FGF19, гибридов пептидных последовательностей FGF19 и/или FGF21 и вариантов гибридов (химер) пептидных последовательностей FGF19 и/или FGF21, обладающих одной или более активностями, такими как активность, направленная на модуляцию гомеостаза желчных кислот. Такими вариантами и гибридами (химерами) пептидных последовательностей FGF19 и/или FGF21 являются последовательности, используемые для лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот. Такими вариантами и гибридами (химерами) пептидных последовательностей FGF19 и/или FGF21 также являются последовательности, которые, по существу или в основном, не стимулируют или не индуцируют образование гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) или онкогенез ГЦК. Такими вариантами и гибридами (химерами) пептидных последовательностей FGF19 и/или FGF21 также являются последовательности, которые не индуцируют значительного повышения или увеличения уровня липидов.

В одном из вариантов осуществления изобретения, способ или применение модуляции гомеостаза желчных кислот или лечение расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот, включает введение химерной пептидной последовательности, содержащей: a) N-концевую область, включающую по меньшей мере семь аминокислотных остатков; где указанная N-концевая область, от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, имеет последовательность DSSPL или DASPH; и b) C-концевую область, содержащую часть SEQ ID NO:99 [FGF19], где указанная C-концевая область, от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, имеет аминокислотные остатки 16-29 последовательности SEQ ID NO:99 [FGF19] (WGDPIRLRHLYTSG; SEQ ID NO:169), где остаток W соответствует положению первой аминокислоты указанной С-концевой области, где указанное введение осуществляют в целях модуляции гомеостаза желчных кислот или лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, способ или применение модуляции гомеостаза желчных кислот или лечение расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот, включает введение химерной пептидной последовательности, содержащей: a) N-концевую область, включающую часть SEQ ID NO:100 [FGF21], где N-концевая область, от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, имеет аминокислотные остатки GQV, и где остаток V соответствует положению последней аминокислоты N-концевой области; и b) C-концевую область, содержащую часть SEQ ID NO:99 [FGF19], где указанная C-концевая область имеет, от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, аминокислотные остатки 21-29 последовательности SEQ ID NO:99 [FGF19], RLRHLYTSG (SEQ ID NO:185), и где остаток R соответствует положению первой аминокислоты C-концевой области; где указанное введение осуществляют в целях модуляции гомеостаза желчных кислот или лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, способ или применение модуляции гомеостаза желчных кислот или лечение расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот, включает введение химерной пептидной последовательности, содержащей: a) N-концевую область, включающую часть SEQ ID NO:100 [FGF21], где указанная N-концевая область, от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, имеет по меньшей мере 5 смежных аминокислот SEQ ID NO:100 [FGF21], включая аминокислотные остатки GQV, где остаток V соответствует положению последней аминокислоты N-концевой области; и b) C-концевую область, содержащую часть SEQ ID NO:99 [FGF19], где указанная C-концевая область, от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, имеет аминокислотные остатки 21-29 последовательности SEQ ID NO:99 [FGF19], RLRHLYTSG (SEQ ID NO:185), и где остаток R соответствует положению первой аминокислоты C-концевой области; где указанное введение осуществляют в целях модуляции гомеостаза желчных кислот или лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, способ или применение модуляции гомеостаза желчных кислот или лечение расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот, включает введение пептидной последовательности, содержащей или состоящей из них: a) вариант последовательности FGF19, имеющий одну или более аминокислотных замен, инсерций или делеций по сравнению с исходной последовательностью FGF19 или последовательностью FGF19 дикого типа; b) вариант последовательности FGF21, имеющий одну или более аминокислотных замен, инсерций или делеций по сравнению с исходной последовательностью FGF21 или последовательностью FGF21 дикого типа; c) часть последовательности FGF19, присоединенную к части последовательности FGF21; или d) часть последовательности FGF19, присоединенную к части последовательности FGF21, где часть(и) последовательности FGF19 и/или FGF21 имеет(ют) одну или более аминокислотных замен, инсерций или делеций по сравнению с исходной последовательностью FGF19 и/или FGF21 или с последовательностью FGF19 и/или FGF21 дикого типа; где указанное введение осуществляют в целях модуляции гомеостаза желчных кислот или лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот.

В различных конкретных вариантах осуществления изобретения, химерная пептидная последовательность имеет N-концевую область, содержащую по меньшей мере 6 смежных аминокислот SEQ ID NO:100 [FGF21], включая аминокислотные остатки GQ; или N-концевую область, содержащую по меньшей мере 7 смежных аминокислот SEQ ID NO:100 [FGF21], включая аминокислотные остатки GQV.

В различных дополнительных вариантах осуществления изобретения, пептидная последовательность имеет амино-концевые аминокислоты 1-16 SEQ ID NO:100 [FGF21], присоединенные к карбокси-концевым аминокислотам 21-194 SEQ ID NO:99 [FGF19], либо пептидная последовательность имеет амино-концевые аминокислоты 1-147 SEQ ID NO:99 [FGF19], присоединенные к карбокси-концевым аминокислотам 147-181 SEQ ID NO:100 [FGF21] (M41), либо пептидная последовательность имеет амино-концевые аминокислоты 1-20 SEQ ID NO:99 [FGF19], присоединенные к карбокси-концевым аминокислотам 17-181 SEQ ID NO:100 [FGF21] (M44), либо пептидная последовательность имеет амино-концевые аминокислоты 1-146 SEQ ID NO:100 [FGF21], присоединенные к карбокси-концевым аминокислотам 148-194 SEQ ID NO:99 [FGF19] (M45), либо пептидная последовательность имеет амино-концевые аминокислоты 1-20 SEQ ID NO:99 [FGF19], присоединенные к внутренним аминокислотам 17-146 SEQ ID NO:100 [FGF21] или к карбокси-концевым аминокислотам 148-194 SEQ ID NO:99 [FGF19] (M46).

В различных других вариантах осуществления изобретения, пептидная последовательность имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену на аминокислотные остатки 125-129 SEQ ID NO:99 [FGF19], EIRPD; по меньшей мере одну аминокислотную замену на аминокислотные остатки 126-128 SEQ ID NO:99 [FGF19], IRP; или по меньшей мере одну аминокислотную замену на аминокислотные остатки 127-128 SEQ ID NO:99 [FGF19], RP, или по меньшей мере одну аминокислотную замену на аминокислотные остатки 1-124 SEQ ID NO:99 [FGF19] и/или на аминокислотные остатки 130-194 SEQ ID NO:99 [FGF19]. Более конкретно, например, пептидная последовательность имеет замену на один из аминокислотных остатков 127-128 SEQ ID NO:99 [FGF19], IRP, где по меньшей мере одной аминокислотной заменой является R127L или P128E.

Способы и применения настоящего изобретения могут быть осуществлены с использованием описанной здесь пептидной или химерной последовательности. Так, например, такой последовательностью является последовательность, которая включает любую пептидную последовательность, или состоит из этой пептидной последовательности, представленную здесь как M1-M98 или M101-M160, или SEQ ID NN: 1-98, 101-135 или 138-196; пептидная последовательность, которая включает любую последовательность, или состоит из этой последовательности, представленную в таблицах 1-10; или пептидная последовательность, которая включает любую последовательность, или состоит из этой пептидной последовательности, представленную здесь в Списке последовательностей.

Способы и применения настоящего изобретения могут быть осуществлены с использованием пептидной или химерной последовательности, имеющей любую подходящую длину. В конкретных вариантах осуществления изобретения, N-концевая или С-концевая область пептидной или химерной последовательности имеет длину приблизительно от 20 до 200 аминокислотных остатков. В других конкретных аспектах изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислотных делеций у амино-конца, карбокси-конца или во внутренней области. В других конкретных вариантах осуществления изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет N-концевую область или C-концевую область, которая включает аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей приблизительно 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100 или более аминокислот. В других более конкретных вариантах осуществления изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет часть последовательности FGF19 или часть последовательности FGF21, которая включает аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей приблизительно 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100 или более аминокислот FGF19 или FGF21.

В различных аспектах изобретения, пептидная последовательность имеет: мотив последовательности WGDPI (SEQ ID NO:170), соответствующий последовательности WGDPI аминокислот 16-20 SEQ ID NO:99 [FGF19]; замену, мутацию или делецию мотива последовательности WGDPI (SEQ ID NO:170), соответствующего последовательности WGDPI FGF19 (SEQ ID NO:170) и состоящего из аминокислот 16-20 FGF19; последовательность WGDPI (SEQ ID NO:170) с одной или более аминокислотными заменами, мутациями или делециями. В различных других аспектах изобретения, пептидная последовательность отличается от последовательности варианта FGF19 тем, что в ней последовательность WGDPI FGF19 (SEQ ID NO:170) в положениях аминокислот 16-20 заменена любой из последовательностей из GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) или FGDPI (SEQ ID NO:184).

В различных других аспектах изобретения, N-концевая область содержит аминокислотные остатки VHYG (SEQ ID NO:101), где указанная N-концевая область содержит аминокислотные остатки DASPHVHYG (SEQ ID NO:102), либо указанная N-концевая область содержит аминокислотные остатки DSSPLVHYG (SEQ ID NO:103). Более конкретно, в одном из аспектов изобретения, остаток G соответствует остатку в последнем положении N-концевой области.

В различных дополнительных аспектах изобретения, N-концевая область содержит аминокислотные остатки DSSPLLQ (SEQ ID NO:104), где остаток Q представляет собой аминокислоту в последнем положении N-концевой области, или аминокислотные остатки DSSPLLQFGGQV (SEQ ID NO:105), где остаток V соответствует остатку в последнем положении N-концевой области.

Более конкретно, N-концевая область также включает: RHPIP (SEQ ID NO:106), где R представляет собой аминокислоту в первом положении N-концевой области; или HPIP (SEQ ID NO:107), где H представляет собой собой аминокислоту в первом положении N-концевой области; или RPLAF (SEQ ID NO:108), где R представляет собой аминокислоту в первом положении N-концевой области; или PLAF (SEQ ID NO:109), где P представляет собой аминокислоту в первом положении N-концевой области; или R, где R представляет собой аминокислоту в первом положении N-концевой области.

В различных других аспектах изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет аминокислотные остатки HPIP (SEQ ID NO:107), которые представляют собой первые 4 аминокислотных остатка N-концевой области. В различных других аспектах изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет: остаток R в первом положении N-концевой области; или остаток М в первом положении N-концевой области; или последовательность MR в первом и втором положениях N-концевой области; или последовательность RM в первом и втором положениях N-концевой области; или последовательность RD в первом и втором положениях N-концевой области; или последовательность DS в первом и втором положениях N-концевой области; или последовательность MD в первом и втором положениях N-концевой области; или последовательность MS в первом и втором положениях N-концевой области; или последовательность MDS в 1-3 положениях N-концевой области; или последовательность RDS в 1-3 положениях N-концевой области; или последовательность MSD в 1-3 положениях N-концевой области; или последовательность MSS в 1-3 положениях N-концевой области; или последовательность DSS в 1-3 положениях N-концевой области; или последовательность RDSS (SEQ ID NO:115) в 1-4 положениях N-концевой области; или последовательность MDSS (SEQ ID NO:116) в 1-4 положениях N-концевой области; или последовательность MRDSS (SEQ ID NO:117) в 1-5 положениях N-концевой области; или последовательность MSSPL (SEQ ID NO:113) в 1-5 положениях N-концевой области; или последовательность MDSSPL (SEQ ID NO:110) в 1-6 положениях N-концевой области; или последовательность MSDSSPL (SEQ ID NO:111) в 1-7 положениях N-концевой области.

В различных других конкретных аспектах изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет N-концевую область, в которой аминокислотным остатком в первом положении является остаток «M», остаток «R», остаток «S», остаток «H», остаток «P», остаток «L» или остаток «D». В различных альтернативных конкретных аспектах изобретения, пептидная или химерная последовательность не имеет остатка «M» или остатка «R» в первом положении N-концевой области.

В различных других аспектах изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет N-концевую область, содержащую любую из нижеследующих последовательностей: MDSSPL (SEQ ID NO:1 10), MSDSSPL (SEQ ID NO:111), SDSSPL (SEQ ID NO:112), MSSPL (SEQ ID NO:113) или SSPL (SEQ ID NO:114).

В различных дополнительных аспектах изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет остаток в последнем положении С-концевой области, который приблизительно соответствует остатку 194 SEQ ID NO:99 [FGF19].

В различных более конкретных аспектах изобретения, пептидная последовательность имеет любую из нижеследующих последовательностей или состоит из этих последовательностей:

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M3) (SEQ ID NO:3);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIREDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M140) (SEQ ID NO:194);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M160) (SEQ ID NO:196);

RHPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M5) (SEQ ID NO:5);

HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M5-R) (SEQ ID NO:160);

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHSLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M71) (SEQ ID NO:71);

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M72) (SEQ ID NO:72);

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVVQDELQGVGGEGCHMHPENCKTLLTDIDRTHTEKPVWDGITGE (M73) (SEQ ID NO:73);

RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M1) (SEQ ID NO:1 или 139);

RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M2) (SEQ ID NO:2 или 140);

RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M48) (SEQ ID NO:48 или 6 или 148);

RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M49) (SEQ ID NO:49 или 7 или 149);

RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M50) (SEQ ID NO:50);

RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M51) (SEQ ID NO:51 или 36 или 155);

MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M53) (SEQ ID NO:192);

MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDS16MDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M70) (SEQ ID NO:70);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M139) (SEQ ID NO:193); или

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILCDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M141) (SEQ ID NO:195);

или подпоследовательности или фрагмента любой из вышеуказанных пептидных последовательностей. В некоторых вариантах любой из вышеуказанных пептидных последовательностей, концевой остаток R был делетирован.

В различных дополнительных конкретных аспектах изобретения, N-конец пептидной последовательности включает любую из нижеследующих последовательностей или состоит из этих последовательностей:

HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M5-R) (аминокислоты 1-25 SEQ ID NO:160);

DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6-R) (аминокислоты 2-22 SEQ ID NO:6);

RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M7) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:7);

HPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8-R) (аминокислоты 2-26 SEQ ID NO:8);

HPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9-R) (аминокислоты 2-28 SEQ ID NO:9);

HPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M10-R) (аминокислоты 2-28 SEQ ID NO:10);

RPLAFSDAGPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M11) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:11);

RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12) (аминокислоты 1-29 SEQ ID NO:12);

RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:13);

HPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14-R) (аминокислоты 2-26 SEQ ID NO:14);

RPLAFSDAGPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M15) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:15);

RPLAFSDAGPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M16) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:16);

RPLAFSDAGPHVGWGDPIRLRHLYTSG (M17) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:17);

RPLAFSDAGPHYGWGDPIRLRHLYTSG (M18) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:18);

RPLAFSDAGPVYGWGDPIRLRHLYTSG (M19) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:19);

RPLAFSDAGPVHGWGDPIRLRHLYTSG (M20) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:20);

RPLAFSDAGPVHYWGDPIRLRHLYTSG (M21) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:21);

RPLAFSDAGPHVHGWGDPIRLRHLYTSG (M22) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:22);

RPLAFSDAGPHHGWGDPIRLRHLYTSG (M23) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:23);

RPLAFSDAGPHHYWGDPIRLRHLYTSG (M24) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:24);

RPLAFSDAGPHVYWGDPIRLRHLYTSG (M25) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:25);

RPLAFSDSSPLVHWGDPIRLRHLYTSG (M26) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:26);

RPLAFSDSSPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M27) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:27);

RPLAFSDAGPHVWGDPIRLRHLYTSG (M28) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:28);

RPLAFSDAGPHVHYWGDPIRLRHLYTSG (M29) (аминокислоты 1-28 SEQ ID NO:29);

RPLAFSDAGPHVHYAWGDPIRLRHLYTSG (M30) (аминокислоты 1-29 SEQ ID NO:30);

RHPIPDSSPLLQFGAQVRLRHLYTSG (M31) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:31);

RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSG (M32) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:32);

RHPIPDSSPLLQFGPQVRLRHLYTSG (M33) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:33);

RHPIPDSSPLLQFGGAVRLRHLYTSG (M34) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:34);

RHPIPDSSPLLQFGGEVRLRHLYTSG (M35) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:35);

RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSG (M36) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:36);

RHPIPDSSPLLQFGGQARLRHLYTSG (M37) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:37);

RHPIPDSSPLLQFGGQIRLRHLYTSG (M38) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:38);

RHPIPDSSPLLQFGGQTRLRHLYTSG (M39) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:39);

RHPIPDSSPLLQFGWGQPVRLRHLYTSG (M40) (аминокислоты 1-28 SEQ ID NO:40);

DAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M74-R) (аминокислоты 2-24 SEQ ID NO:74);

VHYGWGDPIRLRHLYTSG (M75-R) (аминокислоты 2-19 SEQ ID NO:75);

RLRHLYTSG (M77-R) (аминокислоты 2-10 SEQ ID NO:77);

RHPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9) (аминокислоты 1-28 SEQ ID NO:9);

RHPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:8);

RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12) (аминокислоты 1-29 SEQ ID NO:12);

RHPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M10) (аминокислоты 1-28 SEQ ID NO:10);

RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13) (аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:13);

RHPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14) (аминокислоты 1-26 SEQ ID NO:14);

RPLAFSDAGPHVHYGGDIRLRHLYTSG (M43) аминокислоты 1-27 SEQ ID NO:43); или

RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6) (аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:6).

В различных других конкретных аспектах изобретения, пептидная последовательность включает нижеследующие последовательности или состоит из нижеследующих последовательностей:

DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:138 или 161);

DSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:141);

или подпоследовательности или фрагменты любой из вышеуказанных пептидных последовательностей. В некоторых вариантах любой из вышеуказанных пептидных последовательностей, концевой остаток R был делетирован.

В различных других конкретных аспектах изобретения, к пептидной последовательности присоединяют дополнительные аминокислотные остатки 30-194 SEQ ID NO:99 [FGF19] у C-конца, что приводит к образованию химерного полипептида.

В различных других вариантах осуществления изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет аминокислотные замену, добавление или инсерцию, либо она представляет собой подпоследовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота является делетированной. Такая пептидная последовательность может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более замен, добавлений, инсерций и делеций аминокислотных остатков (10-20, 20-30, 30-40, 40-50 и т.п.), например, у N- или C-конца или во внутренней области. Так, например, подпоследовательность имеет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более делеций аминокислот у амино-конца, карбокси-конца или во внутренней области. В конкретном аспекте изобретения, аминокислотная замена или делеция присутствует в любом из положений аминокислот 8-20 FGF19 (AGPHVHYGWGDPI) (SEQ ID NO:187).

В различных более конкретных аспектах изобретения, пептидная или химерная последовательность включает всю представленную ниже последовательность FGF19:

PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPE EPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:188), или ее часть, расположенные у С-конца пептида, либо в этих последовательностях, остаток «R» у амино-конца был делетирован.

В различных вариантах осуществления изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет более высокую или более низкую функцию или активность по сравнению с исходной последовательностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения, пептидная последовательность имеет пониженную способность к образованию ГЦК по сравнению с FGF19 или с вариантом последовательности FGF19, в которой, в положениях аминокислот 16-20 FGF19, последовательность WGDPI (SEQ ID NO:170) заменена любой из последовательностей GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) или FGDPI (SEQ ID NO:184); или повышенную активность, направленную на снижение уровня глюкозы, по сравнению с FGF19 или с вариантом последовательности FGF19, в которой, в положениях аминокислот 16-20 FGF19, последовательность WGDPI (SEQ ID NO:170) заменена любой из последовательностей GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) или FGDPI (SEQ ID NO:184); или пониженную активность в отношении повышения уровня липидов по сравнению с FGF19 или с вариантом последовательности FGF19, в которой, в положениях аминокислот 16-20 FGF19, последовательность WGDPI (SEQ ID NO:170) заменена любой из последовательностей GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) или FGDPI (SEQ ID NO:184); или пониженную активность в отношении повышения уровня триглицеридов, холестерина, не-ЛВП или ЛВП по сравнению с FGF19 или с вариантом последовательности FGF19, в которой, в положениях аминокислот 16-20 FGF19, последовательность WGDPI (SEQ ID NO:170) заменена любой из последовательностей GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) или FGDPI (SEQ ID NO:184); либо указанная пептидная последовательность обладает более низкой активностью, направленной на снижение потери массы, по сравнению с последовательностью FGF21. Такие функции и активности могут быть определены in vitro или in vivo, например, у мышей db/db.

В других различных вариантах осуществления изобретения, пептидная или химерная последовательность влияет на функцию или активность других молекул. В одном из аспектов изобретения, пептидная последовательность способствует сохранению или повышению FGFR4-опосредуемой активности. В другом аспекте изобретения, пептидная последовательность связывается с рецептором фактора роста фибробластов 4 (FGFR4) или активирует FGFR4, либо она не связывается с FGFR4 или не активирует FGFR4 на детектируемом уровне. В другом аспекте изобретения, пептидная последовательность связывается с FGFR4 с меньшей, сравнимой или с большей аффинностью, чем аффинность связывания FGF19 с FGFR4. В другом аспекте изобретения, пептидная последовательность активирует FGFR4 на более низком, сравнимом или более высоком уровне, чем FGF19.

В других различных вариантах осуществления изобретения, пептидная или химерная последовательность включает одну или более аминокислот, таких как L-аминокислоты, D-аминокислоты, не-природные аминокислоты или аминокислотные миметики, производные или аналоги. В других различных вариантах осуществления изобретения, пептидная или химерная последовательность имеет N-концевую область или С-концевую область, или часть последовательности FGF19 или часть последовательности FGF21, связанные посредством линкера или спейсера.

В других дополнительных вариантах осуществления изобретения, химерная или пептидная последовательность входит в фармацевтическую композицию, которая, в свою очередь, может быть использована в способах и применениях настоящего изобретения. Такие композиции включают комбинации неактивного ингредиента или других активных ингредиентов. В одном из вариантов осуществления изобретения, композиция, такая как фармацевтическая композиция, включает химерную пептидную последовательность или пептидную последовательность и агент, способствующие улучшению гомеостаза желчных кислот.

Настоящее изобретение также относится к применениям и способам лечения, которые включают введение или доставку химерной пептидной последовательность или пептидной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения, применение или способ лечения индивидуума включает введение химерной пептидной последовательность или пептидной последовательности согласно изобретению индивидууму, такому как индивидуум, страдающий расстройством или имеющий риск развития у него расстройства, которое может быть подвергнуто лечению пептидной последовательностью согласно изобретению, в количестве, эффективном для лечения указанного расстройства. В другом варианте осуществления изобретения, указанный способ или указанное применение включает введение химерной пептидной последовательность или пептидной последовательности согласно изобретению индивидууму, такому как индивидуум, страдающий расстройством, связанным или ассоциированным с действием желчных кислот.

В конкретных аспектах способов и применений настоящего изобретения, химерную пептидную последовательность или пептидную последовательность вводят индивидууму в количестве, эффективном для улучшения или обеспечения гомеостаза желчных кислот. Неограничивающими примерами расстройств, которые связаны или ассоциированы с действием желчных кислот, и которые могут быть подвергнуты лечению в соответствии с описанными здесь способами и применениями настоящего изобретения, являются метаболический синдром; расстройство, ассоциированное с метаболизмом липидов или глюкозы; расстройство, ассоциированное с метаболизмом холестерина или триглицеридов; диабет типа 2; холестаз, включая, например, внутрипеченочный холестаз (например, первичный ПБЦ, ПНВХ, ПСХ, ВХБ, холестаз новорожденных и холестаз, индуцированный лекарственными средствами (например, эстрогеном)); заболевания, ассоциированные с внепеченочным холестазом (например, прерывание поступления желчи, ассоциированное со сдавливанием опухолью, блокада желчных протоков желчными камнями); малабсорбция желчных кислот и другие расстройства, поражающие дистальный отдел тонкой кишки, включая поражения, связанные с резекцией подвздошной кишки; воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона и язвенный колит); расстройства, связанные с нарушением абсорбции желчных кислот неясной этиологии (идиопатические) и вызывающие диарею (например, диарею, ассоциированную с действием желчных кислот (ДЖК)) и симптомы заболеваний ЖКТ и рак ЖКТ, печени, и/или желчного пузыря (например, рак толстой кишки и гепатоцеллюлярный рак); и/или патологии, связанные с нарушением синтеза желчных кислот, такие как патологии, приводящие к развитию не-алкогольного стеатогепатита (НАСГ), цирроза печени и гипертензии воротной вены. В одном из вариантов осуществления изобретения, расстройством, связанным или ассоциированным с действием желчных кислот, является малабсорбция желчных кислот. В другом варианте осуществления изобретения, расстройством, связанным или ассоциированным с действием желчных кислот, является диарея. В другом варианте осуществления изобретения, расстройством, связанным или ассоциированным с действием желчных кислот, является холестаз (например, внутрипеченочный или внепеченочный холестаз). В другом варианте осуществления изобретения, расстройством, связанным или ассоциированным с действием желчных кислот, является перичный билиарный цирроз. В другом варианте осуществления изобретения, расстройством, связанным или ассоциированным с действием желчных кислот, является перичный склерозирующий холангит. В другом варианте осуществления изобретения, расстройством, связанным или ассоциированным с действием желчных кислот, является ПНВХ (например, прогрессирующий ПНВХ).

Настоящее изобретение также относится к способам и применениям анализа и/или идентификации химерной пептидной последовательность или пептидной последовательности, такой как химерные пептидные последовательности и пептидные последовательности, которые модулируют гомеостаз желчных кислот, но при этом обладают, но необязательно, высокой или статистически значимой активностью в отношении образования ГЦК. В одном из вариантов осуществления изобретения, способ или применение включают: a) получение последовательности пептида-кандидата; b) введение последовательности пептида-кандидата тестируемому животному; c) измерение уровней желчных кислот у животного после введения ему последовательности пептида-кандидата в целях определения способности последовательности модулировать гомеостаз желчных кислот; и d) анализ последовательности пептида-кандидата на индуцирование развития ГЦК у животного, или анализ на экспрессию маркера, коррелирующего с активностью в отношении образования ГЦК. Пептид-кандидат, который модулирует гомеостаз желчных кислот, но не обладает значительной активностью в отношении образования ГЦК, может быть идентифицирован как пептидная последовательность, которая модулирует гомеостаз желчных кислот, но не обладает значительной активностью в отношении образования ГЦК.

В конкретном аспекте изобретения, химерную пептидную последовательность или пептидную последовательность также анализируют на способность индуцировать образование ГЦК у животного (например, оценивают образец ткани печени, взятой у тестируемого животного) или на экспрессию маркера, коррелирующего с активностью в отношении образования ГЦК. Такие способы и применения позволяют идентифицировать данного кандидата как кандидата, обладающего активностью в отношении модуляции гомеостаза желчных кислот, но при этом обладающего, но необязательно, высокой или значимой активностью в отношении образования ГЦК.

Описание графического материала

На фиг. 1 показана экспрессия cyp7a1 у мышей db/db, которым были внутрибрюшинно введены дозы FGF19 и FGF21 (SEQ ID NN:99 и 100) в указанных концентрациях.

На фиг. 2A-2D показана экспрессия cyp7a1 в человеческих первичных гепатоцитах после введения дозы A) варианта Ml (SEQ ID NO:1); B) варианта M2 (SEQ ID NO:2); C) варианта M5 (SEQ ID NO:5); и D) варианта M32 (SEQ ID NO:32).

На фиг. 3A-3D показана экспрессия cyp7a1 в человеческих первичных гепатоцитах после введения дозы A) варианта M69 (SEQ ID NO:69); B) варианта M75 (SEQ ID NO:75); C) варианта M70 (SEQ ID NO:70); и D) варианта M76 (SEQ ID NO:76).

На фиг. 4A-4D показана экспрессия cyp7a1 в человеческих первичных гепатоцитах после введения дозы A) варианта M85 (SEQ ID NO:85); B) варианта M96 (SEQ ID NO:96); C) варианта M90 (SEQ ID NO:90); и D) варианта M98 (SEQ ID NO:98).

На фиг. 5 представлена таблица, в которой указаны IC₅₀ cyp7a1 (пМ), относительный уровень экспрессии cyp7a1 и оценка образования ГЦК для указанных вариантов: Ml, M2, M5, M32, M69, M70, M75, M76, M85, M90, M96 и M98.

На фиг. 6 представлены результаты клинического испытания с участием человека, указывающие на то, что введение M70 приводит к ингибированию 7a-гидрокси-4-холестен-3-она (C4), то есть, маркера синтеза желчных кислот, по сравнению с введением плацебо.

На фиг. 7 показано, что экспрессия комплекса FGFR4/β-klotho в клетках L6 повышает активность путей передачи внутриклеточного сигнала под действием FGF19, M3 и M70.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к химерным и пептидным последовательностям, которые модулируют гомеостаз желчных кислот и могут быть использованы для лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот. В одном из вариантов осуществления изобретения, химерная пептидная последовательность включает, или состоит из них, N-концевую область, имеющую по меньшей мере семь аминокислотных остатков и N-концевую область, которая, от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, имеет последовательности DSSPL (SEQ ID NO:121) или DASPH (SEQ ID NO:122; и C-концевую область, содержащую часть FGF19, где указанная C-концевая область, от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, имеет аминокислотные остатки 16-29 FGF19 (WGDPIRLRHLYTSG; SEQ ID NO:169), где остаток W соответствует положению первой аминокислоты указанной С-концевой области.

В другом варианте осуществления изобретения, химерная пептидная последовательность включает, или состоит из них, N-концевую область, имеющую часть FGF21, где N-концевая область, , от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, имеет аминокислотные остатки GQV, и где остаток V соответствует положению последней аминокислоты N-концевой области; и C-концевую область, имеющую часть FGF19, где указанная C-концевая область, от положения первой аминокислоты до положения последней аминокислоты, включает аминокислотные остатки 21-29 последовательности FGF19 (RLRHLYTSG, SEQ ID NO:185), и где остаток R соответствует положению первой аминокислоты C-концевой области.

В других вариантах осуществления изобретения, пептидная последовательность включает, или состоит из него, вариант последовательности FGF19, имеющий одну или более аминокислотных замен, инсерций или делеций по сравнению с исходной последовательностью FGF19 или последовательностью FGF19 дикого типа. В других вариантах осуществления изобретения, пептидная последовательность включает, или состоит из него, вариант последовательности FGF21, имеющий одну или более аминокислотных замен, инсерций или делеций по сравнению с исходной последовательностью FGF19 или последовательностью FGF19 дикого типа. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, пептидная последовательность включает, или состоит из нее, часть последовательности FGF19, присоединенную к части последовательности FGF21. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, пептидная последовательность включает, или состоит из нее, часть последовательности FGF19, присоединенную к части последовательности FGF21, где часть(и) последовательности FGF19 и/или FGF21 имеет(ют) одну или более аминокислотных замен, инсерций или делеций по сравнению с исходной последовательностью FGF19 и/или FGF21 или с последовательностью FGF19 и/или FGF21 дикого типа.

Настоящее изобретение также относится к способам и применениям лечения индивидуума, страдающего расстройством или имеющего риск развития расстройства, которое может быть подвергнуто лечению с использованием вариантов и гибридов пептидных последовательностей FGF19 и/или FGF21. В одном из вариантов осуществления изобретения, способ или применение включают контактирование индивидуума с одним или более вариантами или гибридами пептидных последовательностей FGF19 и/или FGF21 или введение индивидууму этих вариантов или гибридов в количестве, эффективном для лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот. В другом варианте осуществления изобретения, способ или применение включают контактирование индивидуума с одной или более молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими вариант или гибрид пептидной последовательности FGF19 и/или FGF21, или введение индивидууму этих молекул нуклеиновой кислоты (например, элемента регуляции экспрессии, функционально присоединенного к нуклеиновой кислоте, кодирующей пептидную последовательность, включая, но необязательно, вектор) в количестве, эффективном для лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот.

Репрезентативная исходная последовательность FGF21 или последовательность FGF21 дикого типа представляет собой:

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:99).

Репрезентативная исходная последовательность FGF19 или последовательность FGF19 дикого типа представляет собой:

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPH RDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:100). Аллельными вариантами FGF21 являются, например, M70, M71 и M72.

Используемые здесь термины «пептидная», «белковая» и «полипептидная» последовательность являются синонимами и означают две или более аминокислот или «остатков», включая химические модификации и производные аминокислот, ковалентно связанные амидной связью, или их эквиваленты. Аминокислоты, образующие весь пептид или его часть, могут быть выбраны из 21 известной природной аминокислоты, где указанные аминокислоты могут быть обозначены однобуквенным кодом или более распространенным трехбуквенным кодом. В пептидных последовательностях согласно изобретению, стандартные аминокислотные остатки имеют свое общепринятое значение. Так, например, «Leu» означает лейцин, «Ile» означает изолейцин, а «Nle» означает норлейцин и т.п.

В настоящем изобретении представлены репрезентативные пептидные последовательности, которые отличаются от описанных здесь исходных полипептидов FGF19 и FGF21 тем, что они модулируют гомеостаз желчных кислот in vivo (см., например, таблицы 1-10 и список последовательностей). Неограничивающими конкретными примерами являются пептидная последовательность, в которой амино-концевые аминокислоты 1-16 FGF21 присоединены к карбокси-концевым аминокислотам 21-194 FGF19; пептидная последовательность, в которой амино-концевые аминокислоты 1-147 FGF19 присоединены к карбокси-концевым аминокислотам 147-181 FGF21; пептидная последовательность, в которой амино-концевые аминокислоты 1-20 FGF19 присоединены к карбокси-концевым аминокислотам 17-181 FGF21; пептидная последовательность, в которой амино-концевые аминокислоты 1-146 FGF21 присоединены к карбокси-концевым аминокислотам 148-194 FGF19; и пептидная последовательность, в которой амино-концевые аминокислоты 1-20 FGF19 присоединены к внутренним аминокислотам 17-146 FGF21, которые, в свою очередь, присоединены к карбокси-концевым аминокислотам 148-194 FGF19.

Дополнительные конкретные пептидные последовательности имеют мотив последовательности WGDPI (SEQ ID NO:170), соответствующий последовательности аминокислот WGDPI 16-20 FGF19 (SEQ ID NO:99), не содержат мотива последовательности WGDPI (SEQ ID NO:170), соответствующего последовательности аминокислот WGDPI 16-20 FGF19 (SEQ ID NO:99); или имеют замененный (то есть, мутированный) мотив последовательности WGDPI (SEQ ID NO:170), соответствующий последовательности аминокислот WGDPI 16-20 FGF19 (SEQ ID NO:99).

Конкретные пептидные последовательности согласно изобретению также включают последовательности, отличающиеся от последовательностей FGF19 и FGF21 (например, описанных в настоящей заявке) и от последовательностей варианта FGF19 тем что в этих последовательностях, последовательность WGDPI (SEQ ID NO:170) в положениях аминокислот 16-20 FGF19 заменена любой из последовательностей GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) или FGDPI (SEQ ID NO:184). В соответствии с этим, последовательности FGF19 и FGF21 дикого типа (например, представленные здесь как SEQ ID NOS:99 и 100, соответственно) могут быть исключены, и может быть также исключена последовательность FGF19, в которой последовательность WGDPI (SEQ ID NO:170) в положениях аминокислот 16-20 FGF19 заменена любой из последовательностей GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) или FGDPI (SEQ ID NO:184). Однако, такое исключение не относится к последовательности, в которой, например, 3 остатка FGF21 присоединены к последовательности FGF19, имеющей, например, любую из последовательностей GQV, GQV, GDI, или GPI, или 2 остатка FGF21 присоединены к любой из WGPI (SEQ ID NO:171), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182) или WGDP (SEQ ID NO:183).

Конкретные неограничивающие примеры пептидных последовательностей включают, или состоят из них, полноразмерный вариант последовательности или ее часть, представленные здесь как M1-M98 (SEQ ID NN: l-52, 192 и 54-98, соответственно). Более конкретные неограничивающие примеры пептидных последовательностей включают, или состоят из них, полноразмерную последовательность или ее часть, представленные здесь как:

HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M5-R) (SEQ ID NO:160) (последовательности FGF21 могут также включать остаток «R» у амино-конца);

DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:138 и 161);

RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M1) (SEQ ID NO:l или 139);

RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M2) (SEQ ID NO:2 или 140);

DSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:141);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M3) (SEQ ID NO:3);

RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M49) (SEQ ID NO:49, 7 или 149);

MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M53) (SEQ ID NO:192);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M139) (SEQ ID NO:193);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIREDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M140) (SEQ ID NO:194);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILCDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M141) (SEQ ID NO:195); или

или подпоследовательность или фрагмент любой из вышеуказанных пептидных последовательностей. В некоторых вариантах любой из вышеуказанных пептидных последовательностей, концевой остаток R был делетирован.

Другими конкретными неограничивающими примерами пептидных последовательностей являются пептидные последовательности, имеющие у N-конца пептидную последовательность, включающую или состоящую из них, нижеследующую полноразмерную последовательность или часть любой из нижеследующих последовательностей: